专利名称：一种极耐热木聚糖酶基因及其表达蛋白与应用的制作方法
技术领域：
本发明属于基因工程技术及生物质利用领域，具体涉及一种极耐热木聚糖酶基因及其表达蛋白与应用。
背景技术：
木聚糖是植物细胞壁半纤维素的主要成分，是除纤维素之外自然界中最为丰富的可再生资源。木聚糖酶是木聚糖降解酶系中的最为关键的多糖水解酶，通过随机切割木聚糖的β-1，4-糖苷键，将木聚糖水解为木寡糖、低聚木糖及少量的木糖和阿拉伯糖。由于木聚糖酶在造纸工业中纸浆的预漂白、作为添加剂动物提高饲料及烘焙食品的质量及以木聚糖为原料生产功能性低聚木糖等方面都体现出优良特性，因此可作为一种高效的工业酶制 剂。
发明内容
发明目的针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一种极耐热木聚糖酶基因，以使其满足使用要求。本发明的另一目的是提供一种上述极耐热木聚糖酶基因的表达蛋白。本发明还有一目的是提供上述一种极耐热木聚糖酶基因的应用。技术方案为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下
一种极耐热木聚糖酶基因，其DNA序列如SEQ NO 1所示。上述的极耐热木聚糖酶基因表达的极耐热木聚糖酶，其氨基酸序列如SEQ NO 2所示。一种极耐热木聚糖酶，氨基酸序列为权利要求2所述的SEQ NO :2序列中的氨基酸经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失及添加形成的具有木聚糖酶活性的衍生蛋白质。一种重组体系，在所述的重组体系上克隆有如SEQ NO 1所示的DNA序列；所述的重组体系包括重组质粒和重组菌。一种用于扩增极耐热木聚糖酶基因的引物，所使用的引物对为
Tth-I :5’ -GGAATTCCATATGGCAGTTGTGGCAAACTACGATTTTGAGAC-3’ ；
Tth-2 :5’ -CCGCTCGAGCTTAGTCAGGATCAGGTTG-3’ 。上述的极耐热木聚糖酶在酶解木聚糖中的应用。酶解反应温度为70-100°C，PH5. 5-8. 5。所述的木聚糖来源于纤维原料中的半纤维素，包括榉木木聚糖、桦木木聚糖和燕麦木聚糖。上述的重组体系在酶解木聚糖中的应用。上述的极耐热木聚糖酶在酶解玉米秸杆中的应用。有益效果与现有技术相比，本发明所提供的木聚糖酶具有极强的耐热性能和中性pH条件下高活性的特性，在95°C、pH7. O的条件下酶活性最高，比酶活达到145. 8U/mg ；该蛋白酶在温度为70°C -100°C、pH为5. 5-8. 5的范围内，均具有较高的酶活。该木聚糖酶的耐热性能极高，在85°C、添加终浓度为5mM Ca2+的反应体系中，保温2h酶活性保持不变。上述特性使得本发明得到的木聚糖酶比现有木聚糖酶具有更大的优越性，适用于80°C以上高温、中性PH条件下半纤维素的降解，具有潜在的工业应用价值。
图I是木聚糖酶Tth xynlOA的SDS-PAGE蛋白电泳 图2是Tth xynlOA的最适温度结果 图3是Tth xynlOA的最适pH结果 图4是Tth xynlOA的热稳定性结果 图5是Tth xynlOA降解玉米秸杆半纤维素TLC图。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明。以下实施例中所使用的材料、试剂等，若无特殊说明，均可从商业途径获得。实施例I木聚糖酶基因Tth xynlOA的制备
可采用如下人工合成的方式制备似基因，也可以以thermarum的总DNA为模版通过PCR的方式得到。本研究的木聚糖酶基因RA 似通过上海捷瑞生物工程有限公司合成，基因序列如SEQ NO 1所示
实施例2木聚糖酶基因Tth xynlOA的亚克隆 用下述引物对PCR扩增实施例I中的木聚糖酶基因
Tth-I :5’ -GGAATTCCATATGGCAGTTGTGGCAAACTACGATTTTGAGAC-3’ ；
Tth-2 :5’ -CCGCTCGAGCTTAGTCAGGATCAGGTTG-3’ ；
上述引物合成时，Tth-I引入Nde I酶切位点，Tth-2引入Xho I酶切位点。PCR 反应体系I μ L T. thermarum 基因组 DNA, 1μ L Tth-1, IuL Tth-2, 25 μ LPremix ExTaq, 22 μ L 超纯水。PCR 反应条件94°C变性 5min ;94°C变性 30sec，52°C退火 30sec，72°C延伸 3min，30Cycles ;72°C延伸 IOmin ;4°C保温。PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测产量和特异性，并用PCR产物回收试剂盒进行纯化(BIOMIGA，上海)。实施例3重组克隆、表达载体pET-20b-7iA xynlOA的构建与验证
将纯化过的PCR产物(实施例2制备)、pET-20b (Novagen)用分别Nde I和Xho I双酶切，琼脂糖电泳回收酶切酶切PCR及载体大片段。割胶回收后的目的片段与载体，经浓缩加入8yL无菌水重悬，加入IyL IOXLigase Buffei^PlyL Ligase，于16°C连接过夜。用连接反应产物转化大肠杆菌pET-20b，然后涂于含IOOy g/mL Amp (氨苄青霉素)的培养皿，37°C培养 10-12h。从转化平板上挑取多个单菌落，采用BIOMIGA的质粒小量提取试剂盒提取质粒。对获得的质粒双酶切验证并对获得的重组质粒进行测序。测序结果显示，pET-20b载体中插入了所克隆的目的片段(核苷酸长度为3474bp)，进而得到重组克隆、表达载体pET-20b-RAxynlOAAth xynlOA的DNA序列如SEQ NO :1所示,其表达的蛋白(极耐热木聚糖酶)的氨基酸序列如SEQ NO 2所示，将该蛋白命名为Tth XynlOA0实施例4重组木聚糖酶Tth xynlOA的表达与纯化
将重组克隆、表达载体pET-20b-RA xynlOA (实施例3制备)电转至宿主菌疋coliBL21(DE3) (Novagen)，获得含有重组质粒的重组菌。将单菌落的重组菌接种于5mL含有100 μ g/ml氨节青霉素的Luria-Bertani broth (LB)培养基,在37°C温度下,200rpm震荡培养8-12h。将上述4mL菌液接种于含400mL培养基的IOOOmL摇瓶中，37°C温度下，200rpm震荡培养，当吸光度达到O. 6-0. 8时，加人200 μ L的IM IPTG，并在30°C温度下，120rpm诱导表达10-12h。用高速冷冻离心机将培养液在4°C下一下以13000rpm离心15min，收集菌体。用50mL超纯水洗漆并在4°C下一下以13000rpm离心15min,回收菌体,接着用20mLIXBinding Buffer 重悬(0.5M NaCl, 20mM Tris_HCl，5mM imidazole，ρΗ7· 9)，在冰水浴中，用超声波破碎机破碎细菌细胞，并在4°C下13000rpm离心15min，得到含木聚糖酶TthxynlOA的粗提液。粗提液先经70°C加热处理30min的热处理，除去不耐热的杂蛋白，再用Ni-NTA亲 和层析柱进行纯化(方法见His-Bind Kits,Novagen)。纯化酶纯度的鉴定和分子量的测定采用SDS-PAGE方法进行，结果见图1，SI表示pET_20b空质粒表达出的蛋白，S2表示经粗提液中的Tth xynlOA蛋白，S3表示纯化过后的Tth xynlOA蛋白，分子量约为130kDa,与理论值相近。实施例5重组木聚糖酶Tth xynlOA的酶学性质分析
酶活定义为lmin内催化榉木木聚糖(sigma)产生Iymol木糖所需的酶量。( I)最适温度
用PH值为7. O的0. IM咪唑-邻笨二甲酸氢钾缓冲液稀释实施4得到的纯酶液，用稀释后的酶液进行酶活测定。酶活测定反应体系为200 μ L，由1%榉木木聚糖100 μ L，90 μ L
0.IM咪唑-邻笨二甲酸氢钾缓冲液和10 μ L稀释酶液组成；反应体系的pH为7. O。将反应体系在60-100°C温育IOmin后，加入300 μ L DNS试剂终止反应，沸水浴5min后测定550nm的吸光值。实验设3次重复，取平均值作图，结果如图2所示，研究结果表明在95°C时，木聚糖具有最高的酶活性，为145. 8U/mg ;将此温度下的酶活反应体系的吸光值最为相对活性100%，其它温度下酶活反应体系的吸光值与此最高酶活性体系的吸光值作为相对活性。其中，在温度80-100°C的反应体系中酶活性较高。(2)最适 pH
酶活性测定体系为200 μ L，由1%榉木木聚糖100 μ L，ρΗ4. 0-8. O的90 μ L 0. IM咪唑-邻笨二甲酸氢钾缓冲液和IOyL稀释酶液组成。将反应体系在95°C温育IOmin后，力口Λ 300 μ L DNS试剂终止反应，沸水浴5min后测定550nm的吸光值，实验设3次重复实验，取平均值。结果如图3所示，研究结果表明，在pH为7.0时，木聚糖酶具有最高的酶活性，为145. 8U/mg ;将此pH值下的酶活反应体系的作为相对活性100%，其它pH值下酶活反应体系的吸光值与此最高酶活性体系的吸光值的比值作为相对活性。在PH5. 5-8. 5的条件下，酶活较高。(3)重组酶热稳定性
用PH值为7. O的0. IM咪唑-邻笨二甲酸氢钾缓冲液稀释实施例4得到的纯酶液，用稀释后的酶液进行酶活测定。通过对此酶的结构分析，该酶需要Ca2+维持其热稳定性，所以酶热稳定的反应体系为200 μ L，由1%榉木木聚糖100 μ L，88 μ L O. IM咪唑-邻笨二甲酸氢钾缓冲液，2yL IOOmM CaCl2和10 μ L稀释酶液组成。将稀释酶液在85°C、90°C和95°C水浴30min、60min、90min和120min，测定酶的残存酶活。酶活测定反应体系中pH为7.0，测定温度为95°C。实验设3次重复，取平均值。结果如图4所示，研究结果显示，85°C处理2h未见酶活下降，可见该木聚糖在85 °C条件下热稳定非常好。实施例6重组木聚糖酶Tth xynlOA降解木聚糖的应用研究
将重组木聚糖酶Tth xynlOA再分别作用于榉木木聚糖、桦木木聚糖和燕麦木聚糖。分别在含有20g/L的上述3种木聚糖溶液中，加入5mg的纯化酶(实施例4制备所得)，在85°C的温度条件下水解lh，经离子色谱检测，木聚糖转化生成木糖至木六糖的比率分别为98. 3%，85. 6%及42. 2%，如表I所示。以上研究结果表明该木聚糖酶对桦木木聚糖和榉木木聚糖的降解性能要明显强于燕麦木聚糖，因此，该酶特别适用于与桦木木聚糖、榉木木聚糖结构组成相似的半纤维素原料的降解。 表I重组木聚糖酶Tth xynlOA对榉木、桦木和燕麦木聚糖的降解
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实施例7重组木聚糖酶Tth xynlOA降解玉米秸杆半纤维素的应用研究 重组木聚糖酶Tth xynlOA对玉米稻杆半纤维的降解研究,具体步骤如下所述
(I)将玉米秸杆用粉碎机粉碎，残渣干燥后，取IOg加入IOOmL的l%NaOH于85°C水浴震荡lh。用水将处理后的纤维原料洗至中性，再放置干燥箱中干燥。(2)称取O. 5g的干燥的纤维原料，加入上述的缓冲溶液20mL与Img的纯化酶于20mL的反应体系中，85 °C水浴震荡lh、2h、3h和4h。(3)分别收集上述lh、2h、3h和4h水解液50yL，13000rpm，20°C条件下离心IOmin,收集上清并于_20°C的冰箱中保存。(4)配置上述水解液适宜的TLC的展层剂和显色剂，展层剂中正丁醇乙酸水=2 I :1，显色剂为将Ig的3，5-二羟基甲苯加入到IOOmL的硫酸/甲醇溶液(2 8)中配制而成。(5)用毛细吸管蘸取少量的1%的木I-木4糖的混合液及上述样品，分别点至宽度为10cm、长度为20cm的玻璃娃胶板上，点完样后用吹分机吹干并将娃胶板放置于上述展层剂的层析缸中。(6) 3h后取出玻璃板先风干，再放置于100°C的干燥箱中烘干，在通风橱中用喷壶将硅胶板均匀喷洒，接着在再放置于100°c的干燥箱中烘干。结果如图5所示，M为木I-木4的标准样品，1、2、3和4分别为lh、2h、3h和4h的
水解液。研究结果表明，重组木聚糖酶Tth xynlOA可以快速有效地将玉米秸杆降解为低聚木糖，其中木二糖的含量超过50%。
权利要求
1.一种极耐热木聚糖酶基因，其DNA序列如SEQ NO 1所示。
2.权利要求I所述的极耐热木聚糖酶基因表达的极耐热木聚糖酶，其氨基酸序列如SEQ NO 2 所示。
3.一种极耐热木聚糖酶，其特征在于氨基酸序列为权利要求2所述的SEQ N0:2序列中的氨基酸经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失及添加形成的具有木聚糖酶活性的衍生蛋白质。
4.一种重组体系，其特征在于在所述的重组体系上克隆有如SEQ NO :1所示的DNA序列；所述的重组体系包括重组质粒和重组菌。
5.一种用于扩增权利要求I所述的极耐热木聚糖酶基因的引物，其特征在于所使用的引物对为Tth-I :5’ -GGAATTCCATATGGCAGTTGTGGCAAACTACGATTTTGAGAC-3’ ；Tth-2 :5’ -CCGCTCGAGCTTAGTCAGGATCAGGTTG-3’ 。
6.权利要求2所述的极耐热木聚糖酶在酶解木聚糖中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于酶解反应温度为70-100°C，pH5.5-8. 5。
8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于所述的木聚糖来源于纤维原料中的半纤维素，包括榉木木聚糖、桦木木聚糖和燕麦木聚糖。
9.权利要求4所述的重组体系在酶解木聚糖中的应用。
10.权利要求2所述的极耐热木聚糖酶在酶解玉米秸杆中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种极耐热木聚糖酶基因及其表达蛋白与应用，该极耐热木聚糖酶基因的DNA序列如SEQ NO1所示。极耐热木聚糖酶基因表达的极耐热木聚糖酶的氨基酸序列如SEQ NO2所示。该极耐热木聚糖酶具有极强的耐热性能和中性pH条件下高活性的特性，在95℃、pH7.0的条件下酶活性最高，比酶活达到145.8U/mg；该蛋白酶在温度为70-100℃、pH为5.5-8.5的范围内，均具有较高的酶活。该木聚糖酶的耐热性能极高，在85℃、添加终浓度为5mMCa2+的反应体系中，保温2h酶活性保持不变。上述特性使得本发明得到的木聚糖酶比现有木聚糖酶具有更大的优越性，适用于80℃以上高温、中性pH条件下半纤维素的降解，具有潜在的工业应用价值。
文档编号C12N1/15GK102864161SQ201210333819
公开日2013年1月9日 申请日期2012年9月11日 优先权日2012年9月11日
发明者王飞, 时号, 李迅 申请人:南京林业大学