用于检测单核苷酸多态性的isfet阵列的制作方法

用于检测单核苷酸多态性的isfet阵列的制作方法
【专利摘要】设备，所述设备包括用于检测基因组内单核苷酸多态性SNP的模块并且包括：四个反应室，所述反应室用于接收流体样品，每个反应室含有不同的碱基A、C、G、T中的一种，和引物；参比电极，其在使用时浸没在所述流体样品中；一对离子敏感场效应晶体管(Ion?Sensitive?Field?Effect?Transistors)，ISFETs，其与各个反应室相关联，每对的ISFETs包括各自的传感膜或共同的传感膜，所述传感膜暴露在关联反应室内；和多个差分检波器(difference?detector)，每个差分检波器具有一对输入端，所述输入端分别和与不同反应室相关联的ISFETs的输出端耦合。
【专利说明】用于检测单核苷酸多态性的ISFET阵列

【技术领域】
[0001]本发明涉及使用ISFET阵列的高效多核苷酸测序和SNP检测。

【背景技术】
[0002]脱氧核糖核酸(DNA)是细胞核中的长分子，并且其含有用于活的有机体的发育和功能行使的遗传“指令”。图1显示具有双螺旋结构的DNA部分，其具有外部的糖和磷酸酯骨架和内部碱基部分。信息以碱基序列编码，所述碱基有四种类型；腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤和胸腺嘧啶，分别以其首字母A、C、G和T表示。在双链上，碱基通过形成氢键以互补的方式就位，如图2中显示的，结果腺嘌呤仅与胸腺嘧啶成对且胞嘧啶仅与鸟嘌呤成对。DNA片段被称为基因，其编码特定蛋白的投影。在人群体中99.9%的密码是相似的并且产生差异的是剩余的0.1%。单核苷酸多态性是基因的单一突变，其可以在大于群体的1%中发现。发现SNPs在识别与群体中大多数相比个体的遗传差异方面，和还对于其后续的诊断都提供有价值的信息。
[0003]随着遗传科学的进展，对人类基因组进行测序已经通过发现基因的特定多态性和疾病之间的关系，帮助鉴定了很多缺陷和遗传病的根源。在个体基因组中检测单核苷酸多态性(SNPs)并且以SNP对代谢的影响方面的信息对其作图可以改善和促进诊断学。
[0004]可以通过增加温度或通过使用酶将如图1中所示的DNA双螺旋结构变性。由于DNA链的互补性质，可能通过设计合适的探针/引物和提供所述核苷酸，通过互补复制模板/靶来复制所述分子。这样，为了发现人基因组中是有或没有特定序列，可以设计引物与靶DNA的变性单链相互作用。如果其匹配，则其可在靶上延伸[2]。该引物在靶上的延伸释放焦磷酸盐和H+离子[3]。因此，通过检测分析物中酸性增加与否，可以确定延伸是否发生；并从而确定设计的序列是否匹配。
[0005]近年来,提供定点护理(point-of-care)解决方案是感兴趣的领域,其可以以不需要建立实验室和专家的方式快速进行必要的测试。该领域中的一种该方法[I]依赖于使用离子敏感场效应晶体管(ISFETs)，其与CMOS (互补金属氧化物半导体)技术兼容并且从其相关优势获益。ISFET用作传感器，用于测量pH和用于检测pH下降，以表明延伸发生与否。然而，目前使用的ISFETs平台使它们对功率(power)和内存(memory)敏感。需要目前使用的平台处理大量的数据以提供是/否的答案，说明在靶DNA中检测到特定多态性与否。这些强烈的需求主要由于需要在测量中删除的错误源的存在。
[0006]ISFET是浮动门(floating gate) FET家族成员并且其门电压(gate voltage)从参比电极(“远端门(remote gate)”)通过电解质和其浮动门顶部的敏感膜提供。图3显示ISFET的图示。在早期发展阶段，ISFETs使用不同材料用于提供对于电解质中的离子浓度的此种灵敏度，需要特别处理，而目前将其以市售CMOS (互补金属氧化物半导体)技术实施[5]，例如如图4中所示的，使用钝化层(Si3N4在Si02上方)作为传感膜，从而不需要ISFET特异处理步骤。传感膜材料可以与电解质中的H+离子结合，在其上部形成电荷表面并将该电荷与传感膜下的金属层耦合。已经显示，相对于参比电极的敏感膜上的电压依赖于离子浓度[4]。带有其它传感膜的ISFETs也是已知的，例如替代Si3N4，其可以由Ta205形成。
[0007]可以在数学上表达pH(H+)和电压之间的关系，以显示从参比电极(远端门G)至IJ传感膜(G’ )的电压下降线性依赖于pH(参见以下方程式(I))。方程式⑵中Y表示非PH相关化学电压，Ut为热电压且α表示由于实际上非理想条件导致的灵敏度降低。
[0008]VG, = Vc-Vchem (I)
[0009]Vchem = Y +2.3 a UTpH (2)
[0010]晶体管的特性是其门和电源电压的差异的函数(方程式(3)为(a)弱反型(WeekInvers1n), (b)强反型(Strong Invers1n)和(c)速度饱和[6])，即
I, f __ pr、
[0011]1D =4?) expexPiT^^ exPTT1
t Vut j (3a)
「 ψ 2
? _ I _ ,, f rr I (xr tr \tr r DS
[001 2] 1D — Μ,.(- ?X y Vcs-1, TO F DS ----γ--
HZ 」(3b)
[0013]4=^τ(--^^ο)2(? + ^)
2 L(3c)
[0014]因此，设计一些接口以提供所需的反馈，使所有参数不变，这样以致该电压差异也依然不变，而其绝对值遵循由PH改变导致的化学电压下降的变化(浮动门和固有MOSFET (金属氧化物半导体场效应晶体管)的来源根据pH改变)。用于此目的的常见接口显示于图5中。
[0015]然而，ISFETs可以遭受非理想状态。例如，这可以包括化学和热噪声，和漂移，其是由于捕获电荷(trapped charge)导致的传感膜的降解(这已经被报道为其阈值电压变化的主要原因[8，9])。漂移以DC偏移出现，以每小时数毫伏的改变速率随时间变化[10]
[5]。当进行测量时必须小心，并且无论何时都测量相对另一个pH的pH改变，必须以微分的方式使用参考FET(REFET)计算测量结果。[注意:不应该将REFET与图3的参比电极-或远端门-混淆]。
[0016]ISFETs 用于 SNP 检测
[0017]测序和SNP检测中使用ISFET依赖于以下事实:当它们匹配(即其序列互补)时，作为焦磷酸盐水解的结果，引物/探针链在靶DNA链上的延伸的副产物，氢离子被释放[3]，并且传感膜上和周围这些离子增加的浓度允许反应的发生在反应发生后某时被检测。在此情况下，检测其改变足以能够确定具有已知序列的设计探针是否与靶相匹配，而不是进行PH的绝对测量。因此，在差异配置中具有用于检测所有非理想信号并随后将它们从工作ISFET删去的REFET，可以提供pH改变的可靠监视[11，12]。从而，将REFET暴露于非可延伸(即非匹配)引物与核苷酸、酶和靶DNA链的混合物，以提供如对于工作ISFET的除pH改变外的相同条件[13]。图6显示典型在用于SNP检测的基于ISFET的测序使用的配置。
[0018]现有技术
[0019]目前的技术使用上文讨论的配置以实施阵列用于平行检测不同SNPs，如参考文献[I] (D.M.Garner, Hua Bai, P.Georg1u, T.G.Constandinou, S.Reed, L.M.Shepherd,W.Wong, K.T.Lim 和 C.Toumazou, 〃A multichannel DNA SoC for rapid point-of-caregene detect1n, 〃 于 Solid-State Circuits Conference Digest of Technical Papers(ISSCC) ,2010 IEEE Internat1nal，2010，第 492_493 页)的图 27.4.1 中表示的。为了检测序列和随后碱基位点n+1处的突变的存在，设计长度为η的引物并与靶DNA和酶混合。将其插入四个室，每个室具有ISFET以传感pH。每个室仅含有一种类型的核苷酸(即第一室仅含有核苷酸类型A，第二室仅含C，第三室仅含G和第四室仅含T)。pH(作为设计的引物在靶DNA链上延伸的结果)仅在含有互补于位置n+1处核苷酸的核苷酸的室中下降，因为其是唯一可以延伸所述引物的一个。将四个室中的所有ISFETs与之前讨论的REFET相比较。[注意:在杂合子情况下，与纯合子的情况相反，两种不同核苷酸类型将互补，其导致在两个不同室中PH下降。这在下文进一步讨论。]
[0020]可以设计并构建ISFET阵列以提供多组(四个)ISFET SNP检测器。此阵列可以提供对相同SNP的多重测试，例如提供对给定SNP增加的检测，和/或提供对不同SNP的测试。在后一情况下，ISFETs的各个组的孔(对于各个不同SNP测试)将含有不同引物。在一些情况下，这些阵列可以非常大。
[0021]该当前的平台具有缺点。高功率和内存需要是主要问题，其产生于用于克服非理想ISFET状态的接口和信息必须被处理以删去噪声和寄生效应的方式。
[0022][I]的图27.4.2显示一种最前沿芯片上系统的系统总览。如在那幅图中显示的，对于阵列中四十个ISFETs (其中一个是REFET)加上十个温度传感器读出器，使用五十个Σ -Δ调节器以及ISFET偏移消除电路。该系统的复杂性增加阵列中ISFETs的数量，并且可以通过设置的ADCs和控制单元的数量容易看出对加强的功率和内存的需要。诸如参考文献[I]中的图中描述的系统中的一些缺点在下文中解释。
[0023]小的pH改变和灵敏度
[0024]室内核苷酸的延伸在缓冲液中发生并且pH下降依赖于其组成成分的混合物(例如其量和密度限定反应中将产生多少离子并且其密度将是多少)。实际上，PH典型地降低一个单位或更少。在延伸过程中PH改变的实例显示于图7的图表中。考虑到对于最佳传感膜室温的理想灵敏度为59mV/pH，可以预期电容耦合之后浮动门上的电压改变至多为大约10-60mV，并且实际上它小于59mV ;例如在参考文献[14] (P.Georg1u和C.Toumazou,〃ISFET characteristics in CMOS and their applicat1n to weak invers1noperat1n")中报道为 44mV/pH。
[0025]单一REFET
[0026]在大阵列中，整个芯片依赖于一个REFET，因为对于所有ISFETs的条件必需相同。如果REFET运行错误，则所有测量将以误差产生偏差。此外，REFET将不且实际上不能就其分析物而言与所有其它ISFETs —致，因为不同SNPs需要不同引物。
[0027]参比电极
[0028]为了提供共同条件，单独参比电极或远端门用于整个芯片和用于REFET。因此，使ISFETs的远端门偏离等电位是困难的并且要求挑战性的同等传导电位的电解质微流体设计(例如盐桥)，或在阵列结构上的不同点布线和设计稳定的参比电极。
[0029]监视/追踪反应
[0030]已知技术需要监视反应以将行为解释为pH改变和SNPs检测。这是如此，尽管最终应答(或输出值)是表明PH降低与否，和从而是否发现SNP(—或零)的单一比特信息。必须从开始监视反应以能够获得结果。
[0031]ISFET 接口
[0032]在阵列中使用用于所有ISFETs的单个通信接口是不理想的，因为其需要在ISFETs的漏极(drain)和源级处添加开关以将它们各个与接口(依次)连接从而监视反应。这影响ISFETs的性能并且需要通过芯片快速扫描所有ISFETs以横跨阵列对pH进行基本上连续的测量。从而，需要相当大的努力以多路传输(multiplex)和反多路传输(de-multiplex)从单个接口读取的测量值。此外，这导致对于模拟差分对(analoguedifferential pair)的变动负荷(varying load),其另一种输入是REFET。因此，以差分测量平行有效监视横跨阵列的所有ISFETs的仅有途径是对每个ISFET提供单个接口并随时间记录其数据，从而在之后从对于REFET记录的数据减去它。在该情况下，必须同时对所有ISFETs的任一个读值或必须高速扫描阵列从而以小于化学反应发生所花费的时间长度的时间间隔对各个ISFET取样[16]。
[0033]数字转换器模拟(ADCs)
[0034]已知的配置需要模拟数据向数字数据的高精确度转变，和对记录的数据进行读值和从工作ISFET数据减去REFET数据的处理单元。高精确度是重要的，因为至多仅数十毫伏的一点PH改变(当pH以一个单位改变时理想地为59mV)必须被检测到，并且对于该pH改变，尤其当信号伴有来自ISFET自身的偏移时，量化噪声不应该是可比的。对于阵列中每个单独ISFET，一个建议的设计需要10-比特ADCs [I]。该结构要求高容量的内存以及处理单元，不仅导致所述设计是尤其功率和内存加强的，而且还极大地增加芯片设计的复杂性。以该结构，必须收集大量数据以监视和解释pH降低的检测-即除了对于REFET的10比特夕卜，来自四个ISFETs的40比特的信息(每个监视以四种碱基类型(八，(:，6和1')中每种的引物延伸的可能性)，对于每个SNP的取样时间产生50比特的信息。这当然随着要平行分析的SNPs数量而按比例增加。
[0035]上文已经讨论了对于基于ISFET的SNP检测的目前设置的主要缺点和问题。已经描述了比如对单个REFET的性能的依赖性，参比电极的设计和对高精确度ADCs的要求，从开始监视反应，和收集大量导致高功率和内存消耗的冗余数据的问题。上文提及的问题的根源在于已知平台的模拟性质，以及测量后消除异常信号所需的算法和ISFET的不理想行为。
[0036]类似的考虑适用于在RNA中SNP检测的情况中。
[0037]发明概沭
[0038]根据本发明的第一个方面，提供一种设备，所述设备包括用于检测基因组中单核苷酸多态性SNP的模块，并且包括:
[0039]四个反应室，所述反应室用于接收流体样品，所述反应室每个含有碱基A，C，G，T中的不同一种，和引物；
[0040]参比电极，所述参比电极在使用时浸没入所述流体样品；
[0041]一对离子敏感场效应晶体管，ISFETs，所述离子敏感场效应晶体管与各个反应室关联，每对的ISFETs包括各自的传感膜或共同的传感膜，所述传感膜暴露在关联的反应室内；和
[0042]多个差分检波器，每个差分检波器具有一对输入端，所述输入端分别和与不同反应室关联的ISFET的输出端耦合。
[0043]所述多个差分检波器可以具有输入端对，所述输入端对与反应室的不同输出端对耦合。
[0044]所述设备可以包括四个差分检波器X，Y，Z和W，这些差分检波器具有输入端，所述输入端以如下方式与反应室ISFETs耦合:
[0045]X:A 和 T
[0046]Y:T 和 C
[0047]Z:C 和 G
[0048]W:A 和 G。
[0049]所述设备可以包括输出检测器，所述输出检测器用于监视由差分检波器提供的输出值，从而检测指示核苷酸添加不可能的输出状态。
[0050]所述设备可以包括处理器，将所述处理器与所述输出检测器耦合并且配置所述处理器以通过对设备进行调整，对检测不可能状态进行反应，从而消除所述不可能状态。
[0051]对所述多个差分检波器的偏移进行所述调整。
[0052]配置所述处理器以通过以下中的一个或组合进行所述调整:改变施加于所述参比电极的偏置电压，改变差分检波器偏置电流，改变偏置参考电流，和改变通过缓冲级(buffer stage)的电流。
[0053]所述差分检波器可以是差分放大器，可以是跨导放大器，和可以是比较器。
[0054]所述设备可以包括被配置成检测不同SNPs的多个所述模块。
[0055]根据本发明的第二个方面，提供一种检测基因组内单核苷酸多态性SNP的方法，所述方法包括:
[0056]在四个反应室中接收流体样品，每个反应室含有不同的碱基A、C、G、T中的一种，和引物；
[0057]使用一对离子敏感场效应晶体管ISFETs检测反应室内任何pH改变，所述离子敏感场效应晶体管与每个反应室关联，每对的ISFETs包括各自的传感膜或共同的传感膜，所述传感膜暴露在关联反应室内；和
[0058]设置多个差分检波器的输出端，每个差分检波器具有一对输入端，所述输入端分别和与不同反应室关联的ISFETs的输出端耦合。
[0059]所述方法可以进一步包括监视由差分检波器提供的输出以检测指示核苷酸添加不可能的输出状态。
[0060]监视由差分检波器提供的输出可以包括在真值表中查找输出。
[0061]所述方法可以进一步包括通过对所述设备进行调整，对检测不可能状态进行反应，从而消除所述不可能状态。
[0062]可以对所述多个差分检波器的偏移进行所述调整。
[0063]对所述设备进行调整包括以下中的一种或组合:改变施加于参比电极的偏置电压，改变差分检波器偏置电流，改变偏置参考电流，和改变通过缓冲级的电流。
[0064]所述差分检波器可以是差分放大器，可以是跨导放大器，和可以是比较器。
[0065]根据本发明的第三个方面，提供一种设备，所述设备包括用于检测基因组内单核苷酸多态性SNP的模块并且包括:
[0066]四个反应室，其用于接收流体样品，每个反应室含有不同的碱基A、C、G、T中的一种，和引物；
[0067]参比电极，其在使用时浸没在所述流体样品中；和
[0068]与每个反应室关联的
[0069]一对离子敏感场效应晶体管ISFETs，每对的ISFETs包括各自的传感膜，或共同的传感膜，所述传感膜暴露在关联反应室内，并且所述ISFETs对以推拉构型耦合；
[0070]MOSFET反相器级(inverter stage),其具有与所述推拉构型的输出端稱合的输入端；和
[0071]输出级，其提供依赖于所述传感膜上存在的电压的可切换的数字输出。
[0072]所述MOSFET反相器级可以包括一个MOSFET反相器，或多个层叠的MOSFET反相器。
[0073]所述设备可以包括参考室，所述参考室含有非匹配引物。
[0074]所述设备可以包括参考输出检测器，所述参考输出检测器用于监视参考室的输出，以检测设备内的错误偏差。
[0075]所述设备可以进一步包括处理器，所述处理器与所述参考输出检测器耦合，并且配置所述处理器以通过对设备进行调整，对检测错误偏差进行反应，从而消除所述偏差。
[0076]所述设备可以进一步包括输出检测器，所述输出检测器用于监视输出级的数字输出，以检测指示核苷酸添加不可能的输出状态。
[0077]所述设备可以包括处理器，所述处理器与所述输出检测器耦合并且配置所述处理器以通过对所述设备进行调整，对检测不可能状态进行反应，从而消除所述不可能状态。
[0078]可以配置所述处理器以通过改变施加于所述参比电极的偏置电压进行所述调整。
[0079]可以配置所述处理器以通过改变可编程反相器以调整开关阈来进行所述调整。
[0080]所述设备可以包括被配置成检测不同SNPs的多个所述模块。
[0081]根据本发明的第四个方面，提供一种检测基因组内单核苷酸多态性SNP的方法，所述方法包括:
[0082]在四个反应室中接收流体样品，每个反应室含有不同的碱基A、C、G、T中的一种，和引物；
[0083]使用一对离子敏感场效应晶体管ISFETs检测反应室内任何pH改变，所述离子敏感场效应晶体管与每个反应室关联，每对的ISFETs包括各自的传感膜，或共同的传感膜，所述传感膜暴露于关联的反应室内，并且ISFETs对以推拉构型耦合；
[0084]将推拉ISFETs的输出端MOSFET反相器级的输入端耦合；和
[0085]提供来自输出级的数字输出，所述数字输出是依赖存在于所述传感膜上的电压可切换的。
[0086]所述方法还可以包括在参考室上进行所述方法的步骤，所述参考室含有非匹配引物。
[0087]所述方法可以包括监视所述参考室的输出以检测设备内的错误偏差。
[0088]所述方法可以包括通过对所述设备进行调整，对检测错误偏差进行反应，从而消除所述偏差。
[0089]所述方法可以包括监视输出级的数字输出以检测指示核苷酸添加不可能的输出状态。
[0090]监视由输出级提供的数字输出可以包括在真值表中查找输出。
[0091]所述方法可以包括通过对所述设备进行调整，对检测不可能状态进行反应，从而消除所述不可能状态。
[0092]进行所述调整可以包括改变施加于参比电极的偏置电压。
[0093]进行所述调整可以包括改变可编程反相器以调整开关阈。
[0094]附图简沭
[0095]图1显示DNA片段，和互补碱基对；
[0096]图2显示碱基对的化学结构；
[0097]图3 是 ISFET ；
[0098]图4是未改进CMOS技术中的ISFET ；
[0099]图5 是共同 ISFET 接口，漏极输出器(drain-source follower)。
[0100]图6是用于对于SNP检测的应用的ISFET的配置；
[0101]图7是显示作为引物延伸的结果的pH降低的图表；
[0102]图8显示从DNA构建到染色体的次序；
[0103]图9是无REFET差分测量配置；
[0104]图10显示阵列中内存编址法；
[0105]图11是ISFET操作电容模型；
[0106]图12是ISFET电容模型；
[0107]图13是基于ISFET的反相器；
[0108]图14是化学开关；
[0109]图15是当门电压经3.3s从O扫至电源(3.3V)时，比较化学开关和MOSFET反相器中的行为的图表；
[0110]图16是显不对于不同pH的基于ISFET的反相器特性的图表；
[0111]图17是单个DNAGA像素配置；
[0112]图18是显示当pH随时间改变时，像素操作的模拟的图表；
[0113]图19是DNAGA配置实例；
[0114]图20是DNAGA数据通路总览；
[0115]图21是DNAGA校准和控制算法；
[0116]图22 是用于 DNAGA 的状态机器实例(Sample State Machine)；
[0117]图23是无REFET的DNAGA校准和读值算法；
[0118]图24是无REFET的DNAGA结构实例；
[0119]图25是用于在无REFET的DNAGA中检测无效状态的组合逻辑的实施实例；
[0120]图26是误差检测逻辑的Carnot-图实例；
[0121]图27是对于杂合子情况调整和检测SNPs的方案实例；
[0122]图28是具有对于切换点的调整是可编程的第二反相器的反相器层叠配置；
[0123]图29是当使用可编程门反相器时无REFET DNAGA校准和读值算法；和
[0124]图30显示描述来自两个不同ISFET的输入之间进行的差分测量的框图。
[0125]发明详沭
[0126]如之前讨论的，对于基于ISFET的SNP检测，以当前的设置存在许多缺点和问题。现在将描述可以极大地简化此种装置的操作的新方法和设备。例如，现在将建议的差分测量的新方法不仅增加PH改变测量的可信度，而且降低记录所需的数据量。还将描述进一步的在克服ISFET/化学测量的固有问题的同时提供直接的数字结果的新方法。然而，在继续所建议的配置之前，解释误差指示的思想以澄清所建议的设计的性能。
[0127]如在图8中显示的,DNA分子位于染色体对内。编码某个蛋白的投影(project1n)的基因(作为DNA的片段)，位于特定染色体对的特定部分。该染色体对的两条染色体上的基因序列可以相同(纯合)或可以不同(杂合)。当搜索个体种基因的特定碱基位置处的特定突变时，可能在两条染色体臂上找到相似的突变(即该个体是纯合子)或两个不同碱基(该个体是杂合子)位于研究的点。
[0128]例如，对于具有23对染色体的人类，基因序列的位置η上的碱基可以不同并且作为结果导致基因的投影不同。如果位置η之前的碱基序列由α表示并且其之后的序列以β表示，如果在他/她的基因组仅αΑβ序列存在，以致染色体对的两条臂都具有αΑβ，则靶基因多态性属于的人是具有类型A的纯合子。如果发现两个等位基因(即基因的不同形式)，例如αΑβ和a CP，以致染色体对的一个臂含有αΑβ的序列并且另一个含有αΟβ，则他/她是杂合子。
[0129]因此，对于基因的单突变，对于个体，可能存在4个核苷酸的空间和从而10个可能等位基因:四种纯合子情况，其中仅四个碱基中的一个填充染色体对的两条臂中的位置(αΑβ , αΟβ , α6β和αΤβ);和六种杂合子情况，其中染色体对在两条臂中的位置发现两个不同等位基因(α Αβ和α(:β,αΑβ和αΟβ,αΑβ和αΤβ,α(:β和α6β,α(:β和αΤβ，α6β和αΤβ)。因此，在人基因组中不可能发现3或4个等位基因并且其也不能具有缺口。从数学上看个体中的该问题，

f 4、( 4、
[0130]有效条件:纯合的U+杂合_U = 10 (3)

⑷[4') (4']
[0131]无效条件:U+[3J+l4J =6 (4)
[0132]回顾SNP测试，为了发现人靶DNA中特定基因的多态性，设计长度为η的具有与靶基因互补序列的引物以发现靶DNA链中位置n+1处的碱基(所述靶取自个体DNA的样品，例如取自唾液，并且染色体的两个臂上具有DNA的两种类型)。将引物和靶DNA分子以及所需的酶插入四个室。每个室仅具有四种核苷酸(A，C，G*T)中的一种。在每个室中，存在测量H+离子浓度的ISFET。位于含有与靶匹配并成功延伸引物的核苷酸的室中的ISFET，将检测PH降低。因此，仅从各个ISFET/室寻找一个比特的信息(即如果pH降低，则为1，或如果不降低则为0)。从所述四个ISFETs，我们可能能够得到24= 16种情形。但从前一段，我们知道仅10种情形是有效的并且我们预期找到这十种情形中的一种:
[0133]有效结果
[0134]纯合子{1000，0100，0010，0001}(5)
[0135]杂合子{1100,1010,1001,0110,0101,0011}
[0136]无效结果:{0000，1110，1101，1011,0111，1111}(6)
[0137]然而，由于之前描述的非理想信号(例如化学和热噪音，以及ISFET的阈电压随时间的漂移)的存在，所述测量值可能以误差偏差。这些不需要的信号将具有DC或非常低频率的性质并且以偏移出现。该误差可以影响ISFET输出并导致其以可能发出错误的pH降低的信号的方式作用或导致其不显示已经发生的PH降低。这些噪音常见并且出现可以造成6种无效情形中的一个；例如当ISFETs中没有一个报告pH降低，或它们所有，或它们中的三个报告PH降低。
[0138]新差分方案(无REFET)
[0139]现在将描述新结构，所述新结构中不再需要REFET。替代测量每个ISFET信号，在信号在测量点也被放大的同时，计算差分测量。这可以减少ADC的工作，而且更有利的是可以甚至不需要ADC。图9显示“无REFET”差分测量所需的配置(因为ISFETs以使其信号电容耦合的浮动门晶体管工作，以电容器表示室)。在该配置中，每个室(A，T，C，G)具有两个ISFETs (或实际上是共享相同传感膜的两个固有的浮动栅MOSFETs)。每个ISFET提供差分放大器中的输入端成对晶体管中的一个。使用四个差分放大器(X，Y，Z，W)。ISFETs以室的两个ISFETs中的一个成为放大器的非反转输入端并且另一个形成另一个放大器的反转输入端的方式布线。在该配置中，之前已知的具有数个缓冲和偏移取消回路的接口设计已经以单个简单的差分放大器替代。
[0140]图30显示描述两个不同ISFETs (A，T，C和G)的输入(a和b)之间进行的差分测量的框图。差分测量输入，并且提供输出C。如在图30显示的，可以存在确定差分输出c满足多个阈值带中的哪个的逻辑步骤。例如在图30中，存在上阈值和下阈值。如果c大于上阈值，则相应的输出X，Y，Z或W将是+1，如果c低于下阈值，则相应输出X，Y，Z或W将为-1，或如果c落在上和下阈值之间，则相应输出X，Y，Z或W将是O。
[0141]差分放大器X，Y，Z和W的输出可以被分为三个区域。一个由-1表不，为反转输入端ISFET上的pH降低的结果；另一个以I表示非反转输入端中的pH降低的结果；并且O对于在两个的任一个中都未检测到PH降低时，或它们两个中都检测到但已经删去时的情况。考虑到在四个室中的每个中可能发生的16种情况(10个有效，和6个无效)，建立真值表，所述真值表陈述哪个结果有效并且每个有效结果表示什么，并且另外哪个无效(即差分放大器的输出状态指示核苷酸添加不可能)和要求设备的偏移被调节。表1是对应于图9的配置的真值表的实例，其中“AR”代表“需要调整”。
[0142]

【权利要求】
1.设备，所述设备包括用于检测基因组内单核苷酸多态性SNP的模块，并且包括: 四个反应室，所述反应室用于接收流体样品，每个所述反应室含有不同的碱基A、C、G、T中的一种，和引物； 参比电极，所述参比电极在使用时浸没入所述流体样品中； 一对离子敏感场效应晶体管ISFETs，其与各个反应室关联，每对的ISFETs包括各自的传感膜或共同的传感膜，所述传感膜暴露于关联的反应室内；和 多个差分检波器，每个差分检波器具有一对输入端，所述输入端分别和与不同反应室关联的ISFETs的输出端耦合。
2.根据权利要求1所述的设备，所述多个差分检波器具有多对输入端，所述多对输入端与不同对的反应室的输出端耦合。
3.根据权利要求2所述的设备，所述设备包括四个差分检波器X，Y，Z和W，这些差分检波器具有以如下方式与反应室ISFETs耦合的输入端:
X:A 和 T
Y:T 和 C
Z:C 和 G
W:A 和 G。
4.根据在前权利要求中任一项所述的设备，所述设备包括输出检测器，所述输出检测器用于监视由所述差分检波器提供的输出，以便检测以下输出状态，所述输出状态指示核苷酸添加是不可能的。
5.根据权利要求4所述的设备，所述设备包括处理器，所述处理器与所述输出检测器耦合并且被配置成通过对所述设备进行调整对检测到不可能状态进行反应，从而消除所述不可能状态。
6.根据权利要求5所述的设备，对所述多个差分检波器的偏移进行所述调整。
7.根据权利要求6所述的设备，所述处理器被配置成通过以下中的一个或组合进行所述调整:改变施加于所述参比电极的偏置电压，改变差分检波器偏置电流，改变偏置参考电流，和改变通过缓冲级的电流。
8.根据在前权利要求中任一项所述的设备，其中所述差分检波器是差分放大器。
9.根据权利要求1至7任一项所述的设备，其中所述差分检波器是跨导放大器。
10.根据权利要求1至7任一项所述的设备，其中所述差分检波器是比较器。
11.根据在前权利要求中任一项所述的设备，所述设备包括被配置成检测不同SNPs的多个所述模块。
12.—种检测基因组内单核苷酸多态性SNP的方法，所述方法包括: 在四个反应室中接收流体样品，每个所述反应室含有不同的碱基A、C、G、T中的一种，和引物； 使用一对离子敏感场效应晶体管ISFETs检测所述反应室内的任何pH改变，所述离子敏感场效应晶体管与每个反应室关联，每对的ISFETs包括各自的传感膜或共同的传感膜，所述传感膜暴露在关联的反应室内；和 设置来自多个差分检波器的输出端，每个差分检波器具有一对输入端，所述输入端分别和与不同反应室关联的ISFETs的输出端耦合。
13.根据权利要求12所述的方法，所述方法还包括监视由所述差分检波器提供的输出，以便检测以下输出状态，所述输出状态指示核苷酸添加是不可能的。
14.根据权利要求13所述的方法，其中对由所述差分检波器提供的输出的监视包括在真值表中查找输出。
15.根据权利要求13或14之一所述的方法，还包括通过对所述设备进行调整对检测到不可能状态进行反应，从而消除所述不可能状态。
16.根据权利要求15所述的方法，其中对所述多个差分检波器的偏移进行所述调整。
17.根据权利要求16所述的方法，其中对所述设备进行调整包括以下中的一种或组合:改变施加于所述参比电极的偏置电压，改变差分检波器偏置电流，改变偏置参考电流，和改变通过缓冲级的电流。
18.根据权利要求12至17任一项所述的方法，其中所述差分检波器是差分放大器。
19.根据权利要求12至17任一项所述的方法，其中所述差分检波器是跨导放大器。
20.根据权利要求12至17任一项所述的方法，其中所述差分检波器是比较器。
21.设备，所述设备包括用于检测基因组内单核苷酸多态性SNP的模块并且包括: 四个反应室，其用于接收流体样品，每个反应室含有不同的碱基A、C、G、T中的一种，和引物； 参比电极，其在使用时浸没在所述流体样品中；和 与每个反应室关联的 一对离子敏感场效应晶体管ISFETs，每对的ISFETs包括各自的传感膜或共同的传感膜，所述传感膜暴露在关联反应室内，并且所述ISFETs对以推拉构型耦合； MOSFET反相器级，其具有与所述推拉构型的输出端耦合的输入端；和 输出级，其提供依赖于所述传感膜上存在的电压的可切换的数字输出。
22.根据权利要求21所述的设备，所述MOSFET反相器级包括一个MOSFET反相器，或多个层叠的MOSFET反相器。
23.根据权利要求21或22之一所述的设备，所述设备包括参考室，所述参考室含有非匹配引物。
24.根据权利要求23所述的设备，所述设备包括参考输出检测器，所述参考输出检测器用于监视所述参考室的输出，以检测所述设备内的错误偏差。
25.根据权利要求24所述的设备，所述设备包括处理器，所述处理器与所述参考输出检测器耦合，并且被配置成通过对所述设备进行调整以对检测的错误偏差进行反应，从而消除所述偏差。
26.根据权利要求21或22任一项所述的设备，所述设备包括输出检测器，所述输出检测器用于监视所述输出级的数字输出，以便检测以下输出状态，所述输出状态指示核苷酸添加是不可能的。
27.根据权利要求26所述的设备，所述设备包括处理器，所述处理器与所述输出检测器耦合并且被配置成通过对所述设备进行调整对检测到不可能状态进行反应，从而消除所述不可能状态。
28.根据权利要求25或27任一项所述的设备，所述处理器被配置成通过改变施加于所述参比电极的偏置电压进行所述调整。
29.根据权利要求25或27任一项所述的设备，所述处理器被配置成通过改变可编程反相器以调整开关阈来进行所述调整。
30.根据权利要求21至29任一项所述的设备，所述设备包括被配置成检测不同SNPs的多个所述模块。
31.一种检测基因组内单核苷酸多态性SNP的方法，所述方法包括: 在四个反应室中接收流体样品，每个所述反应室含有不同的碱基A、C、G、T中的一种，和引物； 使用一对离子敏感场效应晶体管ISFETs检测所述反应室内任何pH改变，所述离子敏感场效应晶体管与每个反应室关联，每对的所述ISFETs包括各自的传感膜或共同的传感膜，所述传感膜暴露于关联的反应室内，并且ISFETs对以推拉构型耦合； 将所述推拉ISFETs的输出端与MOSFET反相器级的输入端耦合；和 提供来自输出级的数字输出，所述数字输出是依赖于存在于所述传感膜上的电压可切换的。
32.根据权利要求31所述的方法，所述方法还包括在参考室上进行所述方法的步骤，所述参考室含有非匹配引物。
33.根据权利要求32所述的方法，所述方法包括监视所述参考室的输出以检测所述设备内的错误偏差。
34.根据权利要求33所述的方法，所述方法包括通过对所述设备进行调整对检测到错误偏差进行反应，从而消除所述偏差。
35.根据权利要求31所述的方法，所述方法包括监视所述输出级的数字输出，以便检测以下输出状态，所述输出状态指示核苷酸添加是不可能的。
36.根据权利要求35所述的方法，其中监视由所述输出级提供的数字输出包括在真值表中查找所述输出。
37.根据权利要求35或36任一项所述的方法，所述方法包括通过对所述设备进行调整对检测到不可能状态进行反应，从而消除所述不可能状态。
38.根据权利要求34或37任一项所述的方法，其中进行所述调整包括改变施加于参比电极的偏置电压。
39.根据权利要求34或37任一项所述的方法，其中进行所述调整包括改变可编程反相器以调整开关阈。
【文档编号】C12Q1/68GK104204790SQ201380018533
【公开日】2014年12月10日 申请日期:2013年3月19日 优先权日:2012年3月30日
【发明者】穆罕默德列扎·苏哈巴提, 卡尔文·西姆 申请人:基因奥尼克斯有限公司