重组微生物及其使用方法

重组微生物及其使用方法
【专利摘要】本发明涉及用于通过微生物发酵产生化学化合物(特别是但不限于乙醇)的方法。还描述了经遗传修饰的微生物，所述微生物能够使用一氧化碳产生一种或多种产物(特别是但不限于乙醇)作为主要产物，并且能够产生少量的或不产生2,3-丁二醇和/或其前体。
【专利说明】重组微生物及其使用方法

【技术领域】
[0001] 本发明涉及用于通过微生物发酵产生化学化合物，尤其是但不仅限于是己醇的方 法，W及用于该些方法的经遗传修饰的微生物。

【背景技术】
[0002] 已知产己酸的微生物可用于通过底物（包括例如一氧化碳、二氧化碳、氨气和甲 醇）发酵来生产燃料（例如己醇或下醇）和其它化学物质。很多该些微生物天然产生至少 两种-如果不是更多的话-产物。但是，当将微生物用于产生产物时，尤其是用在工业规模 上时，不总是需要微生物产生多种产物。例如，多种产物的产生可能是W生产效率和特殊价 值的产品的产率为代价，因为副产物可能从参与产生主要需要产物的途径中转移出碳。另 夕F，副产物可能对微生物有毒，产生多种产物会使所需产物的回收和分离变得困难，并且难 W控制发酵条件W有利于使得一种产品的产生优于另一种产品。副产物也可能是发酵罐中 的潜在污染源，因为它们可能是有害生物的底物。
[0003]在通过含一氧化碳的底物的微生物发酵来产生己醇时，2, 3-下二醇通常作为副产 物产生。该可能降低己醇的生产效率和产率W及造成如上所述的其它问题。
[0004]本发明的目的是克服现有技术的一种或多种缺陷，或者至少为公众提供有用的选 择。


【发明内容】

[0005]本发明涉及，尤其是，新的经遗传修饰的微生物，和亲代微生物相比，所述微生物 能够使用一氧化碳来产生一种或多种产物并且能够产生降低量的2, 3-下二醇和/或其前 体。在一个实施方案中，和亲代微生物相比，所述经遗传修饰的微生物基本不产生2, 3-下 二醇和/或其前体。在一个具体实施方案中，所述微生物产生己醇作为主要产物。
[0006]在第一方面，本发明提供了一氧化碳营养型产己酸微生物，所述微生物被改造为 适于在发酵含一氧化碳的底物时产生一种或多种产物W及降低量的或基本不产生2, 3-下 二醇和/或其前体，和亲代微生物相比，所述微生物包括破坏了 2, 3-下二醇生物合成途径 的一种或多种遗传修饰。
[0007]在一个具体实施方案中，本发明提供了一氧化碳营养型产己酸微生物，所述微生 物被改造为适于在发酵含一氧化碳的底物时产生己醇作为主要产物W及降低量的或基本 不产生2, 3-下二醇和/或其前体，和亲代微生物相比，所述微生物包括破坏了 2, 3-下二醇 生物合成途径的一种或多种遗传修饰。
[0008]在一个实施方案中，所述微生物被改造为适于进一步产生甲酸、乳酸、丙丽酸、玻 巧酸、额氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、己醜乳酸、苹果酸、延胡索酸（fumerate)、2-丽戊二酸 (2-oxogluterate)、巧樣酸中的一种或多种。
[0009]在一个实施方案中，与亲代微生物相比，所述微生物被改造为适于产生增加量的 己醇、甲酸、乳酸、丙丽酸、玻巧酸、额氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、己醜乳酸、苹果酸、延胡索酸、 2-丽戊二酸、巧樣酸中的一种或多种。
[0010] 在一个实施方案中，所述微生物包括至少一种遗传修饰，所述遗传修饰破坏了一 种或多种能将丙丽酸转化成己醜乳酸的酶的表达和/或活性。
[0011] 在一个实施方案中，所述一种或多种能将丙丽酸转化成己醜乳酸的酶是己醜乳酸 合酶（als巧。
[0012] 在一个实施方案中，所述微生物包括至少一种遗传修饰，所述遗传修饰破坏了一 种或多种能将己醜乳酸转化成己偶姻的酶的表达和/或活性。
[0013] 在一个实施方案中，所述一种或多种能将己醜乳酸转化成己偶姻的酶是己醜乳酸 脱駿酶（budA)。
[0014] 在一个实施方案中，所述微生物包括至少一种遗传修饰，所述遗传修饰破坏了一 种或多种能将己偶姻转化成2, 3-下二醇的酶的表达和/或活性。
[0015] 在一个实施方案中，所述一种或多种能将己偶姻转化成2, 3-下二醇的酶选自 2, 3-下二醇脱氨酶（2, 3b化）、己偶姻还原酶、伯醇：仲醇脱氨酶。
[0016] 在一个实施方案中，所述微生物包括至少一种遗传修饰，所述遗传修饰破坏了两 种或多种酶的组合的表达和/或活性，所述酶能将丙丽酸转化成己醜乳酸、将己醜乳酸转 化成己偶姻、和/或将己偶姻转化成2, 3-下二醇。
[0017] 在一个实施方案中，所述遗传修饰破坏了一种或多种W下酶的表达和/或活性：
[0018] 己醜乳酸合酶（als巧；
[0019] 己醜乳酸脱駿酶炬udA);
[0020] 2, 3-下二醇脱氨酶（2, 3b化）；
[0021] 己偶姻还原酶；和
[0022] 伯醇：仲醇脱氨酶。。
[0023] 在一个实施方案中，所述遗传修饰破坏了一种或多种W下酶的表达和/或活性：
[0024] 己醜乳酸合酶（als巧；
[00巧]己醜乳酸脱駿酶炬UdA);和
[0026] 2, 3-下二醇脱氨酶（2,抓化）。
[0027] 在一个实施方案中，所述一种或多种遗传修饰破坏了一种或多种编码一种或多种 上述酶的基因。在一个实施方案中，所述一种或多种遗传修饰破坏了一种或多种上述酶的 表达和/或活性所需的化合物的活性。在一个实施方案中，所述一种或多种遗传修饰增强 了一种或多种化合物的表达或活性，所述化合物抑制了一种或多种上述酶的表达或活性。
[0028] 在一个具体实施方案中，所述微生物选自自产己醇梭菌（Clostridium autoethanogenum)、扬氏梭菌（Clostridiumljungdahlii)、和拉氏梭菌（Clostridium ragsdalei)W及相关分离株。在另一个实施方案中，所述组也包括科斯卡培梭菌 (Clostridiumcoskatii)。
[0029] 在一个具体实施方案中，所述微生物是自产己醇梭菌DSM23693。
[0030] 在第二方面，本发明提供了用于产生一氧化碳营养型产己酸微生物的方法，所述 微生物被改造为适于在发酵含一氧化碳的底物时产生一种或多种产物W及降低量的或基 本不产生2, 3-下二醇和/或其前体，所述方法包括遗传修饰一氧化碳营养型产己酸亲代微 生物W破坏2, 3-下二醇生物合成途径。
[0031] 在一个实施方案中，和亲代微生物相比，所述方法导致了一种或多种产物的产生 增加。
[0032] 在一个具体实施方案中，本发明提供了用于产生一氧化碳营养型产己酸微生物的 方法，所述微生物被改造为适于在发酵含一氧化碳的底物时产生己醇作为主要产物W及降 低量的或基本不产生2, 3-下二醇和/或其前体，所述方法包括遗传修饰一氧化碳营养型产 己酸亲代微生物W破坏2, 3-下二醇生物合成途径。
[0033] 本发明也提供了通过所述第二方面的方法产生的微生物。
[0034] 在一个实施方案中，所述方法包括将一种或多种遗传修饰引入到亲代微生物中， 所述遗传修饰破坏了编码能将丙丽酸转化成己醜乳酸的一种或多种酶的一种或多种基 因。在一个实施方案中，所述一种或多种能将丙丽酸转化成己醜乳酸的酶是己醜乳酸合酶 (als巧。
[00巧]在一个实施方案中，所述方法包括将一种或多种遗传修饰引入到亲代微生物中， 所述遗传修饰破坏了编码能将己醜乳酸转化成己偶姻的一种或多种酶的一种或多种基因。 在一个实施方案中，所述一种或多种能将己醜乳酸转化成己偶姻的酶是己醜乳酸脱駿酶 (budA) 〇
[0036] 在一个实施方案中，所述方法包括将一种或多种遗传修饰引入到亲代微生物中， 所述遗传修饰破坏了编码能将己偶姻转化成2, 3-下二醇的一种或多种酶的一种或多种基 因。在一个实施方案中，所述一种或多种能将己偶姻转化成2, 3-下二醇的酶选自2, 3-下 二醇脱氨酶化3b化）、己偶姻还原酶、伯醇：仲醇脱氨酶。
[0037] 在一个实施方案中，所述方法包括将一种或多种遗传修饰引入到亲代微生物中， 所述遗传修饰破坏了两种或多种基因的组合，所述基因编码能将丙丽酸转化成己醜乳酸、 将己醜乳酸转化成己偶姻、和/或将己偶姻转化成2, 3-下二醇的酶。
[0038] 在一个实施方案中，所述方法包括将一种或多种遗传修饰引入到亲代微生物中， 所述遗传修饰破坏了一种或多种基因，所述基因编码己醜乳酸合酶（als巧、己醜乳酸脱駿 酶炬udA)和2, 3-下二醇脱氨酶化3b化）中的一种或多种。
[0039] 在一个实施方案中，所述方法包括引入遗传修饰，所述遗传修饰破坏了一种或多 种上述酶的表达或活性所需的化合物的活性。
[0040] 在一个实施方案中，所述方法包括引入增强了一种或多种化合物的表达或活性的 遗传修饰，所述化合物抑制了一种或多种上述酶的表达或活性。
[0041] 在第H方面，本发明提供了用于产生一种或多种产物的方法。在一个实施方案中， 所述方法为用于产生己醇、甲酸、乳酸、丙丽酸、玻巧酸、额氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、己醜乳 酸、苹果酸、延胡索酸、2-丽戊二酸、巧樣酸中的一种或多种。
[0042] 在一个具体实施方案中，本发明提供了用于通过微生物发酵产生一种或多种产物 (在一个实施方案中包括己醇W及一种或多种其它产物）的方法，所述微生物发酵包括使 用本发明第一方面的和/或通过本发明第二方面的方法产生的一种或多种微生物发酵含 C0的底物。在一个实施方案中，所述一种或多种其他产物选自玻巧酸、乳酸、甲酸、额氨酸、 亮氨酸、丙丽酸、异亮氨酸、己醜乳酸、苹果酸、延胡索酸、2-丽戊二酸、巧樣酸。
[0043] 本发明也提供了用于降低来自工业过程的总的大气碳排放的方法。
[0044] 在一个实施方案中，所述方法包括如下步骤：
[0045] (a)将含CO的底物提供给生物反应器，所述生物反应器含有本发明第一方面的和 /或通过本发明第二方面的方法产生的一种或多种微生物的培养物；和
[0046] 化）在所述生物反应器中厌氧发酵所述培养物W产生一种或多种上述产物，优选 包括己醇。
[0047] 在另一个实施方案中，所述方法包括W下步骤：
[0048] 在由工业生产过程产生的含C0的气体释放到大气中之前，将所述气体捕获；
[0049] 通过培养物厌氧发酵所述含C0的气体W产生一种或多种上述产物，优选包括己 醇，所述培养物含有一种或多种本发明第一方面的微生物和/或通过本发明第二方面的方 法产生的微生物。
[0050] 在所述方法方面的具体实施方案中，将所述微生物维持在水性培养基中。
[0051] 在所述方法方面的具体实施方案中，对所述底物的发酵发生在生物反应器中。
[0052] 优选地，所述含C0的底物是含C0的气态底物。在一个实施方案中，所述底物包含 工业废气。在某些实施方案中，所述气体是钢铁厂废气或合成气。
[0053] 在一个实施方案中，所述底物通常会含有大比例的C0,例如至少约20体积％至约 100体积％的C0、20体积％至70体积％的C0、30体积％至60体积％的C0和40体积％至 55体积％的C0。在具体实施方案中，所述底物包含约25体积％、或约30体积％、或约35 体积％、或约40体积％、或约45体积％、或约50体积％的C0、或约55体积％的C0、或约60 体积％的〇)。
[0054] 虽然所述底物不必需含有任何氨气，但是存在应该不会对依据本发明方法的产 物形成不利。在具体实施方案中，存在氨气可获得提高的醇产生的整体效率。例如，在具 体实施方案中，所述底物可包含约2:1、或1:1或1:2比例的&:0)。在一个实施方案中，所 述底物包含约30体积％或更低的&、20体积％或更低的&、约15体积％或更低的&、或者 约10体积％或更低的&。在其他实施方案中，所述底物流包含低浓度的&，例如小于5体 积％、或小于4体积％、或小于3体积％、或小于2体积％、或小于1体积％或者基本上不含 氨气。例如，所述底物还可含有一些0)2,例如约1体积％至约80体积％的(?或1体积％ 至约30体积％的CA。
[00巧]在某些实施方案中，所述方法还包括从发酵液中回收一种或多种产物的步骤。在 一个实施方案中，从发酵液中回收己醇。在一个实施方案中，从发酵液中回收一种或多种 产物，所述产物包括甲酸、乳酸、丙丽酸、玻巧酸、额氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、己醜乳酸、苹果 酸、延胡索酸、巧樣酸和2-丽戊二酸。
[0056] 在第四方面，本发明提供了通过第H方面的方法产生的一种或多种产物。在一个 实施方案中，所述一种或多种产物选自己醇、甲酸、乳酸、丙丽酸、玻巧酸、额氨酸、亮氨酸、 异亮氨酸、己醜乳酸、苹果酸、延胡索酸、巧樣酸和2-丽戊二酸。在一个实施方案中，所述一 种或多种产物至少包括己醇。
[0057] 在第五方面，本发明提供了一氧化碳营养型产己酸微生物，和亲代微生物相比，所 述一氧化碳营养型产己酸微生物中的一种或多种非必需基因已被破坏。
[0058] 在第六方面，本发明提供了产生其中一种或多种非必需基因已被破坏的一氧化碳 营养型产己酸微生物的方法，所述方法包括遗传修饰亲代微生物中的一种或多种非必需基 因。
[0059] 本发明也提供了通过第六方面的方法产生的微生物。
[0060] 在一个实施方案中，一种或多种非必需基因是编码将己醜乳酸转化成己偶姻的 酶、和/或编码将己偶姻转化成2, 3-下二醇的酶的基因。在一个实施方案中，所述酶是如 本文所述的酶。
[0061]在某些实施方案中，所述微生物选自自产己醇梭菌、扬氏梭菌、拉氏梭菌、科斯卡 培梭菌、齡泥下酸杆菌炬utyribacteriumlimosum)、甲基营养下酸杆菌炬utyribacterium meth}dot;ro地i州m)、伍氏醋酸杆菌（Acetobacteriumwoodii)、己氏嗜碱菌 (Alkalibaculumbacchii)、Blautiaproducta、齡泥真杆菌巧ubacteriumlimosum)、热醋 穆尔氏菌（Moorellathermoacetica)、热自养穆尔氏菌（Moorellathermautotrophica)、 普氏产醋杆菌（Oxobacterpfennigii)和凯伍热厌氧菌（Thermoanaerobacterkiuvi)。
[0062] 在一些实施方案中，所述微生物选自自产己醇梭菌、扬氏梭菌和拉氏梭菌。在另一 个实施方案中，所述组也包括科斯卡培梭菌。
[0063] 在一个具体实施方案中，所述微生物是自产己醇梭菌DSM23693。
[0064] 在第走方面，本发明提供了用于通过微生物发酵产生一种或多种产物的方法，所 述微生物发酵使用了一种或多种第五方面的微生物和/或通过第六方面的方法产生的微 生物。
[0065] 在一个具体实施方案中，本发明提供了用于通过微生物发酵产生己醇和一种或多 种其他产物的方法，所述微生物发酵包括使用第五方面的和/或通过第六方面的方法产生 的一种或多种微生物对含C0的底物发酵。
[0066] 在一个实施方案中，所述方法包括如下步骤：
[0067] (a)将含C0的底物提供给生物反应器，所述生物反应器含有第五方面的和/或通 过第六方面的方法产生的一种或多种微生物的培养物；和
[0068] 化）在所述生物反应器中厌氧发酵所述培养物W产生一种或多种产物。
[0069] 在另一个实施方案中，所述方法包括W下步骤：
[0070] (a)在由工业生产过程产生的含C0的气体释放到大气中之前，将所述气体捕获；
[0071] 化）通过培养物厌氧发酵所述含C0的气体W产生一种或多种产物，所述培养物含 有第五方面的和/或通过第六方面的方法产生的一种或多种微生物。
[0072] 在一个实施方案中，所述一种或多种产物是如本文所述的产物。
[0073] 在一个实施方案中，所述含C0的底物是如本文所述的底物。
[0074] 广义上说，本发明还可单独或综合地包括本申请说明书中提及或指出的部分、要 素和特征，包括两个或多个所述部分、要素或特征的任意或所有组合，并且当本文提及的具 体整数在本发明所涉及的领域具有已知的等价物时，所述已知的等价物如同单独被提出一 样纳入本文。

【专利附图】

【附图说明】
[00巧]本发明的该些方面和其他方面一应该W其所有新的方面考虑一将通过后文 描述（仅作为示例）并参考附图而变得清楚，其中：
[0076]图1示出了产生2,3-下二醇的一氧化碳营养型产己酸菌（例如，自产己酸梭菌 DSM23693)中的C0的代谢途径。
[0077] 图化表明了在具有向己醇的碳通量再分配的产生2, 3-下二醇的一氧化碳营养型 产己酸菌中敲除2, 3-下二醇生物合成途径的影响并且显示了来自C0的新产物（例如，玻 巧酸、2-丽戊二酸、甲酸、额氨酸、亮氨酸）的产生。
[0078] 图2示出了自产己酸梭菌DSM23693基因组上的budA基因和其5'和3'侧翼区。 也显示了用于PMTL85141质粒的侧翼片段的PCR扩增和随后的克隆的引物。
[0079] 图3示出了用于自产己酸梭菌DSM23693中budA基因敲除的含有位于由lacZ基 因分开的DNA片段侧翼的5'和3'budA基因的示例性pMTL85141-budA-ko质粒。
[0080] 图4示出了用于本发明的示例性甲基化质粒。
[00引]图5示出了（A) ;budA基因敲除后自产己酸梭菌DSM23693的基因组区域的图形说 明并且也显示了用于筛选自产己酸梭菌DSM23693budA基因敲除的引物位置W及来自野生 型自产己酸梭菌DSM23693和其相应的budA基因敲除菌株的PCR产物的预期大小。炬）：自 产己酸梭菌DSM23693budA基因敲除的PCR筛选的琼脂糖凝胶电泳图像。泳道1和9表示 GeneRuler?lk:bPlusDNALadder。泳道2-6显不了使用引物0g09和Ogl化对从野生型 自产己酸梭菌DSM23693(+ve，2. 7化）和6个潜在的自产己酸梭菌DSM23693budA基因敲除 (1-6, 2. 2化）中分离的基因组DNA的budA祀区域进行的PCR扩增。泳道10-16显示了使用 对budA基因273bp的内部区域特异的引物0g44f和0g45i对从野生型（+ve)自产己酸梭 菌DSM23693和6个潜在的自产己酸梭菌DSM23693budA基因敲除中分离的基因组DNA进 行的PCR(*)。
[0082] 图6;使用引物0g44f/0g45i和0g42f/0g4化对自产己酸梭菌DSM23693budA和 2, 3b化基因中RAM插入进行的PCR确认。
[0083] 图7示出了自产己酸梭菌DSM23693和A2, 3b化ClosTron突变体在发酵过程中 将己偶姻转化为下二醇的速率。
[0084] 序列表的简单描沐
[0085] 该说明书附带序列表，其中列出下面的序列：
[0086]Seq.ID1:自产己醇梭菌DSM23693budA基因的核巧酸序列。
[0087]Seq.ID2:自产己醇梭菌DSM23693budA蛋白的氨基酸序列。
[0088]Seq.ID3:自产己醇梭菌DSM23693budA基因的5'侧翼区的核巧酸序列。
[0089]Seq.ID4:budA基因的3'侧翼序列的核巧酸序列。
[0090] SeqID5-8和10和11:如下文表1中描述的。
[0091]Seq.ID9:大肠杆菌-梭菌穿梭载体-质粒PMTL85141的核巧酸序列。
[0092]Seq.ID. 12:pMTL85141-budA-ko的核巧酸测序结果，其表明该质粒上存在的侧翼 DNA片段不含有突变。
[0093]SeqID13:自产己醇梭菌（Y18178, 01:7271109)的 16srRNA基因。
[0094]SeqID14:自产己醇梭菌DSM23693的潜在budA敲除转化体的克隆1的16srRNA 基因：（93% )的同一性。
[0095]Seq.ID15:自产己醇梭菌DSM23693的潜在budA敲除转化体的克隆2的16srRNA 基因；（94% )。
[0096]Seq.ID16:自产己醇梭菌DSM23693的潜在budA敲除转化体的克隆3的16srRNA 基因：（95% )。
[0097]Seq.ID17:自产己醇梭菌DSM23693的潜在budA敲除转化体的克隆4的16srRNA 基因：（93% )。
[0098]Seq.ID18:自产己醇梭菌DSM23693的潜在budA敲除转化体的克隆5的16srRNA 基因：（94% )。
[0099]Seq.ID19:自产己醇梭菌DSM23693的潜在budA敲除转化体的克隆6的16srRNA 基因：（92% )。
[0100]SeqID20.使用引物0g09f得到的自产己醇梭菌DSM23693的潜在budA敲除转化 体的克隆1的PCR产物的核巧酸测序结果（92% )。
[0101]SeqID21.使用引物Ogl化得到的自产己醇梭菌DSM23693的潜在budA敲除转化 体的克隆1的PCR产物的核巧酸测序结果（92% )。
[0102]SeqID22.使用引物Ogl化得到的自产己醇梭菌DSM23693的潜在budA敲除转化 体的克隆3的PCR产物的核巧酸测序结果（92% )。
[0103]SeqID23.使用引物Ogl化得到的自产己醇梭菌DSM23693的潜在budA敲除转化 体的克隆4的PCR产物的核巧酸测序结果（92% )。
[0104]SeqID24.使用引物Ogl化得到的自产己醇梭菌DSM23693的潜在budA敲除转化 体的克隆5的PCR产物的核巧酸测序结果。
[0105] SeqID25.使用引物0g09f得到的自产己醇梭菌DSM23693的潜在budA敲除转化 体的克隆6的PCR产物的核巧酸测序结果。
[0106]SeqID26.使用引物Ogl化得到的克隆6的自产己醇梭菌DSM23693budA祀区域 的核巧酸测序结果。
[0107]SeqID27和28 ;在下文的表4中描述。
[0108]Seq29和30:在下文的表4中描述。
[0109]SEQID31:和诱导型lac启动子融合的新的甲基转移酶基因的核巧酸序列。
[0110] SEQID32:新的甲基转移酶的蛋白序列。
[01川SEQID33:质粒PGS20的核巧酸序列。
[011引SEQ_IDNO34:自产己醇梭菌、扬氏梭菌和拉氏梭菌的新的醇脱氨酶的氨基酸序 列。
[0113]SEQ_IDNO35:自产己醇梭菌的新的醇脱氨酶的核酸序列。
[0114]SEQ_IDNO36:扬氏梭菌的新的醇脱氨酶的核酸序列。
[0115]SEQ_IDNO37:拉氏梭菌的新的醇脱氨酶的核酸序列。
[0116]Seq.ID. 38:自产己醇梭菌的苹果酸酶1的核巧酸序列。
[0117]Seq.ID. 39:自产己醇梭菌的苹果酸酶1的氨基酸序列。
[0118]Seq.ID. 40:自产己醇梭菌的苹果酸酶2的核巧酸序列。
[0119]Seq.ID. 41:自产己醇梭菌的苹果酸酶2的氨基酸序列。
[0120]Seq.ID. 42:自产己醇梭菌的苹果酸脱氨酶的核巧酸序列。
[0121]Seq.ID. 43:自产己醇梭菌的苹果酸脱氨酶的氨基酸序列。
[0122] Seq.ID. 44:自产己醇梭菌的丙丽酸磯酸双激酶的核巧酸序列。
[0123]Seq.ID. 45:自产己醇梭菌的丙丽酸磯酸双激酶的氨基酸序列。
[0124]Seq.ID. 46:自产己醇梭菌的丙丽酸駿化酶的核巧酸序列。
[0125]Seq.ID. 47:自产己醇梭菌的丙丽酸駿化酶的氨基酸序列。
[0126]Seq.ID. 48:自产己醇梭菌的丙丽酸駿激酶的核巧酸序列。
[0127]Seq.ID. 49:自产己醇梭菌的丙丽酸駿激酶的氨基酸序列。
[012引 Seq.ID. 50:自产己醇梭菌的延胡索酸水合酶亚基A的核巧酸序列。
[0129]Seq.ID. 51:自产己醇梭菌的延胡索酸水合酶亚基A的氨基酸序列。
[0130]Seq.ID. 52:自产己醇梭菌的延胡索酸水合酶亚基B的核巧酸序列。
[0131]Seq.ID. 53:自产己醇梭菌的延胡索酸水合酶亚基B的氨基酸序列。
[0132]Seq.ID. 54:自产己醇梭菌的延胡索酸还原酶1的核巧酸序列。
[0133]Seq.ID. 55:自产己醇梭菌的延胡索酸还原酶1的氨基酸序列。
[0134]Seq.ID. 56:自产己醇梭菌的延胡索酸还原酶2的核巧酸序列。
[0135]Seq.ID. 57:自产己醇梭菌的延胡索酸还原酶2的氨基酸序列。
[0136]Seq.ID. 58:自产己醇梭菌的延胡索酸还原酶3的核巧酸序列。
[0137]Seq.ID. 59:自产己醇梭菌的延胡索酸还原酶3的氨基酸序列。
[013引 Seq.ID. 60:拉氏梭菌的苹果酸酶1的核巧酸序列。
[0139]Seq.ID. 61:拉氏梭菌的苹果酸酶1的氨基酸序列。
[0140]Seq.ID. 62:拉氏梭菌的苹果酸脱氨酶的核巧酸序列。
[0141]Seq.ID. 63:拉氏梭菌的苹果酸脱氨酶的氨基酸序列。
[0142]Seq.ID. 64:拉氏梭菌的丙丽酸磯酸双激酶的核巧酸序列。
[0143]Seq.ID. 65:拉氏梭菌的丙丽酸磯酸双激酶的氨基酸序列。
[0144]Seq.ID. 66:拉氏梭菌的丙丽酸駿化酶的核巧酸序列。
[0145]Seq.ID. 67:拉氏梭菌的丙丽酸駿化酶的氨基酸序列。
[0146]Seq.ID. 68:拉氏梭菌的丙丽酸駿激酶的核巧酸序列。
[0147]Seq.ID. 69:拉氏梭菌的丙丽酸駿激酶的氨基酸序列。
[014引 Seq.ID. 70:拉氏梭菌的延胡索酸水合酶亚基A的核巧酸序列。
[0149]Seq.ID. 71:拉氏梭菌的延胡索酸水合酶亚基A的氨基酸序列。
[0150]Seq.ID. 72:拉氏梭菌的延胡索酸水合酶亚基B的核巧酸序列。
[0151]Seq.ID. 73:拉氏梭菌的延胡索酸水合酶亚基B的氨基酸序列。
[0152]Seq.ID. 74:拉氏梭菌的延胡索酸还原酶1的核巧酸序列。
[0153]Seq.ID. 75:拉氏梭菌的延胡索酸还原酶1的氨基酸序列。
[0154]Seq.ID. 76:拉氏梭菌的延胡索酸还原酶2的核巧酸序列。
[0155]Seq.ID. 77:拉氏梭菌的延胡索酸还原酶2的氨基酸序列。
[0156]Seq.ID78:扬氏梭菌budA基因的5'上游序列或同源臂。
[0157]Seq.ID79:扬氏梭菌budA基因的3'下游序列或同源臂。
[0158]Seq.ID80:拉氏梭菌budA基因的5'上游序列或同源臂。
[0159]Seq.ID81:拉氏梭菌budA基因的3'下游序列或同源臂。
[0160]SeqID82:自产己醇梭菌DSM23693budA上ClosTron祀向区域的核巧酸序列。
[0161]SeqID83;自产己醇梭菌DSM23693 2, 3b化上ClosTron祀向区域的核巧酸序列。
[0162]SeqID84:用于筛选A2, 3b化ClosTron突变体的寡核巧酸0g42f。
[0163]SeqID85:用于筛选A2, 3b化ClosTron突变体的寡核巧酸0g43r。
[0164]Seq.ID86:使用引物fDl得到的从自产己醇梭菌DSM23693A2, 3b化ClosTron 克隆2扩增的16srRNAPCR产物的核巧酸序列。
[0165] SeqID87:使用引物rP2得到的从自产己醇梭菌DSM23693A2,3b化ClosTron 克隆2扩增的16srRNAPCR产物的核巧酸序列。
[0166]Seq.ID88:使用引物fDl得到的自产己醇梭菌DSM23693A2, 3b化ClosTron克 隆4的16srRNAPCR产物的核巧酸序列。
[0167] SeqID89:使用引物rP2得到的自产己醇梭菌DSM23693A2,3b化ClosTron克 隆4的16srRNAPCR产物的核巧酸序列。
[0168]Seq.ID90:使用引物fDl得到的自产己醇梭菌DSM23693AbudAClosTron克隆1 的16srRNAPCR产物的核巧酸序列。
[0169]SeqID91:使用引物rP2得到的自产己醇梭菌DSM23693AbudAClosTron克隆 1的16srRNAPCR产物的核巧酸序列。
[0170]Seq.ID92:使用引物fDl得到的自产己醇梭菌DSM23693AbudAClosTron克隆 3的16srRNAPCR产物的核巧酸序列。
[0171]SeqIDand93:使用引物rP2 得到的自产己醇梭菌DSM23693AbudAClosTron 克隆3的16srRNAPCR产物的核巧酸序列。
[0172]SeqID94 ;自产己醇梭菌DSM23693 2, 3b化基因的5'同源臂的核巧酸序列。
[0173]SeqID95:自产己醇梭菌DSM23693 2, 3b化基因的3'同源臂的核巧酸序列。
[0174]Seq.ID96和97:用于扩增自产己醇梭菌DSM23693 2, 3b化基因的5'同源臂的引 物和。
[01巧]Seq.ID98和99:用于扩增自产己醇梭菌DSM23693 2, 3b化基因的3'同源臂的引 物。
[0176]Seq.ID100和101:可用于确认自产己醇梭菌DSM23693 2, 3b化基因敲除的侧翼 引物。
[0177]SeqID102:自产己醇梭菌DSM23693SecA化基因的5'同源臂的核巧酸序列。
[0178]SeqID103:自产己醇梭菌DSM23693SecA化基因的3'同源臂的核巧酸序列。
[0179]Seq.ID104和105:用于扩增自产己醇梭菌DSM23693 2, 3b化基因的5'同源臂的 引物。
[0180]Seq.ID106和107 ;用于扩增自产己醇梭菌DSM23693 2, 3b化基因的3'同源臂的 引物。
[0181]Seq.ID108和109:可用于确认自产己醇梭菌DSM23693SecA化基因敲除的侧翼 引物。
[0182]SeqID110:自产己醇梭菌DSM23693SecA化基因的II类内含子祀向盒的核巧酸 序列。
[0183]Seq.ID111和112:可用于确认自产己醇梭菌DSM23693SecA化基因插入失活的 侧翼引物。
[0184]SeqID113:自产己醇梭菌DSM23693alsS基因的5'同源臂的核巧酸序列。
[0185]SeqID114:自产己醇梭菌DSM23693alsS基因的3'同源臂的核巧酸序列。
[0186]Seq.ID115和116:用于扩增自产己醇梭菌DSM23693alsS基因的5'同源臂的引 物序列。
[0187]Seq.ID117和118:用于扩增自产己醇梭菌DSM23693alsS基因的3'同源臂的引 物序列。
[0188]Seq.ID119和120:可用于确认自产己醇梭菌DSM23693alsS基因敲除的侧翼引 物的序列。
[0189]SeqID120:自产己醇梭菌DSM23693ilvC基因的5'同源臂的核巧酸序列。
[0190]SeqID121:自产己醇梭菌DSM23693ilvC基因的3'同源臂的核巧酸序列。
[0191]Seq.ID123和124:用于扩增自产己醇梭菌DSM23693ilvC基因的5'同源臂的引 物序列。
[0192]Seq.ID125和126:用于扩增自产己醇梭菌DSM23693ilvC基因的3'同源臂的引 物序列。
[0193]Seq.ID127和128:可用于确认自产己醇梭菌DSM23693ilvC基因敲除的侧翼引 物的序列。
[0194]SeqID129:自产己醇梭菌DSM23693ilvl基因的5'同源臂的核巧酸序列。
[0195]SeqID130:自产己醇梭菌DSM23693ilvl基因的3'（Seq.ID130)同源臂的核 巧酸序列。
[0196]Seq.ID131和132:用于扩增自产己醇梭菌DSM23693ilvl基因的5'同源臂的引 物序列。
[0197]Seq.ID133和134:用于扩增自产己醇梭菌DSM23693ilvl基因的3'同源臂的引 物序列。
[0198]Seq.ID135和136:可用于确认自产己醇梭菌DSM23693ilvl基因敲除的侧翼引 物的序列。
[0199]SeqID137:自产己醇梭菌DSM23693ilvB基因的5'同源臂的核巧酸序列。
[0200]SeqID138:自产己醇梭菌DSM23693ilvB基因的3'同源臂的核巧酸序列。
[0201] Seq.ID139和140:用于扩增自产己醇梭菌DSM23693ilvB基因的5'同源臂的引 物序列。
[0202] Seq.ID141和142:用于扩增自产己醇梭菌DSM23693ilvB基因的3'同源臂的引 物序列。
[020引 Seq.ID143和144:可用于确认自产己醇梭菌DSM23693ilvB基因敲除的侧翼引 物的序列。
[0204]SeqID145:alsS的ClosTron内含子祀向核巧酸序列的实例。
[0205]SeqID146:ilvC的ClosTron内含子碑1向核巧酸序列的实例。
[0206]SeqID147:ilvl的ClosTron内含子祀向核巧酸序列的实例。
[0207]SeqID148:ilvB的ClosTron内含子祀向核巧酸序列的实例。
[020引 SeqID149和150:可用于筛选alsSClosTron突变体的寡核巧酸。
[0209]SeqID151和152:可用于筛选ilvCClosTron突变体的寡核巧酸。
[0210] SeqID153和154:可用于筛选ilvlClosTron突变体的寡核巧酸。
[0211] SeqID155和156:可用于筛选ilvBClosTron突变体的寡核巧酸。
[021引 所有的序列都使用标准的IUPAC缩写，参见ht化://en.m.W化ipedia.org/w化i/ Nucleic_acid_notation#section_l。例女口 ：
[0213] A腺嘿岭核巧
[0214] C胞嚼巧核巧
[0215] G鸟嘿岭核巧
[0216]T 胸腺嚼巧
[0引7] WAorT
[0引引 SC或G
[0引引 MA或C
[0220] KG或T
[022。 RA或G
[022引 YC或T
[022引 BC、G或 T
[0224] DA、G或 T
[022引 HA、C或 T
[022引 VA、C或 G
[0227]N或-任何碱基（不是缺口）、A、C、G、T【具体实施方式】
[022引 W下是在广义上给出的对本发明（包括其优选的实施方案）的说明。下文在标题 "实施例"下给出的公开内容进一步解释本发明，其提供了支持本发明的实验数据、本发明 多个方面的具体实例W及实施本发明的方法。
[0229] 本发明提供了能够通过发酵含C0的底物产生一种或多种产物的微生物。在一个 具体实施方案中，本发明提供了能够通过发酵含C0的底物产生己醇，或己醇和一种或多种 其他产物的微生物。和亲代微生物相比，所述重组微生物至少产生减少量的2, 3-下二醇和 /或其前体。在一种实施方案中，和亲代微生物相比，所述微生物基本不产生2, 3-下二醇或 其前体。
[0230] 通过多种基因敲除研究，本发明人意外地鉴定出如果在一氧化碳营养型产己酸微 生物中破坏2, 3-下二醇生物合成途径，则与亲代微生物相比，所述微生物能够产生增加水 平的甲酸、乳酸、玻巧酸、2-丽戊二酸、额氨酸、亮氨酸、异亮氨酸和己醇。本发明人也认为所 述微生物产生了增加水平的丙丽酸和TCA循环中间体化合物己醜乳酸、苹果酸、延胡索酸、 巧樣酸，因为它们是玻巧酸、2-丽戊二酸和额氨酸、亮氨酸和异亮氨酸生产的前体。该有很 多显著的优势。一个主要的优势是己醇生产的效率的提高，包括产生的更高水平的己醇。不 希望園于任何具体理论，本发明人认为额氨酸、亮氨酸、甲酸、乳酸和丙丽酸的水平的增加 使得微生物可用更多该些化学物质来供给己醇产生。另外，必须经常用氨基酸和其他化学 物质补充发酵液W确保发酵过程中微生物的生存能力和生产效率。通过本发明重组微生物 产生额氨酸、亮氨酸、甲酸、乳酸和丙丽酸可W不再需要用该些化学物质补充发酵液，节约 了成本。另外，本发明的微生物中降低或去除2, 3-下二醇产生也具有优势。2, 3-下二醇可 能对微生物有毒并因此可对发酵和生长产生负面影响。降低或去除发酵液中的2, 3-下二 醇也使得更容易从发酵液中回收己醇；通常必须一起回收己醇和2, 3-下二醇并且接着将 它们在随后的步骤中分离。因为2, 3-下二醇是很多有害生物的底物，因此它也是发酵罐中 的潜在的微生物污染源。另外，由于玻巧酸、2-丽戊二酸、甲酸、乳酸、丙丽酸、额氨酸、亮氨 酸和异亮氨酸可用于很多商业过程并且可在下游化学产物生产中用作中间体化合物，因此 它们具有独立的经济价值。
[0231] 本发明人已经首次证明了在一氧化碳营养型产己酸微生物中非必需基因的破坏 或敲除。相应地，在另一方面，本发明也提供了一氧化碳营养型产己酸微生物W及产生该些 微生物的方法和使用该些微生物的方法，其中和亲代微生物相比，所述微生物的一种或多 种非必需基因已被破坏。"非必需基因"是编码该样一种蛋白的基因，所述蛋白不是微生物 生存所必需的，因此不补充该蛋白微生物也能生存。非必需基因的实例包括编码己醜乳酸 脱駿酶和2, 3-下二醇脱氨酶的那些基因。技术人员能够使用本领域的标准技术（包括破 坏基因（如本文所述）的重组技术W及测试该些遗传修饰是否对微生物的生存产生影响的 标准测定法）鉴定非必需基因。
[0232] 虽然下文本发明的描述将重点放在通过遗传修饰对2, 3-下二醇生物合成途径的 破坏上，应理解如果需要的话本发明的微生物也可包括一种或多种其他的遗传修饰（包括 破坏一种或多种与2, 3-下二醇生物合成途径无关的非必需基因）。对于涉及破坏非必需基 因的本发明方面，应理解包括对编码不是2, 3-下二醇途径中的酶的基因的遗传修饰。
[0233] 另外，尽管下文的描述可能将重点放在作为主产物的己醇的产生和回收上，应理 解本发明可用于提高一种或多种非己醇的产物的产生水平或者除了己醇之外还同时提高 一种或多种产物的产生水平。
[0234] 定父
[0235] 本文中提到的"发酵液"是包含至少一种营养培养基和细菌细胞的培养基。
[0236] 本文中提到的穿梭微生物是其中表达甲基转移酶的微生物，并且其不同于目标微 生物。
[0237] 本文中提到的目标微生物是其中表达包括在表达构建体/载体上的基因的微生 物，并且其不同于所述穿梭微生物。
[023引术语"主要发酵产物"意指W最高的浓度和/或产率产生的那种发酵产物。
[0239]当用于发酵过程时，术语"提高效率"、"提高的效率"等包括但不限于提高如下中 的一个或多个：催化所述发酵的微生物的生长速率、生长和/或产物产生速率、产生的所需 产物（例如醇）的体积/消耗的底物的体积、所需产物的产生速率或产生水平、W及产生的 所需产物与所述发酵的其他副产物相比的相对比例。
[0240] 短语"含一氧化碳的底物"及类似术语应被理解为包括任意底物，其中一氧化碳可 被一种或多种细菌菌株用于例如生长和/或发酵。
[0241] 短语"含一氧化碳的气态底物"及类似短语和术语包括含有某一水平一氧化碳的 任意气体。在某些实施方案中，所述底物含有至少约20体积％至约100体积％的C0、20体 积％至70体积％的C0、30体积％至60体积％的C0、和40体积％至55体积％的C0。在具 体实施方案中，所述底物包含约25体积％、或约30体积％、或约35体积％、或约40体积％、 或约45体积％、或约50体积％的C0、或约55体积％的C0、或约60体积％的C0。
[0242] 虽然所述底物不必需含有任何氨气，但是存在&应该不会对本发明方法的产物不 利。在具体实施方案中，存在氨气可获得提高的醇产生的整体效率。例如，在具体实施方案 中，所述底物可包含约2:1、或1:1或1:2比例的CO。在一个实施方案中，所述底物包含 约30体积％或更低的&、20体积％或更低的&、约15体积％或更低的&、或者约10体积％ 或更低的&。在其他实施方案中，所述底物流包含低浓度的&，例如小于5体积％、或小于4 体积％、或小于3体积％、或小于2体积％、或小于1体积％或者基本上不含氨气。例如，所 述底物还可含有一些CA，例如约1体积％至约80体积％的0)2、或1体积％至约30体积％ 的CA。在一个实施方案中，所述底物包含小于或等于约20体积％的0)2。在具体的实施方 案中，所述底物包含小于或等于约15体积％的C〇2、小于或等于约10体积％的C〇2、小于或 等于约5体积％的(?或者基本上不含〔化。
[0243] 在W下的说明书中，从递送和发酵"含C0的气态底物"的方面描述本发明的实施 方案。但是，应理解，所述气态底物可W其他形式提供。例如，所述含C0的气态底物可W溶 解于液体中的形式提供。实质上，将液体用含一氧化碳的气体饱和，然后将所述液体加入 生物反应器中。该可使用标准的方法学实现。例如，可使用微泡分散发生器化ensirisak et.al.Scale-upofmicrobubbledispersiongeneratorforaerobicfermentation； AppliedBiochemistryandBiotechnologyVolume101，Number3/〇ctober，2002)。又例 女口，可将所述含CO的气态底物吸附到固态支持物上。该些替代方法被术语"含CO的底物" 等所涵盖。
[0244] 在本发明的具体实施方案中，所述含C0的气态底物是工业排气或废气。"工业废 气或工业排气"应被广义地认为包括工业过程产生的任何含C0的气体，并且包括铁金属产 品生产、有色金属产品生产、石油精炼过程、煤的气化、生物质的气化、电力生产、炭黑生产 和焦炭生产所产生的气体。本文其他部分还提供了另外的实例。
[0245] 除非另有说明，否则本文所用的短语"发酵"、"发酵过程"或"发酵反应"等意图包 括所述过程的生长阶段和产物生物合成阶段。如下所述，在一些实施方案中，所述生物反应 器可包括第一生长反应器和第二发酵反应器。因此，向发酵反应中加入金属或组合物应被 理解为包括加入到该些反应器之一或两个中。
[0246] 术语"生物反应器"包括由一个或多个容器和/或培或管道排布组成的发酵装置， 其包括连续揽拌蓋反应器（CSTR)、固定化细胞反应器（ICR)、滴流床反应器（TBR)、鼓泡培、 气升式发酵罐、静态混合器或适用于气-液接触的其他容器或其他装置。如下所述，在一些 实施方案中，所述生物反应器可包含第一生长反应器和第二发酵反应器。因此，当提到向所 述生物反应器或发酵反应中加入底物时，如果合适，应该理解为加入到该些反应器之一或 两个中。
[0247]当用于依据本发明的发酵产物时，"一种或多种产物"等类似的短语意指包括例如 己醇、玻巧酸、丙丽酸、乳酸、额氨酸、甲酸、异亮氨酸和亮氨酸。在一个实施方案中，"一种或 多种产物"也可包括己醜乳酸、苹果酸、延胡索酸、巧樣酸、和2-丽戊二酸中的一种或多种。 应理解本发明的方法适用于意在用于己醇（单独或与其他产物结合）的产生和回收或除了 己醇之外的产物的产生和回收的方法。
[024引所述术语"己酸盐"包括单独的己酸盐，W及分子或游离己酸与己酸盐的混合物， 例如存在于如本文可能描述的所述发酵液中的己酸盐和游离己酸的混合物。所述发酵液中 的分子己酸与己酸盐的比例取决于所述系统的抑。术语玻巧酸、丙丽酸、乳酸、甲酸、己醜乳 酸、苹果酸、延胡索酸、巧樣酸、和2-丽戊二酸应被相似地理解。
[0249] 除非另有说明，提到本文任何可W-种或多种异构形式（例如，D、L、内消旋、S、R、 顺式或反式形式）的化合物，应通常被认为包括提到所述化合物的任何一种或多种该样的 异构体。例如，提到"己偶姻"应被认为包括提到其D和L异构体之一或两者。
[0250] "外源核酸"是源自待引入其的微生物之外的核酸。外源核酸可源自任意适合的来 源，包括但不限于待引入它们的微生物、与待引入它们的生物不同的微生物菌株或种，或者 它们可通过人工或重组方法形成。所述外源核酸可被改造为适于整合到待引入其的微生物 的基因组中，或者保持染色体外状态。
[0巧1] 所述"2, 3-下二醇生物合成途径"是一种反应途径，所述反应包括将丙丽酸转化成 己醜乳酸、将己醜乳酸转化成己偶姻、和将己偶姻转化成2, 3-下二醇。
[0巧2] 如本文使用的，"破坏所述2, 3-下二醇生物合成途径"等类似的短语意指降低 2, 3- 了二醇的产生，或在一种实施方案中基本消除（eliminated) 2, 3- 了二醇的产生。 [0253] "2, 3- 了二醇的前体"意指涵盖己偶姻和己醜乳酸。
[0巧4] 酶"能够转化"第一化合物或底物为第二化合物或产物，如果W其活性形式存在， 酶能够催化其中至少一部分第一化合物被转化为第二化合物的反应。
[0巧5] 提到"醇脱氨酶"应被认为包括能够催化丽（例如己偶姻）转化为仲醇（例如 2, 3-下二醇）的醇脱氨酶，或者反之亦然。该样的醇脱氨酶包括仲醇脱氨酶和伯醇脱氨酶。 "仲醇脱氨酶"是可将丽（例如己偶姻）转化为仲醇（例如2, 3-下二醇）的醇脱氨酶，或 反之亦然。"伯醇脱氨酶"是可将酵转化为伯醇的醇脱氨酶，或反之亦然；但是，许多伯醇脱 氨酶也能够催化丽转化为仲醇，或反之亦然。该些醇脱氨酶也可称为"伯醇-仲醇脱氨酶"。 因此，在本发明的某些实施方案中，提到"2, 3-下二醇脱氨酶"应被认为包括提到可能被归 类为伯醇、仲醇或伯醇-仲醇脱氨酶的2, 3-下二醇脱氨酶。
[0巧6]"遗传修饰"一所述遗传修饰破坏了 2, 3-下二醇生物合成途径或破坏了依据本 发明的一种或多种酶的表达或活性一应被广义地认为包括任何该样的遗传修饰，所述遗 传修饰至少降低了 2, 3-下二醇的生物合成、一种或多种酶的表达或活性或者在一些实施 方案中基本抑制了一种或多种酶的表达或活性或基本阻止了 2, 3-下二醇的产生。所述短 语应被认为包括，例如：对编码一种或多种所述酶的基因的修饰（包括对参与基因表达的 基因调节元件的修饰）；核酸的引入，所述核酸产生降低或抑制了一种或多种所述酶活性 的蛋白、或者降低或阻止了一种或多种所述酶表达的蛋白；核酸的引入，所述核酸表达被改 造为适于阻断基因表达的核酸（例如，反义RNA、siRNA(小干扰RNA)、CRISPR(成簇的规律 间隔的短回文重复序列））；通过将修饰引入到编码蛋白的基因中来降低或抑制所述蛋白， 所述蛋白是一种或多种所述酶的表达或活性所必需。应理解一种或多种所述酶的表达或活 性所需的蛋白可直接作用于一种基因或一种或多种酶，或可间接通过其他化合物起作用。 相似地，降低或抑制一种或多种所述酶的活性或表达的蛋白可直接作用于所述基因或所述 一种或多种酶，或可间接通过其他化合物起作用。
[0巧7]"基因修饰"应被广义地认为并且意指包括，例如，将一种或多种外源核酸引入到 微生物中、将突变引入基因位点上、添加或从基因组中移除一种或多种核巧酸、用不同的核 巧酸置换一种或多种核巧酸、置换基因、移除基因、添加基因等等。
[0巧引"亲代微生物"是用于产生本发明的重组微生物的微生物。在一种实施方案中，所 述亲代微生物可W是天然存在的微生物（即野生型微生物）或之前曾被修饰过的微生物 (遗传修饰的或重组微生物）。在本发明涉及产生降低量的或基本不产生2, 3-下二醇的微 生物的实施方案中，所述亲代微生物是含有功能性的2, 3-下二醇途径的微生物（包括天然 存在的微生物或之前曾被修饰过的微生物）。含有功能性的2, 3-下二醇生物合成途径的亲 代微生物的实例包括自产己醇梭菌、扬氏梭菌、拉氏梭菌、科斯卡培梭菌W及相关分离株。
[0巧9]"功能性"的2, 3-下二醇生物合成途径是其中微生物能将丙丽酸转化成2, 3-下二 醇的途径。在一个具体实施方案中，所述途径包括将丙丽酸转化成己醜乳酸、将己醜乳酸转 化成己偶姻、和将己偶姻转化成2, 3-下二醇。在一个具体实施方案中，丙丽酸转化成己醜 乳酸是由己醜乳酸合酶催化的、己醜乳酸转化成己偶姻是由己醜乳酸脱駿酶催化的、己偶 姻转化成2, 3-下二醇是由2, 3-下二醇脱氨酶或己偶姻还原酶催化的。
[0260] 术语核酸"构建体"或"载体"及类似术语应被广义地认为包括适合用作载体将遗 传物质转移到细胞中的任意核酸（包括DNA和RNA)。该术语应被认为包括质粒、病毒（包 括瞻菌体）、粘粒和人工染色体。构建体或载体可包括一种或多种调节元件、复制起点、多克 隆位点和/或选择标记。在具体的实施方案中，所述构建体或载体被改造为适于破坏亲代 微生物中天然存在的基因。在另一个实施方案中，所述构建体或载体被改造为适于使得由 所述构建体或载体编码的一种或多种基因表达。核酸构建体或载体包括裸露核酸，W及用 一种或多种可帮助向细胞递送中的试剂配制的核酸（例如脂质体缀合的核酸、其中含有所 述核酸的有机体）。
[0261] 在说明书通篇中，提供了适用于本发明的酶的示例性序列信息（例如，己醜乳酸 合酶、己醜乳酸脱駿酶、2, 3-下二醇脱氨酶、己偶姻还原酶）。提供该信息用来鉴定适用于 本发明的示例性酶并且使得技术人员能够实施本发明的具体实施方案而无需过多实验。应 理解酶的核酸序列和氨基酸序列可根据微生物的不同而不同。因此，本发明不应被理解为 仅限于该些具体的实施方案，而是应被理解为延伸到对该样的酶的破坏，即所述酶具有不 同的序列但是能够催化丙丽酸转化成己醜乳酸、己醜乳酸转化成己偶姻和/或己偶姻转化 成2, 3-下二醇。通常，所述酶具有和本文示例性的酶至少约75%的氨基酸序列同一性。在 具体实施方案中，所述酶具有和本文示例性的酶至少约80%、85%、90%、95%或99%的序 列同一性。在所述核酸水平上，编码该些变体酶的基因具有和编码本文示例性的酶的核酸 至少约75%的序列同源性。在具体实施方案中，该些核酸具有和编码本文示例性的酶的核 酸至少约80 %、85 %、90 %、95 %或99 %的序列同源性。
[0262] 也应理解所述变体酶不需要具有和本文具体示例性的酶相同的活性水平。只 需要所述酶在催化目的转化时具有某些活性水平。技术人员会容易理解其他该样的酶， 尤其是考虑到本文所包含的信息。用于评估所述2, 3-下二醇途径的酶的活性的酶测定 法包括例如由SpeckmanandCollins(SpecificityoftheWesterfeldAdaptationof theVoges-ProskauerTest, 1982,Appl.Environ.Microbiol. 44:40-43)或Dulieuand Poncelet(Spectrophotometricassayofaacetolactatedecarboxylase,1999,Enzy andMicrobiolTechnol, 25, 537-42)记载的Voges-Proskauertest测定法。
[026引微牛物
[0264] 如上文所述，本发明提供了重组微生物，所述重组微生物能够使用一氧化碳产生 一种或多种产物（在一个具体实施方案中，己醇作为主要产物）并且与亲代微生物相比能 够产生减少量的或基本不产生2, 3-下二醇和/或其前体。所述微生物包含破坏了 2, 3-下 二醇生物合成途径的一种或多种遗传修饰（和亲代微生物相比）。
[0265] 如上所述，在一个实施方案中，所述微生物产生己醇作为主要产物。在一个实施方 案中，所述微生物也产生甲酸、乳酸、丙丽酸、玻巧酸、额氨酸、亮氨酸、异亮氨酸中的一种或 多种。在一个实施方案中，所述微生物被改造为适于产生与亲代微生物相比的增加量的己 醇、甲酸、乳酸、丙丽酸、玻巧酸、额氨酸、亮氨酸、异亮氨酸中的一种或多种。在某些实施方 案中，所述微生物产生己醜乳酸、苹果酸、巧樣酸、延胡索酸、2-丽戊二酸中的一种或多种。 在一个具体实施方案中，所述微生物被改造为适于产生增加量的己醜乳酸、苹果酸、延胡索 酸、2-丽戊二酸中的一种或多种。
[0266] 所述一种或多种遗传修饰优选破坏能够将丙丽酸转化成己醜乳酸、将己醜乳酸转 化成己偶姻、将己偶姻转化成2, 3-下二醇的一种或多种酶的表达和/或活性。在某些实施 方案中，所述一种或多种遗传修饰仅破坏丙丽酸到己醜乳酸的转化、仅破坏己醜乳酸到己 偶姻的转化或仅破坏己偶姻到2, 3-下二醇的转化。在其他实施方案中，所述一种或多种遗 传修饰破坏了该些转化中的两种或H种。
[0267] 在一个实施方案中，所述一种或多种能将丙丽酸转化为己醜乳酸的酶是己醜乳酸 合酶（als巧。
[026引己醜乳酸合酶活性能够将丙丽酸转化成己醜乳酸并且是支链氨基酸（包括额氨 酸、亮氨酸、异亮氨酸）产生所必需的（图1)。可在亲代微生物中表达具有己醜乳酸合 酶活性的一种或多种酶。可从GenBank中获得自产己醇梭菌（AEI90719. 1、AEI90730. 1、 AEI90731. UAEI90713. UAEI90714. 1)、扬氏梭菌（ADK15104. UADK15104. UADK15105. 1、 ADK15400. 1、ADK15400. 1)和拉氏梭菌（AEI90734. 1、AEI907：M. 1、AEI90735. 1、 AEI90727. 1、AEI90727. 1)的示例性氨基酸序列W及自产己醇梭菌（册876013. 1、 册876023. 1、册876021. 1)、扬氏梭菌（CP001666. 1-化JU_c38920、化JU_c32420、化JU_ C20420-30)和拉氏梭菌（册876014. 1、册876024. 1、册876022. 1)的各自核酸序列。但是，女口 上文所述，编码所述酶的基因的序列和所述酶的氨基酸序列可根据微生物的不同而变化。
[0269] 在某些实施方案中，亲代微生物可包含一种W上能够将丙丽酸转化成己醜乳酸的 酶。当亲代微生物含有一种W上能够将丙丽酸转化成己醜乳酸的酶时，可引入一种或多种 基因修饰W使得破坏两种或多种所述酶的表达和/或活性。当亲代微生物中存在一种W上 酶时，破坏一种W上所述酶可能产生W下作用：将玻巧酸、一种或多种TCA循环中间体和/ 或己醇的产生增加到高于仅破坏单个酶时可达到的水平。可通过破坏存在于所述亲代微生 物中的每一个额外的酶来进一步提高产生水平。虽然破坏所有所述酶的表达和/或活性可 在所需产物的产生方面提供一些优势，本发明人认为不必破坏所有所述酶的表达和/或活 性即可获得本发明的有益效果。
[0270] 在一个实施方案中，至少两种、H种、四种或五种能够将丙丽酸转化为己醜乳酸的 酶被破坏。
[0271] 在本发明的实施方案中，当丙丽酸到己醜乳酸的转化基本或全部被阻断时，微生 物的生长和通过微生物的发酵可能需要补充一种或多种氨基酸（包括，例如，额氨酸、亮氨 酸和异亮氨酸）。该可通过任何使氨基酸能够被微生物利用的方法来实现。例如，可将一 种或多种氨基酸加入到培养、生长或发酵培养基中、微生物的培养物中、和/或发酵液中。 在某些实施方案中，可将氨基酸直接加入到培养基或发酵液中或W提取物（例如酵母提取 物）的形式加入。
[0272] 在一个实施方案中，所述一种或多种能将己醜乳酸转化为己偶姻的酶是己醜乳酸 脱駿酶（budA)。
[0273] 己醜乳酸脱駿酶活性能够将己醜乳酸转化为己偶姻（图1)。可在亲代微生物中表 达具有己醜乳酸脱駿酶活性的一种或多种酶。可从GenBank中获得自产己醇梭菌、扬氏梭 菌和拉氏梭菌的己醜乳酸脱駿酶的示例性氨基酸（AEI90717. 1、ADK13906. 1、AEI90718. 1) 和核酸（册876011. 1、CP001666. 1-化JU_c08380、册876012. 1)序列信息。但是，如上文所 述，编码所述酶的基因的序列和所述酶的氨基酸序列可根据微生物的不同而变化。
[0274] 在某些实施方案中，亲代微生物可包含一种W上能够将己醜乳酸转化为己偶姻的 酶。当亲代微生物含有一种W上该类酶时，可引入一种或多种基因修饰W使得破坏两种或 多种所述酶的表达和/或活性。当亲代微生物中存在一种W上所述酶时，破坏一种W上所 述酶可能产生W下作用：将额氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、己醇、乳酸、甲酸和玻巧酸、和/或一 种或多种TCA循环中间体的产生增加到高于仅破坏单个酶时可达到的水平。可通过破坏存 在于所述亲代微生物中的每一个额外的酶来进一步提高产生水平。虽然破坏所有所述酶的 表达和/或活性可在所需产物的产生方面提供一些优势，本发明人认为不必破坏所有所述 酶的表达和/或活性即可获得本发明的有益效果。
[0275] 在一个实施方案中，所述一种或多种能将己偶姻转化为2, 3-下二醇的酶选自 2, 3-下二醇脱氨酶（2, 3-b化）和己偶姻还原酶。
[0276] 2, 3-下二醇脱氨酶活性是能够将己偶姻转化为2, 3-下二醇（图1)。可从 GenBank中获得自产己醇梭菌、扬氏梭菌和拉氏梭菌的己醜乳酸脱駿酶的示例性氨基酸 (AEI90715. 1、ADK15380. 1、AEI90716. 1)和核酸（册876009. 1、CP001666.l-CLJU_c23220、 册876010. 1)序列信息。可在亲代微生物中表达具有己醜乳酸合酶活性的一种或多种酶。 例如，本发明人已经鉴定出自产己醇梭菌、拉氏梭菌和扬氏梭菌含有其他能够将己偶姻转 化为2,3-下二醇的伯醇；仲醇脱氨酶。569 1〇11〇334、35、36和37中提供了该酶的示例性 序列信息。但是，如上文所述，编码所述酶的基因的序列和所述酶的氨基酸序列可根据微生 物的不同而变化。
[0277] 在某些实施方案中，亲代微生物可包括一种W上能够将己偶姻转化为2, 3-下二 醇的酶。当亲代微生物含有一种该类酶时，可引入一种或多种基因修饰W使得破坏两种或 多种所述酶的表达和/或活性。当亲代微生物中存在一种W上该类酶时，破坏一种W上该 类酶可能具有W下作用：将额氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、己醇、乳酸、甲酸和玻巧酸、和/或一 种或多种TCA循环中间体的产生增加到高于仅破坏单个酶时可达到的水平。可通过破坏存 在于所述亲代微生物中的每一个额外的酶来进一步提高产生水平。虽然破坏所有所述酶的 表达和/或活性可在所需产物的产生方面提供一些优势，本发明人认为不必破坏所有所述 酶的表达和/或活性即可获得本发明的有益效果。
[027引在一个实施方案中，至少两种或H种能够将己偶姻转化为2, 3-下二醇的酶被破 坏。
[0279] 在一个实施方案中，所述微生物选自产己酸一氧化碳营养型生物，包括自产己醇 梭菌、扬氏梭菌、拉氏梭菌、食一氧化碳梭菌（Clostridiumcarboxidivorans)、德氏梭菌(Clostridium化akei)、粪味梭菌（Clostridiumscatologenes)、醋酸梭菌（Clostridium aceti州m)、蚁酸醋酸梭菌（Clostridiumformicoaceti州m)、大梭菌（Clostridium ma即um)、伍氏醋酸杆菌（Acetobacteriumwoodii)、己氏嗜碱菌（A化aliba州lum bacchii)、热醋穆尔氏菌（Moorellathermoacetica)、卵形鼠抱菌（Sporomusaovate)、甲 基营养下酸杆菌炬utyribacteriummeth}dot;ro地i州m)、Blautiaproducta、齡泥真杆菌 (Eubacteriumlimosum)、凯伍热厌氧菌（Thermoanaerobacterkiuvi)。
[0280] 该些一氧化碳营养型产己酸菌由它们在形成己醜-CoA、己酸盐和其他产物的 厌氧条件下利用并W气态一碳（C1)来源（例如一氧化碳（C0)和含有C0和/或氨气 化）的二氧化碳（C〇2))作为能源而进行化能自养生长的能力定义。所述一氧化碳营养 型产己酸菌具有相同的发酵模式，Wood-Uungd址1或还原性己醜-CoA途径，并且由W 下酶组的存在定义，所述酶组包括一氧化碳脱氨酶（C0DH)、氨化酶、甲酸脱氨酶、甲醜四 氨叶酸合成酶、亚甲基四氨叶酸脱氨酶、甲醜四氨叶酸环水解酶、亚甲基四氨叶酸还原 酶和一氧化碳脱氨酶/己醜-CoA合酶（C0DH/ACS)，该组合是该类细菌特征性的和特有 的值rake,肺sel,Matthies,Wood, &Ljungd址1,2006)。与糖发酵细菌的化能自养生长 相比一所述糖发酵细菌能将底物转化为生物质、次级代谢产物和从其形成产物（通过 己醜-CoA或直接形成）的丙丽酸，在产己酸菌中底物被直接输送（channel)转化为己 醜-CoA，从己醜-CoA形成产物、生物质和次级代谢产物。
[0281] 在一个实施方案中，所述微生物选自一组一氧化碳营养型梭菌，所述梭菌包括 自产己醇梭菌、扬氏梭菌、和拉氏梭菌W及相关分离株。该些包括但不限于自产己醇梭 菌JAI-IT值SM10061) (Abrini,化veau，&Nyns, 1994)、自产己醇梭菌LBS1560(DSM19630) (W0/2009/064200)、自产己醇梭菌LBS1561 (DSM23693)、扬氏梭菌阳TCT值SM13528 = ATCC55383) (Tanner，Miller，&Yang, 1993)、扬氏梭菌邸I-2(ATCC55380)(美国专利 5,593,886)、扬氏梭菌〇01(410： 55988)(美国专利 6,368,819)、扬氏梭菌0-52(410： 55989)(美国专利6, 368, 819)、或"拉氏梭菌PllT"(ATCCBAA-622) (W0 2008/028055)、和 相关分离株例如"科斯卡培梭菌"扣S专利2011/0229947)、W及其突变株（例如，扬氏梭 菌 0TA-1)(Tirado-Acevedo0.ProductionofBioethanolfromSynthesisGasUsing Clostridium1jungdahlii.PhDthesis,NorthCarolinaStateUniversity, 2010)。
[028引 该些菌株形成梭菌rRNAI群内的亚群（Collinsetal.，1994)，尽管如DNA-DNA 再结合和DM指纹印迹实验所测定的，所述菌株是不同的种属，但是它们在16SrRNA基因 水平上具有至少99%的同一性（W0 2008/028055,美国专利2011/02299470)。
[0283] 该群的菌株由共有的特征定义，它们有着类似的基因型和表型，同时它们均具有 相同的保存能量的模式和发酵代谢模式。该群菌株缺少细胞色素并通过Rnf复合体保存能 量。
[0284]该组的所有菌株的基因组大小为约4. 2MBp(K坤keetal.，2010)和GC组成 为约 32 %mol(Abrinietal. , 1994;Kiipkeetal. , 2010;Tanneretal. , 1993)(WO 2008/028055;美国专利2011/0229947)并具有保守的必要关键基因操纵子，所述操纵子编 码Wood-Uungd址1途径的酶（一氧化碳脱氨酶、甲醜-四氨叶酸合成酶、亚甲基-四氨叶酸 脱氨酶、甲醜-四氨叶酸环水解酶、亚甲基-四氨叶酸还原酶和一氧化碳脱氨酶/己醜-CoA 合酶）、氨化酶、甲酸脱氨酶、化f复合体（rnfCDGEAB)、丙丽酸：铁氧还蛋白氧化还原酶、 酵：铁氧还蛋白氧化还原酶（K6pkeetal. , 2010, 2011)。已经发现所述Wood-Ljungd址1 途径基因（负责气体摄取）的结构和数目在所有种属中都是一样的，尽管在核酸和氨基酸 序列上不同（K6pkeetal.，2011)。
[0285] 所述菌株都有着类似的形态和大小（对数生长细胞为0.5-0. 7X3-510ym)，是 嗜温的（最适生长温度为30-37°C)并且为严格厌氧菌（Abrinietal. , 1994;Tanneret al.，1993)(WO2008/028055)。而且，它们都具有相同的主要系统发育特征，例如相同的pH 范围（pH4-7. 5,最适的初始抑为5. 5-6)、依赖含CO的气体W类似的生长速率进行强的 自养生长、W及代谢谱一W己醇和己酸作为主要发酵终产物并且在某些条件下形成的少量 2, 3-了二醇和乳酸（Abrinietal., 1994;Kiipkeetal., 2010;Tanneretal., 1993) (WO2008/02805W。所有的种都发现有巧隙产生。但是，所述种在对不同糖（例如鼠李糖、 阿拉伯糖）、酸（例如葡萄糖酸、巧樣酸）、氨基酸（例如精氨酸、组氨酸）、或其它底物（例 如甜菜碱、下醇）的底物利用上是不同的。发现一些种是某些维生素（例如硫胺素、生物 素）的营养缺陷型而其它种则不是。在该些生物范围内已经显示出駿酸被还原成它们对应 的醇（Perez,Richter,Lof1:us, &Angenent, 2012)。
[0286]因此所述特征不是一种生物（如自产己醇梭菌或扬氏梭菌）所特有的，而是一氧 化碳营养型的且能够合成己醇的梭菌属的一般特征。因此，可预期本发明可用于该些菌株， 尽管表现上可能会有不同。
[0287] 在某些实施方案中，所述亲代微生物选自自产己醇梭菌、扬氏梭菌和拉氏梭菌。在 一个实施方案中，该组也包括科斯卡培梭菌。在一个具体实施方案中，所述亲代微生物是自 产己醇梭菌DSM23693。
[028引可使用任意数量的已知的转化和重组核酸技术修饰亲代微生物W得到本发明 的微生物。该些技术记载于例如Sambrooketal, (Mole州larCloning:A1油oratory manual,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY, 1989)中。又例 女口，可使用下文实施例部分描述的方法。
[0289] 一般举例来说，在将突变引入基因、或破坏或敲除基因的情况下，可设计合适的核 酸构建体或载体W整合到亲代微生物的基因组中W破坏所述基因。该些构建体通常包括和 待破坏的基因内区域或侧翼区域同源的核酸序列（同源臂），该样使得能够发生同源重组， 并且能够发生突变的引入、该基因的一个核酸区域的切除、或用不同的核酸对一个基因区 域的置换。虽然优选的是所述构建体的同源臂和他们祀向的基因组上的区域具有100%的 互补性，但是该也不是必须的，只要序列足够互补W使得能够和目的基因区域祀向重组。通 常，如Sambrooketal1989中所定义的，同源臂具有能够使得在严格条件下与祀向区域杂 交的同源性水平。
[0290] 考虑到参与2, 3-下二醇生物合成途径的酶的可用序列信息，技术人员会了解足 W允许将外源基因祀向同源重组和整合到亲代微生物基因组中的核酸序列。但是，例如，在 budA的例子中，可使用本文描述的侧翼同源臂（例如，SeqID3、4和78-81)，或者在扬氏梭 菌的例子中，可从GenBank上的核酸序列信息设计本文描述的侧翼同源臂（CP000166. 1)。 又例如，可从相关微生物的基因组序列信息中确定依据本发明的待破坏的编码酶的基因的 侧翼序列。具体举例来说，可从GenBankCP001666.1上的信息中确定扬氏梭菌中的侧翼序 列。
[0291]W其他一般实例来说，当将核酸引入到亲代微生物W用来表达抑制2, 3-下二醇 生物合成途径的酶的表达和/活性的蛋白或核酸时、或用来表达提高抑制2, 3-下二醇生物 合成途径的酶的表达和/活性的化合物表达的蛋白时，可设计构建体W使得所述蛋白在微 生物中表达。通常，构建体包括合适的调节元件（包括启动子）。可使用组成型或诱导型启 动子。
[0292] 当本发明采用通过引入突变等对基因的直接破坏时，如上所述，用于转化所述亲 代微生物的构建体或载体会被改造为适于整合到微生物的基因组中。在表达蛋白或核酸的 情况下一所述蛋白或核酸被改造为适于破坏2, 3-下二醇生物合成途径的酶的表达或活 性、或者适于提高参与该途径的酶的抑制剂的表达或活性，所述构建体在转化亲代微生物 时可保持染色体外状态或可被改造为适于整合到所述微生物的基因组中。因此，用于本发 明的构建体可包括核巧酸序列，所述核巧酸序列被改造为适于帮助整合（例如可允许同源 重组并祀向整合到宿主基因组中的区域）或帮助染色体外构建体的表达和复制（例如复制 起点、启动子和其他调节元件或序列）。
[0293] 可使用任意数量的本领域的标准技术构建用于本发明的核酸构建体。例 女口，可使用化学合成或重组技术。该类技术记载于例如，Sambrooketal(Mole州lar Cloning:Alaboratorymanual.ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpring Harbor,NY, 1989)。其他示例性技术记载于下文的实施例部分。实质上，所述个体基因、调节 元件、同源臂等等将被可操作地相互连接W使得它们能够执行它们的所需功能。本领域普 通技术人员会了解用于本发明的适当载体。但是，举例来说，下述载体可能是适合的；pMTL、 pIMP、pJIR和下文实施例部分所示例的质粒。
[0294] 应理解，用于产生本发明的微生物的核酸可W是任何适合的形式，包括DNA、RNA 或cDNA(包括双链和单链核酸）。
[0295] 可将所述一种或多种外源核酸W裸露核酸形式递送到亲代微生物或可将其用一 种或多种可促进转化过程的试剂配制（例如脂质体缀合的核酸、其中含有所述核酸的有机 体）。合适时，所述一种或多种核酸可W是DNA、RNA或其组合。
[0296] 可使用任意数量的本领域中已知用于产生重组微生物的技术由亲代微生物和一 种或多种外源核酸制备本发明的微生物。仅举例来说，转化（包括转导或转染）可通过电 穿孔、接合（con化gation)、原瞻菌体诱导、或化学感受态或天然感受态来实现。适合的转化 技术记载于例女口SambrookJ,FritschEF,ManiatisT:Mole州larCloning:Alaboratory Manual,ColdSpringHarbourLabrotaryPress,ColdSpringHarbour, 1989。
[0297]又例如，可使用记载于Ko邱keetal. 2010,Poc.Nat.Acad.Sci. U.S.A. 107:13087-92 ；PCT/NZ2011/000203 ；W02012/053905；Straetzetal.,1994,Appl. Environ.Microbiol. 60:1033-37;Mermelsteinetal.，1992,Biotechnology, 10, 190-1 95 ;Jenne:rtetal.，2000,Microbiology, 146:3071-3080;Tyurinetal.，2004,Appl. Environ.Microbiol. 70:883-890中的电穿化技术。又例如，可使用记载于化asanna TamarapuParthasarathy, 2010,DevelopmentofaGeneticModificationSystemin ClostridiumscatologenesATCC25775forGenerationofMutants,MastersProject WesternKen化ckyUniversity中的原瞻菌体诱导技术。又例如，可使用记载于Herbert etal.,2003,FEMSMicrobiol.Lett. 229:103-110 或Williamsetal.,1990,J.Gen.Microbiol. 136:819-826 中的接合方法。
[029引在某些实施方案中，由于在要转化的微生物中具有活性的限制性系统，必须将要 引入所述微生物的核酸甲基化。该可使用多种技术进行，所述技术包括下文描述的那些，其 在下文实施例部分进一步示例说明。
[0299] 举例来说，在一个实施方案中，通过包括如下步骤的方法产生本发明的重组微生 物：
[0300] 将（i)本文描述的待引入到亲代微生物的构建体/载体和（ii)包含甲基转移酶 基因的甲基化构建体/载体引入穿梭微生物；
[0301] 表达所述甲基转移酶基因；
[0302] 从所述穿梭微生物分离一种或多种构建体/载体；和，
[0303] 将所述一种或多种表达构建体/载体引入目标微生物。
[0304] 在一个实施方案中，步骤B的甲基转移酶基因是组成型表达的。在另一个实施方 案中，步骤B的甲基转移酶基因的表达是诱导的。
[0305] 所述穿梭微生物是可促进组成所述表达构建体/载体的核酸序列的甲基化的微 生物，优选限制性酶阴性（restrictionnegative)的微生物。在具体实施方案中，所述 穿梭微生物是限制性酶阴性的大肠杆菌、枯草杆菌炬acillussubtillis)或乳酸乳球菌 (Lactococcuslactis)。
[0306] 所述甲基化构建体/载体包含编码甲基转移酶的核酸序列。
[0307] -旦所述表达构建体/载体和甲基化构建体/载体被引入所述穿梭微生物，存 在于所述甲基化构建体/载体上的甲基转移酶基因就被诱导。可通过任意适合的启动子 系统进行诱导，但在本发明一个具体的实施方案中，所述甲基化构建体/载体包含诱导型 lac启动子（例如，在SEQ_IDNO31中）并且可通过加入乳糖或其类似物，更优选异丙 基-目-D-硫代-半乳糖巧（IPTG)来诱导。其他适合的启动子包括ara、tet或T7系统。 在本发明另一个实施方案中，所述甲基化构建体/载体启动子是组成型启动子。
[030引在一个具体的实施方案中，所述甲基化构建体/载体具有对所述穿梭微生物的种 类特异性的复制起点，W使存在于所述甲基化构建体/载体上的任意基因均可在所述穿梭 微生物中表达。优选地，所述待引入到亲代微生物的构建体/载体具有对所述目标微生物 的种类特异性的复制起点。
[0309] 所述甲基转移酶的表达可导致存在于所述待引入到亲代微生物的构建体/载体 上的基因的甲基化。然后，可根据许多已知方法中的任一种将所述构建体/载体从所述穿 梭微生物中分离。仅举例来说，可使用下文实施例部分描述的方法分离所述构建体/载体。
[0310] 在一个具体的实施方案中，两种构建体/载体被共分离。
[0311] 可使用任意数量的已知方法，将所述祀向（destined化r)亲代微生物的构建体/ 载体引入所述微生物。但是，举例来说，可使用下文实施例部分描述的方法。
[0312] 可W想到，可将甲基转移酶基因引入穿梭微生物并过表达。因此在一个实施方案 中，可W使用已知方法收集所得的甲基转移酶并在体外用于甲基化所述待引入亲代微生物 中的构建体。然后，可将所述构建体/载体引入所述目标（亲代）微生物。在另一个实施方 案中，将甲基转移酶基因引入所述穿梭微生物的基因组，然后将所述祀向（destined化r) 亲代微生物的构建体/载体引入所述穿梭微生物，从所述穿梭微生物中分离一种或多种构 建体/载体，然后将所述构建体/载体引入目标（亲代）微生物。
[0313] 可W想到，可将如上文所定义的祀向（destined化r)亲代微生物的构建体/载体 和甲基化构建体/载体结合W提供一种目标组合物。该种组合物在绕过限制性屏障机制W 产生本发明的重组微生物方面特别有用。
[0314] 在一个具体实施方案中，上文所述的构建体/载体是质粒。
[0315] 本领域普通技术人员会了解用于产生本发明的微生物的许多适合的甲基转移酶。 但是，可W使用例如枯草杆菌瞻菌体OT1甲基转移酶和下文实施例中描述的甲基转移酶。 考虑到所需甲基转移酶的序列和遗传密码，应容易地了解编码适合的甲基转移酶的核酸。 在一个实施方案中，编码甲基转移酶的核酸如下文实施例所述（例如SEQ_IDN031的核 酸）。
[0316] 可W使用任意数量的被改造为适于使甲基转移酶基因表达的构建体/载体来产 生所述甲基化构建体/载体。但是，举例来说，可使用下文实施例部分描述的质粒。
[0317] 根据本文包含的信息，会理解可改造（tailor)亲代微生物的遗传修饰W利于使 得一种或多种产物的产生优于一种或多种其他产物。例如，破环丙丽酸到己醜乳酸的转化 有利于使得乳酸、甲酸、苹果酸、延胡索酸、巧樣酸、玻巧酸和2-丽戊二酸的产生优于额氨 酸、亮氨酸、异亮氨酸的产生。 。31引产牛方法
[0319] 本发明提供了一种用于通过微生物发酵产生一种或多种产物的方法，所述方法包 括使用本发明的微生物发酵含C0的底物。在一种具体的实施方案中，所述方法用于通过微 生物发酵产生己醇或一种或多种其他产物，其包括使用本发明的微生物发酵含C0的底物。 本发明的方法可用于减少来自工业过程的总的大气碳排放。
[0320] 优选地，所述发酵包括使用本发明的重组微生物在生物反应器中厌氧发酵底物W 产生所述一种或多种产物（在一种具体的实施方案中，己醇、或己醇和一种或多种其他产 物）的步骤。
[0321] 在一个实施方案中，所述方法包括如下步骤：
[0322] (a)将含C0的底物提供给生物反应器，所述生物反应器含有本发明第一方面的一 种或多种微生物的培养物；和
[0323] 化）在所述生物反应器中厌氧发酵所述培养物W产生一种或多种产物（在一个实 施方案中包括己醇）。
[0324] 在一个实施方案中，所述方法包括W下步骤：
[0325] i.在由工业生产过程产生的含C0的气体释放到大气中之前，将所述气体捕获；
[0326] ii.通过培养物厌氧发酵含C0的气体W产生一种或多种产物（在一个实施方案中 包括己醇），所述培养物含有本发明第一方面的一种或多种微生物。
[0327] 在本发明的一个实施方案中，被所述微生物发酵的气态底物是含C0的气态底物。 所述气态底物可W是作为工业过程副产物或者从某些其他来源（例如汽车废气）获得的含 C0的废气。在某些实施方案中，所述工业过程选自铁金属产品生产例如钢铁厂、有色金属产 品生产、石油精炼过程、煤的气化、电力生产、炭黑生产、氨生产、天然气精炼、甲醇生产和焦 炭生产。在该些实施方案中，可在所述含C0的气体被排放到大气中之前使用任意方便的方 法从所述工业过程中将其捕获。所述CO可w是合成气（含一氧化碳和氨气的气体）的组 分。从工业过程产生的C0通常被燃烧掉来产生c〇2,因此本发明在减少c〇2温室气体排放 和产生用作生物燃料的下醇方面尤其有用。根据所述含C0的气态底物的组成，还可能需要 对其进行处理，W在将其引入所述发酵之前除去任何不需要的杂质例如尘粒。例如，可使用 已知的方法过滤或洗涂所述气态底物。
[032引应理解，为使所述细菌生长并发生C0到己醇（和/或其他产物）的转化，除所述 含C0的底物气体外，需要将适合的液体营养培养基进料至所述生物反应器。所述底物和培 养基可连续、分批或分批补料方式进料至所述生物反应器。营养培养基会含有足W允 许所使用的微生物生长的维生素和矿物质。适合用于使用C0进行发酵W产生己醇（和任 选的一种或多种其他产物）的厌氧培养基是本领域中已知的。例如，Biebel(Journalof IndustrialMicrobiology&Biotechnology(2001) 27, 18-26)记载了适合的培养基。所述 底物和培养基可WW连续、分批或分批补料方式进料至所述生物反应器。在本发明的一个 实施方案中，所述培养基如下文实施例部分所述。
[0329] 合乎需要地，所述发酵应在用于发生C0到己醇（和/或其他产物）的发酵的合适 条件下进行。应考虑的反应条件包括；压力、温度、气体流速、液体流速、培养基抑、培养基 氧化还原电势、揽拌速率（如果使用连续揽拌蓋反应器的话）、接种物水平、确保所述液相 中的C0不成为限制的最大气体底物浓度W及避免产物抑制的最大产物浓度。
[0330] 此外，通常需要增加底物流中的C0浓度（或气态底物中的C0分压），从而提高 C0作为底物时发酵反应的效率。在增加的压力下操作可显著增加C0从气相转移到液相的 速率，在液相中C0可被所述微生物作为碳源摄取用于产生所述己醇（和/或其他产物）。 该进而意味着，当生物反应器保持在升高的压力而非大气压力下时，可减少保留时间（定 义为生物反应器中的液体体积除W输入气体流速）。最佳反应条件将部分地取决于本发 明所使用的具体微生物。但是，一般来说，优选的是所述发酵在高于环境压力的压力下进 行。并且，因为给定的C0到己醇（和/或其他产物）的转化率部分地是所述底物保留时间 的函数，并且实现所需保留时间进而限定了生物反应器的所需体积，所W使用增压系统可 大大地减少所需的生物反应器的体积，从而减少所述发酵设备的资金成本。依据美国专利 no. 5, 593,886中给出的实例，反应器体积的减少与反应器操作压力的增加成线性比例，即 在10个大气压下操作的生物反应器仅需要是在1个大气压下操作的生物反应器体积的十 分之一。
[033。 已经在别处描述了在升高的压力下进行气体到己醇发酵的益处。例如，W0 02/08438描述了在30psig和75psig压力下进行的气体到己醇的发酵，获得的己醇产率分 别为150g/l/天和369g/l/天。但是，发现在大气压下使用相似的培养基和输入气体组成 进行的示例性发酵产生1/20到1/10的己醇/升/天。
[0332] 还合乎需要的是，含C0的气态底物的引入速率是该样的，即确保液相中的C0浓度 不成为限制。该是因为C0受限的条件的结果可能是己醇产物被所述培养物消耗。
[0333] 用于进料至发酵反应的气流组成可对所述反应的效率和/或成本有显著影响。例 女口，化可降低厌氧发酵过程的效率。在发酵之前或之后的发酵过程各阶段中，对不需要或不 必要的气体的处理会增加该些阶段的负担（例如，当在气体流进入生物反应器之前将气体 流压缩时，不必要的能量可能被用于压缩发酵中不需要的气体）。因此，可能需要处理底物 流（尤其是来自工业来源的底物流）w除去不需要的组分并增加需要的组分的浓度。
[0334] 在某些实施方案中，将本发明的细菌培养物维持在水性培养基中。优选地，所述水 性培养基是基本厌氧微生物生长培养基。合适的培养基是本领域中已知的，记载于例如美 国专利no. 5, 173, 429和5, 593,886和W0 02/08438,并且如下文实施例部分所述的。
[0335] 可通过本领域中已知的方法从发酵液中回收本发明方法产生的一种或多种产物 (在一个实施方案中，产生己醇、或含有己醇和/或一种或多种其他产物的混合醇流），所述 方法例如分觸或蒸发、渗透蒸发、W及萃取发酵（包括例如液-液萃取）。也可通过本领域 中已知的方法从发酵液中回收副产物，例如酸（包括己酸盐）。例如，可使用含有活性炭过 滤器的吸附系统或电渗析。或者，也可使用连续气提。
[0336] 在本发明某些优选实施方案中，可通过W下方式从所述发酵液中回收己醇和/或 一种或多种其他产物：从所述生物反应器连续移出部分发酵液，从所述发酵液中分离微生 物细胞（方便地通过过滤），并从所述发酵液中回收一种或多种产物。醇可通过例如蒸觸方 便地回收，酸可通过例如吸附到活性炭上来回收。优选地将分离的微生物细胞返回至所述 发酵生物反应器。优选地将已除去任何的醇和酸后剩余的无细胞渗透物返回至所述发酵生 物反应器。可将另外的营养物（例如B族维生素）加入到所述无细胞渗透物中W在将其返 回至所述生物反应器之前补充所述营养培养基。
[0337] 同样地，如果如上所述调整所述发酵液的抑W增强己酸到活性炭的吸附，那么应 在将其返回至所述生物反应器之前将抑重新调整到与所述发酵生物反应器中发酵液类似 的抑。
[033引可使用W下很多技术从发酵液中回收玻巧酸，例如，酸化、与离子交换层析结合的 电渗析（SongandLee, 2006,EnzymeMicrobTechnol39, 352-361)、Ca(0H)沉淀与过滤和 添加硫酸（Leeetal2008,ApplMicrobiolBiotechnol79, 11-22)、或使用基于胺的萃取 剂（例如H正辛胺）的化学萃取（Huhetal，2006,ProcBiochem41,1461-1465)。对于所 有的方法，具有游离酸形式而非盐形式是至关重要的。但是大多数玻巧酸的生物技术产生 过程都在P册-7的中性或微酸范围内操作。考虑到玻巧酸的pKa(pKa= 4. 16和5. 61)，在 该些情况下，大部分玻巧酸都W盐而非游离酸的形式存在。但是已知自产己醇梭菌和一氧 化碳营养型产己酸菌在所需要的抑4-6的低抑范围下耐受和生长。
[0339] 可相对容易地通过W下方法从发酵液中回收支链氨基酸额氨酸、亮氨酸和异亮 氨酸；浓缩（例如反渗透）、生物质的结晶或去除（例如超滤或离也）和离子交换层析 (Ikeda,A. , 2003,AminoAcidProductionProcesses,inR.FaurieandJ.Thommel(eds.) MicrobialproductionofL-aminacids, 1-35)。
[0340] 可通过任何已知的方法从发酵液中回收乳酸、甲酸、2-丽戊二酸和其他产物。但 是，例如，在乳酸的情况下，传统的发酵过程产生可被收集和再酸化的乳酸巧沉淀。或者，可 使用膜技术（例如电渗析）来分离乳酸。可通过在选择性离子渗透膜上应用适合的电势从 发酵液中分离低浓度的乳酸。其他适合的技术包括纳米过滤，其中单价离子可在压力下选 择性地穿过膜。
[0341] 应理解，在一些情况下，可使用所述方法产生和回收除了己醇之外的产物（例如， 包括额氨酸、亮氨酸、玻巧酸、丙丽酸、乳酸和甲酸的一种或多种产物）。因此，本发明应被理 解为包括用于产生该些产物中的一种或多种的方法。 阳34引连施例:
[0343] 现将参照如下非限制性实施例更详细地描述本发明。 阳344]连施例1:
[0345] 通过同源重组删除自产己醇梭菌budA基因
[0346] 使用包含自产己醇梭菌DSM23693的budA基因的5'和3'同源臂的质粒进行遗传 修饰（图1-2)。使用新的甲基转移酶将所述质粒在体内甲基化，接着将其转化到自产己醇 梭菌DSM23693(DSMZ，德国）中。已经通过PCR和通过抑制自产己醇梭菌DSM23693AbudA 菌株中的2, 3-下二醇的产生表明了所述budA基因的敲除。
[0347] 表达质粒的构建：
[0348] 本发明使用了标准重组DNA和分子克隆技术，该些技术由Sambrooketal, 1989 和Ausubeletal，1987记载。从NCBI中获得了自产己醇梭菌DSM23693的5'上游侧翼同 源臂（Seq.ID3)和3'下游侧翼同源臂（Seq.ID4)的DNA序列。
[034引 根据制造商的说明书，使用Invitrogen的化relinkGenomicDNAminikit分离 来自自产己醇梭菌DSM23693的基因组DM。
[0巧0] W自产己醇梭菌DSM23693基因组DNA作模板、iProof高保真DNA聚合酶炬io-Rad Ubratories)和表1中的寡核巧酸通过PCR扩增所述5' (Seq.ID3)和3'侧翼同源臂（Seq.ID4)，并且PCR所用程序如下；98°C初始变性30s，然后25个循环的变性（98C，10s)、退火 (60。15s)和延伸（72。30s)，然后是最后延伸步骤（72。7min)。
[0巧1] 塞1;用于克隆的寡核巧酸
[0巧2]

【权利要求】
1. 一种重组的一氧化碳营养型产乙酸微生物，所述微生物被改造为适于在发酵含一氧 化碳的底物时产生一种或多种产物以及降低量的或基本不产生2, 3- 丁二醇和/或其前体， 所述微生物与亲代微生物相比包含破坏了 2, 3- 丁二醇生物合成途径的一种或多种遗传修 饰。
2. -种重组的一氧化碳营养型产乙酸微生物，所述微生物被改造为适于在发酵含一氧 化碳的底物时产生乙醇作为主要产物以及降低量的或基本不产生2, 3- 丁二醇和/或其前 体，所述微生物与亲代微生物相比包含破坏了 2, 3- 丁二醇生物合成途径的一种或多种遗 传修饰。
3. 权利要求2的重组微生物，其中所述微生物被改造为适于进一步产生甲酸、乳酸、丙 酮酸、琥珀酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、乙酰乳酸、苹果酸、延胡索酸、2-酮戊二酸、柠檬酸 中的一种或多种。
4. 权利要求2或3的重组微生物，其中与亲代微生物相比，所述微生物被改造为适于产 生的增加量的乙醇、甲酸、乳酸、丙酮酸、琥珀酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、乙酰乳酸、苹果 酸、延胡索酸、2-酮戊二酸、柠檬酸中的一种或多种。
5. 权利要求1-4中任一项的重组微生物，其中所述微生物包括至少一种遗传修饰，所 述遗传修饰破坏了一种或多种能将丙酮酸转化成乙酰乳酸的酶的表达和/或活性。
6. 权利要求1-4中任一项的重组微生物，其中所述微生物包含至少一种遗传修饰，所 述遗传修饰破坏了一种或多种能将乙酰乳酸转化成乙偶姻的酶的表达和/或活性。
7. 权利要求1-4中任一项的重组微生物，其中所述微生物包含至少一种遗传修饰，所 述遗传修饰破坏了一种或多种能将乙偶姻转化成2, 3- 丁二醇的酶的表达和/或活性。
8. 权利要求1-4中任一项的重组微生物，其中所述微生物包含至少一种遗传修饰，所 述遗传修饰破坏了两种或多种能将丙酮酸转化成乙酰乳酸、将乙酰乳酸转化成乙偶姻和将 乙偶姻转化成2, 3- 丁二醇的酶的组合的表达和/或活性。
9. 权利要求5或8的重组微生物，其中所述一种或多种能将丙酮酸转化成乙酰乳酸的 酶是乙酰乳酸合酶（alsS)。
10. 权利要求6或8的重组微生物，其中所述一种或多种能将乙酰乳酸转化成乙偶姻的 酶是乙酰乳酸脱羧酶（budA)。
11. 权利要求7或8的重组微生物，其中所述一种或多种能将乙偶姻转化成2, 3- 丁二 醇的酶为选自以下的酶：2, 3- 丁二醇脱氢酶（2, 3bdh)、乙偶姻还原酶、伯醇：仲醇脱氢酶。
12. 权利要求1-11中任一项或多项的重组微生物，其中所述一种或多种遗传修饰破坏 了乙酰乳酸合酶（alsS)、乙酰乳酸脱羧酶（BudA)、2, 3-丁二醇脱氢酶（2, 3bdh)、乙偶姻还 原酶、伯醇：仲醇脱氢酶中的一种或多种的表达和/或活性。
13. 权利要求1-12中任一项的重组微生物，其中所述亲代微生物选自自产乙醇梭 菌（Clostridium autoethanogenum)、扬氏梭菌（Clostridium 1 jungdahlii)、拉氏梭菌 (Clostridium ragsdalei)和科斯卡塔梭菌（Clostridium coskatii)。
14. 权利要求12的重组微生物，其中所述亲代微生物是自产乙醇梭菌DSM23693。
15. -种产生重组的一氧化碳营养型产乙酸微生物的方法，所述微生物能够在发酵含 一氧化碳的底物时产生一种或多种产物以及降低量的或基本不产生2, 3- 丁二醇和/或其 前体，所述方法包括遗传修饰一氧化碳营养型产乙酸亲代微生物以破坏2, 3- 丁二醇生物 合成途径。
16. -种产生重组的一氧化碳营养型产乙酸微生物的方法，所述微生物能够在发酵含 一氧化碳的底物时产生乙醇作为主要产物以及降低量的或基本不产生2, 3- 丁二醇和/或 其前体，所述方法包括遗传修饰一氧化碳营养型产乙酸亲代微生物以破坏2, 3- 丁二醇生 物合成途径。
17. 权利要求15或16的方法，其中所述方法包括将一种或多种遗传修饰引入到所述亲 代微生物中，所述遗传修饰破坏了一种或多种基因，所述基因编码能将丙酮酸转化成乙酰 乳酸、将乙酰乳酸转化成乙偶姻和/或将乙偶姻转化成2, 3- 丁二醇的一种或多种酶。
18. 权利要求17的方法，其中所述方法包括将一种或多种遗传修饰引入到所述亲代微 生物中，所述遗传修饰破坏了两种或多种基因的组合，所述基因编码能将丙酮酸转化成乙 酰乳酸、将乙酰乳酸转化成乙偶姻和/或将乙偶姻转化成2, 3- 丁二醇的酶。
19. 权利要求17或18的方法，其中所述一种或多种能将丙酮酸转化成乙酰乳酸的酶 是乙酰乳酸合酶（alsS)，所述一种或多种能将乙酰乳酸转化成乙偶姻的酶是乙酰乳酸脱 羧酶（budA)和/或所述一种或多种能将乙偶姻转化成2, 3-丁二醇的酶为选自以下的酶： 2, 3-丁二醇脱氢酶（2, 3bdh)、乙偶姻还原酶、伯醇：仲醇脱氢酶。
20. 权利要求15-19中任一项的方法，其中所述方法包括将一种或多种遗传修饰引入 到所述亲代微生物中，所述遗传修饰破坏了一种或多种基因，所述基因编码乙酰乳酸合酶 (alsS)、乙酰乳酸脱羧酶（BudA)和2, 3- 丁二醇脱氢酶（2, 3bdh)中的一种或多种。
21. 通过权利要求15-20的任一项的方法产生的重组微生物。
22. -种用于产生一种或多种产物的方法，所述方法包括使用如权利要求1-14和21中 任一项的微生物发酵含CO的底物。
23. -种用于产生乙醇、甲酸、乳酸、丙酮酸、琥珀酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、乙酰乳 酸、苹果酸、延胡索酸、2-酮戊二酸、柠檬酸中的一种或多种的方法，所述方法包括使用如权 利要求1-14和21中任一项的微生物发酵含CO的底物。
24. 权利要求22或23的方法，所述方法包括如下步骤： (a) 将含CO的底物提供给生物反应器，所述生物反应器含有一种或多种权利要求1-13 和19中任一项的微生物的培养物；和 (b) 在所述生物反应器中厌氧发酵所述培养物以产生所述一种或多种产物，优选包括 乙醇。
25. 权利要求22或23的方法，所述方法包括如下步骤： (a) 在由工业生产过程产生的含CO的气体被释放到大气中之前，将所述气体捕获； (b) 通过培养物厌氧发酵所述含CO的气体以产生所述一种或多种产物，优选包括乙 醇，所述培养物含有一种或多种权利要求1-13和19中任一项的微生物。
26. 权利要求22-25中任一项的方法，其中所述底物含有至少约20体积％至约100体 积％的CO。
27. 权利要求22-26中任一项的方法，其中所述方法还包括从所述发酵液中回收所述 一种或多种产物的步骤。
28. 通过权利要求22-27中任一项的方法产生的一种或多种产物。
29. 权利要求28的一种或多种产物，其中所述一种或多种产物选自乙醇、甲酸、乳酸、 丙酮酸、琥珀酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、乙酰乳酸、苹果酸、延胡索酸、柠檬酸和2-酮戊 二酸。
【文档编号】C12N15/53GK104395455SQ201380018640
【公开日】2015年3月4日 申请日期:2013年1月31日 优先权日:2012年1月31日
【发明者】M·科普克, S·那加拉祖, 陈铱婷 申请人:新西兰郎泽科技公司