专利名称：一种香菇Cr02菌种的分子特异性标记引物及检测方法
技术领域：
本发明涉及一种香菇Cr02菌种的分子特异性标记引物，以及利用该引 物对香菇Cr02菌种进行鉴别和4全测的方法。
(二)
背景技术：
我国香菇产量已从1983年的1.95万吨迅速发展到2005年的242万吨， 占全球香菇总产量的70%以上。有专家预测，由于中国香菇产业的迅猛发 展，在近10年内其将成为世界产量最高的食用菌。中国香菇以其惊人的发 展速度、优良的品质及低廉的成本为世界菇业人士瞩目，中国香菇己风靡 世界。优良菌种对香菇产量和品质的贡献率举足轻重，这决定了香菇菌种 在香菇产业中的重要地位。1999年我国签署了《国际植物新品种保护法》， 这不仅要求我们尊重其它国家的品种知识产权，同时也要加强保护我们国 家自己的品种知识产权。为了建立食用菌新品种登记制度来真正保护我国 的品种产权，必须首先建立成熟的品种鉴定技术，为新品种登记奠定基础。 尤其日本2004年4月1日开始实行《种苗法修正案》，对我国食用菌尤其 是香菇的出口构成了极大的威胁。就国内而言，香菇栽培菌种"同种异名， 异种同名"的现象，不仅给菇农带来了极大的损失，影响了他们的栽培积极 性，也极大地影响了中国香菇的快速发展；而且，随着大规模的工厂化栽 培方式的出现，对香菇栽培菌抹质量的要求越来越高，需要发展更为简便、 快速、准确的菌株鉴定技术，以保证每批次的用种都准确无误。
分子生物学技术的快速发展，特别是分子标记技术的建立与成熟，为 发展简便、快速、准确的菌种鉴定i支术提供了有效手段。不同于常用的
RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA,随才几扩增多态性DNA)和 AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism,扩增片l殳长度多态性) 分子标i己才支术，SCAR ( Sequence CharacterizedAmplified Region,特;f正性片 段扩增区域)标记是一种十分稳定的分子标记，在应用上具有迅速、简便、 低成本的特点。
发明内容
本发明目的是提供一种香菇Cr02菌种的分子特异性标记引物，以及一 种利用该引物对香菇Cr02菌种进行快速鉴定的方法。 本发明采用的技术方案是
一种香菇Cr02菌种的分子特异性标记引物，所述引物序列为 上游引物5 '-TCTCGATGCAAGAAACTTGAA-3'; 下游引物5'画TCGGTCAAAATTAGTCAGGT曙3'。
该引物对是采用PCR^支术，经过大量筛选试-验，采用RAPD标记为引 物获得香菇Cr02菌种的特异性DNA片段,将该片段克隆测序，以得到DNA 序列为基础，所设计的特异性引物，以该引物对香菇Cr02菌种进行PCR 扩增，可获得333bp大小的特异性片段。
本发明还涉及一种对香菇Cr02菌种进行鉴定和检测的方法，所述方法 为提取待测香菇菌种基因组DNA作为模板，以所述分子特异性标记引 物作为扩增引物，进行PCR扩增，对扩增产物进行电泳;险测，若电泳结果 出现333bp的DNA条带，则待测菌种为香菇Cr02菌种；所述分子特异性 标记引物序列为
上游引物5'-TCTCGATGCAAGAAACTTGAA-3'; 下游引物5'-TCGGTCAAAATTAGTCAGGT-3'。
所述方法关键在于扩增引物的选择，DNA提取、PCR反应体系及反应 条件确定，以及电泳4企测，均可按照本领域常规方法进行。 优选的，本发明所述PCR反应体系组成如下 PCR Buffer 终浓度为1 x
lmmol/L 2.5mmol/L
2.5U 各1.25 juM 60ng
dNTPs MgCl2 Taq DNA酶 上、下游引物 模板DNA 余量为ddH20; PCR反应条件如下
94。C预变性6min后；92。C变性40s， 53。C退火40s， 72。C延伸2min， 共30个循环；最后于72。C补平7min，终止温度为4°C。
PCR Buffer终浓度为1 x ,是指PCR Buffer中各组分在反应体系中的 浓度与1 x PCR Buffer相同，通常选用体积为反应体系体积1/10的10 x PCR Buffer。 lOxPCR Buffer成分为100 mM Tris-HCl ( pH8.5 )、 500mMKCl、 25mMMgCl2和1.0% Triton-X-100,溶剂为ddH20。
具体的，本发明所述方法如下
(l)取待测香菇菌种，接种至PDA斜面，25。C培养14d,转接至PD 液体培养基中，25。C下振荡培养14d，收集菌丝，以SDS-CTAB 法提取待测香菇菌种基因组DNA;
(2 )以步骤(1 )提取的基因组DNA为模板，以所述分子特异性标记 引物作为扩增引物，进行PCR扩增
PCR反应体系每20 ji L组成如下:
IOxPCR Buffer
2 juL
10mmol/LdNTPs
2 juL
25mmol/L MgCl:
5U/ ju L Taq DNA酶
0.5 juL
25juM上、下游引物
各1 juL
20ng/ m l模板dna
3 ]Li L
ddH20补足至20 ju L; PCR反应条件如下
94。C预变性6min后；92。C变性40s， 53。C退火40s, 72°。延伸2min, 共30个循环；最后于72。C补平7min,终止温度为4°C;
(3 )取步骤(2 )扩增产物5 n L,与1 ju L 0.25%溴酚兰緩沖液混匀， 点样于1.5%的琼脂糖凝胶上，于1 x TAB緩冲液中、5V/cm电压 下电泳，电泳结束后EB染色，EB染色通常在含0.5吗/ml EB的 水溶液中染色30分钟。于自动凝胶图像分析仪上照相，若电泳结 果出现333bp的DNA条带，则待测菌种为香菇Cr02菌种。
本发明有益效果主要体现在:本发明检测方法与常规形态学检测、拮 抗试验、出菇试验相比，具有检测时间短，准确性高的优点；本发明方法 检测所需时间只要1 3天，而常规的拮抗试验所需要的时间至少两周时间， 出菇试验则需要至少3个月的时间。
图1为对香菇菌种进行PCR扩增的结果；M为DNA分子量标准；C为阴 性对照；箭头所指为从编号为17的香菇Cr02菌种扩增出的分子量为333bp
的特殊DNA条带；其余编号为其它常用的香菇生产菌种。 具体实施例方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围 并不仅限于此
实施例1:
(1)菌丝培养和基因组DNA的提取将低温保藏的香菇菌种转接到 PDA斜面(PDA斜面培养基取去皮马铃薯200克，切成小块，加水1000 毫升煮沸30分钟，滤去马铃薯块，将滤液加水补足至IOOO毫升，加葡萄 糖20克，琼脂15克，溶化后分装，12rC灭菌30分钟，冷却得斜面)上， 25。C下培养。14d后接到100ml PD液体培养基(PD液体培养基取去皮 马铃薯200克，切成小块，加水1000毫升煮沸30分钟，滤去马铃薯块， 将滤液力。水补足至1000毫升，加葡萄糖20克，121。C灭菌30分钟，冷却 即得PD液体培养基)中，25。C下100r/min振荡培养14d,收集菌丝，放 入-2(TC水箱保藏备用。基因组DNA的提取采用SDS-CTAB法，并使用 DNA纯化试剂盒(杭州博日科技有限公司)对提取的DNA进行纯化。纯 化的基因组DNA先用1.5%的琼脂糖凝胶电泳定性检测，再用DNA/RNA 紫外分光光度计定量检测。DNA提取物于-2(TC水箱贮藏备用。
(2 )设计特异PCR扩增引物，引物对的序列为上游引物
5'-TCTCGATGCAAGAAACTTGAA-3' 和 下 游 引 物
5'-TCGGTCAAAATTAGTCAGGT-3',由上海生物工程技术有限公司合成。 (3 )SCAR分子标记的PCR扩增10xPCR Buffer 2pl， 1Ommol/L dNTPs
2jal， 25mmol/L MgCl22(il, 5UV1 Taq DNA酶0.5pl， 25mM特异引物对各l(al,
20ng/)il模板DNA3n1, ddH20补足至20ial。扩增反应在TC-XP型扩增仪上
进行。94。C预变性6min后；92。C变性40s, 53。C退火40s, 72。C延伸2min, 共30个循环；最后于72。C补平7min,终止温度为4。C。
(4)电泳检测取步骤(3) PCR扩增产物5ul，与lul 0.25%溴酚兰 緩冲液混匀，点样于1.5%的琼脂糖凝胶上，于lxTAB緩沖液中，5V/cm 电压下电泳，电泳结束后，在含0.5昭/ml EB的水溶液中染色30分钟，然 后在培清JS-380A自动凝胶图像分析仪上照相。
按照上述方法，分别对多种香菇菌种(编号1 23代表香菇菌种依次 为1:申香2号；2:申香4号3:申香6号；4:申香9号；5:申香7 号；6:申香8号；7:申香10号；8:申香12; 9:苏香；10:武香；11: L26; 12: L03; 13: L66; 14: 241; 15: 241-4; 16:庆科20; 17: Cr02; 18: Cr04; 19:闽丰1号；20:沪农1号；21:浙香939-9; 22:浙香939-6; 23:香九)进行检测，以无菌水为阴性对照，电泳结果见图1。其中编号 17为香菇Cr02菌种，扩增出分子量为333bp的特殊DNA条带，其余编号 为其他常用的香菇生产菌种，未见有333bp特殊DNA条带产生。
序列表—ST25
SEQUENCE LISTING <110>浙江省林业科学研究院
<120〉 一种香菇Cr02菌种的分子特异性标记引物及检测方法
<130>
<160> 2
<170> Patentln version 3.4
<210〉 1
<211〉 21
〈212> DNA
<213> Unknown
<220>
<223〉 人工序列 <400> 1
tctcgatgc3 agaaacttga a 21
<210> 2
<211> 20
<212> 腿
<213> Unknown
<220〉
<223> 人工序列
〈400> 2
tcggtcaaaa ttagtcaggt 20
权利要求
1.香菇CrO2菌种的分子特异性标记引物，所述引物序列为 上游引物5′-TCTCGATGCAAGAAACTTGAA-3′； 下游引物5′-TCGGTCAAAATTAGTCAGGT-3′ 。
2. —种用如权利要求1所述的分子特异性标记引物对香菇Cr02菌种进行 鉴定和检测的方法，所述方法为提取待测香菇菌种基因组DNA作为 才莫^1,以所述分子特异性标记引物作为扩增引物，进4亍PCR扩增，对 扩增产物进行电泳检测，若电泳结果出现333bp的DNA条带，则待测 菌种为香菇Cr02菌种；所述分子特异性标记引物序列为上游引物5'-TCTCGATGCAAGAAACTTGAA-3'; 下游引物5'-TCGGTCAAAATTAGTCAGGT-3'。
3. 如权利要求2所述的方法，其特征在于所述PCR反应体系组成如下 PCR Buffer 终浓度为1 xdNTPs lmmol/L MgCl2 2.5mmol/L Taq DNA酶 2.5U 上、下游引物 各1.25"M 模板DNA 60ng 余量为ddH20; PCR反应条件如下94。C预变性6min后；92。C变性40s, 53。C退火40s, 72。C延伸2min, 共30个循环；最后于72。C补平7min，终止温度为4°C。
4. 如权利要求3所述的方法，其特征在于所述方法如下(1 )取待测香菇菌种，接种至PDA斜面，25。C培养14d，转接至PD 液体培养基中，25。C下振荡培养14d,收集菌丝，以SDS-CTAB 法提取待测香菇菌种基因组DNA;(2 )以步骤(1 )提取的基因组DNA为模板，以所述分子特异性标记引物作为扩增引物，进行PCR扩增 PCR反应体系每20 )i L组成如下 10 xpCR Buffer 2juL 10mmol/LdNTPs 2pL 25mmol/L MgCl2 2 |u L5U/ p L Taq DNA酶 0.5 ju L 25jaM上、下游引物 各ljuL 20ng/ ja L模板DNA 3 |a LddH20补足至20 ja L; PCR反应条件如下94。C预变性6min后；92。C变性40s, 53"C退火40s, 72。C延伸2min， 共30个循环；最后于72。C补平7min,终止温度为4°C;(3)取步骤(2)扩增产物5jaL,与1 laL0.25。/。溴酚兰緩冲液混匀， 点样于1.5%的琼脂糖凝胶上，于1 xTAB緩冲液中、5V/cm电压 下电泳，电泳结束后用EB染色，于自动凝胶图像分析仪上照相， 若电泳结果出现333bp的DNA条带，则待测菌种为香菇Cr02菌 种。
5. 如权利要求3所述的方法，其特征在于所述EB染色为在含0.5(ig/ml EB 的水溶液中染色30分钟。
全文摘要
本发明提供了一种香菇Cr02菌种的分子特异性标记引物，以及利用该引物对香菇Cr02菌种进行鉴别和检测的方法。所述引物序列为上游引物5′-TCTCGATGCAAGAAACTTGAA-3′，下游引物5′-TCGGTCAAAATTAGTCAGGT-3′。本发明有益效果主要体现在本发明检测方法与常规形态学检测、拮抗试验、出菇试验相比，具有检测时间短，准确性高的优点；本发明方法检测所需时间只要1～3天，而常规的拮抗试验所需要的时间至少两周时间，出菇试验则需要至少3个月的时间。
文档编号C12N15/11GK101363055SQ20081012031
公开日2009年2月11日 申请日期2008年8月25日 优先权日2008年8月25日
发明者付立忠, 吴学谦, 吴庆其, 李海波, 程俊文, 亮 贺, 魏海龙 申请人:浙江省林业科学研究院