一株异常威克汉姆酵母菌及其应用的制作方法

本发明涉及一株异常威克汉姆酵母菌及其在滇橄榄果酒发酵中的应用，属于微生物技术领域。

背景技术：

我国是世界上最大的水果生产国，但水果深加工业却一直很薄弱。果酒是以水果为原料经过发酵而成的低度饮料酒，富含糖、有机酸、酯类及多种维生素。果汁中的主要成分是糖类，酵母菌则是以糖类物质作为基质进行发酵，生成酒精和一定量的香味物质。所以酵母品种是酿造果酒的关键因素之一，酵母性状的好坏直接影响到所酿果酒的口感和风味，决定果酒品质的优劣。

滇橄榄 (Phyllanthus emblical L)是大戟科叶下珠属(Phyllanthus)落叶乔木的果实，又名余甘子、庵摩乐果、油甘子、圆橄榄，是一种独特的生长于中国亚热带、热带的部分地区，特别是干热河谷地区落叶乔木或灌木的资源植物，在国内其分布及数量在云南、福建、四川等地为多，在云南广布于海拔900～l400m的元江、怒江、澜沧江、南盘江、金沙江等流域，属少见的乔木类型，系全属750种植物中唯一具有核果、染色体为四培体的植物。中医学认为滇橄榄味甘、酸、涩，性凉，具有清热生津、清咽利嗓、止咳化痰、保肝解毒、健胃消食等功效。现代医学证实其具有抗氧化、抗衰老、抗癌、抗菌、消炎等作用。

滇橄榄先后已经开发出治疗性药品及系列饮料和果脯。但滇橄榄果酒作为一种保健酒的开发尚属起步阶段，因滇橄榄含有大量的单宁、鞣酸，苦涩味很重，现有的产品消费者很难接受。徐国雄等人研究的滇橄榄酒生产工艺中，通过加入0.4%的NaOH和0.1～0.2克每升的亚硫酸钠进行脱涩处理，发酵后除涩效果不是很明显。

张煜行等人研究出了一种异常威克汉姆酵母HJY-006在白酒生产中的应用，该菌株既能有一定的酒精产量，又能很好地满足白酒对酯香的要求。王松等人研究出了一种能分解果胶的异常威克汉姆酵母，可使酿造的果酒更清澈有光泽，感官品质得到提升。但关于异常威克汉姆酵母在增香除涩方面鲜有报道。本发明以滇橄榄为原料，以发酵后果酒中单宁含量和口感品质作为指标，筛选出了一株异常威克汉姆酵母菌。

技术实现要素：

本发明从采集至云南保山的一种滇橄榄果实表面上，采用微生物分离纯化的方法，获得了一株异常威克汉姆酵母菌（Wickerhamomyces anomalus）G1，其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2016年9月20日，保藏编号为CGMCC No.13050，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

本菌株分离所用的培养基为YPD培养基，培养基成分为：酵母粉10.0g、蛋白胨 20.0g、葡糖糖20.0g、琼脂20.0g、蒸馏水1000mL。

本发明中所述的异常威克汉姆酵母菌Wickerhamomyces anomalus G1具有以下微生物学特征：

1、形态学特征：细胞个体呈圆形，生长方式为出芽生殖；菌落呈乳白色，球形凸起，表面湿润、有光泽，不透明，奶油状；

2、生理生化特征：本发明中Wickerhamomyces anomalus G1与相似度最高菌株异常威克汉姆酵母 SX1的生理生化特征比较结果见表1，使用杭州微生物试剂有限公司的酵母样真菌生化鉴定管所得出；通过挑取单菌落穿刺至培养基中部，在28℃培养24h左右，通过培养基颜色的变化判断是阴性还是阳性，注：“+”表示阳性；“-”表示阴性。结果表明Wickerhamomyces anomalus G1在碳源上能利用甘油、淀粉和柠檬酸，而异常威克汉姆酵母 SX1不能利用。

表1 Wickerhamomyces anomalus G1与异常威克汉姆酵母 SX1的生理生化特征比较

；

3、菌株的18SrDNA的鉴定：

提取菌株的总DNA，用酵母菌18SrDNA通用引物扩增目的片段，对片段进行回收、克隆、测序。对酵母菌18SrDNA基因片段序列使用NCBI的BLAST进行18SrDNA的相似性比对，结果显示与Wickerhamomyces anomalus SX1的相似度最高，达到99%，鉴定它是异常威克汉姆酵母（Wickerhamomyces anomalus） ，命名为Wickerhamomyces anomalus .G1。

本发明应用异常威克汉姆酵母G1和市售葡萄酒高活性干酵母RV171用于滇橄榄果酒酿造，分别对酿造后果酒的品质指标及单宁残留含量测定，综合分析得出异常威克汉姆酵母G1对滇橄榄果酒具有增香除涩等功效。

本发明的优点及应用前景：

将本发明异常威克汉姆酵母G1与市售葡萄酒高活性干酵母RV171在酵母产酒精能力、降解单宁能力及感官评定进行比较，发现本发明酵母菌的发酵能力强、发酵所得滇橄榄果酒品质优，回甘明显，能增香除涩，具有典型的滇橄榄果香和风味；利用异常威克汉姆酵母G1酿造的滇橄榄果酒，品质良好，具有良好的市场应用前景。

附图说明

图1 异常威克汉姆酵母G1发酵滇橄榄酒的气质图谱；

图2市售葡萄酒高活性干酵母RV171发酵滇橄榄酒的气质图谱。

具体实施方式

下面通过附图和实施例对本发明作进一步详细说明，但本发明保护范围不局限于所述内容，实施例中方法如无特殊说明的均为常规方法，使用的试剂如无特殊说明为常规市售试剂或按常规方法制得的试剂。

实施例1：异常威克汉姆酵母菌株G1的分离筛选

1、样品为从云南保山采集得到的成熟滇橄榄果实，取10颗带有果香味的滇橄榄装入锥型瓶中，用200mL无菌水震荡清洗果实表面，从中取10mL浊水在2000r/min下离心5min，吸取0.1mL上清液涂布均匀于装有固体YPD培养基的培养皿上，28℃下恒温培养2d；

2、从中挑取直径约为2mm的乳白色凸起单菌落，在无菌操作台上，挑取选定的20个单菌落划线接种于YPD固体培养基上，28℃下培养2d。待长出后从中挑取6个乳白色，球形凸起，表面湿润、有光泽，不透明，奶油状菌落接种到YPD液体培养基中，28℃下摇床培养24h。

3、分别吸取10ml菌液加入到250ml滇橄榄汁中，并加入50g红糖，在22℃室温下厌氧发酵8d。通过测量这6株菌发酵滇橄榄酒的品质指标及感官分析，筛选出增香除涩最明显的那株菌。

4、提取该菌株的总DNA，用酵母菌18SrDNA通用引物扩增目的片段，对片段进行回收、克隆、测序，序列如SEQ ID NO：1所示，对酵母菌18SrDNA基因片段序列使用NCBI的BLAST进行18SrDNA的相似性比对， 结果显示与Wickerhamomyces anomalus SX1的相似度最高，达到99%，鉴定它是异常威克汉姆酵母（Wickerhamomyces anomalus），命名为Wickerhamomyces anomalus.G1。

本菌株分离所用的培养基为YPD培养基，培养基成分为：酵母粉10.0g、蛋白胨 20.0g、葡糖糖20.0g、琼脂20.0g、蒸馏水1000mL。

实施例2：异常威克汉姆酵母菌株G1用于滇橄榄果酒酿造，其步骤为：

1、原料处理：选用云南保山成熟的滇橄榄果实为原料，清洗→晾干→粉碎打成汁→过滤→得到滇橄榄汁。

2、主发酵：在已灭菌的6瓶500mL容量瓶中各添加滇橄榄汁250mL，分为两组，即实验组和对照组，每组3瓶。将异常威克汉姆酵母G1与市售葡萄酒高活性干酵母RV171扩培后分别按6%（2×10⁸cfu/mL）体积比添加到不同组中，同时加入50g红糖，将这两组发酵瓶放置在22～25℃室温下密封发酵8d（前3d进行有氧发酵，后5d进行无氧发酵），即得滇橄榄果酒发酵原液。

3、澄清保藏：分别按10:1的比例加入1%（g/mL）浓度的明胶溶液，即在250mL的滇橄榄果酒发酵原液中加入25mL的1%明胶溶液，搅拌30min后静置2h，过滤取上清液；将澄清的上清液放置在65℃水浴锅中消毒15min，待冷却后装瓶密封保存在干燥阴凉处。

实施例3：异常威克汉姆酵母菌株G1发酵滇橄榄果酒品质的指标测定

指标测定方法：糖度测定：糖度计；pH的测定：pH酸度计；酒精体积分数的测定：蒸馏法和酒精计。

指标测定结果：用异常威克汉姆酵母G1所酿造的果酒，其pH为3.19，糖度为10.0%，酒精体积分数为14.5%，三项指标显示该发酵液已达到GB 15038-2006果酒国标要求。与干酵母RV171相比，菌株G1产酒精能力更强，降酸更明显。

表2 滇橄榄果酒品质的指标测定结果

。

实施例4：异常威克汉姆酵母菌株G1发酵滇橄榄果酒的感官评定

将两组滇橄榄果酒发酵原液请10位评委品尝，参照GB 15038-2006葡萄酒、果酒通用分析方法中的感官评分标准打分（表3），得出异常威克汉姆酵母菌株G1发酵的滇橄榄果酒口感要优于市售葡萄酒高活性干酵母RV171。用异常威克汉姆酵母G1所酿造的果酒颜色为棕黄色，酒体具有纯正和谐的滇橄榄果香，口味清爽细腻，酒体丰满，回甘明显，具有滇橄榄独特的典型性，结果见表4。

表3 滇橄榄果酒感官评分标准

；

表4 ：两组菌株发酵滇橄榄果酒后的感官评分

。

实施例5：异常威克汉姆酵母菌株G1单宁降解能力的测定：

取这两组发酵原液各10mL在2000r/min下离心10min，取上清液保存备用；同理取等体积的新鲜滇橄榄汁作为空白组；参照单宁含量试剂盒说明书用分光光度计分别测量这三组的单宁含量；分光光度计预热30min，调节波长至760nm，蒸馏水调零；

结果表5得出本发明异常威克汉姆酵母菌G1发酵的滇橄榄酒中单宁含量为37.89μg/mL，比市售葡萄酒高活性干酵母RV171发酵的滇橄榄酒和新鲜滇橄榄汁中的单宁含量都要低，说明酵母菌G1降解单宁的效果好。

表5 两组菌株发酵滇橄榄果酒后的单宁含量

。

实施例6：滇橄榄果酒中香味成分的GC-MS分析

取这两组滇橄榄酒发酵原液各10mL，在2000r/min下离心10min，取上清液分别装入到两个50mL容量的分液漏斗中，再分别加入10mL石油醚，上下摇匀后静置萃取，将萃取出的上清液装入到50mL规格的旋蒸瓶中，在35℃下抽真空慢慢旋蒸，直至旋蒸瓶中剩余1mL溶液，取出并用0.45μm滤膜过滤保存备用；将滤液在GC-MS (Agilent GC7890B/MS5977A)气-质联用仪上分析。

GC条件：色谱柱为HP-5（30m*0.32mm*0.25um），进样口温度250℃，分流比40:1，进样量1μl，起始柱温40℃，保持1min，以5℃/min升温至130℃，保持5min，再以5℃/min升温至220℃，保持5min，再以10℃/min升温至280℃，保持1min。

MS条件：传送线温度：250℃，四级杆温度：150℃，离子源电影70ev，全扫描模式，扫描范围：50-550。

结果如表6、7，可知Wickerhamomyces anomalus G1发酵后的果酒中香味物质成分更多，主要香味物质苯乙醇、环辛四烯、邻苯二甲酸二丁酯等成分含量更高；结果表明了异常威克汉姆酵母G1发酵的滇橄榄果酒拥有更丰富的果香和酒香图（1、2）。

表6：异常威克汉姆酵母G1发酵滇橄榄酒的主要香气成分分析结果

表7：市售葡萄酒高活性干酵母RV171发酵滇橄榄酒的主要香气成分分析结果

。

序列表

<110> 昆明理工大学

<120> 一株异常威克汉姆酵母菌及其应用

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1040

<212> DNA

<213> Wickerhamomyces anomalus G1

<400> 1

tttcgaacca aagactttga tttctcgtaa ggtgccgagt gggtatataa aaaacaccac 60

ccgatcccta gtcggcatag tttatggtta agactacgac ggtatctgat catcttcgat 120

cccctaactt tcgttcttga ttaatgaaaa cgtccttggc aaatgctttc gcagtagtta 180

gtcttcaata aatccaagaa tttcacctct gacaattgaa tactgatgcc cccgaccgtc 240

cctattaatc attacgatgg tcctagaaac caacaaaata gaaccaaacg tcctattcta 300

ttattccatg ctaatatatt cgagcaaagg cctgctttga acactctaat tttttcaaag 360

taaaagtcct ggttcgcctg ccccgagaga caggttagcc agaaggaaag gctcggtcag 420

gaccagtaca cgcaaaaaag cggaccggct gaccaagccc aaagttcaac tacgagcttt 480

ttaactgcaa caactttaat atacgctatt ggagctggaa ttaccgcggc tgctggcacc 540

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aatttgcgcg cctgctgcct tccttggatg tggtagccgt ttctcaggct ccctctccgg 720

aatcgaaccc ttattccccg ttacccgttg aaaccatggt aggccactat cctaccatcg 780

aaagttgata gggcagaaat ttgaatgaac catcgccgac acgaagtcat gcgattcgaa 840

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