专利名称：一种香菇香九菌种的分子特异性标记引物及检测方法
技术领域：
本发明涉及一种香菇香九菌种的分子特异性标记引物，以及利用该引
物对香菇香九菌种进行鉴别和^r测的方法。
(二)
背景技术：
香菇因其美味和具有重要的食、药用价值而倍受国内外消费者的喜 爱，是我国商业化生产规模最大和世界上产量仅次于双孢蘑菇的食用菌。 我国是世界人工栽培香菇的发源地和香菇产量最大的国家，有着丰富的香 菇种质资源。菌种是香菇生产的前提，直接影响着香菇的产量和品质。由 于我国食用菌菌种鉴定与检测技术研究的落后和菌种行政管理机构与法 规的不健全，存在菌种"多、杂、乱、散"的状况，"异种同名、同种异名" 现象普遍存在，因此，建立科学、可靠、快速、简便的菌种鉴定体系极为 重要。
分子生物学技术的快速发展,特别是分子标记和基因标记技术的建立 与成熟，为发展筒便、快速、准确的菌林鉴定技术提供了有效手段。SCAR (特征性片段扩增区域)标记是1993年由Paran和Michelmore在RAPD 基础上提出的，它基于对特异RAPD片段的测序，根据两端序列设计一 对18 24碱基的引物，在较高的退火温度下进行特异扩增实现的，其专 一性引物的采用排除了随机引物结合位点之间的竟争，因而它是一种十分 稳定的分子标记，在应用上具有迅速、简便、低成本的特点。
(三)
发明内容
本发明目的是提供一种香菇香九菌种的分子特异性标记引物，以及一
种利用该引物对香菇香九菌种进行快速鉴定的方法。
本发明采用的技术方案是
一种香菇香九菌种的分子特异性标记引物，所述引物序列为
上游引物5'隱AGGCAGGCCCATCATTTC國3'
下游引物5'-TTGCAGGCAGCAGTAGAATG國3'。
该引物对是采用PCR技术，经过大量筛选试-睑，采用RAPD标记为 引物获得香菇香九菌种的特异性DNA片段，将该片段克隆测序，以得到 DNA序列为基础，所设计的特异性引物，以该引物对香菇香九菌种进行 PCR扩增，可获得582bp大小的特异性片^:。
本发明还涉及一种对香菇香九菌种进行鉴定和检测的方法，所述方法 为提取待测香菇菌种基因组DNA作为模板，以所述分子特异性标记引 物作为扩增引物，进行PCR扩增，对扩增产物进行电泳检测，若电泳结 果出现582bp的DNA条带，则待测菌种为香菇香九菌种；所述分子特异 性标记引物序列为
上游引物5 '-AGGCAGGCCCATCATTTC画3'
下游引物5 '-TTGCAGGCAGCAGTAGAATG-3'。
所述方法关键在于扩增引物的选择，DNA提取、PCR反应体系及反 应条件确定，以及电泳检测，均可按照本领域常规方法进行。
优选的，本发明所述PCR反应体系组成如下
PCR Buffer 终浓度为1 x
dNTPs lmmol/L
MgCl2 2.5mmol/L
Taq DNA酶 2.5U
上、下游引物 各1.25juM 模板DNA 60ng 余量为ddH20; PCR反应条件如下
94。C预变性6min后；92。C变性40s, 38。C退火40s， 72。C延伸2min， 共30个循环；最后于72。C补平7min,终止温度为4°C。
PCR Buffer终浓度为1 x ,是指PCR Buffer中各组分在反应体系中的 浓度与1 x PCR Buffer相同，通常选用体积为反应体系体积1/10的10 x PCRBuffer。 lOxPCR Buffer成分为100 mM Tris-HCl (pH8.5 )、 500 mM KCl、 25 mMMgCl2和1.0%Triton-X-100，溶剂为ddH20。
具体的，本发明所述方法如下
(1) 取待测香菇菌种，接种至PDA斜面，25。C培养14d，转接至PD 液体培养基中，25。C下振荡培养14d,收集菌丝，以SDS-CTAB 法提取待测香菇菌种基因组DNA;
(2) 以步骤(1)提取的基因组DNA为模板，以所述分子特异性标 记引物作为扩增引物，进行PCR扩增
PCR反应体系每20 |i L组成如下
10 x PCRBuffer 2|aL
lOmmol/LdNTPs 2|uL
25mmol/L MgCl2 2 ji L
5U/ ji L Taq DNA酶 0.5 ju L
25liM上、下游引物 各1 jaL 20ng/ ju L模板DNA 3 " LddH20补足至20 juL; PCR反应条件如下
94。C预变性6min后；92。C变性40s, 38。C退火40s, 72。C延伸2min, 共30个循环；最后于72。C补平7min,终止温度为4°C;
(3)取步骤(2)扩增产物5juL,与1 juL0.25。/。溴酚兰緩沖液混匀， 点样于1.5%的琼脂糖凝胶上，于1 xTAB緩冲液中、5V/cm电 压下电泳，电泳结束后EB染色，EB染色通常在含0.5吗/ml EB 的水溶液中染色30分钟。于自动凝胶图像分析仪上照相，若电 泳结果出现582bp的DNA条带，则待测菌种为香菇香九菌种。
本发明有益效果主要体现在本发明检测方法与常规形态学检测、拮 抗试验、出菇试验相比，具有检测时间短，准确性高的优点；本发明方法 检测所需时间只要1~3天，而常规的拮抗试验所需要的时间至少两周时 间，出菇试验则需要至少3个月的时间。
(四)
图l为对香菇菌种进行PCR扩增的结果；M: Marker,即DNA分子量 标准；CK:阴性对照；1:申香2号；2:申香4号3:申香6号；4:申 香9号；5:申香7号；6:申香8号；7:申香10号；8:申香12; 9: 苏香；10:武香；11: L26; 12: L03; 13: L66; 14: 241; 15: 241-4; 16:庆科20; 17: Cr02; 18: Cr04; 19:闽丰1号；20:沪农1号；21: 浙香939-9; 22:浙香939-6; 23:香九；箭头所指为编号为23的香菇香 九菌林扩增出的分子量为582bp的特殊DNA条带。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述,但本发明的保护范围
并不仅限于此 实施例1:
(1 )菌丝培养和基因组DNA的提取将低温保藏的香菇菌种转接 到PDA斜面(PDA斜面培养基取去皮马铃薯200克，切成小块，加水 1000毫升煮沸30分钟，滤去马铃薯块，将滤液加水补足至1000毫升， 加葡萄糖20克，琼脂15克，溶化后分装，121。C灭菌30分钟，冷却得斜 面)上，25。C下培养。14d后接到100mlPD液体培养基(PD液体培养基 取去皮马铃薯200克，切成小块，加水1000毫升煮沸30分钟，滤去马铃 薯块，将滤液加水补足至1000毫升，加葡萄糖20克，121。C灭菌30分钟， 冷却即得PD液体培养基)中，25。C下100r/min振荡培养14d,收集菌丝， 放入-2(TC水箱保藏备用。基因组DNA的提取采用SDS-CTAB法，并使 用DNA纯化试剂盒(杭州博日科技有限公司)对提取的DNA进行纯化。 纯化的基因组DNA先用1.5%的琼脂糖凝胶电泳定性#:测，再用 DNA/RNA紫外分光光度计定量检观'J。DNA提取物于-20。C冰箱贝i藏备用。
(2) 设计特异PCR扩增引物，引物对的序列为上游引物5'-AGGCAGGCCCATCATTTC-3' 和 下 游 引 物 5'匿
TTGCAGGCAGCAGTAGAATG-3',由上海生物工程技术有限公司合成。
(3) SCAR分子标记的PCR扩增10xPCRBuffer2[xl， 1Ommol/L dNTPs2pl， 25mmol/LMgCl22pl, 5U/nl Taq DNA酶0.5nl， 25mM特异引 物对各l[il, 20ng4il模板DNA3ia1, ddH20补足至20(al。扩增反应在TC-XP 型扩增仪上进行。94。C预变性6min后；92。C变性40s， 38。C退火40s， 72°C 延伸2min，共30个循环；最后于72。C补平7min,终止温度为4。C。
(4) 电泳检测取步骤(3) PCR扩增产物5ul，与lul 0.25%溴酚
兰緩冲液混匀，点样于1.5%的琼脂糖凝胶上，于lxTAB緩冲液中，5V/cm 电压下电泳，电泳结束后，在含0.5pg/ml EB的水溶液中染色30分钟， 然后在培清JS-380A自动凝胶图像分析仪上照相。
按照上述方法，分别对多种香菇菌种(编号1 23代表香菇菌种依次 为1:申香2号；2:申香4号3:申香6号；4:申香9号；5:申香7 号；6:申香8号；7:申香10号；8:申香12; 9:苏香；10:武香；11: L26; 12: L03; 13: L66; 14: 241; 15: 241-4; 16:庆科20; 17: Cr02; 18: Cr04; 19:闽丰1号；20:沪农1号；21:浙香939-9; 22:浙香939-6; 23:香九)进行^r测，以无菌水为阴性对照，电泳结果见图1。其中编号 23为香菇香九菌种，扩增出了分子量为582bp的特殊DNA条带，其余编 号为其他常用的香菇生产菌种也扩增出了相应的DNA条带，但分子量约 为750bp。 序列表—ST25
SEQUENCE LISTING <110>浙江省林业科学研究院
<120> —种香菇香九菌种的分子特异性标记引物及检测方法
<130〉
<160〉 2
<170〉 Patentln version 3.4
<210〉 1
〈211> 18
<212> DNA
<213> Unknown
<220>
<223>人工序列 〈400〉 1
aggcaggccc atcatttc 18
<210〉 2
<211〉 20
<212> 睡
<213> Unknown
<220>
<223>人工序列
<400> 2
ttgcaggcag cagtagaatg 20
权利要求
1.香菇香九菌种的分子特异性标记引物，所述引物序列为上游引物5′-AGGCAGGCCCATCATTTC-3′下游引物5′-TTGCAGGCAGCAGTAGAATG-3′。
2. —种用如权利要1所述的分子特异性标记引物对香菇香九菌种进行鉴 定和检测的方法，所述方法为提取待测香菇菌种基因组DNA作为模 板，以所述分子特异性标记引物作为扩增引物，进行PCR扩增，对扩 增产物进行电泳检测，若电泳结果出现582bp的DNA条带，则待测菌 种为香菇香九菌种；所述分子特异性标记引物序列为上游引物5'-AGGCAGGCCCATCATTTC-3' 下游引物5'-TTGCAGGCAGCAGTAGAATG-3'。
3. 如权利要求2所述的方法，其特征在于所述PCR反应体系组成如下 PCR Buffer 终浓度为1 xdNTPs lmmol/L MgCl2 2.5mmol/L Taq DNA酶 2.5U 上、下游引物 各1.25jaM 模板DNA 60ng 余量为ddH20; PCR反应条件如下94。C预变性6min后；92。C变性40s, 38。C退火40s， 72。C延伸2min, 共30个循环；最后于72。C补平7min，终止温度为4°C。
4. 如权利要求3所述的方法，其特征在于所述方法如下(1 )取待测香菇菌种，接种至PDA斜面，25。C培养14d,转接至PD 液体培养基中，25。C下振荡培养14d，收集菌丝，以SDS-CTAB 法提取待测香菇菌种基因组DNA;(2 )以步骤(1 )提取的基因组DNA为模板，以所述分子特异性标记引物作为扩增引物，进行PCR扩增 10 xpCR Buffer 2juL 10mmol/LdNTPs 2juL 25mmol/L MgCl2 2 ju L5U/ ju L Taq DNA酶 0.5 ju L 25jaM上、下游引物 各1juL 20ng/ ju L模板DNA 3 ju LddH20补足至20 ja L; PCR反应条件如下94。C预变性6min后；92。C变性40s, 38。C退火40s, 72。C延伸2min, 共30个循环；最后于72。C补平7min,终止温度为4°C;(3 )取步骤(2 )扩增产物5 ja L,与1 ji L 0.25%溴酚兰緩冲液混匀， 点样于1.5%的琼脂糖凝胶上，于1 xTAB緩冲液中、5V/cm电压 下电泳，电泳结束后用EB染色，于自动凝胶图像分析仪上照相， 若电泳结果出现582bp的DNA条带，则待测菌种为香菇香九菌 种。
5. 如权利要求3所述的方法，其特征在于所述EB染色为在含0.5(ag/ml EB 的水溶液中染色30分钟。
全文摘要
本发明提供了一种香菇香九菌种的分子特异性标记引物，以及利用该引物对香菇香九菌种进行鉴别和检测的方法。所述引物序列为上游引物5′-AGGCAGGCCCATCATTTC-3′，下游引物5′-TTGCAGGCA GCAGTAGAATG-3′。本发明有益效果主要体现在本发明检测方法与常规形态学检测、拮抗试验、出菇试验相比，具有检测时间短，准确性高的优点；本发明方法检测所需时间只要1～3天，而常规的拮抗试验所需要的时间至少两周时间，出菇试验则需要至少3个月的时间。
文档编号C12Q1/68GK101358239SQ200810120568
公开日2009年2月4日 申请日期2008年8月25日 优先权日2008年8月25日
发明者付立忠, 吴学谦, 吴庆其, 李海波, 程俊文, 亮 贺, 魏海龙 申请人:浙江省林业科学研究院