专利名称：一种胞外生产重组β-环状糊精转移酶的生产方法
技术领域：
本发明属于发酵工程技术领域，具体来说是用培养重组大肠杆菌生产β-环状糊精葡萄糖基转移酶( β -CGT酶)的生产方法。
背景技术：
环状糊精葡萄糖基转移酶(简称CGT酶)是一种能够通过分子内转移糖基反应转化淀粉及相关基质合成环糊精(CDs)的胞外酶，根据生成的主要产物可大致分为α-、β-、Y-三种类型。环状糊精一般分类为α-、β-、Υ-、δ-、ε-、ζ -及11-0)，分别由6、7、8、9、10、11及12个葡萄糖单元组成，其中研究最多且应用最广的是α-、β-、Υ-⑶。目前β -⑶的应用最广泛,这是由于β -⑶的孔径适中，性质稳定。环糊精是一种具有内疏水外亲水的筒状结构，能和许多疏水客体化合物或功能基团包结在其环形疏水空隙内，从而改变了客体物质的物理、化学或生物学性质，以此特性为基础衍生出环糊精的包埋、包合技术，致使其在轻工、农业、化工、环保、食品领域尤其是作为食品添加剂方面应用性很广。因此大规模生产β_⑶有重要的意义。现有的生产β -⑶的主要方法是酶生产法，想要提高β -⑶的产率、降低制作成本，必须大幅度的提高β-CGT酶的产率，目前国外对β-CGT酶的研究较多，国内关于这方面的研究不太成熟，主要包括筛选和诱变野生菌种、产酶发酵条件优化等，基因工程菌的研究不多。国内能够生产β_⑶不多，生产的β-CGT酶只能自给自足，且相比日本、德国、法国等国家产量不高，价格较贵且纯度不高，国内环糊精的供需也多依靠进口。产β -CGT酶的微生物种类很多，现在工业上生产环糊精所用的CGT酶大都来自芽孢杆菌属，但此类菌产CGT酶的能力非常低，不能满足环糊精的制备需求。为了解决野生菌种产CGT酶能力较低这个问题，运用基因工程将有关CGT酶基因在其他宿主菌种表达成为如今研究开发的热点。
发明内容
本发明的目的是提供一种高效胞外表达β -环绕糊精转移酶的生产工艺，以解决发酵工艺中酶活不高，工业应用成本高等难题。本发明成功构建含有表达载体pET28(+)-cgt并转化疋Cb7i BL21(DE3)宿主菌，通过摇瓶发酵条件优化，成功实现了 β -CGT酶的高效胞外表达，为其大规模生产奠定了基础。(I)菌株(大肠杆菌)以Ε. Coli BL21 (DE3) (pET28 (+) /cgt)为出发菌株(谢振荣，赵三军，唐湘华等.來M PaenibaciIIus sp.的β -环糊精葡萄糖基转移酶基因的克隆及在大肠杆菌中的表达[J].食品科技，2010，35(11) : 16^19.)；
(2)种子培养阶段将_80°C甘油保藏的菌株接入种子培养基，使用恒温培养摇床培养12小时，转速150rpm，温度35 37°C ;
(3)发酵阶段按照1-2%的接种量接种至200ml液体发酵培养基中，放于恒温摇床中发酵培养，温度控制在35-37°C，转速控制在150-160rpm，培养6_8个小时；
(4)诱导阶段当菌体0D_达到I. 4-1. 6时，加入乳糖诱导，保证乳糖的终浓度为4 6g/L，温度保持在35-37°C，转速提高至170-180rpm，诱导8_9个小时后过滤，所得液体即为β-环糊精葡萄糖基转移酶粗酶液。所述大肠杆菌疋Cb7i BL21(DE3) (pET28(+)_cgt)的构建方法为将来源于Paenibacillus sp. XW-6-66的β -环糊精葡萄糖基转移酶基因(谢振荣，赵三军，唐湘华等· PamibeiciIIus sp.的β -环糊精 葡萄糖基转移酶基因的克隆及在大肠杆菌中的表达[J].食品科技，2010，35(11) : 16 19.)插入质粒ρΕΤ28(+)，构建了表达载体pET28(+)/cgt，并将其转化宿主菌疋Coli BL21(DE3)；
所述种子培养基组成为4_6g/L酵母粉，9-llg/L蛋白胨，9-llg/L NaCl，pH 7. 0-7. 2,并含有浓度为O. 05mg/ml的卡那霉素。所述发酵培养基组成为4_6g/L酵母粉，9-llg/L蛋白胨，9-llg/L NaCl，
1-1. 25mmol/L CaCl2, 2-2. 5mmol/L MgSO4. 7H20, pH 7. 0-7. 2，并含有浓度为 0. 05mg/ml 的卡
那霉素。β -环绕糊精转移酶环化酶活测定的具体步骤如下
实验组
(1)0.5mL 1%马铃薯淀粉和O. 4 mL 0.2 mol/L甘氨酸-氢氧化钠缓冲液ρΗ9. O于40°C水浴中预热5 min ；
(2)加入100μ L适当稀释的酶液，40°C水浴中反应20 min ；
(3)加入3.5 mL 30 mmol/L氢氧化钠终止反应,冷却；
(4)加入O.5 mL O. 02% (W/V)酹酞-5 mmol/L碳酸钠溶液显色；
(5)550 nm下测定吸光度值。对照组以不加酶液为对照组，其它同实验组。酶活定义一个酶活定义为上述条件下每分钟生产I mg 环糊精所需要的酶量。酶活力计算公式
QI
酶活力(U/mL ) =— X η χ -
V t
其中，C一 β -环糊精生成量mg ；
V—酶液体积mL ； η—酶液稀释倍数； t一反应时间min。本发明采用两阶段控制工艺，实现了重组大肠杆菌胞外高效表达β -环糊精葡萄糖基转移酶。该工艺与现有的工艺相比步骤少，时间短，适合大规模生产，有效的胞外表达，大大的提闻了生广效率。
图I是分光光度计法测定β -⑶含量的标准曲线。
具体实施例方式实施例I :
1、大肠杆菌厶Coli BL21 (DE3) (pET28 (+) /cgt)的构建将来源 Paenibacillus5/7.XW-6-66的β-环糊精葡萄糖基转移酶基因(谢振荣，赵三军，唐湘华等.来源Paenibacillus sp.的β _环糊精葡萄糖基转移酶基因的克隆及在大肠杆菌中的表达[J].食品科技，2010，35(11) : 16 19.)插入质粒ρΕΤ28(+)，构建了表达载体pET28(+)/cgt，并将其转化宿主菌万.Coli BL21(DE3)；
2、种子培养阶段将-80°C甘油保藏的上述大肠杆菌菌株接入种子培养基中，种子培养基为5g/L酵母粉，10g/L蛋白胨，10g/L NaCl,卡那霉素O. 05mg/ml, ρΗ7·0,使用恒温培养摇床培养12小时，转速150rpm，温度37°C ； 3、发酵阶段按照1%的接种量接种菌株至200ml液体发酵培养基中，发酵培养基为5g/L 酵母粉，10g/L 蛋白腺，10g/L NaCl, I mmol/L CaCl2, 2mmo I/LMgSO4. 7H20,卡那霉素0. 05mg/ml, pH 7. 0，放于恒温摇床中发酵培养，温度控制在37°C，转速控制在160rpm，培养6个小时；
4、诱导阶段当菌体0D_达到I.5时，加入乳糖诱导，保证乳糖的终浓度为5g/L，温度保持在35°C，转速提高至ISOrpm，诱导9个小时后过滤，所得液体即为β-环糊精葡萄糖基转移酶粗酶液，测得环化酶活为7. 121U/ml。实施例2:
I 菌株大肠杆菌疋 Coli BL21(DE3) (pET28 (+)/cgt)；
2种子培养阶段将_80°C甘油保藏的上述大肠杆菌菌株接入种子培养基中，种子培养基5. 5g/L酵母粉，10. 5g/L蛋白胨，10. 5g/L NaCl，卡那霉素O. 05mg/ml, ρΗ7· 2，使用恒温培养摇床培养12小时，转速150rpm，温度37°C ；
3发酵阶段按照2%的接种量接种菌株至200ml液体发酵培养基中，发酵培养基5. 5g/L 酵母粉，10. 5g/L 蛋白胨，10. 5g/L NaCl，I. 2mmol/L CaCl2, 2. 25mmol/L MgSO4. 7H20,卡那霉素0. 05mg/ml, pH 7. 2,放于恒温摇床中发酵培养,温度控制在35°C,转速控制在150rpm，培养8个小时；
4、诱导阶段当菌体0D_达到I. 4时，加入乳糖诱导，保证乳糖的终浓度为5g/L，温度保持在36°C，转速提高至170rpm，诱导9个小时后过滤，所得液体即为β _环糊精葡萄糖基转移酶粗酶液，测得环化酶活为7. 225U/ml。实施例3:
1、菌株大肠杆菌疋Coli BL21(DE3) (pET28 (+)/cgt)；
2、种子培养阶段将-80°C甘油保藏的上述大肠杆菌菌株接入种子培养基中，种子培养为5g/L酵母粉，10g/L蛋白胨，10g/L NaCl,卡那霉素O. 05mg/ml, pH7. I,使用恒温培养摇床培养12小时，转速150rpm，温度37°C ；
3、发酵阶段按照2%的接种量接种菌株至200ml液体发酵培养基中，发酵培养基为5g/L 酵母粉，10g/L 蛋白胨，10g/L NaCl, I. 2mmol/L CaCl2, 2. 5mmol/L MgSO4. 7H20，卡那霉素0. 05mg/ml,pH 7. I,放于恒温摇床中发酵培养,温度控制在36°C,转速控制在150rpm,培养7个小时；
4、诱导阶段当菌体0D_达到1.6时，加入乳糖诱导，保证乳糖的终浓度为5g/L，温度保持在37°C，转速提高至170rpm，诱导8个小时后过滤，所得液体即为β _环糊精葡萄糖 基转移酶粗酶液，测得环化酶活为7. 197U/ml。
权利要求
1.一种胞外生产重组3 -环状糊精转移酶的生产方法，其特征在于采用发酵阶段和诱导阶段分开的生产エ艺，具体步骤如下 (I)以大肠杆菌^ Coli BL21(DE3) (pET28 (+)/cgt)为出发菌株； (2)种子培养阶段将上述菌株接入种子培养基，使用恒温培养摇床培养12小时，转速150rpm，温度 35 - 37°C ； (3)发酵阶段按照1-2%的接种量接种菌株至200ml液体发酵培养基中，放于恒温摇床中发酵培养，温度控制在35-37°C，转速控制在150-160rpm，培养6_8个小时； (4)诱导阶段当菌体OD_达到I.4-1. 6时，加入乳糖诱导，保证乳糖的终浓度为4 一6g/L，温度保持在35-37°C，转速提高至170-180rpm，诱导8_9个小时后过滤，所得液体即为^-环糊精葡萄糖基转移酶粗酶液。
2.根据权利要求I所述的胞外生产重组3-环状糊精转移酶的生产方法，其特征在于种子培养基组成为4_6g/L酵母粉，9-llg/L蛋白胨，9-llg/L NaCl，pH 7.0-7. 2，并含有浓度为0. 05mg/ml的卡那霉素。
3.根据权利要求2所述的胞外生产重组3-环状糊精转移酶的生产方法，其特征在于发酵培养基组成为:4_6g/L酵母粉，9-llg/L/L蛋白胨，9-llg/L NaCl，1_1. 25mmol/LCaCl2, 2-2. 5mmol/L MgSO4. 7H20, pH 7. 0-7. 2，并含有浓度为 0. 05mg/ml 的卡那霉素。
全文摘要
本发明是一种胞外生产重组β-环状糊精转移酶的生产方法。以大肠杆菌E.ColiBL21(DE3)(pET28(+)/cgt)为出发菌株；经种子培养阶段恒温培养摇床培养12小时，再经发酵阶段，按照1-2%的接种量接种菌株至200ml液体发酵培养基中，放于恒温摇床中发酵培养6-8个小时；当菌体OD600达到1.4-1.6时，加入乳糖诱导8-9个小时后过滤，所得液体即为β-环糊精葡萄糖基转移酶粗酶液。整个发酵时间18小时左右，胞外β-环绕糊精转移酶的环化酶活达到7U/ml以上。本发明采用两阶段控制工艺，实现了重组大肠杆菌胞外高效表达β-环糊精葡萄糖基转移酶。该工艺与现有的工艺相比步骤少，时间短，适合大规模生产，有效的胞外表达，大大的提高了生产效率。
文档编号C12R1/19GK102796712SQ20121033396
公开日2012年11月28日 申请日期2012年9月11日 优先权日2012年9月11日
发明者黄遵锡, 宋拓, 李俊俊, 唐湘华, 许波, 杨云娟, 周峻沛 申请人:云南师范大学