专利名称：一种极耐热木糖苷酶及其编码基因和应用的制作方法
技术领域：
本发明属于基因工程技术及纤维原料水解领域，具体涉及一种极耐热木糖苷酶及其编码基因和应用。
背景技术：
木聚糖是植物细胞壁半纤维素的土要成分，是除纤维素之外自然界中最为丰富的可再生资源之一。木糖就存在于半纤维素多缩戊糖中，是亟待开发的重要可再生资源。如果将半纤维素生物降解为木糖和少量其它单糖，可以用作基本碳源生产各种发酵产品、工业酒精及糠醛制备等。同时，木糖的衍生物木糖醇还可作为食品添加剂，如用于口香糖、糖果及于尿病患者的甜味剂等。木糖苷酶是木聚糖降解酶系中的较为关键的多糖水解酶，通过随机切割木寡糖的 β -I, 4-糖苷键，将木寡糖降解为木糖。由于木糖苷酶可以将寡糖降解为木糖，因此可作为一种高效的工业酶制剂用于木糖及木糖衍生物的生产，因此具有潜在的应用价值。
发明内容
发明目的针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一种极耐热木糖苷酶，以使其满足使用要求。本发明的另一目的是提供一种编码上述极耐热木糖苷酶的核苷酸序列。本发明还有一目的是提供上述一种极耐热木糖苷酶的应用。技术方案为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下
一种极耐热木糖苷酶，氨基酸序列如SEQ NO 1所示。一种极耐热木糖苷酶，氨基酸序列为权利要求I所述的SEQ NO :1序列中的氨基酸经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失及添加形成的具有木糖苷酶活性的衍生蛋白质。一种编码上述的极耐热木糖苷酶的基因，DNA序列如SEQ NO 2所示。一种可表达上述的极耐热木糖苷酶的重组体系，在所述的重组体系上克隆有如SEQ NO 2所示的DNA序列；所述的重组体系包括重组质粒和重组菌。一种扩增上述的编码极耐热木糖苷酶的基因的方法，所使用的引物对为
Xylo-I :5’ - GGAATTCCATATGGATCTTTACAAGAATCCAAATGTAC-3’ ；
Xylo-2 :5’ -CCGCTCGAGCTCGATCTTTGTATTTGTGAAGAAAAC-3’。上述的极耐热木糖苷酶在酶解木寡糖中的应用。酶解反应温度为75-100°C，PH5. 0-7. 5。所述的木寡糖来源于纤维原料中的半纤维素，包括木二糖、木三糖和木四糖。上述的重组体系在酶解木寡糖中的应用。上述的极耐热木糖苷酶在酶解玉米秸杆的木寡糖中的应用。有益效果与现有技术相比，本发明所提供的木糖苷酶具有优良的耐热性能。在95°C、pH为6.0的条件下酶活性最高，比酶活达到117. 6U/mg ;该蛋白酶在温度为75-100°C, pH为5. 0-7. 5的范围内，均具有较高的酶活。该木糖苷酶的耐热性能极高，在85°C反应体系中，保温Ih酶活性基本保持不变。上述特性使得本发明得到的木糖苷酶比现有木糖苷酶具有更大的优越性，适用于80°C以上高温、偏中性的pH条件下木寡糖的降解，具有潜在的工业应用价值。
图I是木糖苷酶Tth xylo的SDS-PAGE蛋白电泳 图2是Tth xylo的最适温度结果 图3是Tth xylo的最适pH结果 图4是Tth xylo的热稳定性结果 图5是Tth xylo降解玉米秸杆半纤维素TLC图。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明。以下实施例中所使用的材料、试剂等，若无特殊说明，均可从商业途径获得。实施例I嗜热陆地热泉高温神袍菌基因组DNA的提取
采用嗜热陆地热泉高温神袍菌Thermo toga thermarum DSM5069 (购自德国微生物菌种保藏中心)新鲜菌体10g，悬于5mL 50mM Tris缓冲溶液中(pH8. 0)，混匀后在37°C放置20min，然后加入2mL 10%SDS，55°C放置5min，用等体积的酚-氯仿(24:1)抽提一次，取上清液加入2倍体积的无水乙醇，于_20°C放置30min，4°C 13000rpm离心20min，收集沉淀。沉淀溶于 0. 5mL TE 缓冲液(ρΗ8· 0，IOmM Tris, ImM EDTA)，加入 10mg/mL RNase 3μ L,37°C保温lh，用等体积的酚-氯仿(24:1)抽提一次，取上清加入2倍体积的无水乙醇，于_20°C放置30min，4°C 13000rpm离心20min，收集沉淀，真空冷冻干燥，用0. 5mL超纯水溶解。实施例2木糖苷酶基因Tth xylo的制备
可采用如下方法制备Tth xylo基因，也可以采用人工合成的方式得到。认Thermotoga thermarum DSM5069的总DNA (实施例I制备)为模版，用下述引物对进行PCR扩增
Xylo-I :5’ - GGAATTCCATATGGATCTTTACAAGAATCCAAATGTAC-3’ ；
Xylo-2 :5’ -CCGCTCGAGCTCGATCTTTGTATTTGTGAAGAAAAC-3’ ；
引物合成时，Tth-I引入Nde I酶切位点，Tth-2引入Xho I酶切位点。PCR 反应体系I μ L T. thermarum 基因组 DNA, 1μ L Tth-1, IuL Tth-2, 25 μ LPremix ExTaq, 22 μ L 超纯水。PCR 反应条件94°C变性 5min ;94°C变性 30sec，52°C退火 30sec，72°C延伸 3min，30Cycles ;72°C延伸 IOmin ;4°C保温。PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测产量和特异性，并用PCR产物回收试剂盒进行纯化(BI0MIGA，上海)。实施例3重组克隆、表达载体pET-20b-7iA xylo的构建与验证
将纯化过的PCR产物(实施例2制备)、pET-20b (Novagen)用分别Nde I和Xho I双酶切，琼脂糖电泳回收酶切酶切PCR及载体大片段。割胶回收后的目的片段与载体，经浓缩加入8yL无菌水重悬，加入IyL IOXLigase Buffei^PlyL Ligase，于16°C连接过夜。用连接反应产物转化大肠杆菌pET-20b，然后涂于含IOOy g/mL Amp (氨苄青霉素)的培养皿，37°C培养 10-12h。从转化平板上挑取多个单菌落，采用BI0MIGA的质粒小量提取试剂盒提取质粒。对获得的质粒双酶切验证并对获得的重组质粒进行测序。测序结果显示，pET-20b载体中插入了所克隆的目的片段(核苷酸长度为2322 bp)，进而得到重组克隆、表达载体pET-20b-m xylo, Tth xylo的核苷酸如SEQ NO 2所示，其编码的氨基酸序列如SEQ NO I所示，将该蛋白命名为Tth xylo。实施例4重组木糖苷酶Tth xylo的表达与纯化 将重组克隆、表达载体pET-20b-Tth xylo (实施例3制备)电转至宿主菌疋coliBL21(DE3) (Novagen)，获得含有重组质粒的重组菌。将单菌落的重组菌接种于5mL含有100 μ g/ml氨节青霉素的Luria-Bertani broth (LB)培养基,在37°C温度下,200rpm震荡培养8-12h。将上述4mL菌液接种于含400mL培养基的1000 mL摇瓶中，37°C温度下，200rpm震荡培养，当吸光度达到0. 6-0. 8时，加人200 μ L的IM IPTG，并在30°C温度下，120rpm诱导表达10-12h。用高速冷冻离心机将培养液在4°C下一下以13000rpm离心15min，收集菌体。用50mL超纯水洗漆并在4°C下一下以13000rpm离心15min,回收菌体,接着用20mLIXBinding Buffer 重悬(0.5M NaCl, 20mM Tris_HCl，5mM imidazole，ρΗ7· 9)，在冰水浴中，用超声波破碎机破碎细菌细胞，并在4°C下13000rpm离心15min，得到含木糖苷酶Tthxylo的粗提液。粗提液先经70°C加热处理30min的热处理，除去不耐热的杂蛋白，再用Ni-NTA亲和层析柱进行纯化(方法见His-Bind Kits,Novagen)。纯化酶纯度的鉴定和分子量的测定采用SDS-PAGE方法进行，结果见图1，I即为化过后的Tth xylo蛋白，分子量约为85 kDa，与理论值相近。实施例5重组木糖苷酶Tth xylo的酶学性质分析
酶活定义为1 min内催化4-硝基苯基-β -D-吡喃木糖苷(ρΝΡΧ)产生I μ mo I对硝基苯酚(pNP)所需的酶量。( I)最适温度
用PH值为6.0的0. IM咪唑-邻笨二甲酸氢钾缓冲液稀释实施4制得的纯酶液，用稀释后的酶液进行酶活测定。酶活测定反应体系为200 μ L，20mM的4-硝基苯基-β -D-吡喃木糖苷(PNPX) 10 μ L，180 μ L 0. IM咪唑-邻笨二甲酸氢钾缓冲液和10 μ L稀释酶液组成；反应体系的pH为6. O。将反应体系在60-1001温育201^11后，加入60(^1^ IM Na2CO3试剂终止反应，测定410nm的吸光值。实验设3次重复，取平均值作图，结果如图2所示，研究结果表明在95°C时，木糖苷酶具有最高的酶活性，为117. 6 U/mg ;将此温度下的酶活反应体系的吸光值最为相对活性100%，其它温度下酶活反应体系的吸光值与此最高酶活性体系的吸光值作为相对活性。其中，在温度75-100°C的反应体系中酶活性较高。(2)最适 pH
酶活测定反应体系为200 μ L，20mM的4-硝基苯基-β -D-吡喃木糖苷(ρΝΡΧ) 10 μ L，180 μ L ρΗ4. 0-ρΗ8. 5的0. IM咪唑-邻笨二甲酸氢钾缓冲液和10 μ L稀释酶液(同上)组成。将反应体系在95°C温育20 min后，加入600 μ L IM Na2CO3试剂终止反应，测定410nm的吸光值，实验设3次重复实验，取平均值。结果如图3所示，研究结果表明，在pH为6. O时，木糖苷酶具有最高的酶活性，为117.6 U/mg;将此pH值下的酶活反应体系的作为相对活性100%，其它pH值下酶活反应体系的吸光值与此最高酶活性体系的吸光值的比值作为相对活性。在PH5. 0-7. 5的条件下，酶活较高。( 3 )重组酶热稳定性
用PH值为6. O的O. IM咪唑-邻笨二甲酸氢钾缓冲液稀释实施例4制得的纯酶液，用稀释后的酶液进行酶活测定。将稀释酶液在75°C、80°C、85°C、90°C和95°C分别水浴30 min、60 min,90 min和120 min，测定酶的残存酶活。酶活测定反应体系中pH为6. 0，测定温度为95°C。实验设3次重复，取平均值。结果如图4所示，研究结果显示，85 °C处理I h未见酶活下降，可见该木聚糖在85°C条件下热稳定非常好，该酶在75°C温育2 h酶活未见下降。实施例6重组木糖苷酶Tth xylo的应用研究
重组木糖苷酶Tth xylo对木寡糖的降解研究,具体步骤如下所述 (I)用pH6. O的上述缓冲液配制1%木二糖、木三糖及木四糖各lmL，混匀后形成1%的混合液。吸取100 μ L混合液，加入上述的缓冲溶液90 μ L与含10 μ L的纯化酶于100 μ L的反应体系中，75 °C水浴震荡O. 5h、lh、2h和3h。(2)分别收集上述lh、2h、3h和4h水解液于_20°C的冰箱中保存。(3)配置上述水解液适宜的TLC的展层剂和显色剂，展层剂中正丁醇乙酸水=2 I :1，显色剂为将Ig的3，5-二羟基甲苯加入到IOOmL的硫酸/甲醇溶液(2 8)中配制而成。(4)用毛细吸管蘸取少量的1%的木I-木4糖的混合液及上述样品，分别点至宽度为10cm、长度为20cm的玻璃娃胶板上，点完样后用吹分机吹干并将娃胶板放置于上述展层剂的层析缸中。(5) 3h后取出玻璃板先风干，再放置于100°C的干燥箱中烘干，在通风橱中用喷壶将硅胶板均匀喷洒，接着在再放置于100°c的干燥箱中烘干。结果如图5所示，M为木I-木4的标准样品，1、2、3和4分别为O. 5h、lh、2h和3h
的水解液。研究结果表明，重组木糖苷酶Tth xylo可以快速有效地将木二糖、木三糖及木四糖降解为木糖。因此，此木糖苷酶Tth xylo适用于玉米秸杆等原料的木糖生产。
权利要求
1.一种极耐热木糖苷酶，其特征在于氨基酸序列如SEQ NO 1所示。
2.一种极耐热木糖苷酶，其特征在于氨基酸序列为权利要求I所述的SEQ NO 1序列中的氨基酸经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失及添加形成的具有木糖苷酶活性的衍生蛋白质。
3.一种编码权利要求I所述的极耐热木糖苷酶的基因，其特征在于DNA序列如SEQNO 2所示。
4.一种可表达权利要求I所述的极耐热木糖苷酶的重组体系，其特征在于在所述的重组体系上克隆有如SEQ NO 2所示的DNA序列；所述的重组体系包括重组质粒和重组菌。
5.一种扩增权利要求3所述的编码极耐热木糖苷酶的基因的方法，其特征在于所使用的引物对为Xylo-I :5’ - GGAATTCCATATGGATCTTTACAAGAATCCAAATGTAC-3’ ；Xylo-2 :5’ -CCGCTCGAGCTCGATCTTTGTATTTGTGAAGAAAAC-3’。
6.权利要求I或2所述的极耐热木糖苷酶在酶解木寡糖中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于酶解反应温度为75-100°C，pH5.0-7. 5。
8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于所述的木寡糖来源于纤维原料中的半纤维素，包括木二糖、木三糖和木四糖。
9.权利要求4所述的重组体系在酶解木寡糖中的应用。
10.权利要求I所述的极耐热木糖苷酶在酶解玉米秸杆的木寡糖中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种极耐热木糖苷酶及其编码基因和应用，该极耐热木糖苷酶的氨基酸序列如SEQNO1所示。该木糖苷酶具有优良的耐热性能。在95℃、pH为6.0的条件下酶活性最高，比酶活达到117.6U/mg；该蛋白酶在温度为75-100℃、pH为5.0-7.5的范围内，均具有较高的酶活。该木糖苷酶的耐热性能极高，在85℃反应体系中，保温1h酶活性基本保持不变。上述特性使得本发明得到的木糖苷酶比现有木糖苷酶具有更大的优越性，适用于80℃以上高温、偏中性的pH条件下木寡糖的降解，具有潜在的工业应用价值。
文档编号C12P19/14GK102864132SQ201210333818
公开日2013年1月9日 申请日期2012年9月11日 优先权日2012年9月11日
发明者王飞, 时号, 李迅, 钱方军 申请人:南京林业大学, 沭阳祥泰生物能源科技有限公司