来自威克汉姆西弗酵母（wickerhamomycesciferrii)的乙酰转移酶的制作方法
【专利摘要】本发明涉及提供乙酰化鞘氨醇碱的新型酶。
【专利说明】来自威克汉姆西弗酵母（WICKERHAMOMYCES CIFERRM)的 乙酰转移酶 发明领域
[0001] 本发明的主题是提供乙酰化鞘氨醇碱的新型酶。 现有技术
[0002] 自从60年代开始已经使用西弗毕赤酵母（Pichia ciferrii)来生产鞘氨醇碱和 鞘脂。
[0003] 来自野生型株的鞘氨醇碱和鞘脂的产量一直需要提高。
[0004] 鞘氨醇碱，特别是植物鞘氨醇，鞘氨醇和二氢鞘氨醇，在作为美容活性物质的各种 用途中使用，以保护和护理皮肤。它们被直接掺入美容护理产品，或在化学转化为皮肤相似 的神经酰胺后掺入美容护理产品。
[0005] 非常规酵母西弗毕赤酵母的特征在于，它在培养基中分泌相对大量的乙酰化鞘氨 醇碱，主要是四乙酰基植物鞘氨醇（TAPS)和三乙酰基鞘氨醇（TriASa)。通过提取操作可以 从培养肉汤中提取形成的TAPS，然后将其化学转化为游离植物鞘氨醇和各种神经酰胺。
[0006] 有效的乙酰化是将鞘氨醇碱转运至培养基的基本要求；对微粒体部分的酶测试已 经证明，与低产株相比，具有乙酰化鞘氨醇碱高产量的那些菌株（高产株）显示显著增加的 特异性乙酰转移酶活性（Barenholz等人，1971 ;Barenhoz等人，1973)。因此这种酶活性可 以被鉴定为各种西弗毕赤酵母菌株有效生产乙酰化鞘氨醇碱的主要原因之一。
[0007] 迄今为止，所有纯化、表征和鉴定这种酶的努力均告失败，因此所述蛋白和相应基 因都是未知的。
[0008] 本发明的目的是提供能够乙酰化鞘氨醇碱的酶及其编码序列。
[0009] 发明描沭
[0010] 出人意料的，已经发现下文所述的酶能够解决本发明遇到的问题。
[0011] 因此本发明的主题是如权利要求所述的编码乙酰转移酶的分离的核酸。
[0012] 本发明的另一主题是显示本发明酶的修饰活性的重组细胞。
[0013] 本发明描述的乙酰转移酶以及编码它们的DNA序列提供大量优点。它们可以用 于生物工程化和高度特异的在各种功能团（羟基和氨基）上乙酰化指定的底物（鞘氨醇 碱）。与化学乙酰化步骤相比，产生的副产品更少，因此可以将产量损失和费力的纯化步骤 降到最低。因此本发明具有巨大的潜力，尤其是对于需要高产品纯度的应用而言。尤其在 美容、食品和奢侈消费品以及药品方面，特别高的产品纯度是必需的，这样的话本发明具有 特别巨大的潜力。可以按照基本上不同的两种方式利用本发明实现乙酰化鞘氨醇碱的生物 技术生产：第一种，可以利用生物催化方法实现生产，其中在合适的反应器中通过添加乙酰 转移酶将所选鞘氨醇碱酶促乙酰化。第二种，可以通过基因工程方法（代谢工程化）使用 乙酰转移酶基因产生重组微生物菌株，其能够在发酵过程中从简单的碳源和氮源直接合成 乙酰化鞘氨醇碱。与化工方法相比，发酵方法是更低廉并且生态上更持久。此外，它是立体 特异的，而这在化学全合成中是得不到保证的。
[0014] 只需利用本发明所述的乙酰转移酶之一或其基因，可以特异性产生不完全乙酰化 的鞘氨醇碱。这些可以具有特定的生物学效应，因此可用于特定应用，例如作为美容或药物 活性物质或其前体。不完全乙酰化的鞘氨醇碱只能极度费力的通过化学法制备，因此生物 技术方法具有相当大的成本优势。
[0015] 除非另有说明，所述的所有百分比（％)都是质量百分比。
[0016] 通过一种分离的核酸（其具有选自组[Al到Gl]的序列）来提供所述问题的解决 方案。
[0017] Al)Seq ID No. 1所示序列，其中所述序列编码通过转移来自3分子的乙酰辅酶A 的乙酰残基而能够将植物鞘氨醇转化为三乙酰基植物鞘氨醇的蛋白，
[0018] BI)无内含子的序列，其来源于Al)所示序列，并与Seq ID No. 1所示序列编码相 同的蛋白或肽，
[0019] Cl)编码蛋白或肽的序列，所述蛋白或肽包括Seq ID No. 2所示序列并通过转移来 自3分子的乙酰辅酶A的乙酰残基而能够将植物鞘氨醇转化为三乙酰基植物鞘氨醇，
[0020] Dl)与组Al)到Cl)之一所示序列、尤其优选组Al)所示序列具有至少70%、尤其 优选至少90%、仍然更优选至少95%和最优选至少99%同一性的序列，其中所述序列编码 通过转移来自3分子的乙酰辅酶A的乙酰残基而能够将植物鞘氨醇转化为三乙酰基植物鞘 氨醇的蛋白或肽，
[0021] El)与组Al)到Dl)之一所示序列、尤其优选组Al)所示的序列的互补链杂交或考 虑到遗传密码的简并性将与其杂交的序列，其中所述序列编码通过转移来自3分子的乙酰 辅酶A的乙酰残基而能够将植物鞘氨醇转化为三乙酰基植物鞘氨醇的蛋白或肽，
[0022] Fl)组Al)到El)之一所示序列、尤其优选组Al)所示序列的衍生物，通过取代、添 力口、倒置和/或缺失至少1个碱基、优选至少2个碱基、仍然更优选至少5个碱基和最优选 至少10个碱基、但优选不超过100个碱基、尤其优选不超过50个碱基和最优选不超过25 个碱基而获得，其中所述衍生物编码通过转移来自3分子的乙酰辅酶A的乙酰残基而能够 将植物鞘氨醇转化为三乙酰基植物鞘氨醇的蛋白或肽，
[0023] Gl)组Al)到Fl)之一所示序列、尤其优选组Al)所示序列的互补序列。
[0024] 通过一种分离的核酸（其具有选自组[A2到G2]的序列）来提供所述问题的另一 解决方案。
[0025] A2) Seq ID No. 3所示序列，其中所述序列编码通过转移来自1分子的乙酰辅酶A 的乙酰残基而能够将三乙酰基植物鞘氨醇转化为四乙酰基植物鞘氨醇的蛋白，
[0026] B2)无内含子的序列，其来源于A2)所示序列并与Seq ID No. 3所示序列编码相同 的蛋白或肽，
[0027] C2)编码蛋白或肽的序列，所述蛋白或肽包括Seq ID No. 4所示序列并通过转移来 自1分子的乙酰辅酶A的乙酰残基而能够将三乙酰基植物鞘氨醇转化为四乙酰基植物鞘氨 醇，
[0028] D2)与组A2)到C2)之一所示序列、尤其优选组A2)所示序列具有至少70%、尤其 优选至少90%、仍然更优选至少95%和最优选至少99%同一性的序列，其中所述序列编码 通过转移来自1分子的乙酰辅酶A的乙酰残基而能够将三乙酰基植物鞘氨醇转化为四乙酰 基植物鞘氨醇的蛋白或肽，
[0029] E2)与组A2)到D2)之一所示的序列、尤其优选组A2)所示的序列的互补链杂交或 考虑到遗传密码的简并性将与其杂交的序列，其中所述序列编码通过转移来自1分子的乙 酰辅酶A的乙酰残基而能够将三乙酰基植物鞘氨醇转化为四乙酰基植物鞘氨醇的蛋白或 肽，
[0030] F2)组A2)到E2)之一所示序列、尤其优选组A2)所示序列的衍生物，通过取代、添 力口、倒置和/或缺失至少1个碱基、优选至少2个碱基、仍然更优选至少5个碱基和最优选 至少10个碱基、但优选不超过100个碱基、尤其优选不超过50个碱基和最优选不超过25 个碱基而获得，其中所述衍生物编码通过转移来自1分子的乙酰辅酶A的乙酰残基而能够 将三乙酰基植物鞘氨醇转化为四乙酰基植物鞘氨醇的蛋白或肽，
[0031] G2)组A2)到F2)之一所示序列、尤其优选组A2)所示序列的互补序列。
[0032] "核苷酸同一性"或"氨基酸同一性"通过已知方法来确定。通常使用专门的计算 机程序（利用考虑具体要求的算法）。
[0033] 用于确定同一性的优选方法首先在待比较的序列之间产生最大匹配。用于确 定同一'丨生的计算机程序包括但不限于GCG程序包，包括GAP(Deveroy, J.等人，Nucleic Acid Research 12(1984)，第 387 页,Genetics Computer Group University of 町8。〇118；[11，]^(1;[。;[116(￥；0,以及131^3了？，131^3了1^和卩六3了六（六]^8。11111，3.等人，]〇111'仙1〇1^ Molecular Biology 215(1990),第403-410页）。BLAST程序可以获自国立生物技术信 息中心（National Center For Biotechnology Information(NCBI))和其他来源（BLAST Handbuch, Altschul S.等人，NCBI NLM NIH Bethesda ND 22894 ;Altschul S?等人，上 文）。
[0034] 还可以使用公知的Smith-Waterman算法来确定核苷酸同一'丨生。
[0035] 利用 BLASTN 程序（Altschul, S.等人，Journal of Molecular Biology 215 (1990)，第403-410页）来确定"核苷酸同一性"的优选参数是：
【权利要求】
1. 一种分离的核酸，其具有选自组Al)到Gl)的序列 Al)Seq ID No. 1所示序列，其中所述序列编码通过转移来自3分子的乙酰辅酶A的乙 酰残基而能够将植物鞘氨醇转化为三乙酰基植物鞘氨醇的蛋白， BI)无内含子的序列，其来源于Al)所示序列并与Seq ID No. 1所示序列编码相同的蛋 白或肽， Cl)编码蛋白或肽的序列，所述蛋白或肽包括Seq ID No. 2所示序列并通过转移来自3 分子的乙酰辅酶A的乙酰残基而能够将植物鞘氨醇转化为三乙酰基植物鞘氨醇， Dl)与组Al)到Cl)之一所示序列具有至少70%同一性的序列，其中所述序列编码通 过转移来自3分子的乙酰辅酶A的乙酰残基而能够将植物鞘氨醇转化为三乙酰基植物鞘氨 醇的蛋白或肽， El)与组Al)到Dl)之一所示序列的互补链杂交或考虑到遗传密码的简并性将与其杂 交的序列，其中所述序列编码通过转移来自3分子的乙酰辅酶A的乙酰残基而能够将植物 鞘氨醇转化为三乙酰基植物鞘氨醇的蛋白或肽， Fl)组Al)到El)之一所示序列的衍生物，通过至少1个碱基的取代、添加、倒置和/或 缺失来获得，其中所述衍生物编码通过转移来自3分子的乙酰辅酶A的乙酰残基而能够将 植物鞘氨醇转化为三乙酰基植物鞘氨醇的蛋白或肽， Gl)组Al)到Fl)之一所示序列的互补序列。
2. -种分离的核酸，其具有选自组A2)到G2)的序列 A2)Seq ID No.3所示序列，其中所述序列编码通过转移来自1分子的乙酰辅酶A的乙 酰残基而能够将三乙酰基植物鞘氨醇转化为四乙酰基植物鞘氨醇的蛋白， B2)无内含子的序列，其来源于A2)所示序列并与Seq ID No. 3所示序列编码相同的蛋 白或肽， C2)编码蛋白或肽的序列，所述蛋白或肽包括Seq ID No. 4所示序列并通过转移来自1 分子的乙酰辅酶A的乙酰残基而能够将三乙酰基植物鞘氨醇转化为四乙酰基植物鞘氨醇， D2)与组A2)到C2)之一所示序列具有至少70%同一性的序列，其中所述序列编码通 过转移来自1分子的乙酰辅酶A的乙酰残基而能够将三乙酰基植物鞘氨醇转化为四乙酰基 植物鞘氨醇的蛋白或肽， E2)与组A2)到D2)之一所示序列的互补链杂交或考虑到遗传密码的简并性将与其杂 交的序列，其中所述序列编码通过转移来自1分子的乙酰辅酶A的乙酰残基而能够将三乙 酰基植物鞘氨醇转化为四乙酰基植物鞘氨醇的蛋白或肽， F2)组A2)到E2)之一所示序列的衍生物，通过至少1个碱基的取代、添力口、倒置和/或 缺失来获得，其中所述衍生物编码通过转移来自1分子的乙酰辅酶A的乙酰残基而能够将 三乙酰基植物鞘氨醇转化为四乙酰基植物鞘氨醇的蛋白或肽， G2)组A2)到F2)之一所示序列的互补序列。
3. -种细胞，其特征在于它已经被遗传修饰，因此与其野生型相比，它显示酶E1和/或 E2中至少一种的修饰活性，其中酶E1选自 酶E1，具有Seq ID No. 2的多肽序列，或具有与参照序列Seq ID No. 2相比，其中直至 25%、优选直至20%、尤其优选直至15%、特别是直至10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、 3%、2%或1%的氨基酸残基通过缺失、插入、取代或其组合被修饰并且仍然具有含有参照 序列Seq ID No. 2的酶的至少10%、优选50%、尤其优选80%、特别是超过90%的酶活性 的多肽序列，其中酶￡:的酶活性旨在表示通过转移来自3分子的乙酰辅酶A的乙酰残基而 将植物鞘氨醇转化为三乙酰基植物鞘氨醇的能力， 和酶E2选自 酶E2，具有Seq ID No. 4的多肽序列，或具有与参照序列Seq ID No. 4相比，其中直至 25%，优选直至20%，尤其优选直至15%，特别是直至10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、 3%、2%或1%的氨基酸残基通过缺失、插入、取代或其组合被修饰并且仍然具有含有参照 序列Seq ID No. 4的酶的至少10%、优选50%、尤其优选80%、特别是超过90%的酶活性 的多肽序列，其中酶&的酶活性旨在表示通过转移来自1分子的乙酰辅酶A的乙酰残基而 将三乙酰基植物鞘氨醇转化为四乙酰基植物鞘氨醇的能力。
4. 如权利要求3所述的细胞，其特征在于与其野生型相比，它显示酶E1和E2中至少一 种的活性增加，优选两种酶的活性均增加。
5. 如权利要求3或4所述的细胞，其特征在于它选自酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)，乳酸克鲁维酵母（Kluyveromyces Iactis)，多型汉逊酵母（Hansenula polymorpha)，粉状毕赤酵母（Pichia pastoris)，西弗毕赤酵母（Pichia ciferrii)，解脂 耶罗维亚酵母（Yarrowia Iipolytica)，白色念珠菌（Candida albicans),实用假性酵母 (Candida utilis)和棉阿舒囊霉（Ashbya gossypii)。
6. 如权利要求3-5中至少一项所述的细胞用于生产鞘氨醇碱基和/或鞘脂的用途。
7. -种用于生产鞘氨醇碱基和/或鞘脂的方法，包括如下步骤 a) 将权利要求3-5中至少一项所述的细胞与包含碳源的培养基接触， b) 在使细胞能够从所述碳源形成鞘氨醇碱基和/或鞘脂的条件下培养细胞，和 c) 任选地，分离形成的鞘氨醇碱基和/或鞘脂。
8. -种用于生产N-乙酰化脂肪族伯胺的方法，包括处理步骤 A)将酶E1或E2中的至少一种与包含脂肪族伯胺和乙酰辅酶A的培养基接触，所述脂 肪族伯胺特别是选自具有6到18个碳原子的那些，其优选是线性的，其中酶E1选自 酶E1，具有Seq ID No. 2的多肽序列，或具有与参照序列Seq ID No. 2相比，其中直至 25%、优选直至20%、尤其优选直至15%、特别是直至10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、 3%、2%或1%的氨基酸残基通过缺失、插入、取代或其组合被修饰并且仍然具有含有参照 序列Seq ID No. 2的酶的至少10%、优选50%、尤其优选80%、特别是超过90%的酶活性 的多肽序列，其中酶E1的酶活性旨在表示通过转移来自乙酰辅酶A的3分子乙酰残基，将 植物鞘氨醇转化为三乙酰基植物鞘氨醇的能力， 和酶E2选自 酶E2，具有Seq ID No. 4的多肽序列，或具有与参照序列Seq ID No. 4相比，其中直至 25%、优选直至20%、尤其优选直至15%、特别是直至10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、 3%、2%或1%的氨基酸残基通过缺失、插入、取代或其组合被修饰并且仍然具有含有参照 序列Seq ID No. 4的酶的至少10%、优选50%、尤其优选80%、特别是超过90%的酶活性 的多肽序列，其中酶E2的酶活性旨在表示通过转移来自乙酰辅酶A的1分子乙酰残基，将 三乙酰基植物鞘氨醇转化为四乙酰基植物鞘氨醇的能力， 和 B)任选地，分离形成的乙酰化胺。
【文档编号】C12N9/12GK104220592SQ201380018786
【公开日】2014年12月17日 申请日期:2013年3月13日 优先权日:2012年4月11日
【发明者】S·沙费尔, M·法尔维克, H·安德烈埃, T·克勒, D·沃尔夫, F·特尔费尔德, A·珀奇, E·博尔斯, C·朔尔施 申请人:赢创工业集团股份有限公司