产生和筛选新代谢途径的方法

专利名称：产生和筛选新代谢途径的方法
1.发明领域本发明涉及一种新的发现药物的方法，具体地说，本发明涉及一种保存为药物的良好或有希望的来源的生物基因组的系统；一种任意混合来自一种或多种生物的遗传物质以产生新的代谢途径的系统；以及一种预筛选或筛选这些遗传工程细胞以产生新的生化途径和制备新的种类的化合物的系统。该新的或重新构成的代谢途径可用于商业生产这些化合物。
2.发明背景2.1.药物前驱的来源药物发现中的基本任选是确定具有所需活性的前驱化合物，并优选前驱化合物以满足进行进一步药物开发所需的要求。一个药物发现的通常的方法包括产生在生物分析中与产生疾病(疾病目标)有关的大分子，其中测试可能的候选药物的治疗活性，这些分子可为受体，酶或转录因子。
另一种方法包括提供为疾病的病原体的代表的整个细胞或生物。这些病原体包括细菌和肿瘤细胞系。
一般地，存在两种可能的药物候选来源，一批天然产物和合成化合物。通过任意筛选包含尽可能宽范围的结构类型的这一批已实现了前驱化合物的鉴别。合成的组合化合物库的最近进展将进一步增加可用于筛选的化合物的数目和种类，然而，任何合成的化合物库的合成法受人的想象和合成技术的限制。
任意筛选来自例如陆生细菌，真菌，无脊椎动物和植物来源的天然产物已导致发现了许多重要的药物(Franco等，1991，Critical RevBiotechnol 11193-276；Goodfellow等，1989，在“微生物产物新方法”，Cambridge University Press，pp.343-383；Berdy 1974，高级应用微生物学18309-406；Suffness等，1988，在海洋生物的生物药物的重要性，D.G.Fautin，California Academy of Sciences，p.151-157)。多于10,000种的这些天然产物具有生物活性，这些中的至少100种目前被用作抗生素，农业化肥和抗肿瘤剂。这种发现药物的方法的成功极大地取决于进入筛选程序中的化合物的多少。通常，药物公司筛选含有数万种天然和合成化合物的化合物群。然而，新的化合物与以前发现的化合物的比例随着时间而降低。在筛选抗癌药剂中，例如，大多数具有生物活性的微生物种类可产生已被鉴定的化合物。一部分是由于始终如一并足够地发现，重新产生以及提供新的天然产物样品的困难。因为生物多样性很大程度是由于潜在的分子多样性，在目前被选择用于任意筛选的生物中没有足够的生物多样性，这就降低了分离新化合物的可能性。
新的生物活性已始终如一地在各种天然来源中发现。参见例如，Cragg等，1994.(在“Enthnobotany及新药找寻”Wiley，Chichester.p178-196)。少数来源已被系统和全面地试验用于新药物前驱。例如，估计仅5000种植物种类被详尽地研究用于可能的医药用途。这是估计的250,000-3,000,000种类全部的一小部分，它们大多数生长在热带(Abelson 1990，科学247513)。而且，在估计的数百万种海洋微生物中，仅少数已被表征。确实，具有仍未被挖掘为前驱化合物来源的巨大的生物多样性。
陆生微生物，真菌，无脊椎动物和植物历来被用作天然产物的来源。然而，除开一些被细致研究的生物群外，例如放线菌属，它已被开发用于药物筛选和商业生产外，可重复生产和生产问题仍然存在。例如，抗肿瘤剂，紫杉酚，为成熟太平洋水松树的树皮的一部分，并且它作为临床制剂已导致了关于对当地生态系统的破坏的关注。紫杉酚含有11个手性中心，具有2048个可能非对映异构体形式，这样它的在商业规模上的从头合成看来是不可能的(Phillipson，1994，皇家热带医学与卫生学汇刊88 Supp 117-19)。
海洋无脊椎动物是一个有希望的新的化合物的来源，但存在大多数在用于进行药物筛选和大规模重新提供的技术中的不足。例如，海洋无脊椎动物难于重新收集，并且在天然产物的含量方面，许多具有季节的可变性。
海洋微生物是一种有希望的新化合物的来源，但也存在大多数在用于进行药物筛选和用海洋微生物进行工业发酵的技术中的不足。例如，海洋微生物难于收集，建立以及在培养物中保持，并许多具有特殊的营养需求。可靠来源的未被污染的海水通常对于发酵是必需的。估计至少99％的海洋细菌种类在实验室培养基中不能存活。而且，购置的商业发酵装置不适宜用于盐水环境，或高压下。
而且，一些化合物仅当特定的生物相互作用和与环境作用时才在自然界中出现。病原体可能改变植物基因表达并诱发化合物的合成，例如植物抗毒素，促使植物抗侵蚀。例如，野生烟草植物(Nicotianasylvestris)当受来自烟草天蛾(Manduca sexta)幼虫的侵蚀时，则增加其生物碱的合成。同样真菌可通过解毒作用或防止它们的积累对植物抗毒素产生反应。通过传统的高通过量(throughput)筛选，这些代谢物被遗失，该方法不一起评价真菌和它的植物宿主。自然环境对生物的影响的一个明显的例子通过有毒导弹蛙可以看出。虽然可通过将吹风导弹的顶部沿田间种类的腺的背部擦刮来收集致死剂量的钠通道拮抗剂生物碱，蛙毒素，但在第二代陆地饲养的蛙中不能检测到蛙毒素(Daly，1995，美国国家科学院院刊929-13)。只要运用传统的药物筛选技术，象这些的可能有价值的分子可能永远不会被发现。
而且，通过随意筛选的前驱化合物极少成为药物，因为它的效力，选择性，生物利用度或稳定性可能不够。通常，需要一定量的前驱化合物，这样它可被结构修饰以改善它的初始活性。然而，目前从天然来源尤其是植物合成和开发前驱化合物的方法相对效率低。存在与药物开发各阶段有关的明显的障碍，例如重新收集，产生药物的生物的生长，去复制(dereplication)，菌株改进，培养基改进和扩大生产。这些问题延迟了新化合物的临床试验，并影响使用这些新来源的药物前驱的经济性。
目前，对天然产物的上述海洋，植物和动物来源利用不足。对于这些开发不足的来源，目前现有的制备和筛选前驱化合物的方法不能被有效地运用。不象一些陆生细菌和真菌，这些产生药物的生物不容易适应于工业发酵技术。同时，发现药物新来源的压力被新的高效和高通过量的筛选技术加剧。因此，普遍需要利用作为仍未开发的化合物来源的遗传资源和化合物多样性的方法以用于发现药物的目的。2.2.表达库最近药物发现计划已转移到以机理为基础的发现筛选。一旦确定一个分子靶(例如参与调节疾病的激素受体)，则将分析设计为识别和/或合成在分子水平与靶相互作用的治疗剂。
基因表达库被用来识别，试验和制备靶分子。在不知道蛋白质物理性质时，表达克隆已成为获得编码单一蛋白质的靶基因的常规方法。
通过筛选基因表达库识别，从人和哺乳动物组织制备的许多蛋白质为可能的疾病靶，例如，受体(Simonsen等，1994，药物科学动态15437-441；Nakayama等，1992，当今生物技术评论3497-505；Aruffo，1991，当今生物技术评论2735-74l)，信号转导蛋白(Margolis等，US5,434,064)。参见Seed等，1987，美国国家科学院院刊843365-3369；Yamasaki等，1988，科学241825-828；和Lin等，1992，细胞68775-785，(类型III TGF-β受体)为通过在哺乳动物细胞中的功能性表达克隆识别的蛋白质的例子。
一旦靶疾病被确定，靶蛋白或表达靶蛋白的被遗传设计的宿主细胞被用于生物分析以筛选前驱化合物(Luyten等，1993，生物技术动态11247-54)。因此，在药物发现的方案中，基因表达文库的使用极大地受限制于可能的蛋白质疾病靶的识别和产生。仅在药物为蛋白质或小肽，例如，抗体的那些情况下，表达文库才被制备以产生和筛选具有所需生物活性的分子(Huse等，1991，Ciba Foundation Symp15991-102)。
然而，与药物发现相关的基因表达文库具有其它的用途。为了识别参与产生具有药物活性的代谢物和特殊化学物质的生物合成途径的基因的目的，已制备出了微生物的基因文库。这些途径需要多种蛋白质(具体地说，酶)，必然伴有比用作药物靶的单一蛋白质更大的复杂性。例如，通过筛选该生物的基因文库确定了编码细菌聚酮化合物合成酶(PKSs)途径的基因(Malpartida等，1984，自然，309462；Donadio等，1991，科学252675-679)。PKSs催化为重要一类治疗化合物的聚酮化合物类的生物合成的多个步骤，并控制产生的聚酮化合物的结构多样性。已开发出允许克隆的PKS基因定向突变和表达的在链霉菌属中的宿主 载体系统(McDaniel等，1993，科学2621546-1550；Kao等，1994，科学265509-512)。该特定的宿主载体系统已被用来开发更为有效的产生聚酮化合物类的途径，并被用来合理地开发新的聚酮化合物类(Khosla等，WO95/08548)。
另一个例子是通过在大肠杆菌宿主中发酵来制备织物染料，靛蓝。含有编码多酶生物合成途径的基因的两个操纵子已被遗传操纵以提高外源大肠杆菌宿主的靛蓝的产生(Ensley等，1983，科学222167-169；Murdock等，1993，生物/技术11381-386)。总之，编码代谢途径的基因的异种表达的常规研究包括定向克隆，序列分析，设计突变和编码已知参与以前表征的代谢途径的蛋白质的特定基因的重排。
鉴于对疾病机理和药物靶确定的认识的巨大进步，日益需要改进迅速识别前驱化合物并将它们引入临床试验的策略和方法。
3.发明概述本发明提供一种产生和筛选用于药物发现目的的分子多样性的药物发现系统。本发明的方法将已知为/或有希望为药物前驱来源的生物的遗传物质捕捉并保存在混合的基因表达文库中。
在一个实施方案中，本发明包括从一种或多种供体生物构建混合天然途径的基因表达文库，其中供体生物包括微生物，植物和动物，尤其是在自然界不能大量回收，或不能在实验室中培养的那些。根据它们已知的生物特性，可选择库中的供体生物，或它们可为已知和/或从自然界收集的未知种类的生物的混合物。在宿主生物中克隆和表达供体生物基因组的任意片段，它们中的一些含有全部和部分生化途径。
根据本发明，转移的DNA的基因产物的亚组(subset)能在宿主生物中起作用。在宿主生物中，供体生物自然发生的途径可由此被重新构成。供体基因在异种宿主的不相类似的生理和调节环境中的表达可暴露其它沉默的代谢途径。供体生物的代谢途径也可与存在于宿主生物中的代谢途径相互作用以产生新的化合物或宿主生物一般不产生的化合物。
而且，由于在任一时间，在宿主生物中仅仅表达确定的亚组的供体生物的基因，该系统可使得在宿主生物的已表征的生化/细胞背景下更易于检测代谢途径和化合物。从本质上讲是，这些供体生物的遗传资源被捕捉和保存在基因表达文库中，该基因表达文库在不同的药物发现步骤中可被复制和反复使用。
在另一个实施方案中，本发明包括结合的嵌合途径表达文库的构建，其中来自一种或多种供体生物的遗传物质在宿主生物中被任意组合，克隆和表达。这些文库从多个途径和生物产生基因的任意组合，这样产生了以前在自然界不存在的代谢途径和独立的基因组。术语“独立的基因组”指从来自组合基因表达文库中的一个或多个途径或生物的基因的连接而获得的两个或多个基因的任何结合。多种基因产物能在宿主生物中起作用，其中它们相互作用以形成产生新类别的化合物的新的嵌合代谢途径。因此，通过混合组合嵌合基因表达文库中的现存的途径和生物的遗传物质增加了可用于药物筛选的分子结构的多样性。
虽然可使用筛选基因表达文库的标准方法，但该文库可被进一步修饰以掺入一个报道体系来满足识别正在表达所需途径和代谢产物的克隆的需要。在一个具体的实施方案中，宿主生物被遗传改造包括编码可操纵性地与化学应答启动子相关的报告蛋白质的基因，该化学应答启动子与在表达文库中要检测的所需种类的代谢物产生应答。
在另一个实施方案中，宿主生物可暴露于为报道分子前体的生理探针中，该前体通过在所找到的途径中产生的化合物直接或间接转化为报道分子。报道分子表征的活化或报道前体的转化产生了允许识别和分离所需克隆的信号。
在本发明的另一个实施方案中，文库中的宿主生物可与报道体系或含有试样或本身为所需化合物的靶的其它指示细胞类型，例如抗感染剂针对的病原体或抗肿瘤剂针对的肿瘤细胞一起内嵌在半固体基质中。可使用高流通量的筛选方法，例如，大滴流分选，荧光激活细胞分选或磁激活细胞分选以在组合基因表达文库中识别和分离所需生物。
可进一步分析阳性克隆产生的新化合物。通过表征导入分离克隆中的遗传物质可说明导致产生新化合物的代谢途径的遗传学和生物化学。
本发明还涉及用于构建组合基因表达文库的DNA载体，特定的组合基因表达文库，含有特定类型的报道体系的宿主生物，被修饰以便于产生其它毒性化合物的宿主生物，和包含宿主生物，指示细胞和/或报道体系的组合物。3.1.定义如本文所采用，下面术语具有所指明的含义。
“组合天然途径表达文库”是表达从来自多种供体生物的遗传物质制备的构建物的文库，其中存在于遗传物质中的基因可操作性地在适宜宿主生物中引起基因表达的调节区相联系。组合表达文库使用能产生供体生物的功能性基因产物的宿主生物。在各个宿主生物中的遗传物质编码来自一个供体生物的自然发生的生化途径或它的一部分。
“组合嵌合途径表达文库”是表达从来自一种或多种供体生物的任意多联体化的遗传物质制备的构建物的文库，其中存在于遗传物质中的基因可操作性地与在适宜宿主生物中引起基因表达的调节区相联系。使用的宿主生物能产生供体生物的功能性基因产物。
“偏倚的组合基因表达文库”是表达从来自一种或多种供体生物的遗传物质制备的构建物的文库，它已被对特定的性质进行了预先选择。预先选择的遗传物质可被用来制备组合天然途径或嵌合文库。
如本文所采用，术语“文库”指表达构建物或含表达构建物的宿主生物。
术语“生化途径”，“天然途径”和“代谢途径”包含所有系列的由生物进行的相关的生化反应。该途径可包括，但不局限于生物合成或生物降解途径，或能量产生或转化途径。
“化合物”是为生化途径的结果或副产物的任何分子，并且通常是多种基因产物相互作用的产物。
“活性”是宿主生物进行生化反应或一系列导致产生感兴趣化合物的生化反应的能力。
如本发明中所采用的，下面缩写表示eq(当量)；M(摩尔浓度)；mM(毫摩尔浓度)；μM(微摩尔浓度)；N(正常)；mol(摩尔)；mmol(毫摩尔)；μmol(微摩尔)nmol(纳摩尔)kg(千克)；gm(克)；mg(毫克)；μg(微克)；ng(纳克)；L(升)；mL(毫升)；μl(微升)；vol(体积)；s(秒)；和℃(摄氏温度)。
此外，采用下面缩写Cfu克隆形成单位；LBLuria发酵液；ddH2O双蒸馏，反渗透纯化水；海水过滤的太平洋海水；SSW合成海水；FACS荧光激活细胞分选；GFP维多利亚多管水母(Aequorea victoria)绿色荧光蛋白；kbp千碱基对；g重力；rpm每分钟旋转；CIAP小牛肠碱性磷酸酶；EDTA乙二酸四乙胺；TE10mM Tris/1.5mM EDTA pH 7.4；PEG聚乙二醇；E.coli大肠杆菌；CHO中国仓鼠卵巢；S.cerevisiae啤酒糖酵母；A.nidulans构巢曲霉；S.pombe粟酒裂殖酵母；S.lividans变青链霉菌；S.aureus金黄色葡萄球菌；S.coelicolor天蓝色链霉菌；B.subtilis枯草芽孢杆菌；BAC细菌人工染色体；YAC酵母人工染色体；PCR聚合酶链反应；CaMV花椰菜花叶病毒；AcNPV苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒；EBVEpstein-Barr病毒；SDS十二烷基磺酸钠；CsCl氯化铯。
4.


图1组合天然途径表达文库的表达构建物。该表达构建物含有载体DNA以及包括编码代谢途径和天然相联系的调节区的供体DNA片段。
图2组合嵌合途径表达文库的表达构建物。该表达构建物含有载体DNA和各包括供体DNA和调节区的五个多联体化的基因盒。
图3组合天然途径表达文库的克隆方法。将从供体生物(A)提取的可克隆DNA(B)用限制性酶部分消化以产物编码天然发生的生化途径或其一部分的基因组DNA(C)的片段。将被用限制性酶消化以产生具有相容末端(E)的载体的DNA载体(D)连接至基因组DNA的片段上以形成表达构建物(F)。
图4A-4C基因盒的装配。图4A描述了含有粘性BamHI位点和相对于SamI位点的一部分为平端的退火的，磷酸化的lac启动子片段。图4B描述了含有在于侧翼位于lac启动子旁侧的BamHI位点的启动子二聚体。图4C描述了多联体化的启动子片段图5A-5F组合嵌合途径表达文库的克隆方法。图5A表明制备用于cDNA和基因组DNA插入片段的定向克隆的启动子和终止子片段的步骤。图5B表明制备用于与基因组DNA插入片段相连的启动子和终止子片段的步骤。图5C表明制备用于定向克隆，基因盒的装配，以及与固体支持物的连接的cDNA插入片段的步骤。图5D表明制备用于克隆，基因盒的装配以及与固体支持物的连接的基因组DNA插入片段的步骤。图5E和5F表明基因盒的系列连接以及去保护以形成多联体，多联体与裂殖酵母/大肠杆菌穿梭载体(pDblet)的连接；表达构建物从固体载体上的释放以及表达构建物的环化。
图6A-6B用于制备组合基因表达文库的载体。图6A表明Streptocos图谱。粘粒载体Streptocos在多个克隆位点中含有位于T3和T7启动子旁侧的唯一个BamHI位点，复制起点和来自pIJ 699的硫链丝菌肽抗性基因，ColE1起点(ori)，氨苄青霉素基因(Amp)和两个cos位点。图6B表明修饰的pDblet图谱。质粒pDblet在多个克隆位点(MCS)被修饰，并且含有复制的ColE1起点，氨苄青霉素基因(ApR)，两个拷贝的自主复制序列(ARS)，一个ura4标记，以及β-半乳糖苷酶基因(LacZ)。AAatII；BBamHI；NNdeI。图6C表明含有改变的BstXI序列和NcoI位点的寡聚体，它被过量地与SacI/NotI切割的pDblet连接的形成修饰的pDblet。
图7表明化学应答构建物pERD-20-GFP，其包括一个编码绿色荧光蛋白(GFP)的受体基因，化学应答启动子(Pm)和其相关的调节子(Xyls)。
图8表明包含可通透基质和含有受体区的指示细胞的大粗流，在基质中来自组合基因表达文库的克隆被包裹。
图9A和9B提供了在存在和不存在包含海洋细菌基因的表达构建物的情况下，对大肠杆菌细胞库进行FACS分选的实例。用海洋细菌基因的粘粒文库感染称为XLl-GFP的含有化学应答构建物pERD-20-GFP的大肠杆菌菌株XLl MR。在30℃下，将具有或不具有海洋细菌基因的XLl-GFP细胞培养12小时，并进行两轮的FACS分选。图9A具有海洋细菌基因的XLl-GFP；图9B对照XLl-GFP细胞。
图10表明天蓝色链霉菌的放线紫素脱水酶的氨基酸序列的排列，以及来自CXC-AMN 20的预测的部分氨基酸序列。空白的部分说明序列相同，有阴影的部分说明保守序列同源性。
图11海洋细菌的基因组DNA库中的克隆CXC-AMN 20序列的PCR检测。该图表明含有来自海洋细菌基因组DNA的PCR扩增子的染色的琼脂糖凝胶。M分子量标记，大小为bp。-阴性对照。+扩增子和核糖体RNA的阳性对照。泳道含有来自T的扩增子来自所有37种海洋细菌的基因DNA；1，2，3，4海洋细菌的基因组DNA库。
图12A-C海洋细菌种类的基因组DNA中的克隆CXC-AMN 20序列的PCR检测。该图表明含有来自海洋细菌各种类的基因组DNA的PCR扩增子的染色的琼脂糖凝胶。M分子量标记，大小为bp。-阴性对照。+扩增子和核糖体RNA的阳性对照。泳道含有来自海洋细菌基因组DNA的扩增子分别是库1，2，3中的种类#1-10，#12-20和#21-35。
5.发明详述本发明涉及一种药物发现系统，该系统提供用于捕获和保存自然界多样性的遗传资源，并且用于将捕获和资源翻译和扩展为多样性的化学结构的方法和组合物。本发明还便于筛选所需活性和化合物。
更具体地说，本发明提供用于构建和筛选组合基因表达文库的方法。这些文库包括任意种类的多种种类的基因产物，在一些情况下，它能在表达宿主中相互作用，并在某些情况下导致形成新的生化途径和/或产生新类型的化合物。而且，本发明的文库提供有效的得到其它不可得到的分子多样性来源的途径。
新的生化途径可进行，包括但不局限于物质的结构修饰，将化学基团加入物质中或分解物质的过程。
新种类的化合物可包括，但不局限于代谢物，二级代谢物，酶，或生物体的结构组成。感兴趣的化合物可具有一种或多种潜在的治疗特性，包括但不局限于抗生素，抗病毒，抗肿瘤，药理学或免疫调节特性或其它具有商业价值的化合物，如色素。化合物可作为一类受体或一个特定受体的兴奋剂或拮抗剂。
如本发明所采用的，术语“组合基因表达文库”包括组合天然途径表达文库，组合嵌合途径表达文库以及含有表达构建物文库的宿主生物。
“组合天然途径表达文库”是从来自一种或多种供体生物的遗传物质制得的表达构建物文库，其中存在于遗传物质中的基因可操作性地与引起基因在适宜宿主生物中表达的调节区相联系。组合表达文库使用能产生供体生物功能性基因产物的宿主生物。各宿主生物中的遗传物质编码来自供体生物的自然发生的生化途径或其一部分。
“组合嵌合途径表达文库”是从来自多种供体生物的任意嵌合的遗传物质制备的表达构建物文库，其中存在于遗传物质中的基因可操作性地与引起基因在适宜宿主生物中表达的调节区相联系。所采用的宿主生物能产生供体生物的功能性基因产物。在宿主生物中表达时，供体生物的基因产物可相互作用形成新的嵌合生化途径。
通常，本发明的方法包括提供来自一或多个供体生物的遗传物质。操作所述遗传物质，和将所述遗传物质借助于克隆或表达载体导入宿主生物中，这样供体生物的一个或多个基因被转移至并在宿主生物中表达。这些含有供体遗传物质的宿主生物被汇集形成文库。
转移的遗传物质通常包含任意种类的基因，它们表达由一个或多个功能性调节区引起和控制。表达构建物或载体可提供一些这样的调节区。在宿主生物中供体生物的基因被转录，翻译并加工以产生其本身又产生感兴趣的代谢物的功能性蛋白质。
根据本发明，包括完全天然发生的生化途径或其本质一部分的基因表达文库，可大大便于寻找负责产生化合物或提供感兴趣活性的供体多酶体系。参与特定生化途径的基因可按常规分离并以单个表达构建物或克隆来表征。该表达构建物的一个典型的排列示于图1中。
一旦确定了所需活性化合物，这个合适的特征可大大地便于下面的药物开发工作，例如菌株的改进和方法的改进。可在标准条件下培养阳性克隆以产生足够量的用于进一步研究或使用的所需化合物。该生化途径的基因可立即用于测序，突变，表达和更多轮的筛选。克隆的生化途径容易适合于用于过量产生所需化合物的传统的和/或遗传操作。
而且，在供体生物中另外情况下为沉默或不可检测的生化途径可较容易地根据它们在宿主生物中的功能性重建来发现。因为宿主生物的生化特征是熟知的，作为供体遗传物质表达的结果的许多偏离可被容易地识别。可通过将含有供体遗传物质的宿主生物的提取物与在一系列给定的环境条件下已知由对照宿主生物产生的化合物分布图进行比较来检测新化合物。当宿主生物的宿主生化和细胞背景被很好地表征时，甚至可检测非常低水平的所需活性或化合物。如后面章节所描述的，本发明提供了用于检测和分离产生所需活性或化合物类型的克隆的方法。
在一个优选的实施方案中，这些方法可适用于在自然界不能大量回收或不能在实验室培养的供体生物。通过将来自这些生物的遗传物质转移至宿主生物中，生物的代谢途径可重新产生，并且它们的产物可被有效地检测其任何所需性质。因此，捕获并保存了这些生物的遗传多样性。
在本发明另一个实施方案中，可构建组合嵌合途径基因表达文库，其中在导入宿主生物之前，来自一种或多种供体生物的遗传物质被任意地多联体化。因此，文库中的每一宿主生物可各自含有来自各供体途径或生物的唯一，任意的基因组合。图2表达组合嵌合途径基因表达文库的表达构建物中的基因和调节区的排列。大多数情况下，文库中的基因的这些组合在自然界并不发生。在表达时，在各宿主生物中，各种供体途径或生物的功能性基因产物相互作用，产生导致新的嵌合代谢途径和/或产生新化合物的生化反应的组合。总的来说，文库中的供体生物的遗传资源被翻译成在各供体生物中不可能发现的多种化合物。
在本发明的另一个方面，可根据它们的生物特性，或进行互补于宿主生物的所需组不特殊的生化反应的能力来选择供体生物的种类。这些所需特性可包括，但不局限于使用某些营养物质，在极端条件下存活，衍生化学结构的能力，以及分解或催化某些类型化学键形成的能力。当供体生物的基因在宿主生物中表达时，供体基因产物可修饰和/或取代组成宿主代谢途径的宿主基因产物的功能，从而产生新的杂交途径。新的活性和/或化合物可通过包含供体和来自宿主的成分的杂交途径而产生。被供体基因产物修饰的靶代谢途径对于宿主生物可能为原先有的。另一方面，靶代谢途径可由异种基因产物来提供，该异种基因为内源性的或在构建基因表达文库之前或同时已被遗传操作至各宿主生物中。因此，本发明还包括构建和筛选基因表达文库，其中编码供体生物代谢途径的DNA片段在含有靶代谢途径的宿主生物中克隆和共表达。
在本发明的另一个实施方案中，宿主生物可具有将感兴趣化合物分泌至培养基的活性药物外排系统的增强补体，从而降低化合物对宿主生物的毒性。可在培养宿主生物期间使用吸水性物质，如中性树脂，从而可分离由宿主生物产生和分泌的代谢物，因此而便于回收代谢物。
为了使筛选组合基因表达文库的方法更为有效，本发明进一步提供了检测文库中具有感兴趣活性或化合物的那些宿主生物的方法。在本发明的一个实施方案中，宿主生物含有报道体系，该报道体系将通过活化报道分子的从头合成来对引入的变化和出现产生反应，例如出现所需化合物或活性。在一个实施方案中，宿主生物含有报道分子的前体，或生理性探针，由于所需化合物或活性的出现，它则转化为报道分子。阳性克隆中的报道分子产生可检测表达文库中的阳性克隆，以及从不产生它的其它克隆中分离的信号。
在许多方面，该药物发现系统对于药物开发的各个步骤直至临床试验提供了明显的便利和时间优势。本发明的文库与已建立的多孔足迹形式和高流通量筛选的机器人技术相容。本发明的宿主生物为通常用于遗传操作和/或方法开发的生物。本发明利用了这些宿主生物或生产宿主在它们的生物学特性和供养需求方面已清楚地被表征这一事实。通过将来自供体生物的遗传物质转移至其它更为熟悉的表达系统，降低了对供体生物的困难的培养条件的需求。因此，可研究和更有效地优化在本发明系统中发现的任何前驱化合物的生物活性，药物动力学和毒性性质。
阳性克隆中产生的新的代谢途径可通过分子生物学中的标准方法来说明。可在标准或根据经验确定的培养条件下培养产生药物的宿主生物的克隆来合成前驱化合物，这样可分离足够量的前驱化合物用于进一步的分析和开发。已有高纯度的生产方法，例如对于一些这样的标准工业宿主生物建立的良好的制造加工(Good Manufacturing Practice)(GMP)。不象筛选天然产物来源的常规方法，需要较少的努力来使筛选和生产方法适应于各可能的产生药物的生物的特殊的需求。
本发明还提供了根据本发明的方法从特定组的供体生物和/或细胞类型制备的特定的组合基因表达文库。并非一组中所有的生物或细胞类型，尤其是混合样品均需要一一确定或表征以使得制备组合基因表达文库成为可能。
本发明的任何组合基因表达文库可扩增，复制和贮存。扩增指培养含有供体DNA的初始宿主生物，这样可产生宿主生物的多个克隆。复制指挑选和培养文库中的各个克隆。可通过本领域已知的适宜于宿主生物的任何方法贮存和复苏本发明的组合基因表达文库，因此，本发明的文库是一个有效的捕获和保存供体生物遗传资源的方法，该遗传资源在药物发现方案中可重复获得。5.1.组合基因表达文库的制备5.1.1.供体生物任何生物可作为用于制备本发明组合基因表达文库目的的供体生物。供体生物可从私人或公共实验室培养物，或培养物保藏单位，例如美国典型培养物保藏中心，国际真菌学院，或从培养的或未培养的环境样品中获得。
供体生物可能已是药物前驱的传统来源，例如陆生细菌，真菌和植物。供体生物可为已用于产生和/或制备药物的转基因，被遗传操作或遗传选择的菌株。
供体生物可以或不可用目前现有技术提到的微生物学方法来进行培养，例如用于制备文库的遗传物质可直接从环境样品中获得。因为仅少量(≤1％)自然界发现的微生物可在实验室培养，所以本发明的主要优点是本文所使用的供体生物不必是可培养(Torsvik等，1990，应用环境微生物学，156782-787)。
本发明不局限于使用微生物作为供体。植物产生大量的化合物，一些对动物和微生物具有强的活性，例如植物抗毒素(Abelson 1990，科学247513)。这些化合物中的一些可通过创伤或来自植物病原体的细胞壁的提取物来诱导(Cramer等，1985，欧洲分子生物学联合会杂志，4285-289；Cramer等，1985，科学2271240-1243；Dron等，1988，美国国家科学院院刊856738-6742)。生物活性化合物，如紫杉酚，喜树碱，青蒿素，为来自植物的天然产物的实例，它们分别作为抗肿瘤和抗疟疾剂正进行临床开发。任何植物，尤其是具有可能的药物性质的那些，可能为所需的供体生物(Phillipson，1994，皇家热带医学与卫生学汇刊，88补编1S17-9；Chadwick等编，1994，在“人种植物学和新药研究”，Wiley，Chichester，CibaFoundation Symp 185)。
具有可能有用的抗微生物或药物学性质的天然产物的另一个来源是无脊椎动物和脊椎动物。这些化合物的一些起抗竞争者，病原体和捕食者的化学防护的作用。这些化合物也可用来杀伤捕获物或用作联系的各种形式(Caporale 1995，美国国家科学院院刊9275 82)。在多数情况下，二级代谢产物被认为是由相关的可能为共生的微生物所产生(Faulkner等，1993，Gazzetta Chimica Italiana，123301-307；Bewley等，1995，在Antonio Gonzalez教授在“海洋天然产物化学讨论会上的共生的综述”，La Laguna大学，Canary Islands，9，16，1995，p26(摘要))。
在自然界被已知操纵其它生物的生化途径的生物是尤其感兴趣的来源，例如一些植物，如苏铁属，可产生干扰某些昆虫发育的蜕皮素模拟物。这些生物可生存于相同的生态位中，其中它们作为竞争者，共生体，捕食者和捕获物，或作为宿主和寄生物而存在。因此，使用来自在自然界相互发生化学相互作用的生物的遗传物质可能是有利的。
天然产物的另外其它的丰富来源是海洋生物。例如，海洋微生物产生新的分子结构，其中许多具有生物活性，例如辛内酰亚胺A(octalactinA)，它为具有以前在陆生细菌中没有发现的分子结构的可能的抗肿瘤剂(Tapiolas等，1991，美国化学联合会杂志，1134682-83)；和Salinamides(Trischman等，1994，美国化学联合会杂志，116755-758)，它具有可能的抗炎性质。来自海洋生物的一些化合物含有来自海水的溴，由于掺入的卤素的化学活性，使得化合物具有高活性，例如marinone(Pathirana等，1992，Tetrahedron Lett 337663-7666)，混合聚酮化合物和甲瓦龙酸生物合成途径的产物，它具有选择性的抗革兰氏阳性菌的抗生素活性。在具有不同的盐浓度，温度和压力，从极地到热带区的大范围的栖息地中生活着巨大量的海洋生物种类。这些栖息地的独一无二的特性反映在这些生物的独特的遗传学和生物化学中，并且可能提供许多有用的药物前驱。参见，例如Fenical等，1992，“海洋微生物，新的生物资源”。海洋生物技术进展，Vol.I，PlenumPress，New York。
环境样品可从天然或人工环境中获得，可包含原核和真核生物的混合物，和病毒，其中一些可能是未鉴别的，样品可任意收集或从为生态学重点的地区收集，例如靠近工业废物的地区，土壤，淡水或海水过滤物，热泉或热火出口周围的沉积物，和海洋或港湾沉积物可用作供体生物的来源。样品可从海底，海面和潮间的海洋来源收集。样品可从热带，亚热带，温带和其它区域收集。供体生物可为嗜热，嗜盐，嗜酸，嗜压或甲烷微生物。
还优选使用面临灭绝可能性的生物，例如在热带雨林中发现的那些植物和微生物。在这些栖息地正遭到破坏的情况下，可能产生有用药物的种类正在消失。
也可根据它们在传统或合乎规格的药物实践中的用途来收集具有可能药物性质的生物，包括藻类，地衣，真菌，植物和动物。
在许多方面，希望用来自通常不适宜于传统药物发现或开发技术的供体生物的遗传物质来构建文库。这些供体生物可具有一种或多种下面特点(i)该生物不能在实验室繁殖或培养；(ii)从自然界不能回收足够量的该生物来用于进一步的实验；和/或(iii)该生物需要特殊条件来产生未知或者适于工业化的所需化合物。后面的特点也描述了现存培养物收集物中的生物，其中由于不适宜的培养条件，在常规筛选方法中可能检测不到药物前驱。
为了构建表达文库的目的，供体生物不需被分类鉴定或生化表征。根据样品的复杂性和药物发现程序的需要，例如，需要供体种类的去复制(dereplication)，可进行可培养种类或来自环境样品的代表组的鉴定或遗传足迹法。
在提取它们核酸之前，可将供体生物多联体化或在实验室或田间培养，为了制备cDNA，可能要求特殊的生长条件或在培养基中存在一定的化学物质以诱导或增加编码供体生物中的感兴趣活性的基因产物的转录。如果仅需要基因组DNA，可使用标准生长条件来培养生物。
因为在环境样品中的所有供体生物不可能以相同速率繁殖，如果完全在实验室条件下，一些供体生物可能过度生长并导致损失或缓慢生长的微生物的稀释。因此，可优选不进行实验室的在先培养而直接从环境样品中的供体生物制备核酸。这在当试图得到无脊椎动物，例如海绵的次级代谢物时可能尤为有用，其中代谢物通常被认为是由相关的共生和不可培养的微生物产生。从环境样品中的供体生物制备高质量的核酸的方法提供在下面5.1.2节中。
本发明设想的供体生物可包括，但不局限于病毒；细菌；单细胞真核生物，如酵母和原生动物；藻类；真菌；植物；被囊动物；苔藓动物；蠕虫；棘皮动物；昆虫；软体动物；鱼类；两栖动物；爬行动物；鸟类；和哺乳动物。供体生物的非限制性实例列于表I和II。
表I细菌和真菌供体生物的实例表(Berdy 1974，实用微生物进展，18309-406；Goodfellow等，1989，“微生物产品新方法”，Cambridge University Press 343-383)分类 属细菌放线菌目 链霉菌属，单孢丝菌属，Norcodia，马杜拉放线菌属，游动放线菌属，孢囊链霉菌属，小双孢菌属，北里孢菌属真细菌目 固氯菌属，根瘤菌属，无色细菌属，肠杆菌属，布鲁氏菌属，细球菌属，乳酸杆菌属，芽孢杆菌属，梭状芽孢杆菌属，短杆菌属假单孢菌目 假单孢菌属，气杆菌属，弧菌属，盐杆菌属枝原体目 枝原体属粘细菌目 噬细胞菌，粘液球菌属真菌Myxothallophytes 绒泡菌属，煤绒菌属藻形菌纲 毛霉属，疫霉属，根霉属子囊菌纲 曲霉属，青霉属担子菌纲 鬼伞属，Phanerochaete半知菌纲 枝顶孢属(头孢子菌属)，Trochoderma，长孺孢属，镰孢霉属，交链孢霉属，漆斑菌属酵母 糖酵母属表II高等形式的供体生物的实例分类 实例属，化合物和特性植物藻类 海人草(红藻氨酸，治蠕虫剂)狭叶海带(昆布氨酸，治低血压)地衣 松罗(关耳酸，抗菌；地衣酸，抗肿瘤)高等植物 长春花属(长春花)，毛地黄属(强心苷)，鬼臼属(鬼臼毒素)，红豆杉属(紫杉酚)，粗榧属(高三尖杉酯碱)，旱莲木属(喜树碱)，蒿属(蒿素)，锦紫苏属(毛喉素)，角丝鼓藻属(钾通道拮抗剂)原生动物门甲藻 ptychodiscus brevis(brevitoxin心血管性)昆虫 狡蛛属(“盗蛛”毒液)，植瓢虫属(墨西哥豆瓢虫碱)苔藓虫 苔藓虫(bryostatins，抗肿瘤)软体动物 芋螺海绵 细芽海绵(ectyonin，抗菌)Cryptotethyacryta(D 阿拉伯呋喃糖苷)珊瑚 Pseudoterogonia(pseudoteracins，抗炎症)，Erythropodium(erythrolides，抗炎症)蠕虫环节动物门 索沙蚕(沙蚕毒素，杀虫)Spinunculida 裂螠(裂螠素，神经活性)被囊动物 Trididemnum solidum(didemnin，抗肿瘤和抗病毒)Ecteinascidia turbinata(ecteinascidins，抗肿瘤)鱼类 粘盲鳗(粘盲鳗毒素，刺激心脏)，龙鰧(蛋白质毒素，降低血压，呼吸以及减少心率)两栖动物 树棘蛙(蛙毒素，pumiliotoxins，histrionicotoxins和其它聚胺)爬行动物 蛇毒液毒素鸟类 histrionicotoxins，修饰的类胡萝卜素，类视色素和甾族化合物(Goodwin 1984“类胡萝卜素的生物化学”Vol II，Chapman和Hall，New York，pp 160-168)哺乳动物 鸭嘴兽(鸭嘴兽毒液)，修饰的类胡萝卜素，类视色素和甾族化合物(Goodwin 1984，Supra pp.173-185；Devlin 1982“生物化学教科书”Wiley，New York，p.750)5.1.2.从供体生物制备高质量的核酸取决于生物的类型和样品的来源，可通过各种方法从供体生物分离核酸。为了构建充分代表供体生物的遗传信息的基因表达文库，获得没有缺刻，单链缺口和部分变性的高质量核酸是非常重要的。为了制备高质量的核酸，本发明的方法提供样品中的供体生物的温和，快速和完全溶胞，以及来自该生物的核酸酶和其它降解性蛋白质的快速，完全失活。初始的提取可在田间进行以稳定样品中的核酸直至进一步的分离步骤可在实验室中进行。
任何核酸分离方法均要求供体生物充分地断裂。可采用许多标准方法，包括在液氮下凝固，在存在玻璃或其它破裂剂时研磨，以及简单机械剪切或酶消化。
对于混合物质，例如土壤，或对于含有高含量的坚韧的物质，例如纤维素或几丁质(如在丝状真菌和植物中)，可采用冷冻干燥使样品脆弱，从而使它更适合于破裂。该被冷冻干燥的物质长时间只保存具酶活性以及高分子量物质(例如核酸)(Gurney 1984，分子生物学方法，Vol.2，p 35-42，John M.Malker编)。样品可在液氮中被瞬间冷冻。疏松的样品，如土壤，可在细网或尼龙筛中冷冻。在真空下，可对冷冻样品进行24-72小时的冷冻干燥。可将冷冻干燥样品干燥贮存在真空-70℃下。可能需要另外的步骤来制备环境样品，例如浓缩微生物种群(Jacobson等1982，实用环境微生物，582458-2462；Zhou等1996，实用环境微生物，62316-322；Somerville等1989，实用环境微生物，55548-554)。
本发明的一个基本方法，虽然当然不是唯一所采用的，是对Chirgwin等(1979，生物化学，245294)，Sadler等(1992，现代遗传学，21409-416)和Foster(1991，博士论文，University of California，Santa Barbara)的改进。该方法使用强促溶剂，异硫氰酸胍和2-巯基乙醇来使蛋白变性并使核酸酶失活，接着用氯化铯梯度离心来纯化核酸物质。本文提供的方法与Chirgwin的方法所不同之处在于提取了DNA和RNA。本发明的方法还包括了高速离心步骤，和选择性地加入二苯酰亚胺染料。取决于所采用的供体生物，另外的步骤可包括，但不局限于用氯化十六烷基吡啶鎓氯化物或十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)以选择性地去除多糖，用聚乙烯吡咯烷酮处理以去除苯酚，以及进行纤维素层析以去除淀粉和其它碳水化合物(Murray和Thompson，1980，核酸研究84321-25)。
使用反转录酶可将从供体生物分离的RNA转化为互补DNA。
受损的核酸可能难于克隆，从而导致供体生物DNA的损失以及文库中低数目的克隆。如果宿主生物允许重组并且缺乏有效的内源DNA修复机制，那么问题可被严重化。本发明还提供了使用在互补DNA第二条链合成期间常用的酶促反应可以在克隆前在体外修复受损的DNA(Sambrook等1989，“分子克隆”2版，章节8)。例如，可通过DNA聚合酶的Klenow片段和大肠杆菌DNA连接酶来修复DNA裂隙和缺刻。这些酶促反应对于本领域技术人员是熟知的。
当从由环境样品提取的DNA制备重组表达文库时，可获得的DNA量常常受到限制，并且在连接方法的选择上是一个要考虑的问题。如第5.1.3.中所描述的，如果在提取或多联体化之后它的量少(＜100μg)，DNA可被连接到高效克隆系统中，例如SuperCos。扩增克隆中的插入片段，并通过限制性酶消化从载体中释放。由于环境DNA样品的性质，它可能包含原核和真核供体生物，可能需要使用多个宿主生物。如果可获得足够量的初始环境DNA样品，或如果DNA已扩增，DNA可被连接到适宜于所需批表达宿主细胞的一批载体中的每一个中。优选地，载体具有在两个或多个表达宿主之间穿梭的能力。5.1.3.宿主生物和载体本文所采用的术语“宿主生物”广泛地包括单细胞生物，例如细菌，和多细胞生物，如植物和动物。可使用任何细胞类型，包括在体外培养或被遗传改造的那些。现有技术中已知的任何宿主-载体系统可用于本发明。使用可被复制并在多于一个的宿主生物中生存的穿梭载体是有利的。
宿主生物或宿主细胞可从私人实验室保藏物，公共培养物中心，例如美国典型培养物保藏中心或从商业供应商处获得。这些宿主生物或细胞可通过本领域已知的技术被进一步修饰而用于特定的用途。
根据本发明，优选宿主生物或宿主细胞已被用于异源基因的表达，并且被合理地很好地进行了生物化学，生理和/或遗传表征。这些宿主生物可能已被通过常规的遗传菌株改进方法，培养方法，发酵方法和/或重组DNA技术而使用。需使用已开发用于大规模生产过程的供体生物，并已知用于生长和产生次级代谢物的条件。
可在标准的温度，保温时间，光强以及适应于表达宿主的营养和生理需要的培养基组合物的条件下培养宿主生物。然而，用于维持和产生文库的条件可能与用于表达和筛选文库的那些不同。改进的培养条件和培养基也可被用来模仿供体生物的一些营养和生理特点，并且以便于产生感兴趣的代谢物。例如可在营养培养基中提供感兴趣的化合物的化学前体以便于修饰那些前体。本领域已知的任何技术可被用来建立最佳的条件。
宿主生物应优选缺乏进行同源重组以及限制外源DNA的能力。宿主生物应优选具有类似于供体生物的密码子选择。如果采用真核供体生物，优选宿主生物具有适当加工供体信使RNA的能力，例如剪掉内含子。
优选的原核宿主生物可包括，但不局限于大肠杆菌，枯草芽孢杆菌，变青链霉菌，天蓝色链霉菌。也可使用酵母种类，例如啤酒糖酵母(发面酵母)，粟酒裂殖糖酵母(裂殖酵母)，巴斯德毕赤氏酵母和多形汉逊氏酵母(甲基营养型酵母)。还可采用丝状子囊菌，例如粗糙链孢霉和构巢曲霉。优选植物细胞，例如来自烟草属和拟南芥属的那些。优选的哺乳动物宿主细胞包括，但不局限于来自人类，猴和啮齿动物，例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，NIH/3T3，COS，293，VERO等(见Kriegler M.“基因转移和表达实验室手册”New York，Freeman和Co.1990)。
可选择如所需的以特定方式修饰和加工表达的基因产物的宿主生物。蛋白质产物的这些修饰(例如糖基化)和加工(例如裂解)对于蛋白质在生化途径中的作用可能是非常重要的，可选择适宜的细胞系或宿主系统以确保表达的外源蛋白质的正确的修饰和加工。最后，如果供体生物为真核生物，具有用于初级转录物正确和精确加工，糖基化和基因产物的磷酸化的细胞器的真核宿主细胞可能是优选的。
例如，已表明真核真菌具有许多相同的核心分子生物学，在最为常见的真菌种类的许多种之间发生基因交换是有可能的(Gurr等1987，真核微生物的基因结构，Kinghorn编，p.93；Bennet和Lasure 1992，真菌中的基因操作，Academic Press，NY)。真核宿主生物的优选实例为裂体生殖的酵母，粟酒裂殖糖酵母。首先粟酒裂殖糖酵母的分子生物学已被充分研究，许多主要的培养和纯化方法和操作已被按常规进行。第二，它为单细胞，因此在实验室条件下能容易地被培养，贮存和操作。第三，在用于表达混合的真核DNA中尤为重要，它能正确地剪接和表达其它种类的真菌，植物和哺乳动物的基因。对于异源核RNA(含有内含子的RNA)的剪接和加工的研究已说明粟酒裂殖糖酵母与其它真菌和高等直翅目具有显著的用于剪接所需要的核内小RNA(snRNA)成分的类型和结构的相似性。最后，许多非粟酒裂殖糖酵母启动子，其中一些来自哺乳动物和植物病毒，能适度地引起高水平的基因表达(Forsburg，1993，核酸研究，212955)。这一特征可允许真菌DNA/cDNA文库穿梭到哺乳动物细胞表达宿主中，例如NIH3T3(成纤维细胞)，GT1 7(神经元)，或其它细胞类型。
克隆载体或表达载体可被用于将供体DNA导入用于表达的宿主生物中。表达构建物是含有可操作性地与一个或多个调节区相关的供体DNA序列的表达载体。调节区可由供体DNA或载体来提供。可使用多种载体，它包括，但不局限于质粒；粘粒；噬菌体质粒嵌合体；人工染色体，例如酵母人工染色体(YACs)，和细菌人工染色体(BACs，Shizuya等1992，美国国家科学院院刊898794-8797)或修饰的病毒，但是载体一定要与宿主生物相容。可用载体的非限制性实例为λgt11，pWE15，SuperCosl(Stratagene)，pDblet(Brun等1995，基因，164173 177)，pBluescript(Stratagene)，CDM8，pJB8，pYAC3，pYAC4(参见分子生物学中的同前方法的附录，1988，编者Ausubel等，Greene Publish.Assoc.和Wiley Interscience，它在本文被引作参考)。
当宿主和供体生物的调节区和转录因子相容时，供体的转录区将能结合宿主因子，例如RNA聚合酶，以影响宿主生物中的转录。如果供体和宿主生物不相容，与宿主生物相容的调节区可与供体DNA片段相连，以保证被转移的基因的表达。
在全部操纵子，包括它本身的翻译起始密码子，核糖体结合区和邻近的序列被插入到适宜的克隆或表达载体中的情况下，可不需要另外的控制信号。然而，在仅有一部分基因的编码序列被插入时，必然提供外源的控制信号，包括翻译起始密码子(通常为ATG)和邻近的序列。这些外源的调节区和起始密码子可为各种来源，天然的和合成的。组成型和诱导型调节区可被用于供体DNA的表达。当表达文库的产物可能有毒时，需要使用诱导启动子。可通过适宜的转录增强子元件的内含物来提高表达的效率(参见Bittner等1987，酶学方法153516-544)。
“可操作性相联”指一种联系，其中调节区和将要表达的DNA序列以允许转录和最终翻译的方式连接和定位。基因表达所需的调节区的精确性质可随生物与生物而变化。通常，需要能结合RNA聚合酶并启动可操作性相联的核酸序列转录的启动子。这些调节区可包括5′-非密码序列参与转录和翻译开始的那些，例如TATA盒，加帽序列，CAAT序列等。非编码区3′至编码序列也可被保留或复制它的转录终止调节序列，例如终止子和多聚腺苷酰化位点。当它们以允许两个序列转录至相同的RNA转录物上或允许在一个序列中已开始的RNA转录物扩展到第二个序列中的方式相互发生联系时一个核酸分子的两个序列被说成“可操作性地相联”。由此可产生多顺反子转录物。如果在启动子处开始的转录将产生可操作性相联的序列的RNA转录物，那么两个或多个序列，例如启动子和任何其它的核酸序列为可操作性相联。为了成为“可操作性相联”，两个序列必需是不相互紧邻。
此外，表达载体可含有用于初始分离，鉴定或追踪包含供体DNA的宿主生物的可选择或可筛选的标记基因。表达载体也可提供唯一的或方便被定位的限制性位点以允许保存和/或重排部分表达构建物中的DNA插入片段。
表达载体可含有允许载体在一个或多个宿主生物中存在和/或复制，或载体整合到宿主染色体上的序列。这些序列可包括，但不局限于，复制区，自动复制序列(ARS)，着丝粒DNA和端粒DNA。结果，在宿主生物中可产生和保存一个或多个拷贝表达文库。表达构建物可整合在宿主基因组中或宿主生物中保持游离。
通常，使用穿梭载体可能是有利的，该穿梭载体可在至少两种宿主生物中复制和生存，例如，如细菌和哺乳动物细胞，细菌和酵母，细菌和植物细胞或革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌。穿梭载体可含有宽的宿主范围复制起点，例如来自IncP，IncQ质粒的那些，或至少两个或多个复制区。穿梭载体还可包含来自天然产生的质粒的序列，它可被用来借助于接合转移将文库迁移到各种相容的宿主生物中(Hayman等，1993，质粒30251-257)。通过使用穿梭载体来构建文库，供体生物的DNA序列可容易地被复制并从一个宿主生物转移到另一个宿主生物中。
例如，一个优选的典型的表达载体-宿主生物的结合为粘粒，SuperCos 1和大肠杆菌菌株，XLl-Blue MR，它们均可购自Stratagene(La Jolla，CA)。载体通过BamHI克隆位点接受大小变化范围为30-42 kbp的DNA插入片段，并带有新霉素抗性标记(neoR)和用于在哺乳动物细胞中表达的SV40启动子。载体还含有在原核细胞中用于选择的氨苄青霉素抗性基因。大肠杆菌宿主生物缺乏某些限制系统(hsdR，mcrA，mcrCB和mrr)，内切核酸酶(endA1)缺陷，并为重组缺陷(recA)。宿主生物不能酶切带有半胱氨酸和/或腺嘌呤甲基化的插入片段，该插入片段通常存在于真核DNA和使用甲基dNTP类似物合成的cDNA中。
该系统的优点包括在体外将高效λ包装系统用于初始在限性负，recA负大肠杆菌宿主中产生文库。由于来源的性质，基因组DNA可能少于裸露DNA转化所需的量，包装的基因组DNA插入片段可被保护免于降解。一旦在大肠杆菌宿主细胞内，受损的插入片段可被宿主细胞DNA修复机制所修复。该系统仅需要少量起始基因组DNA(5-10μg)，并且由于包装系统仅接受某一大小范围的插入片段，所以可能不需要大小选择。大肠杆菌中的初始文库可被扩增以产生超螺旋粘粒DNA，该粘粒DNA可用于导入其它表达宿主生物中的高效转化方法中。
通过置换用链霉菌的复制起点(例如来自质粒pIJ 101或pIJ 922)和硫链丝菌肽抗性基因置换复制的SV40起点和neoR基因可对SuperCos1载体进行进一步修饰以用于在链霉菌宿主中的克隆。该穿梭载体称为Streptocos(见图6A)，它通过用KpnI和HindIII消化，从含有pIJ 101起点和硫链丝菌肽抗性基因的pIJ 699(Hopwood等，1985，链霉菌的遗传操作，实验室手册，The John Innes Foundation)分离4.0 kb片段而构建。该片段在KpnI位点被末端平齐化，并在SamI-HindIII限制性位点被克隆在SuperCos中(参见Bierman 1992，相关实例见Denis1992)。此外，可借助于接合转移导入序列成分用于穿梭粘粒的迁移(Bierman等1992，基因41643-49)。含有链霉菌特异性启动子的不同的Streptocos形式可被在邻近BamHI克隆位点处导入载体中。通过使用PCR，可产生能被直接克隆至SuperCOS 1的NotI/EcoRI位点的链霉菌启动子片段。可使用多种已知的链霉菌启动子，包括ermE，Pptr(1995，分子生物学，17989)和hrdB(Buttner，M.J.1989，分子生物学，Vol.3，pp.1653-1659)。这个方法通常可用于大范围的宿主-载体系统。因此，如果需要，可通过导入宿主复制起点，可选择的标记基因和同源启动子对SuperCos 1进行修饰。
对于使用植物细胞作为宿主的组合基因表达文库，供体编码序列的表达可由多种启动子的任一种来引发。例如，优选的菌株描述在基因操作原理1985，R.W.OLD和S.B.Primrose 3rd编者Blackwell ScientificPub；载体分子克隆载体和它们的用途的研究1988，R.L.Rodriquez，D.T.Denhardt，Butterworths Pub.；分子克隆实用指南1988，B.Perbal，John Wiley和Sons，病毒启动子，例如CaMV的35S RNA和19S RNA启动子(Brisson等1984，自然310511-514)，或可采用TMV的外壳蛋白启动子；另一方面，可使用植物启动子，例如RuBISCo的小亚基(Coruzzi等，1984，EMBO J.31671-1680；Broglie等1984，科学224838-843)；或热休克启动子，例如大豆hsp 17.5-E hsp 17.3-B(Gurley等1986，分子细胞生物学6559-565)。
植物细胞和原生质体均可用作宿主细胞。植物宿主可包括，但不局限于，玉米，小麦，稻，大豆，番茄，烟草，胡萝卜，花生，土豆，甜菜，向日葵，薯芋，拟南芥，油菜和矮牵牛的细胞。由于没有细胞壁并且它们可能随着细胞培养物而增生，并再生为植物，所以优选植物原生质体。
此外，重组构建物可包括植物可表达的可选择或可筛选的标记基因，它包括，但不局限于使其具有抗生素抗性(例如卡那霉素或潮霉素抗性)或除草剂抗性(例如抗磺酰脲，phosphinothricin，或草甘膦)的基因。可筛选的标记包括，但不局限于编码β-葡糖醛酸酶(Jefferson，1987，植物分子生物学，Rep5387-405)，荧光素酶(Ow等1986，科学234856-859)，和调节花色素苷颜料产生的B蛋白(Goff等1990，EMBOJ92517 2522)的基因。
为了将供体生物DNA导入植物细胞，可采用用于转化植物的根癌土壤杆菌系统。这种以T-DNA为基础的转化载体的恰当的设计和构建对于本领域普通技术人员来讲是熟知的。这些转化选择使用二元土壤杆菌T-DNA载体(Bevan，1984，核酸研究128711-8721)，和共培养方法(Horsch等1985，科学2271229-1231)。通常，土壤杆菌转化系统被用于遗传改造双子叶植物(Bevan等，1982，Ann.Rev.Genet 16357-384，Rogers等1986，酶学方法118627-641)，但它也可被用于转化以及将DNA转移至单子叶植物和植物细胞中(参见Hernalsteen等1984，EMBOJ33039-3041；Hooykassvan Slogteren等1984，自然311763-764；Grimsley等1987，自然3251677-1679；Boulton等1989，植物分子生物学1231-40；Gould等1991，植物生理学95426-434)。
在另一个实施方案中，还可使用各种用于将重组核酸构建物导入植物细胞的其它方法。在目标为单子叶植物细胞时，这些其它方法尤为有用。其它基因转移和转化方法包括，但不局限于，通过钙-，聚乙二醇(PEG)-或电穿孔介导的裸露DNA摄入的原生质体转化(参见Paszkowski等1984，EMBOJ32717-2722，Potrykus等1985，分子和普通遗传学199169-177；Fromm等1985，美国国家科学院院刊825824-5828；Shimamoto，1989，自然338274-276)和植物组织的电穿孔(D′Halluin等，1992，植物细胞41495-1505)。植物细胞转化的另外的方法包括显微注射，碳化硅介导的DNA摄入(Kaeppler等，1990，植物细胞报道9415-418)，和微弹轰击法(参见Klein等1988，美国国家科学院院刊854305-4309；Gordon-Kamm等，1990，植物细胞2603-618)。
对于植物分子生物学技术的综述参见，例如Weissbach和Weissbach，1988，植物分子生物学方法，Academic Press，NY，节VIII，pp.421-463；和Grierson和Corey，1988，植物分子生物学，2d Ed.，Blackie，London，Ch.7-9。
在昆虫系统中，苜蓿银纹夜核蛾多角体病毒(AcNPV)，一种杆状病毒被用作载体来在草地夜蛾细胞中表达供体基因。供体DNA序列可被克隆至病毒的非必需区(例如多角体蛋白基因)并置于AcNPV启动子的控制下(例如多角体蛋白启动子)。接着这些重组病毒被用来感染其中插入基因被表达的宿主细胞(参见Smith等1983，病毒学杂志46584；Smith美国专利号4,215,051)。
在酵母中，多种含有组成型或诱导型启动子的载体可与啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)(发面酵母)，粟酒裂殖糖酵母(Schizosaccharomyces pombe)(裂殖酵母)，巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)和多形汉逊氏酵母(Hansenula polymorpha)(汉逊酵母)一起使用。对于综述，参见现代分子生物学方法Vol.2，1988，Ed.Ausubel等，Greene Publish.Assoc和Wiley Interscience，Ch.13；Grant等1987，酵母的表达和分泌载体，在酵学方法中，Eds Wu和Grossman，1987，Acad Press，N.Y，Vol.153，pp.516-544；Glover，1986，DNA克隆，Vol.II，IRL Press，Wash，D.C.，Ch.3；和Bitter，1987，酵母中的异种基因表达，酶学方法，Eds.Berger和Kimmel，Acad.Press.N.Y.，Vol.152，pp.673-684；和糖酵母的分子生物学，1982，Eds.Strathern等，Cold Spring Harbor Press，Vols.I和II。
在哺乳动物宿主细胞中，多种哺乳动物表达载体可商业购得。此外，可利用大量以病毒为基础的表达系统。在腺病毒被用作表达载体的情况下，可将供体DNA序列连接到腺病毒转录/翻译调节复合物上，如后期启动子和三分裂的前导序列。接着可通过体外或体内重组将嵌合基因插入腺病毒基因组中。在病毒基因组的非必需区(例如区E1或E3)的插入片段将产生能在被感染的宿主中存活并能表达异源产物的重组病毒(例如，参见Logan和Shenk，1984，美国国家科学院院刊813655-3659)。Epstein-Barr病毒(EBV)的复制起点(Orip)和作为反式作用复制因子的EBNA-1被用于产生穿梭游离基因克隆载体，例如EBO-pCD(Spickofsky等1990，DNA Prot Eng Tech 214-18)。以反转录病毒为基础的病毒载体也可被采用(Morgenstern等1989，核酸科学年评，1247-65)。另一方面，可采用痘苗7.5K启动子(参见例如Mackett等，1982，美国国家科学院院刊797415-7419；Mackett等1984，病毒学杂志49857-864；Panicali等1982，美国国家科学院院刊794927 4931)。
可采用多种选择系统用于哺乳动物细胞，包括，但不局限于单纯疱疹病毒胸苷激酶(Wigler等，1977，细胞11223)，次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(Szybalska和Szybalski，1962，美国国家科学院院刊482026)，和腺嘌呤磷酸核糖基转移酶(Lowy等1980，细胞22817)基因可分别用于tk，hgprt或aprt细胞中。而且，抗代谢物抗性可用作选择二氢叶酸还原酶(dhfr)的基础，它可使具有氨甲蝶呤抗性(Wigler等，1980，美国国家科学院院刊773567；O′Hare等1981，美国国家科学院院刊781527)；gpt，它可使具有霉酚醛抗性(Mulligan和Berg，1981，美国国家科学院院刊782072)；新霉素磷酸转移酶(neo)，可使具有氨基糖苷G-418抗性(Colberre-Garapin等1981，分子生物学杂志1501)；和潮霉素磷酸转移酶(hyg)，它可使具有潮霉素抗性(Santerre等1984，基因30147)。
本发明还提供了改进组合基因表达文库性能的对宿主生物的特定修饰。当文库被用于产生次级代谢物的目的时，化合物的毒性可导致未能充分代表文库中的这些具有生产力的宿主生物。在本发明的一个实施方案中可将宿主生物修饰，这样宿主生物的生长和存活受到感兴趣化合物的产生的不利影响少。提高的耐受量可减少在筛选阶段以及生产阶段正在产生可能的药物的宿主生物的损失。
宿主生物的一个优选的修饰是在宿主生物中引入和/或过量产生活性药物外排系统。膜相关的能量驱动外排在大多数生物中的药物抗性中起着主要作用，这些生物包括细菌，酵母和哺乳动物细胞(Nikaido1994，科学264382-388；Balzi等1994，生物化学生物物理进展1187152-162；Gottesman等1993，生物化学年评62385)。具有增强补充的外排系统的被修饰的宿主生物可活跃地分泌较大范围的可能的毒性化合物，因此降低了它在宿主生物中的积累。可避免负反馈机制，例如产生化合物的代谢途径的终产物抑制。而且因为感兴趣的化合物没有在宿主生物内部积累，所以对化合物的分离可能变得更为有效。
在细菌中，已研究了大量外排(efflux)系统，这些外排系统可排出大范围的结构不相关的分子，从例如聚酮化合物抗生素(大肠杆菌的AcrAE基团，Ma等1993，细菌学杂志1756299-6313)，荧光喹啉和溴化乙锭(枯草芽孢杆菌的bmr和金黄色葡萄球菌的norA，Neyfakh等1993，抗微生物剂化学37128-129)，阿霉素(戊霉素轮丝链霉菌的drr)，至叔胺(产气克雷白氏杆菌的qacE和大肠杆菌的mvrC)。外排系统的非限制性实施方案表见表III。任一这种外排系统可用于原核宿主生物。
在酵母中，许多使具有多效性药物抗性的基因编码外排系统，并且可用于本发明。例如bfrl+基因将布雷非德菌素A抗性传给粟酒裂殖糖酵母，并且白色假丝酵母的CDR1基因传递环己酰胺和氯霉素抗性(Prasad等1995，Curr Genet27320-329)。
对于哺乳动物细胞，可使用属于ATP-结合泵蛋白类的多药抗性蛋白质(Juranka等1989，FASEBJ，32583-2592；Paulusma等1996，科学2711126-1128；Zaman等1994，美国国家科学院院刊，918822-8826；Breuninger等1995，癌症研究555342-5347，Koepsell EP 0699753)。人mdr1多种药物抗性基因已在发面酵母中功能表达(Kuchler等1992，美国科学院院刊892302-2306)。任何其它的外排系统也可用于真核细胞。
表III由活性药物流出系统分泌的化合物表化合物类型 具体名称 外排系统阳离子染料 若丹明-6G bmr溴化乙锭吖啶黄素 acrAE碱性抗生素 嘌呤霉素 bmr阿霉素drr，mdr亲水抗生素 新生霉素 acrAE大环内酯疏水抗生素β内酰胺类有机阳离子四装基鏻 bmr不带电荷 紫杉醇 mdr氯霉素 bmr弱酸性萘啶酮酸 emr丝紫霉素 mdr两性离子 氟喹啉类 bmr洗涤剂SDSacrAE可将一种或多种外排系统引入，诱导或过度产生到宿主生物中。可将编码外排系统组成的基因导入宿主生物中并使用上述表达载体和方法使其表达。在一些情况下，使用可诱导启动子来表达外排系统基因是有利的。5.1.4.组合天然途径表达文库本发明涉及组合基因表达文库的构建和用途，其中宿主生物含有编码天然生化途径或其一部分的来自多种供体生物的遗传物质，并且能产生供体生物的功能性基因产物。由此，供体生物的生化途径或其一部分在各个宿主生物的文库中被功能性地重新构建。新活性和这些生化途径的化合物可更易于通过药物发现技术或本文提供的方法来筛选。
DNA或RNA可被用作起始遗传物质用来制备这些文库，其中这些文库可包括cDNA文库，基因组DNA文库以及混合的cDNA/基因组DNA文库。来自例如在5.1.1中描述的多种供体生物的DNA片段被导入宿主生物库中，这样库中的各个宿主生物均含有来自一个供体生物的DNA片段。
如果宿主生物和供体生物具有某些遗传特征，则可能是有利的，例如DNA类似的GC含量和共同的RNA剪接机理，或生理特征，如最适生长温度。因此可能需要使用与供体生物发育遗传学紧密相关的宿主生物。例如，可能更需要原核宿主生物来克隆和表达其它原核操纵子。
不适于传统药物发现或药物开发技术的供体生物可能是优选的。例如，大多数海洋细菌未被很好地表征，并且不适于常规陆生微生物学方法。本发明可简化生产和纯化过程的开发。
转移的供体DNA片段可包含编码完整生化途径的功能性蛋白质或其一部分的编码区以及自然相关的调节区，例如启动子和终止子。通过使用具有较大的编码全部生化途径可能性的大的原核基因组DNA片段可获得最佳结果。如果转移的DNA片段的自然功能和结构在宿主生物中保存，那么供体生物的基因可被相应地表达。还提供了外源调节区，该调节区可与DNA片段相连以确保宿主生物中的被转移基因的转录，从而代替或补充了从天然启动子开始的转录。
令人感兴趣的是，已发现许多来自海洋细菌的基因在大肠杆菌中使用天然启动子来表达功能性蛋白。因此，海洋微生物的基因甚至可在不需要使用外源调节区时表达。在大肠杆菌中使用其天然启动子的海洋细菌的基因的实施方案表提供在表IV中。
表IV在大肠杆菌中使用其天然启动子的海洋细菌基因表基因 属和种参考文献κ-角叉菜胶酶 食鹿角菜交替单孢菌Barbeyron等1994，基因(cgkA)革兰氏(-)需氧 139105-109Na+/H+反向运输解藻朊酸弧菌 Nakamura等，1994，生(NhaA) 物化学和生物物理进展1190465-468磷酸二酯酶 费氏弧菌，两栖 Dunlap等，1993，细菌(cpdP) 学杂志175(15)4615-4624几丁质 交替单孢菌类， Tsujibo等，1993，细菌菌株0-7学杂志175(1)176-181氯化三丁基 交替单孢菌类，M-1，Fukagawa等，1993，生锡抗性 革兰氏(-)Rod 物化学和生物物理研究194(2)733-740dagA-互补河豚毒素交替单孢菌 Macleod等，1992，分子革兰氏(-) 微生物学6(18)2673-2681弧菌溶胞素 解蛋白弧菌David等，1992，基因，(nprV) 革兰氏(-) 112107-112四环素抗性 杀鲑弧菌 Sorum等，1992，化学需氧 分子学36(3)611-615黑素合成 考氏杀瓦氏菌 Fuqua等，1991，基因，(melA) 革兰氏(-)附生 109131-136DNA修饰多酶系统 生丝单孢菌 Danaher等，1990，喜温 基因，89129-133
在一个优选的实施方案中，本发明的方法利用了将原核生物，如细菌的基因组织进入基因组中的各个独立的功能性相关的基因簇，称为操纵子中的方式。在这些簇中，编码生化途径的组成的基因一起与共同的调节区相连。丝状真菌(放线菌)中的功能性相关的基因也被已知聚簇化。许多细菌和放线菌的基因簇，以及少量真核真菌生物合成途径已被分离和表征。例如，用于在草生欧文氏杆菌中从头合成产生类胡萝卜素玉米黄质和β-隐黄质的十二种蛋白质可在细菌大肠杆菌中活化和同步产生(Perry等，1986，细菌学杂志168607-612；Hundle等1991，光化学和光生物学54189-93)。此外，在独立的簇中还含有原核生物氨基酸生物合成途径，例如亮氨酸和异亮氨酸的生物合成以及葡萄糖转移系统，因此，原核生物被用作供体生物时，在生物合成途径中功能性相关的基因可能在一个克隆中被分离。
优选具有含有相对少量非编码区的紧密基因组的供体生物。在许多方面，供体生物为具有相对小的基因组的细菌，例如对于大肠杆菌为4400kbp长度，以及对于古细菌为2500-3500kbp。从下面公式计算在文库中要求达到99％的可能含有供体基因组的全部序列的独立克隆的数目(Clarke等，1976，细胞991-99)N=ln(1-p)ln(1-f)]]>其中N＝文库中必需的重组克隆的数目p＝序列重新出现的可能性f＝在单个重组克隆中基因组的百分比例如大肠杆菌具有约4400kbp的DNA；粘粒载体可包装约40kbp的DNA。根据这些计算，大肠杆菌的全部基因组可望在粘粒文库中的少达504个克隆中被全部表示。因为通常的DNA文库可包含500,000独立的重组克隆，所以每一个这样的文库可有效地代表高达1,000个不同的具有类似于大肠杆菌基因组的细菌种类的基因组。因此，通过筛选包括1,000或更多种细菌的不同的遗传物质的基因表达文库，可有效地产生和估价相当多的化学多样性。
在普通文献中描述的方法之后，例如Maniatis等1989，分子克隆，第2版，Cold Spring harbor Press，New York；和Ausubel等，现代分子生物学方法，Greene Publishing Associates and WileyInterscience，New York，可接着进行用于构建重组基因表达文库的常规分子生物学反应。
重组天然途径基因表达文库的克隆步骤示于图3中。来自供体生物的任何细胞均可作为用于构建基因表达文库的核酸来源。可使用基因组DNA，它包括染色体DNA以及染色体外遗传物质，例如天然产生的质粒。另一方面，可使用供体生物的RNA。优选通过本领域已知的任何方法提取纯化信使RNA(mRNA)并转化为互补DNA(cDNA)。寡聚(dT)引物和任意序列引物可用于引发cDNA的首链合成。可选择性地通过聚合酶链反应(PCR)扩增DNA插入片段。
可通过5.1.2部分提供的方法或通过现有技术已知的方法提取和纯化基因组DNA和RNA。对于丝状真菌和细菌，这些方法可包含包括下面方法a)，b)或c)的多种方法中的任一种，其中a)快速SDS/原生质体的高盐溶胞作用和立即用平衡的苯酚萃取，其中原生质体从生长在液体培养基中的幼小的菌丝体制备；b)在并硫氰酸胍中进行原生质体的快速溶胞作用，接着在Cscl梯度中超离心；或c)从在琼脂糖填料中制备的原生质体分离高分子量DNA，并进行脉冲电场凝胶电泳。对于细菌，通过溶菌酶/去污剂的另一种溶胞方法，与非特异性蛋白酶一起保温，接着用一系列苯酚/氯仿/异戊醇萃取可能是有用的。
对于最佳结果，优选大的任意原核生物基因组DNA片段来更大可能性地含有全部操纵子或其本质的部分。可使用各种限制性酶在特定位点酶切基因组DNA。通过将基因组DNA用常见的切割限制酶部分消化来产生任意大的DNA片段(大于20kbp)。所需的基因组DNA的量根据使用的基因组的复杂性而变化。另一方面，DNA可被物理性地剪切，例如通过细孔针或超声处理。
在插入空的表达载体之前，可根据大小通过标准方法分离这些DNA插入片段，这些方法包括但不局限于，琼脂糖凝胶电泳，动态密度梯度离心和柱层析。优选10-40％线性蔗糖梯度。通过将DNA片段连接到具有互补粘性末端的表达载体中可完成插入。用于连接反应的载体DNA和DNA插入片段的量取决于它们的相对大小，并且可通过现有技术中已知的方法来通过实验确定。然而，如果用于断裂DNA的互补限制位点不存在于表达载体中，可酶促修饰DNA分子的末端，例如产生平末端。另外，可通过将核苷酸序列，即接头或衔接物连接到DNA末端上来产生所需的任何位点；这些被连接的接头或衔接物可包含编码限制性内切酶识别序列的特异性化学合成的寡核苷酸。在另一种方法中，可通过同聚物加尾来修饰酶切的表达载体和DNA插入片段。
在将载体DNA连接到DNA插入片段中后，将表达构建物导入宿主生物，可采用多种方法，包括，但不局限于转化，转染，感染，接合，原生质体融合，脂质体介导的转移，电穿孔，显微注射和微弹轰击法。在具体的实施方案中，通过在体外将DNA包装到噬菌体颗粒中，接着让这些颗粒感染大肠杆菌细胞来将噬菌体或粘粒DNA导入大肠杆菌宿主。还可利用其它天然发生的微生物之间的DNA转移机理，例如细菌接合。
在收集含有表达构建物的宿主细胞形成文库后，可通过现有技术已知的方法扩增和/或复制它们。扩增的目的是提供可被使用多次的文库。通过挑取文库，使细菌生长，并收集噬菌体或细菌用于贮存可完成扩增。
另外，可以规定的顺序贮存文库。大块的文库可在低密度时挑出平板培养以使其形成单个，独立的噬菌斑或菌落，接着将各噬菌斑或菌落转移到编码的多孔主板的各孔中，例如96-孔平板或384-孔平板。在适宜条件下让各菌群在孔中生长。编码的主板可被用作将各克隆分别复制到一个或多个实验平板中的数据库来源。因此，可对文库中的各个克隆分别进行处理和分析。可将编码的数据库平板包被并贮藏以用于将来的用途。可用多针复制基因或用于流体处理的多通道装置。优选地通过实验室自动操作仪进行全部或大多数的转移和操作(Bentley等1992，基因组12534-541)。
可通过冷冻干燥，或在冷藏箱中深低温保藏(-10℃～-100℃)或在液氮(-176℃～-196℃)下保存本发明的文库。
根据采用的宿主-载体系统，可通过多种方法鉴定和选择在文库中含有供体DNA的宿主生物。在一种方法中，根据存在或不存在标记基因的功能来鉴定和选择这些宿主生物，例如胸苷激酶活性，抗生素抗性，例如卡那霉素，氨苄青霉素，博莱霉素或硫链丝菌肽抗性，产生色素，例如黑素，以及氨甲蝶呤抗性。另一方面，可采用通过代谢试验，组织培养物中的聚集点的形成或杆状病毒中包函体的形成所指明的宿主生物表型或代谢的变化。一旦对存在供体DNA的情况进行了选择，可用克隆进行一系列酶促分析或代谢试验以进一步表征。
为了表征含有供体DNA或其一部分的克隆文库中的供体DNA插入片段，可用代表组的克隆进行DNA的微量制备和限制性分析。结果将提供供体DNA大小的指纹图谱和可被认为是文库期望的插入片段DNA的范围和大小的限制性图谱。5.1.5.组合嵌合途径表征文库本发明还涉及组合嵌合途径表达文库的构建和用途，其中宿主生物含有来自一种或多种供体生物的任意多联体化的遗传物质，并且能产生供体生物的功能性基因产物。文库大量的宿主生物可含有来自一种或多种供体生物的任意和唯一的基因组合。被转移基因的共表达可受它们各自天然的调节区或外源提供的调节区的作用。在宿主生物中，来自不同供体生物的多种基因产物相互作用产生新的嵌合代谢途径和新化合物。这些嵌合途径的新的活性及化合物通过常规药物发现方法或本文提供的方法可变得更适合于筛选。
不受在组合嵌合途径基因表达文库中如何产生新途径或化合物的任何理论所束缚，来自一种或多种供体生物的功能性异种基因的共表达促使体内基因产物互相作用，以及与宿主生物的组成成分相互作用。通过这些相互作用，产生新种类的生化反应，其中一些可一齐作用形成嵌合生化途径。异源基因产物可遇到不存在于它们各自供体生物中的底物，辅因子，和产生信号的分子。这些底物，辅因子和产生信号的分子可由宿主生物提供，由在相同宿主生物中共表达的其它异源基因产物提供，或来自培养基。
而且，一些异源基因产物可被结构修饰，和在宿主生物的生物合成期间被不同地区室化和局部化。一些异源基因产物可被暴露于不同于它们各自供体的宿主细胞环境。
可以预测一些异源基因产物还可对宿主生物产生作用并改变宿主细胞环境。可影响，或受异源基因产物的作用影响的宿主细胞环境的因素包括，但不局限于盐浓度，微量元素，营养物，氧，代谢物，能量来源，氧化还原状态和pH。一些异源基因产物还可与宿主基因产物相互作用，从而可导致宿主代谢途径的改变。
取决于异源基因的组合，不存在于自然界的新的嵌合生化途径和新种类的化合物可在宿主生物文库中形成。在组合嵌合途径表达文库中，供体生物的遗传资源被增殖并被扩增，从而提供不可能在各生物中发现的多种化学结构。如此制备的文库可使用常规方法或本发明提供的方法来筛选。因此，新的途径和化合物被变得更适合于药物筛选。
描述在5.1.1.中的任何供体生物可被用于制备组合嵌合途径表达文库。可根据它们已知的生物学特性来筛选供体生物，或它们可为已知和/或未鉴定的生物的混合物。
本发明的组合嵌合途径表达文库可根据节5.1.3中描述的原理来进行装配。为了使来自多种供体生物的DNA片段任意地多联体化，可通过包括下面步骤对文库装配方法进行改选产生较小基因组DNA片段，与调节序列，例如启动子和终止子连接以形成基因盒，并且多联体化基因盒。
插入片段DNA可为来自mRNA的cDNA，和/或基因组DNA片段。可同时纯化不同种类的供体生物的DNA或RNA，或分别分离它们并接着以特定比例混合。可在插入到克隆或表达载体之前的任何阶段进行插入DNA的任意混合。
可在cDNA合成中使用甲基化的核苷酸，例如5-甲基-dCTP以提供抗酶促酶切的保护，并且允许在相对于启动子和终止子片段为有义方向的cDNA插入片段的定向克隆。
可通过用具有相对高频率的切割位点，如Sau3AI的限制酶部分消化来产生为2-7kbp范围的基因组DNA的任意片段。通过将样品的等分试样进行琼脂糖凝胶电泳来监测和证实部分消化。
可提供外源调节区，例如组成型或可诱导启动子和终止子来引起被转移的基因的表达。当宿主和供体表达系统不相容时，必需提供这些调节系列。PCR可用来产生对于特定表达宿主为特异性的，并且在它们的末端已定义了限制位点的各种启动子和终止子片段。可采用将调节区与DNA插入片段相连接的任何方法。可采用用Klenow片段和部分组的核苷酸处理，即填补反应来产生仅特异性连接到具有相容末端的启动子和终止子上的插入DNA片段。
本发明提供一种涉及包含反向定位在唯一的限制位点各侧的两个拷贝的启动子的基因盒的应用方法，插入到这个限制位点的任何DNA将分别通过来自两侧的两个启动子在两条链上转录。
本发明还提供另一种涉及包含位于DNA插入片段各侧的启动子和终止子的基因盒的应用方法。如果进行cDNA定向克隆的方法，cDNA插入片段的5′末端和3′末端将分别具有唯一匹配的带有启动子片段的3′末端和终止子片段的5′末端的限制位点。
在两个末端具有相容的限制位点的基因组DNA片段或cDNA被连接到启动子上，并且在一些情况下，连接到终止子片段上，从而形成具有平均大小均为1-10kbp的基因盒。
通过类似于在肽合成中所采用的方法装配包含多个转录单位的多联体。在一个末端将基因盒库的一个亚组结合到固相，例如磁珠上。将其它流离末端进行几次连续的“去保护”循环和一系列转录单元剩余库的连接。每次加入循环后，固体使得多联体从未被连接的DNA片段中分离。当完成多联体化后，通过用限制酶保温释放多联体，例如内含子核酸酶，它酶切固相附近的唯一的非常稀少的位点以降低酶切多联体化的DNA的可能性。接着可将多联体化的DNA插入克隆载体中以形成被导入适宜宿主生物中的表达构建物；另一方面，在导入宿主生物之前，可将构建物转化到用于扩增的大肠杆菌recA负链菌株中。
有关启动子和终止子片段的合成，基因盒的制备，DNA插入片段的装配以及插入片段和载体的连接的详细情况提供在第5.4和5.5中。
一旦装配了组合嵌合途径表达文库，则它可基本上以节5.1.3中描述的相同方式贮存，扩增，复制，预筛选和筛选。5.1.6.偏倚性组合表达文库在本发明的另一个具体实施方案中，可一起从一种或多种供体生物中收集的预选择的DNA片段制备偏倚性组合天然或嵌合途径表达文库。替代仅使用供体生物全部收集的基因DNA或cDNA，该方法将减少需要被筛选的克隆数目并增加将产生感兴趣化合物的克隆的百分数。预选择的DNA片段包含编码部分或全部生物合成途径的基因，并且可通过将从可能与产生感兴趣化合物相关或参与其中的已知基因制备的多个探针与初始DNA文库杂交来预选择。初始DNA文库，优选粘粒文库并且不一定必需为表达文库，可包含来自一种或多种供体生物的DNA。为了进一步的预筛选，如果初始文库为表达文库，那么可将阳性克隆中的DNA转移至用于制备的宿主中并在其中表达，例如大肠杆菌或浅青紫链霉菌。可预筛选多于一个的初始文库，而且可收集来自所有阳性克隆的DNA，并用于制备偏倚性组合基因表达文库。
可扩增初始文库，这样可在多种宿主生物中预筛选供体生物的DNA。例如，一旦产生了链霉菌中的基因表达文库，可将它导入用于表达和筛选的特定的宿主生物，例如产生氧四环素的S.rimosis，或产生放线菌素的S.parlus。如果表达载体包含天然发生的质粒中的用于基因转移的适宜的序列，这些序列可被用来借助于接合转移将文库迁移到各种相容宿主中。
用于预筛选的探针可来自任何克隆的生物合成途径，例如聚酮化合物生物合成位点，因为这些是最好识别的生物合成位点，并且在已知的簇中之间具有相当多的序列保守，例如actI(放线红素的生物合成-Malpartida等，1987自然325818-820)，WhiE(孢子色素的生物合成-Blanco等，1993基因130107-16)和eryAl(Donadio等，1991科学252，675-679)。类似的原理可用于其它抗生素或次级代谢生物合成位点。例如低GC革兰氏阳性菌中克隆的肽合成酶基因，例如枯草芽孢杆菌(Stachelhaus等，1995科学26969-72)以及高GC革兰氏阳性菌，例如产生硫链丝菌肽，维吉尼亚霉素，缬氨霉素和放线菌素的放线菌种类可具有类似于用作探针以识别两组细菌中的新的生物合成位点的足够的序列。其它克隆的生物合成途径，例如肽合成酶和氨基糖苷合成酶，也可提供用于预筛选初始文库的探针。
另一方面，可通过来自编码参与次级代谢的蛋白质的DNA的探针筛选初始DNA文库。可通过从全部DNA中除去非编码DNA和编码与初级代谢生物合成途径有关的蛋白质的DNA来制备这些探针。剩余的DNA由此偏向于编码参与次级代谢的蛋白质的编码区。除去步骤的详细情况提供在节5.3.5中。5.2.筛选组合表达文库本发明的药物发现系统进一步包括筛选组合表达文库的新方法。在筛选表达文库的标准方法，例如抗体结合和配体结合也可与本发明的表达文库一起使用的同时，可将文库适应于被加尾以识别正在表达所需途径和代谢产物的宿主生物的报道方式。
本文要求保护的方法能在进行最少量的处理以允许文库中具有生产力的克隆的有效和高流通量的检测和分离时进行大量样品的管理。可预筛选文库的广范围的活性，产生的一类化合物或相关DNA序列的存在。在体内和体外分析中，文库也可与靶一起直接使用。已识别或分离的细胞群可容易地培养，进行数量扩增，并进行对产生新化合物的进一步分析。编码导致产生新活性或化合物的代谢途径的基因可通过表征被导入被分离克隆中的遗传物质来描述。有关基因和途径的信息以及克隆将大大便于药物最优化和生产如本文所采用，术语“文库克隆”或“文库细胞”指含有至少一个可能编码供体代谢途径或其一部分的供体DNA片段的组合基因表达文库中的宿主细胞或生物。术语“阳性克隆”或“阳性细胞”指根据报道范围产生信号的文库克隆或细胞，术语“有生产力的细胞”或“有生产力的克隆”指不同于文库中其余的“没有生产力的细胞”，文库中产生感兴趣活性或化合物的宿主细胞或生物。
术语“预筛选”指表明感兴趣的活性或化合物或基因的存在的一般的生物或生化分析。术语“筛选”指针对特定的疾病或临床病症并且采用靶的特定的以治疗为目的的生物或生化分析。术语“靶”通常指整个细胞以及大分子，例如酶，在筛选中试验化合物暴露于其中。预筛选和筛选的应用通常包括颜色指和器的肉眼检测或自动相分析，通过荧光活化细胞分选的荧光检测(FACS)或使用在存在报道范围时在文库细胞群中进行的磁细胞分选系统(MACS)。
本发明方法提供另一种但不相互排斥的产生用于检测和分离这些感兴趣细胞目的的与有生产力的细胞相关的可检测信号的方法。报道物可为促使直接或间接产生可检测信号的分子。例如，报道物可为光发射分子，或可被报道范围的其它成分特异性识别的细胞表面分子。报道范围包括报道物和促使和支持报道物产生信号的复合物，报道范围可包括活的指示细胞或其一部分。可将报道范围的成分掺入到文库的宿主生物中，或它们可在通透性的半固体培养基中与单个或文库细胞库一起被共包被，形成用于筛选的独立的单元。
为了易于在下文中描述的感兴趣的化合物的检测，可将吸收性物质，例如天然树脂，如Diaion HP 20或Amberlite XAD-8树脂加入到文库细胞的培养物中(Lam等，1995，工业微生物杂志15453456)。因为许多次级代谢物为疏水性分子，这些代谢物的释放或分泌可能导致在细胞外部产生沉淀。培养基中的这些树脂的内含物导致在树脂中发生多价螯合作用，该树脂可被从培养基中除去以用于洗脱和筛选。
在本发明的一个实施方案中，宿主生物被操作包含化学应答构建物，该化学应答构建物包含编码可操作性地与对在表达文库中将要筛选的所需类型的化合物或代谢物产生应答的化学应答启动子相关的报道分子的基因。在存在所需活性或化合物时，阳性克隆中的化学应答启动子被诱导启动可操作性相联的报道基因的转录。阳性细胞通过由于报道基因的表达产生的可检测信号来识别。
在另一个实施方案中，可使用在各个细胞中，由于存在所需活性或化合物，作为对生理性变化产生应答而产生信号的生理性探针。该探针可为报道分子的前体，该前体通过被寻找的生化途径中的活性或化合物被直接或间接转化为报道分子。在与有生产力的细胞接触时，生理性探针或报道前体产生促使有生产力细胞的识别和/或分离的可检测信号。接触可通过直接将探针或前体加入到文库细胞中来完成。另一方面，接触可通过包被作用和在筛选期间将探针或前体扩散到文库细胞中来完成。
在本发明的另一个实施方案中，指示细胞可被用于报告所需活性或化合物的产生，从而能够识别和/或分离文库中的有生产力的细胞。可将全部活的或固定的指示细胞，或其细胞的某些部分与各文库细胞或文库细胞库混合或共包被。根据它们对所需活性或化合物的存在产生应答的生物学特征来选择指示细胞。指示细胞可为所需化合物的靶细胞。另一方面，可将指示细胞与报道物一起使用以产生可检测信号。
在全面表征宿主生物，如有可能全面表征供体生物之后，选择各文库的预筛选和筛选。其中宿主生物为阳性的分析是不合格的，而其中供体生物为阳性的分析被认为是可接受的文库预筛选或筛选。优选为与所需生物合成能力有关的酶的靶的底物可被用作表明在特定克隆中存在DNA转录和翻译活性的另一个不相关的靶(例如淀粉酶，β-半乳糖苷酶)。
在本发明的另一个实施方案中，抗生素抗性可被用作产生或可能产生感兴趣次级代谢物的指示物。当文库克隆被置于一组抗生素中时，抗生素抗性可表明存在自我保护机制，例如外排泵，它通常作为对自体毒性的保护在次级代谢物生物合成途径附近被发现。这些克隆在检测时可能不表现出产生次级代谢物，但具有增加的含有可如所需地被进一步操作或检测的相邻的生物合成途径的可能性。
本发明还提供取代在培养皿中培养细菌而在有限的空间培养细胞的包被的有效的高流通量的方法。平板形式的活细胞是实验室和实体密集形式的，而包被的细胞可容易地在液体培养基中生长，其优点是各种分开的细胞被放在一起，并由此而易于检测感兴趣的次级代谢物。包被的另一个优点是能用文库细胞包被报道范围的成分和/或其它指示细胞，这样可在独立的单元中进行预筛选或筛选。细胞的包被作用可容易地通过使用物质，如琼脂糖，藻酸或角叉菜胶的热或离子凝胶化作用来进行。
FACS是一种熟知的根据颗粒的荧光特性分离颗粒(1-130μm大小)的方法(Kamarch，1987，酶学方法，151150-165)。FACS的工作原理是各颗粒中的荧光部分的激光激发。阳性荧光导致将少量电荷传给颗粒。这种变化使得能从混合物中将阳性和阴性颗粒进行电磁分离。被分离的颗粒可被直接积累到96孔或384孔平板中的各孔中。
MACS是一种熟知的根据它们与磁微球体(0.5-100μm直径)的结合能力分离颗粒剂的方法(Dynal，1995)。对磁微球体可以进行多种有用的改变，包括共价加上特异性识别细胞表面抗原或半抗原的抗体。另一方面，对于被包被细胞的磁化，可将报道范围掺入产生磁报道蛋白质如铁蛋白的宿主细胞中。在这种情况下，产生阳性信号的包被细胞起磁微球体的作用。可将选择的微球体暴露磁场中而进行物理性处理。例如，可通过将磁铁放在反应容器的外面来将选择的微球体进行多价螯合。5.2.1.报道构建物根据本发明，文库中的宿主生物可被改造包含含有可操作性地与报道基因相关的化学应答启动子的化学应答报道构建物。宿主生物和/或构建物可包含其它编码参与调节来自化学应答启动子的转录或信号产生的辅佐蛋白质的基因。
化学应答启动子为任何双链DNA序列，它能结合RNA聚合酶，并仅在存在某些种类的活性或某些种类的化合物时启动或调节可操作性相联的报道基因的转录。优选地，在不存在诱导活性或化合物时，在宿主生物中化学应答启动子没有或仅具有低水平的组成型背景转录活性。还可使用通过降低或减小转录活性对活性或化合物的存在产生消极应答的化学应答启动子。
用于本发明的启动子可包括，但不局限于，用于代谢途径，生物降解途径，细胞色素和应激反应的启动子(Orser等，1995，体外毒物学871-85)，例如热激蛋白。例如，可采用假单孢菌TOL质粒间位裂解途径的Pm启动子和它的通过一系列苯甲酸盐和卤素或烷基芳基化合物诱导和调节的阳性调节子XylS蛋白(Ramos等，1988，FEBS Letters226241-246；de Lorenzo等，1993基因13041-46；Ramos等，1986，美国国家科学院院刊838467 8471；Mermod等，1986，细菌学杂志167447-454)。其它非限制性的化学应答启动子的实例为与磷酸盐的利用有关的启动子(Metcalf等，1993，细菌学杂志1753430 3442)，对顺-顺粘康酸敏感的启动子(Rothmel，1990)；对抗生素和水杨酸敏感的启动子(Cohen等，1993，细菌学杂志，1757856-7862；Cohen等，1993，细菌学杂志，1751484-1492)，来自砷酸盐的启动子和来自金黄色葡萄球菌的镉操纵子(Corbisier等，1993，FEBS Letters 110231-238)；SfiA(Quillardet等，1982，美国国家科学院院刊795971-5975)，zwf(Orser等，1995，上文)。
报道基因编码能直接或间接产生可检测信号的报道分子。这包括产生颜色或产生磁性的报道分子以及任何发光的报道物，例如生物发光物，可使用化学发光或荧光蛋白质，它包括，但不局限于Victoriaaequona的绿色荧光蛋白(GFP)(Chalfie等，1994，科学263802-805)，具有增强荧光的改进的GFP(Heim等，1995，自然373663-4)，哈氏弧菌的荧光素酶(LuxAB基因产物)(Karp，1989，生物化学生物物理进展100784 90；Stewart等，1992，普通生物学杂志，1381289-1300)，和来自荧火虫，photinus pyralis的荧光素酶(De wet等，1987，分子细胞生物学7725-737)。可使用任何产生荧光或产生颜色的酶，它包括但不局限于β-半乳糖苷酶(LacZ，Nolan等，1988，美国国家科学院院刊852603-2607)；和碱性磷酸酶。可使用任何细胞表面抗原，例如，大肠杆菌硫氧还蛋白-鞭毛蛋白融合蛋白，即大肠杆菌的以与大肠杆菌鞭毛表面的鞭毛蛋白(fliC基因)形成的融合蛋白形式表达的硫氧还蛋白(trxA基因)(Lu等，1995，生物/技术13366-372)。
本文提供的化学应答报道构建物的实例为pERD-20-GFP，它包含假单孢菌的Pm启动子和XylS基因(Ramos等，1988，FEBS Letter226241-2476)，它们对某些类型的苯甲酸盐产生应答，从而导致报道物GFP的转录和翻译(表达)(见图6)。
不同的启动子序列可通过PCR产生并与GFP或鞭毛蛋白-硫氧还蛋白报道物的编码区相连。可使用标准的DNA纯化方法从有关种类纯化包含感兴趣的启动子的基因组和质粒DNA，并再悬浮于TE中。可对应于具有限制位点的另外序列的启动子区的5′和3′边界合成引物以易化亚克隆。在已确定为对于选择的模板和引物为可接受的条件下，在热循环器中进行扩增反应。通过琼脂糖凝胶电泳分离反应产物，并使用TA克隆盒(Invitrogen，La Jolla)进行亚克隆 扩增的启动子系列可被再克隆到本文中的通常目的的克隆载体的GFP或鞭毛蛋白-硫氧还蛋白的5′端。5.2.2.生理性探针和报道前体本文所采用的生理性探针为荧光或产生颜色的试剂，它们在接触或进入时，产生对文库细胞或指示细胞的生理性和/或代谢参数的变化发生应答的信号。
探针可以为与荧光试剂相连的酶底物。例如，可以将荧光烷基醚与这些细胞一起保温。如果细胞产生多芳香烃，该烃类可诱导微粒体脱烃酶，该酶本身酶切荧光烷基醚，产生荧光产物。
荧光探针可被选择用来检测下列生理和代谢参数的变化，例如，但不局限于Shechter等(1982，FEBS Letters 139121-124)，和Bronstein等(生物化学年评219169-81)中描述的那些。
原因 菌株/底物代谢活性 具体实例 (化合物类型)膜电位降低压力，损伤 BacLight菌株(异丙醇)(半渗透核酸染色)细胞内pH 生理性变化 BCECF-AM(亲脂性的氟苯酚的乙酸基甲酯)细胞色素介导的通过多芳香烃(萘)对 7-乙氧基-十七烷基氧化作用的增加微粒体的脱烃酶的诱导香豆素(荧光烷基醚)5.2.3.文库的预筛选和筛选本发明的组合基因表达文库可通过多种方法来预筛选或筛选，这些方法包括，但不局限于，肉眼观察，自动成像分析，与分子标记DNA探针杂交(Tyaei等1996，自然生物技术，14303-308)荧光激活细胞分选(FACS)和磁细胞分选(MACS)。筛选可在未扩增或扩增文库的大体积培养物中进行。
在本发明具体的实施方案中，在预筛选或筛选期间，将各个文库细胞或细胞库以小滴形式包被在惰性，稳定和多孔的半固体基质中。半固体基质对气体，液体以及大分子是可渗透的，并且允许包被的细胞生长和分裂。适宜基质的实施方案可包括，但不局限于琼脂糖，藻酸和角叉菜胶。可以小滴形式培养和检测包被的文库细胞，并保持可肉眼观察，这样可从小滴中回收细胞用来进一步操作。基质可任选暴露于例如抗生素的物质中，该物质可选择包含可选择性标记的文库细胞。还可将小滴置于营养物中以支持文库细胞的生长。下面实施方案用来说明并且不以任何方式限制本发明。
可用许多方法进行包被作用，根据在后来的预筛选或筛选期间采用的检测方法，制备粗滴(0.5-2.5mm的滴)或微滴(10-250μm的滴)。在形成滴的过程中，可以控制滴的大小和组成。优选地，各粗滴或微滴包含1至5个文库细胞。
例如，可按如下使用藻酸钠制备粗滴使用压力混合器以2000rpm将藻酸钠以1％的浓度溶解在100ml无菌水中。将1体积的大肠杆菌或酵母的文库细胞，例如粟酒裂殖糖酵母和糖酵母类；或链霉菌类的孢子，枯草芽孢杆菌和丝状真菌，例如曲霉和链孢霉类加入到藻酸钠溶液中，这样每滴中包被了1-5个细胞。让混合物静置至少30分钟放气，接着通过导致形成独立的液滴的任何装置挤出。其中一种装置为具有25个计量针头的注射器。通过将藻酸钠溶液滴加到装有135mM氯化钙溶液的轻轻搅拌的烧杯中形成液滴。让小滴固化10分钟，接着转移到除去了氯化钙溶液而以适宜生长培养基取代的灭菌烧瓶中。包被的文库细胞可在标准条件下生长。
可通过产生小滴的任何方法或设备来制备微滴。例如，但不局限于两相环形喷雾器，静电液滴发生器，震荡孔流系统和乳化作用。现有技术熟知其它制备半固体滴的方法；参见例Weaver，美国专利号4,399,219。
下面的实施方案是使用乳化技术制备微滴的例子(Monshipouri等1995，微包被杂志12255-262)。使用为2000rpm的压力混合器，将0.6g多磷酸钠和2％藻酸钠溶解于100ml无菌水中，让藻酸钠溶液放气60分钟。通过将300ml油，例如盐酸组胺酸或橄榄油与1.0g纯化的大豆卵磷脂混合至少30分钟制备油相。通过超声处理至少15分钟来制备在10ml 50％乙二醇中包含1.9g硫酸钙的浆。在导入油相之前立即将该浆和1体积的将产生每滴1-5个细胞的文库细胞掺合到藻酸溶液中。乳化过程通过将藻酸混合物缓慢转移到油相中并以580rpm混合10分钟来启动。接着加入500ml无菌水并让混合持续5分钟。通过离心从油中分离微滴。洗涤微滴并将其重新悬浮在适宜生长培养基中，如果需要即可用于标准条件下的培养。可通过相显微镜来测定微滴的大小。对于通过FACS或MACS的分选目的，如果滴在分选所必需的所需大小范围之外，可使用所需大小限制的滤膜对滴进行大小选择。
根据本发明，报道范围的成分或药物筛选的靶也可被包被在带有文库细胞的滴中。在形成前面所述的粗滴或微滴之前，可将整个报道细胞或包含生物检定，酶，或报道分子的细胞部分与悬浮在培养基中的文库细胞混合。文库细胞产生的感兴趣的化合物可在滴中聚积和扩散以达到共包被的指示细胞或报道物，并产生信号。共包被的指示细胞可为所需化合物的活靶，例如抗感染针对的病原体，或抗肿瘤剂针对的肿瘤细胞。指示细胞的代谢状况中的任何变化，例如死亡，或生长抑制，组成了信号并可在滴内通过现有技术中已知的多种方法来检测。该方法可包括，但不局限于使用生理性探针，例如活体染色，或滴的光学特性的测定。
当滴暴露于报道范围的成分中时，由包被的文库细胞和报道成分产生的代谢物和化合物可扩散通过半固体培养基产生信号，例如，可将生理性探针加入到接着进行适宜的分选方法的一批滴中。如果文库细胞被允许在滴中分开，初始阳性细胞的后代在小菌落中被保持在一起，从而产生一个较强的信号。优选半固体培养基与由报道物产生的信号是光学相容的，例如对一定范围的波长的光是透明的，这样信号可被有效地检测。
粗滴可通过眼睛或使用允许滴通过筛选点，并具有分离阳性物能力的任何设备，使用生色报道物来进行分选。可使用FACS或MACS来分选微滴。FACS操作可通过合格的操作者在任何适宜的机器(例如Becton-Dickinson TACStar Plus)上进行。颗粒悬浮密度(细胞或滴)调节为1×106粒/ml。在所有情况下，阳性物可以1个克隆/孔直接分选到多孔平板中。按照制造商的说明使用MPC-M磁试管架进行MACS(Dynal，5 Delaware Drive，Lake Success，New York 11042)。
在预筛选或筛选中被发现为阳性的包被细胞可通过将滴放在适宜的琼脂或液体生长培养基上来进行培养或将滴溶在柠檬酸钠中来进行回收。培养一段时间后，阳性细胞可从滴中生长出来。为了滴处理和贮存的方便，后面的培养可在多孔平板中进行。
被减少到较小群体的预筛选的阳性物可接着在存在乙二醇的情况下冷冻和贮存或在多孔平板中生长。这些可被用于使用多针复制基因将基因组转移到各种类型的分析平板中(例如分化培养基，选择性培养基，抗微生物或改造的分析菌苔)。在这些微量滴定平板中也可进行特定的分析，并通过标准的平板读出器或目前高流通量筛选技术中所采用的任何其它方法进行阅读。
为了讨论的清楚性，下面的子章节详细地描述了涉及原核生物和真核生物，供体和宿主生物的本发明的不同的实例。下面的实例为举例并不局限本发明。5.3.从供体生物制备高质量核酸的方法作为起始物质的高质量的DNA或RNA的可获得性在DNA文库的构建中是非常重要的，该DNA代表了供体生物的遗传信息。本节提供了从供体生物的培养物或从环境样品中提取，选择和制备高质量核酸的方法。还描述了为了浓缩与次级代谢物相关的DNA而用于预筛选DNA文库的被除去的DNA探针的制备方法。5.3.1.异硫氰酸胍核酸分离可通过机械研磨器，或另外通过研钵和研杵在存在磨得很细的玻璃或浮石用手将冷冻干燥或未冷冻干燥的材料破碎。研磨后立即以每1-2克研磨的冷冻干燥的材料对应于10ml溶胞缓冲液的量进行混合。溶胞缓冲液为5M异硫氰酸胍，50mM Hepes pH 7.6，10mM EDTA，和5％β-巯基乙醇(或250mM DTT)。混合并在50℃下保温5分钟后，在以8000g离心之前，将溶液倒入4％肌氨酸中，混合，并在50℃保温多于5分钟。如果上清可见为混浊，可使用转速为27,000g的90分钟离心步骤以沉降不需要碳水化合物。另外，可采用15,000g的旋转以清除不需要污染物的溶胞产物。离心后，将上清倒入1.42M CsCl(0.15gCsCl/ml)中并在超速离心管中的预先制备的5.7M CsCl/TE(10mMTris-HCl/1mM EDTA)溶液上分层。20℃，可以160,000g进行超速离心18小时。超速离心后，在1.42M/5.7M CsCl界面上的清亮象胶体一样的层为DNA，同时全部的细胞RNA以清亮的片状沉淀物形式存在于管的底部。可将来自超速离心步骤的DNA对TE缓冲液进行透析，换成0.1M NaCl进行透析，用2.5体积乙醇沉淀，干燥并重新溶液于适宜体积的TE中。如果DNA层为白色，可将它移出并在CsCl/二联苯酰亚胺梯度中再离心8小时以除去残留的碳水化合物。可通过用85％异丙醇洗涤2-5次去除染料，并如上面一样进行透析和处理。
可将RNA重新溶解在重新悬浮的缓冲液中(5M，异硫氰酸胍，50mM Hepes，pH 7.6，10mM EDTA)，用50mM Hepes pH 7.6，10mM EDTA溶液稀释至1.33M异硫氰酸胍。如果需要全部RNA，则加入2体积乙醇或1体积异丙醇沉淀稀释的RNA样品。将沉淀的RNA用乙醇漂洗，干燥并重新悬浮在水中或甲酰胺中，-70℃贮存直至使用。5.3.2.含多聚腺苷酸RNA的分离因为绝大多数真核生物mRNA分子在3′末端含有一片聚(腺苷)酸，长度多达250个碱基，它可通过使用寡聚-dT纤维素基质的亲和层析来进行纯化。可使用大量商业可购得的寡聚-dT基质，包括但不局限于简单重力柱，顺磁颗粒，自旋和推进柱。分离的mRNA可以溶解在水或甲酰胺中或在-70℃下干燥的形式贮存。5.3.3.来自总RNA的非核糖体序列的富集非核糖体序列的富集可能是在从困难或不可培养的供体生物获得有用RNA数量中重要的一个步骤。中性蔗糖梯度上RNA的分级分离可用于纯化从其它RNA种类中纯化出显著核糖体RNA(R.McGookin1984，分子生物学方法Vol.2核酸Humana Press，pp.109-112)。离心后，放弃包含最大量核糖体RNA的样品，透析和沉淀剩下的部分。
利用带有或不带有任意加尾的寡-dT引物的任意引物的其它方法和PCR可被用来扩增原料中的少量的RNA。5.3.4.使用Klenow片段的补平反应使用大肠杆菌DNA聚合酶，或其它缺乏3′→5′外切核酸酶活性的DNA聚合酶的Klenow片段，将核苷酸加至5′粘端是通常用来在消化后产生平端DNA分子的标准方法，当没有完全核苷酸组时被使用时，该活性可被用于产生与它们本身不相容但互相相容的连接末端中。
这一技术已被用于制备高效价的基因文库和构建物(Hyug等，1984，核酸研究121863-1874；Zaborovsky等1986，基因42119；Foster，1991，博士论文，加利福尼亚大学，Santa Barbara，Loftus等1992，生物技术12172-175)。
可用Klenow缓冲液(50mM Tris-HCl pH 7.5，10mM MgCl2，50mg/ml BSA，1mM dNTP)，酶，以及在37℃保温3-4小时来进行补平反应。反应后，可通过多种方法纯化DNA，包括但不局限于，亲和层析，乙醇沉淀，和旋转柱沉淀。5.3.5.用于预筛选的被除去的DNA探针的制备方法可从具有复杂生活周期的未没有分化的年幼，中间对数期的生物培养物分离RNA。这个RNA库与参与未分化生长和初级代谢的基因互补。RNA在体外被进行生物素标记并过量地与来自同源或密切相关的异源种类的基因组DNA的被任意剪切，并按基因大小排列的片段进行杂交，用苯酚萃取该混合物导致去除了在界面与初级代谢RNA互补的基因组序列，这一过程可被重复一次。得到的单链DNA片段由初级代谢基因的(+)链和包括与次级代谢相关的其它基因的(+)和(-)链组成。使该DNA混合物变性，并且在高度严谨条件下重新杂交5-10个半CotS，这样仅仅相关的序列可重新杂交以形成双链DNA。可通过与羟基磷灰石结合或通过用绿豆核酸酶消化除去剩余的单链DNA。可接着采用任意引发标记代表非初级代谢相关基因的分离的双链DNA，并将其用作探针来预筛选文库。5.3.6.从土壤或其它混合的环境样品中纯化核酸将土壤样品在液氮中快速冷冻并贮存于-70℃下直至使用。另外，土壤样品被冷冻贮存于-20℃下。使用前立即将样品在冰上融化，或在操作前被冷冻干燥。
取决于材料的物理性质和来源，通过具有少量改进的多种方法提取全部核酸。直接冷冻干燥和处理被干燥成半干燥的样品；非常湿的样品被进行快速冷冻和冷冻干燥；在操作前将油状样品用磷酸盐缓冲液进行稀释。可采用下面任一种方法Ogram等1987，微生物学方法杂志757-66；Steffan等1988，实用环境微生物学，54137-161；Werner等1992，细菌学杂志174(15)5072-5078；Zhou等1996，实用环境微生物学62(2)316-322。
简而言之，通过滴加至热的异硫氰酸胍溶胞缓冲液(见节5.3.1)直接将5g样品溶胞，并进行氯化锑纯化。另外，在50ml离心管中将样品与13.5ml DNA提取缓冲液(100mM Tris-HCl pH 8.0，100mMEDTA，100mM磷酸钠，1.5mM NaCl，1％CTAB(溴化十六烷基甲铵)和100μl 20mg/ml蛋白酶K混合，37℃下，以225rpm的速度水平振荡30分钟。振荡后，加入15ml 20％SDS，65℃下每15-20分钟进行一次尾-尾振荡将样品保温2小时。20℃下，通过以6000×g离心10分钟来收集上清。通过加入4.5ml提取缓冲液和0.5ml 20％SDS，旋涡振荡1分钟，接着在65℃下保温10分钟并且再离心来将片状沉淀物重新提取3次。将从3次提取过程汇集的上清用氯仿-异戊醇(48∶1)提取两次。通过加入0.6体积的异丙醇，接着保温1小时，并在室温下以16,000×g离心20分钟来沉淀核酸。接着将粗提的核酸片状沉淀物重新悬浮于10nM Tris-HCl pH 8.0，2mM EDTA中。如果需要通过EDAE层析对DNA进行进一步纯化。通过用4M乙酸锂或酸性苯酚提取对RNA进行选择性沉淀来从粗提的片状沉淀物中获得全部RNA(Ausubel等1990，Greene Publishing Associates and WileyInterscieuce，New York；Hoben等1988，实用环境微生物学，54703-71)。5.3.7.DNA的修复通过首先用T4 DNA聚合酶使任何被切断的末端平端化来修复带缺刻或被降解的DNA(New England Biolabs)。37℃下，将DNA在平端缓冲液(50mM Tris-HCl pH 7.8，10mM MgCl2，40μMdNTPs，5U/10μg T4 DNA聚合酶)中处理1-2小时。通过加入1/10体积的3M乙酸钠和2.5体积的100％乙醇对DNA进行乙醇沉淀。
沉淀并重新悬浮于水中后，16℃下，将DNA样品在大肠杆菌连接酶缓冲液(50mM Tris-HCl pH 7.8，10mM MgCl2，10mMDTT，26μM NAD+和25μM BSA，10U大肠杆菌)中用大肠杆菌DNA连接酶处理1-2小时。处理后，将DNA样品用20mM Tris－HClpH 8.0，0.3M乙酸钠溶液稀释5倍，并分别用苯酚和氯仿提取一次。向水相中加入2.5体积乙醇沉淀DNA。用70％乙醇将样品漂洗两次，重新悬浮于无菌水或10mM Tris-HCl，pH 8.0，1mM EDTA中，并在-70℃下贮存自至使用。5.4.用于原核表达文库的方法本节提供了使用原核宿主和供体生物制备天然途径表达文库和嵌合途径表达文库的方去。通过节5.3.1-5.3.4描述的方法获得的纯化的高质量的DNA可用于下面的方法中。5.4.1.细菌种类，菌株和培养条件特别好的表达宿主生物是限制性-负型，核酸内切酶缺陷和重组缺陷型。对于大肠杆菌，优选的菌株为XLl-MR(基因型McrA-，McrCB-，McrF，Mrr，hsdr，cndal-，recA-)。对于链霉菌，优选的菌株为浅青紫链霉菌TK64。对于枯草芽孢杆菌，优选的菌株为枯草芽孢杆菌PB 168 trpC2；枯草芽孢杆菌PB5002 sacA，degUhy；枯草芽孢杆菌PB 168 delta trpC2，pksdelta 75.8；枯草芽孢杆菌ATCC 39320和39374。
供体生物为细菌种类。一些被用于选择它们产生可通过目前分析来检测的独特化合物的能力。其它则由于它们存在于可能感兴趣的环境样品中而被选择。在一些实例中，海洋细菌从Harbor Branch OceanographicInstitute and Scripps Institute of Oceanography获得。它们通常从公海近海处大于200英里处收集。将代谢试验以及革兰氏试验以及菌落形态学进行到必需确保样品具有分类差异的程度。
当制备文库贮备物时，让大肠杆菌在37℃下生长并在30℃下表达。让海洋放线菌属和链霉菌属的种类仅在30℃下生长。5.4.2.供体基因组DNA的制备培养来自每一种类的细菌的10ml培养物。通过离心沉淀细菌并重新悬浮于10mM Tris，5mm EDTA(TE)。可通过节5.1.2中描述的方法可纯化DNA，或者可将细菌沉淀物溶解在SDS/蛋白酶K中，用苯酚-氯仿提取，并用异丙醇沉淀。将得到的纯化DNA在TE中悬浮过夜。
将各纯化的DNA的等分试样进行琼脂糖凝胶电泳以证实完整性并确定DNA浓度。
为了制备用于天然途径表达文库的任意大的DNA片段，通过在37℃下，在1X酶缓冲液和每微克DNA 0.01-0.5单位酶中保温1小时，将20μg各种类的DNA用频繁切割酶(frequent-cutting enzyme)例如Sau3A部分消化。可通过实验确定所用酶量以产生所需的大小范围。收集被消化的DNA，苯酚∶氯仿提取，并用乙醇沉淀。100ug该混合物用于需要大量天然基因组DNA片段的各文库。该混合物可选择性地通过蔗糖梯度来按大小分级分离。可同时通过按大小分级分离来选择用于嵌合途径表达文库的较小的DNA片段。
通过将样品的等分试样进行琼脂糖凝胶电泳来证实消化和按大小的分级分离。5.4.3.原核启动子片段的制备在一个实施方案中，合成的寡核苷酸被用于构建含两个拷贝的β-半乳糖苷糖启动子(lac)的片段，一个位于唯一的BamHI位点的一端，被定位于直接转录的lac的各个拷贝朝向中心的BamHI位点(图4A)。合成的寡核苷酸通过合成仪被磷酸化。在室温用T4 DNA连接酶连接30分钟之前，通过煮沸5分钟并缓慢冷却30分钟至25℃使400ng各种寡核苷酸复性。将连接混合物进行琼脂糖凝胶电泳，切除2-7kbp片段并用Gene Clean纯化。通过在15℃在1×连接酶/PEG缓冲液中用T4DNA连接酶保温16小时将连接配对并且正确定位的盒插入pBSK质粒载体的Smal位点。将连接混合物导入XLl-MR细胞中。通过限制酶分析法来分析各个克隆并可选择性地测序以证实定位和准确度。
将pBSK-(lac/lac)n克隆(其中n为2-10的整数)以0.3l的量培养，并使用质粒制备盒(Qiagen)纯化质粒。在1×缓冲液中用Saml完全消化40μg被选择和纯化的pBSK-(lac-lac)n。将消化的DNA进行琼脂糖凝胶电泳，切下lac/lac启动子二聚体，并用Gene Clean纯化，在1×缓冲液中用BamHI完全消化。参见图4B和4C。将消化的启动子单体用苯酚∶氯仿提取。乙醇沉淀，在1×CIAP缓冲液中用CIAP处理来脱磷酸化。如前所述提取和沉淀脱磷酸化的被消化的启动子，并在贮存-20℃下或进一步使用之前以20ng/μl的浓度重新悬浮于TE中。
在另一个实施方案中，将制备的启动子片段与类似制备的不包含启动子序列的接头混合，平接着用于与供体基因组DNA的连接中。在反义转录是一个需要考虑的问题的情况下，这使得产生仅具有一个启动子的盒。5.4.4.用于组合嵌合途径表达文库的基因盒的制备在一个实例中，将基因组DNA(平均大小为3.5kbp)BamHI-BamHI片段与过量的脱磷酸启动子片段混合，接着连接。启动子与基因组DNA片段的摩尔比为20∶1。产生的单元(lac/基因组DNA片段/lac)将具有约为4kbp的平均大小。可使用的其它原核启动子包括其它大肠杆菌启动子(Harley等，1987，核酸研究152343-2361)以及用于链霉菌种类的表达宿主的链霉菌启动子(Strohl，1992，核酸研究V20961-974)。在宿主具有未确定或显著的重组能力时，需要使用一系列不同的启动子，这样包含一些盒的任何克隆将含有一些不同的启动子。5.4.5.固体支持物的制备超连接固定的链霉亲和素颗粒购自Pierce(目录号53113)。3MEmphaze Biosupport Medium ABl“空白玻珠”购自Pierce(目录号53112)。来自其它卖主的相似的固体支持物可代替它们用于此目的。
寡核苷酸购自Life Technologies (Gibco-BRL)。寡核苷酸“玻珠-连接-5”是5′生物素-GCC GAC CAT TTA AAT CGG TTA AT3′。“玻珠-连接-3”是5′磷酸-TAA CCG ATT TAA ATG GTC GGC3′。当退火时，这些寡核苷酸包含一个SwaI限制性内切酶位点(示于下面划线部分)。复性的玻珠-连接寡核苷酸还在3′末端留下一个AT突出端。该突出端在寡核苷酸玻珠-连接-5中的用黑体表示。
生物素-GCC GAC CAT TTA AAT CGG TTA ATCGG CTG GTA AAT TTA GCC AAT在eppendorf管中将等摩尔量的各种颗粒连接寡核苷酸混合在一起。将管中加入5M NaCl至最终浓度为300mM。在60℃将反应保温1.5小时。使用未退火的寡核苷酸作为对照，通过琼脂糖凝胶电泳来证实退火。
为了制备空白玻珠，将100mg干的玻珠重新悬浮在1ml磷酸缓冲生理盐水(PBS)中。加入牛血清蛋白(BSA)至最终浓度为1mg/ml。室温下将玻珠旋转4小时。离心沉淀玻珠，室温下用1M Tris-HCl pH8.0在2小时内将其洗涤3次以封闭未反应的氮杂内酯位点。短暂离心沉淀玻珠并用PBS充分洗涤。在4℃下，将空白玻珠贮存在PBS中直至使用。
为让玻珠连接的寡核苷酸与抗生蛋白链菌素玻珠结合，在1×结合缓冲液中(PBS，500mM NaCl)，将10μg预先退火的寡核苷酸与20μl超连接的固定的链霉亲和素玻珠混合。与保持玻珠悬浮相反，室温下将玻珠保温3小时。沉淀玻珠并用1ml结合缓冲液洗涤3次。接着将玻珠用1×连接缓冲液(50mM Tris-HCl pH 7.8，10mM MgCl2，10mM二硫苏糖醇，1mM ATP，25μg/ml BSA)洗涤并平衡。4℃贮存玻珠直至使用。5.4.6.组合嵌合途径表达文库的装配将基因盒连接到磁珠上在1×激酶缓冲液中使用T4多核苷酸激酶磷酸化基因盒。乙醇沉淀磷酸化片段并重新悬浮于TE中。将其1/10连接到两个短的未磷酸化的合成接头的混合物上。剩余的9/10用于后面步骤。每个接头将具有两个稀有切割酶中的一个，Not1或Srf1。此外，含有Not1的接头在合成寡核苷酸时被用生物素标记。将Not1和Srf1接头与磷酸化的转录单元分别以100∶100∶1的比例混合，并在15℃在1×连接酶/PEG缓冲液中用T4 DNA连接酶连接16小时。让该混合物与亲和素结合的MPG磁珠结合，并用制造商提供的方法从连接混合物中除去玻珠-结合转录单元。
在连接的DNA的混合物中，大约1/2将在一个末端具有生物素标记的Not1接头并在另一末端具有生物素标记的Srf1接头。Not1末端将通过亲和素-生物素连接与颗粒结合。在两个末端具有Not1接头的片段不参与进一步的连接步骤。在两个末端具有Srf1接头的片段不被保留在磁分离步骤。
用于与玻珠结合的DNA连接的DNA库的制备如上将剩余的9/10磷酸化的转录单元仅与Srf1接头连接，接着用Srfl完全消化，脱磷酸化，纯化并用乙醇沉淀。
玻珠结合的DNA的脱保护在1×Srf1缓冲液中用Srf1酶完全消化与玻珠结合的转录单元。加热灭活该反应并且通磁分离除去玻珠。
多联体化接着将玻珠加入到含有脱磷酸Srf1-Srf1消化的转录单元的连接混合物的1×连接缓冲液中。在加热灭活连接酶和磁分离玻珠之前通过加入T4 DNA连接酶启动连接并在25℃进行60分钟。连接主要磷酸化的玻珠结合的DNA与非磷酸化的转录单元之间发生。通过T4多核苷酸激酶磷酸化颗粒上的转录单元，加热灭活，磁分离，并且通过加入更多的T4 DNA连接酶回到连接混合物中。
在通过用Not1消化从玻珠酶切多聚体之前，将该循环重复10次。乙醇沉淀酶切的DNA，重新悬浮于TE中，并且在插入到SuperCos 1或其它载体中之前，根据表达宿主，在琼脂糖凝胶上观察以估计它的性质和大小范围。如节5.4.5中描述的，多联体被用于在相关的表达宿主中产生原核文库。5.4.7.组合天然途径表达文库的装配用于大肠杆菌文库的表达载体被希望是能保留大小为30～42kpb的插入片段的粘粒SuperCos 1。按照制造商的说明(Stratagene)来进行将DNA片段插入到SuperCos 1中并用Gigapack提取物包装。
简而言之，用包含DNA文库的SuperCos 1噬菌体感染XL1-MR宿主细胞。它按照如下来进行37℃在5ml补充有1％麦芽糖，10mMMgSO4的LB培养基中以300rpm将XL1-MR细胞培养过夜。以1∶10稀释过夜的培养物，并在37℃下，以300rpm在LB/10mM MgSO4中培养3小时。以800×g离心沉淀培养物，并重新悬浮于5ml LB中。室温下，将600μl悬浮液与500cfu包装在噬菌体颗粒中的文库一起保温30分钟，接着在37℃下，与8体积的LB以300rpm保温60分钟。
为了扩增表达文库，将被感染的宿主细胞铺在含有50ml LB，50μg/ml氨苄青霉素的150mm培养皿中。室温下这些平板被预先干燥48小时。涂布后，37℃下让平板保温过夜。刮取平板，用每平板含有3ml 15％乙二醇，85％LB重新悬浮菌落。该细菌悬浮液贮存于-70℃以备进一步的使用。
为了制备用于筛选各个克隆的文库，将被感染的宿主细胞铺在含有50ml LB，50mg/ml氨苄青霉素的150mm培养皿中。室温下将平板预先干燥48小时。涂布后，37℃下让平板保温过夜。用灭菌的牙签挑取产生的菌落并一孔一个地转移到多孔平板中。384孔工作平板的每个孔含有75/μ1 LB，50μg/ml氨苄青霉素，7％乙二醇。外面的行(总共80孔)不被接种，但类似地装上培养基以提供在后来保温和冷冻期间的蒸发屏障。37℃下，将这些接种的主皿不振荡放置16小时。过夜的主384孔平皿被用作源平皿复制引一个或多个工作384孔平皿或Omni-Trays中。接着将该主384孔平皿分别包被并在-80℃下冷冻。用384针头复制仪进行复制。在每次使用之前和之后，将384针头复制仪顺序地浸入漂白液中20秒，水中30秒，接着在燃烧之前浸入乙醇中5秒。文库装配的方法取决于载体和表达宿主的选择。5.4.8.表达文库的预筛选有三种类型的预筛选，胞内，差示和选择。
简而言之，第一种类型，胞内预筛选需要将文库导入被遗传改造包含化学应答性的报道构建物的宿主中。报道物为GFP(绿色荧光蛋白)或β-半乳糖苷酶，选择通过荧光激活细胞分选(FACS)或粗滴分选来进行。
第二种类型，差示预筛选，需要用荧光或色素原的生理性示踪物保温宿主中的文库，接着通过FACS或粗滴分选。
第三种类型，选择预筛选，需要用选择性试剂，例如抗生素来保温宿主中的文库，接着通过FACS或粗滴分选来识别存活或增殖的细胞。
对于所有方法，在检测各个培养物之前，在大量扩增文库的培养物中进行细胞分选。
可通过FACS或粗滴分选来预筛选文库。以一种或多种提高高或低密度微环境的方式培养含有DNA文库的宿主细胞的库。
在第一种方法中，按单个细胞来鉴定扩增文库的细胞。在沉淀之前，30℃，以300rpm将大肠杆菌文库等分试样在20体积的培养基中培养4小时，重新悬浮于1体积的灭菌ddH2O，与荧光探针一起保温(如果需要)，并且放置在冰上以转移到FACS设备上。
在第二种方法中，在转移到FACS或粗滴分选设备之前，如节5.2.3所描述的，在存在底物或选择剂时包装和培养扩增文库的等分试样。
对于与荧光示踪物或底物检测的培养物，在FACS之前按照制造商的方法将重新悬浮在ddH2O中的培养物染色，通常如下进行室温下在黑暗中保温15分钟，接着在1.5ml microfuge管中沉淀5分钟并重新悬浮于1体积的冷的ddH2O中。
分选后，将来自表达文库的选择的1-1000克隆库或粗滴培养在0.5L营养培养基中。通过用0.5L乙酸乙酯提取对培养的细菌和培养基进行处理以用于化学分析旋转蒸发产生约20mg-1g提取物/升培养物的粗的有机提取物。纯化同种克隆的DNA并重新转移至宿主细胞中以证实与粘粒相关的序列的定位。由文库克隆的表达产生的化学样品可通过使用一系列柱(阳离子，阴离子，反相)的HPLC和随后通过使用NMR的定量化学分析来测定。5.4.9.通过平板复制对海洋革兰氏(-)菌/大肠杆菌文库的代谢测定在制备DNA文库之前，先检测各种野生型海洋种类以防止重复和有利于确定在完成的文库中进行的代谢测定的顺序。
为了制备用于筛选各克隆的文库，将被感染的宿主细胞，例如大肠杆菌XLl-MR铺在含有50ml LB，50mg/ml氨苄青霉素的150mm培养皿上。室温下预先将平板干燥48小时。铺开后，在37℃下，让平板保温过夜。用灭菌的牙签挑取产生的菌落并一孔一个地转移到384孔平板中。各孔含有75μl LB，50μg/ml氨苄青霉素，7％乙二醇。外面的行(总共80孔)不接种但类似地装上培养基以提供在后面的保温和冷却期间的蒸发屏障。37℃下，将这种接种的主皿不振荡放置16小时。过夜的主384-孔平皿被用作源皿复制到一个或多个工作多孔平皿或Omni-Trays中。接着分别包被主384孔平皿，-80℃贮存。用384针头复制仪进行复制。在每次使用之前和之后，顺序地将384针头复制仪浸入漂白液中20秒，水中30秒，接着在燃烧之前浸入乙醇中5秒。
工作多孔平板或Omni-Trays被用作源平皿将DNA文库复制至一系列差示和/或选择培养基上(例如铁载体检测培养基或抗菌培养基)。汇编结果并与用于构建DNA文库的野生型海洋细菌的图谱进行比较。5.4.10.通过粗滴包被对海洋革兰氏(-)菌/大肠杆菌文库进行代射测定通过称取藻酸钠并通过压力混合器以2000rpm以1％的浓度溶解在100ml无菌水中来包被克隆。加入1体积的文库悬浮物以致每滴包被1-5个克隆。让混合物静置至少30分钟以放气。接着挤压通过允许它形成单个滴的任何设备。其中一个例子是具有25号针头的注射器。这些被滴入装有135mM氯化钙的轻轻搅拌的烧杯中。让滴变硬10分钟并接着转移至灭菌的烧瓶中，除去氯化钙，用LB/Amp培养基和底物(例如x-葡糖胺)代替。接着在30℃下将含有滴的烧瓶振荡过夜，第二天早上检测由存在兰色菌落表示的阳性克隆。
将滴以单层放置在一大的干净的盘中并用眼睛观察。取出阳性菌落并放置于包含LB/Amp和50mM柠檬酸钠pH 7.4的96孔主皿中以溶解滴，并在37℃让其生长过夜。这些过夜的主96孔平皿被用作源平皿复制到一个或多个工作多孔平皿或Omni-Trays中。分别包被主96-孔平皿，并在-80℃下冷冻。阳性克隆可被送去用于特定的产物检测或送去进行另一轮预筛选或筛选。可通过用多针头复制仪进行的复制来进行进一步筛选。在每次使用之前和之后，顺序地将多针头复制仪浸入漂白液中20秒，水中30秒，接着在燃烧前在乙醇中浸入5秒。5.4.11.通过微滴包被对海洋革兰氏(-)菌/大肠杆菌文库进行的代谢测定通过下面方法可产生微滴。以2000rpm使用压力混合器将0.6g多磷酸钠和2％藻酸钠溶解在100ml无菌水中。让该混合物放气60分钟。接着将1.9g硫酸钙在10ml 50％乙二醇中超声处理至少15分钟。在导入已加入1.0g纯化的大豆卵磷脂预混合至少30分钟的油相(橄榄油)之前立即将该浆和将产生1-5个细胞/滴的1体积的文库悬浮液掺合到藻酸溶液中。该乳化过程通过将藻酸混合物缓慢地转移到油相并以580rpm混合10分钟而启动。接着加入500ml无菌水并让混合持续5分钟。可通过离心将微滴从油中移出并洗涤，重新悬浮在LB/Amp中。对于通过FACS的分选，如果滴在分选必需的所需的大小范围之外，可使用具有所需大小限制的滤膜对滴进行大小选择。可在30℃，在含有荧光底物的LB/Amp培养基中将克隆摇荡培养2小时。
保温后，通过离心，洗涤和以1×106滴/ml的密度重新悬浮于无菌水中来制备用于通过FACS分选的样品。可通过相差显微镜来测定滴的大小。由合格的操作者在Becton-Dickinson FACStar Plus上进行FACS操作，并将阳性克隆直接分选到含有LB/Amp的多孔平板中，将阳性克隆分为1个克隆/孔。让平板在37℃下生长直至克隆从玻珠中长出(1-2天)。这些过夜平板被用作源平板复制到一个或多个工作多孔平板或Omni Trays中。分别包被主多孔平板并在-80℃冷冻。可接着将阳性克隆送去用于特定的产物的检测或送去进行另一轮的预筛选或筛选。可通过用96或384针头复制仪进行复制来完成进一步的筛选。在每次使用之前和之后，顺序地将复制仪浸入漂白液中20秒，水中30秒，接着在燃烧之前浸入乙醇中5秒。5.4.12.通过平板复制对放线菌/浅青紫链霉菌文库进行的代谢测定在制备DNA文库之前，先测定各种可培养的野生型放线菌种类以防止分类学重复，并有利用确定在完成的文库中进行的代谢测定的顺序。为了制备用于筛选各克隆的文库，将转化的宿主细胞，浅青紫链霉菌TK66，涂布含有F10A的150mm平皿中。室温下将平皿预先干燥48小时。涂布后，30℃下，让平皿保温过夜。通过涂上硫链丝菌肽来启动选择。用牙签挑取产生的菌落并一孔一个地转移到96孔平皿中。每孔包含F10A培养基。30℃下。将这些接种的主皿放置1-4天。过夜主96孔平皿被用作源平皿复制到一个或多个多孔平皿或Omni-Trays中。接着分别包被主96孔平皿并在-80℃冷冻。用多针头复制仪进行复制。在每次使用之前和之后，顺序地将多针头复制仪浸入漂白液中20秒，水中30秒，接着在燃烧之前浸入乙醇中5秒。
工作多孔平皿或Omni-Trays被用作源平皿将DNA文库复制到一系列分化和/或选择培养基中(例如抗生素平皿或抗菌培养基)。汇集结果并与用于构建DNA文库的野生型细菌的图谱进行比较。5.4.13.通过粗滴包被对放线菌/浅青紫链霉菌文库进行代谢测定通过如节5.4.10中描述的用于大肠杆菌文库的方法来包被克隆。让滴变硬40分钟并接着转移至灭菌烧瓶中，除去氯化钙并用F10A培养基和底物(例如x-gal)代替。30℃下，将含有滴的烧瓶振荡1-5天，并测定由存在兰色菌落表示的阳性克隆。
将滴以一单层放在一个大的干净的盘中并用眼睛观察。提取阳性菌落并放在包含F10A 50mM柠檬酸钠pH 7.4的96孔主皿中以溶解滴，随后在30℃下生长2天。这些过夜的主96孔平皿被用作源平皿复制到一个或多个工作多孔平皿或Omni-Trays中。分别包被主96孔平皿并在-80℃下冷冻。随着可将阳性克隆送去用于特定的产物检测或送去用于另一轮预筛选或筛选。可通过如上面节5.4.9中描述的复制来进行进一步的筛选。5.4.14.通过与指示细胞的共包被进行的文库的预筛选通过平板接种适宜的稀释物并进行菌落计数来滴定文库克隆。将足量的文库细胞混合在1％藻酸中以产生约1个细胞/粗滴。此外，加入足量的指示细胞以产生约50个靶细胞/滴。如节5.4.10描述地制备粗滴，并在适合于文库和指示细胞的条件下进行培养。
通常，在30℃，在R5或F10A中培养浅青紫链霉菌文库粗滴，在30-37℃，在LB或B3中培养大肠杆菌粗滴。可调节培养基和温度以适应指示细胞的生理需要。为了肉眼观察文库细胞对指示细胞的作用，使下面的报道范围为了检测细胞死亡，加入中性红或刚果红；为了检测细胞存在，加入与指示细胞相关的底物(例如对于E.faecalis X-吡喃葡萄糖苷)；为了检测对启动子活化产生应答的β-半乳糖苷报道活性，在培养基中加入80mg/ml X-gal。在如节5.4.10中描述分离阳性粗滴之后，通过加入对文库细胞，但不对指示细胞具有选择性的抗生素来消除指示细胞。接着贮存文库细胞和/或按需要进一步测定。5.5.用于真核表达文库的方法本节描述了可通常用于制备真核供体生物的组合基因表达文库的方法。真核生物中组合嵌合途径基因表达文库的制备所涉及的步骤示于图5A-5F中。
特别好的表达真核宿主生物为稳定的，非丝状的，并且被足够地表征以致能被遗传操作用于基因表达的目的。对酵母和真菌，优选的种类为生长在30℃下粟酒裂殖糖酵母(C.Guthrie和G.R.Funk，酵母遗传学和分子生物学指南，酶学方法，Vol.194，Academic Press)。拟南芥(A.thaliana )和烟草(N.tabacum)细胞为优选的宿主(C.P.Lichtenstein和J.Draper，植物遗传工程，DNA克隆Vol.II，pp.67119)。5.5.1.密度梯度离心除去卫星基因组DNA真核生物基因组通常具有大量主要由核糖体编码区或无明显功能的序列组成的重复DNA。因此，在从真核供体生物制备基因组DNA时，可望从文库将这些非编码DNA序列除去。在克隆之前，存在DNA结合染料，Hoechst 33258的标准CsCl基因组DNA纯化方法可用于分离各种类型的基因组DNA。5.5.2.真核生物启动子和终止子片段的制备通过使用从已知的启动子和终止子的公开序列改变而来的序列特异性引物的PCR可制备启动子和终止子基因片段。启动子和终止子序列的选择可由采用的宿主生物来决定。例如如果采用粟酒裂殖糖酵母作为表达宿主，可采用天然启动子，例如nmt 1或ura 4和非天然启动子，例如来自病毒的那些，如CMV，SV40(Forsburg，1993核酸研究84321-4325)。或来自人的，例如绒毛膜促性腺素或促生长素抑制素(R.Toyama，H.Okayma 1990，FEBS Letters 268(1)pp.217-221)。也可采用类似于在可诱导四环素系统中发现的遗传改造的启动子(Faryar等1992，Curr Genet21345-349)。
可在商业可购得的PCR仪上使用标准的PCR反应条件和高可靠性和生产率的DNA聚合酶，例如，但局限于Pfu聚合酶(Stratagene)或Vent聚合酶(New England Biolabs)来进行PCR反应。因为并非没有引物组都使用相同的反应条件，所以可用现有技术中已知的方法用实验来确定准确的条件。PCR寡核苷酸引物可商业购得或通过现有技术中熟知的方法来合成。
PCR产生的启动子和终止子片段可能在5′末端包含限制位点。本文采用Bgl II，Xho I和BamHI以说明本发明的原理。只要该位点不在启动子或启动子基因序列中出现，可使用任何限制位点。
为了产生与cDNA或基因组DNA插入片段相容的克隆位点，用BglII和Xho I酶切启动子基因片段将产生在它们的5′末端具有Bgl II位点，在它们的3′末端具有Xho I位点的启动子基因片段。仅用Xho I切割的终止子将仅在它们的5′末端具有Xho I位点。5′和3′方向以沿启动子或终止子基因片段的期望的转录方向为基础。参见图5B。
利用大肠杆菌DNA聚合酶1大亚基(Klenow片段)和脱氧核苷酸亚组(在这里为dCTP和dTTP)的部分补平反应可被用来产生不能通过它们的Xho I末端进行自身连接的启动子和终止子片段。由于缺乏碱基互补性，启动子片段的Bgl II末端不受影响，并且终止子片段的BamHI末端没有暴露的5′末端为Klehow片段所利用。
用磷酸酶，例如小牛肠碱性磷酸酶处理将防止Bal II自身连接，并且在启动子和终止子片段中提供用于连接的相似的末端。通过在首链合成中掺入5′-甲基dCTP保护cDNA片段免于NotI的消化(Short，J.M1988，核酸研究167583-7600)。
在本发明另一个实施方案中，当DNA插入片段来自mRNA时，定向克隆可用来提高克隆的效率。可以对启动子和终止子片段为有义的方向将cDNA插入片段单向连接。这可通过在启动子和终止子片段上产生不同，不可连接的末端而实现。Bgl II，Xho I，Xma I和BamHI被用来说明本发明。可使用产生相容末端并可通过甲基化被保护的任何酶对。
在终止子片段的5′末端Xma I位点代替了Xho I位点，而启动子片段的制备没有变化。采用Xma I是由于通过插入Klenow片段和dCTP，它与Not I相容。这产生了具有两个碱基dCTP-dCTP 5′伸出物的终止子片段，它与适当制备的Not I消化的cDNA基因片段相容。参见图5A。5.5.3.DNA插入片段的制备用于真核文库的编码基因片段将来自两个主要的DNA资源，即基因组DNA(gDNA)或酶促来自信使RNA( mRNA)的互补DNA。制备gDNA或cDNA的方法非常相似，但不相同。
使用文献中可获得的标准方法，或尤其是制造商的说明从信使RNA和/或总RNA制备互补DNA。通过节5.3.1描述的异硫氰酸胍方法可同时完成总RNA和基因组DNA的分离，并且mRNA可通过寡-dT纤维素上的顺序亲和层析来分离。
首链cDNA的合成可使用在5′末端包含克隆位点，例如Not I位点的寡-dT DNA引物。在靠近5′末端包含内在Not I位点的随机序列的寡核苷酸也可用于随机引物的首链的合成。使用这一可供选择的引物避免了对于大mRNA的3′偏差。甲基化的脱氧核苷酸，例如5-甲基-dCTP可与聚合酶，例如Pfu一起使用以提供免于限制性消化的保护(Short等，Supra；G.L.Costa，1994，Strategies 78)。仅存在于初始引物中的未甲基化位点可加以酶切，因此确保了cDNA的定义的3′末端。甲基化的cDNA也可通过用甲基化作用处理来制备，但由于所有可获得的位点都将被甲基化并且从而对酶切产生抗性而将丧失克隆的方向性。
通过连接序列特定性连接物，例如修饰的具有5′磷酸的BamHI连接物来制备cDNA的定义的5′末端。当对它的互补的寡核苷酸退火时，连接物仅包含两个碱基的dGTP-dATP 5′突出端和平整5′磷酸末端。可将修饰的连接物连接到如标准方法中的用Pfu或T4 DNA聚合酶处理的cDNA上。在连接了修饰的BamHl连接物和用Not I消化cDNA后，可将连结的cDNA用Klenow片段和dGTP处理，产生用于连接到适宜制备的启动子和终止子片段的被定义的定向的cDNA基因插入片段。片段的方向是这样的，即cDNA的5′末端朝向启动子的3′末端，cDNA的3′末端朝向终止子的5′末端。参见图5C。
通过将全部基因DNA用通常切割的限制酶，例如Sau 3AI部分消化获得基因组DNA片段。该酶被广泛用于此目的，并且部分消化之后进行分级分离，虽然蔗糖梯度是一个非常标准的方法。可使用来自起始酶浓度变化的三种不同消化的片段库以使得基因组中的酶的敏感性不同。
在大小分级分离和纯化之后，可将片段用BamHI甲基化酶处理以保护任何内在的BamHl位点，接着用Klenow片段和dATP和dGTP处理。这产生在BamHI位点被内在甲基化的基因片段，并且仅具有dATPdGTP突出端。参见图5D。这些片段不能自身连接，并且仅能连接到适宜制备的启动子和终止子基因片段。5.5.4.插入片段DNA与启动子和终止子的连接16℃下，将适宜制备的cDNA，启动子和终止子片段连接过夜。在连接反应中可采用10启动子(P)1 cDNA∶10终止子(T)的比例。最佳比例可通过现有技术中已知的方法由实验确定。定向克隆方法仅提供一种连接产物，即正确定向的启动子-有义插入片段-终止子基因盒。
可在16℃下，用不同比例进行制备的基因组DNA，启动子和终止子基因片段的连接。由于没有一种连接成分可以自身连接，可通过实验确定最佳比例。估评形成的连接产物的一半直接可用，形成的1/4的产物不能进行连接循环，1/4的产物在生长链终止之前仅可被连接一次。
下面组合(P＝启动子，frag＝5′→ 3′基因组DNA片段，T＝终止子garf＝3′→ 5′基因组DNA片段)1.P-frag-T5.P-gaff-T2.T-frag-P6.T-garf-P3.P-frag-P7.P-gaff-P4.T-frag-T8.T-garf-T1，6和2，5组合代表所需的构建物，但由于插入片段的方向是随机的，可望50％的构建物对于任何给定的基因是正确的方向(1和6)。
可形成终止子/终止子基因盒，但不能参与任何后续的克隆步骤，因为由于在它们3′末端的被平端化未被切割的BamHI末端而缺乏暴露的5′末端。
由于Bgl II末端缺乏5′磷酸(第一轮)，启动子/启动子构建物将在后面仅与其它暴露的BamHI末端的连接中克隆。由于缺乏5′磷酸，后面与暴露的Bgl II末端的连接在新的基因盒中是稀少的。暴露的BamHI末端仅可在固有的组成链上而不可能在新引入的基因盒中产生。因此可望通过用另一条链上的附近的BamHI位点环化该启动子/启动子基因盒将终止链，这些环化作用是不可恢复的。如果该启动子/启动子片段成为连接效率的一个明显问题，那么在加入新基因盒之前固定生长链的中间激酶处理将允许启动子/启动子片段通过形成Bgl II/Bgl II连接产物延伸生长链。激酶处理促进固相中Bgl II/Bgl II和Bgl II/BamHI连接，它将环化参与的生长链。5.5.5.基因盒的系列连接形成多联体用与前面对原核DNA描述的类似方法进行均由启动子/终止子组合位于其旁侧的基因DNA或cDNA插入片段组成的基因盒的连接。这里主要的不同是该方法使用核酸内切酶BamHI产生用于后面克隆的暴露的3′限制位点。使用BamHI甲基化酶或5-甲基-dCTP确保插入DNA中的BamHI位点被保护。参见图5E。
5-10轮链连接之后，用BamHI将多联体生长链脱保护，并且被用Klenow片段和dATP和dGTP处理来制备用于与表达载体的连接。这使得生长链的所有末端不能互相连接，从而消除了任何环化作用和多联体链的损失。
可以5∶1摩尔比将载体DNA连接到多联体链上。也可采用其它比例。可将它们在16℃下进行8-12小时，或者在22℃下进行4小时。连接后，可洗涤颗粒并将其重新悬浮在内含子核酸酶限制缓冲液。按照生产说明书描述的进行消化。可使用任何内含子核酸酶。优选酶CeuI，因为它产生非回文3′突出端，该突出端可用于防止自身连接。参见图5F。5.5.6.环化和包含多联体构建物的载体的转化通过用1×连接酶缓冲液将CeuI消化混合物稀释100倍可促使从固相释放的多联体-载体分子进行分子内连接。可加入T4连接酶，并可在22℃将反应进行4-6小时，或16℃过夜。参见图5F。可通过微过滤或冷冻干燥来浓缩产生的构建物，并通过标准方法导入粟酒裂殖糖酵母菌株或大肠杆菌或浅青紫链霉菌菌株中。可使用任何方法，包括，但不局限于电穿孔和改进的磷酸钙转化方法。5.5.7.在酵母中表达的制备载体的制备和连接本节描述可通常用于制备使用酵母作为宿主生物的组合基因表达文库的方法。
为了在粟酒裂殖糖酵母制备文库，一个可能的，但当然不是唯一的载体为大肠杆菌/粟酒裂殖糖酵母穿梭载体pDblet(Brun等1995，基因，164173-177)。该载体具有拥有多个克隆位点和f1噬菌体复制起点的优点，它以适当的高拷贝数表达，并在大肠杆菌和粟酒裂殖糖酵母中非常稳定。
对于本发明，可修饰pDblet的多克隆位点(MCS)以适合已知序列的BstXI位点。参见图6B。这是由于用于从固相释放多联体链的内含子核酸酶产生定义序列的3′核苷酸突出端(3′GATT…)。在酶切后，具有序列CCACCTAACTGG的改造的BstXI位点产生适宜的CTAA-3′突出端。
为了修饰pDblet，可首先用SacI和NotI切割以除去没有正确序列的存在的BstXI位点。可将曾通过旋转层析或其它方法纯化的pDblet质粒与预合成的寡核苷酸混合，该寡核苷酸除含BstXI位点的正确序列外，还包含新的NcoI位点和SacI-和NotI-相容突出端。参见图6C。在连接和转化之后，通过用NcoI消化检测微量制备的克隆的正确性。通过BstXI和NcoI位点的存在来鉴定正确的克隆。用BstXI，接着用XhoI位点处理该修饰的pDblet产生包含5′XhoI位点和3′CTAA BstXI突出端的载体。参见图5E。可将该酶切载体用Klenow片段和dCTP和dTTP处理以使得它不能自身连接。该载体可被用来接受多联体链。5.5.8.植物表达文库本节描述可通常用于使用植物细胞作为供体和/或宿主生物制备组合基因表达文库的方法。
为了从植物制备供体DNA，采用下面一般步骤(1)在冷乙醚中预处理植物组织以促进植物破碎；(2)通过与砂，玻璃粒或氧化铝一起研磨将组织机械匀浆；(3)用筛过滤以除去细胞碎片；和(4)用5.1.2中描述的方法提取DNA。如第5.5.3描述，修饰所产生的纯化的DNA。通过如节5.5.3中描述的PCR制备CaMV 35S或胭脂碱合成酶片段，和胭脂碱合成酶终止子片段。将启动子和终止子片段与DNA片段相连，并如节5.5.5和5.5.6中描述的将其与植物DNA载体连接。
优选的植物DNA载体为Bin19或其变异体，它使T-DNA边缘和根瘤土壤杆菌中共同存在的Ti质粒的病毒区的反式作用功能来将供体遗传物质转移到植物宿主细胞的核基因组中(Bevan，1984，supra)。可使用包含多个克隆位点，例如可商业购得pBI 121或pBI 221(Clontech，Palo Alto)的修饰的Bin19载体。卡那霉素抗性和/或β-半乳糖苷酶活性被用作标记来监测转化和预筛选。
如Potrykus等1988在“植物分子生物学方法” Weissbach和Weissbach编Acadcmic Press，p.376-378中描述的从烟草植物叶中制备植物原生质体。通过Power等1988，在“植物分子生物学”Weissbach和Weissbach编Academic Press，p.388-391中描述的使用聚乙二醇的转化将表达构建物导入原生质体细胞中。通过抗生素抗性，例如抗卡那霉素选择转化的原生质体，并可如节5.4.10中描述的被包被用于预筛选。
6.实施例组合基因表达文库的构建和筛选下面的小节描述使用陆生微生物或海洋微生物的混合物作为供体生物制备和预筛选组合基因表达文库。文库使用浅青紫链霉菌，大肠杆菌和粟酒裂殖糖酵母作为宿主生物。结果表明一些文库细胞显示供体生物的代谢活性，表明可能感兴趣的供体代谢途径在宿主生物中是有作用的。此外，表明一个文库克隆包含编码与代谢途径中已知的酶具有序列同源性的海洋细菌蛋白质的DNA。6.1.材料和方法用于本方法的试剂通常是可商业购得的。例如基因Clean，Genome盒(Bio 101，Vista，CA)；限制酶，PCR试剂和缓冲液(Promega，Madison，WI；New England Biolabs；Stratagene，La Jolla，CA)TA克隆盒(Invitrogen，La Jolla，CA)；细菌培养基(Difco，Inc)；Mira翻译抑制蛋白(Hawaiian海洋进口公司)；pBSK质粒，XLl-MR细胞，SuperCos 1粘粒，Gigapack包装提取物(Stratagene，La Jolla，CA)；QiagenQIAprep质粒纯化盒(Qiagen，Inc，Chaworth，CA)；亲和素结合磁多孔玻璃(MPG)珠(CPG，Inc.，New Jersey)；平皿，96和384孔平板，Omni-Trays(Nunc)，96和384针头复制仪和模板(V&P Scientific，San Diego，CA)；氨苄青霉素(IBI，Inc，CA)；绿色荧光蛋白和GFP cDNA(Clontech，Inc)；寡核苷酸(Genset，La Jolla，CA)；别处没有指明的细菌种类和DNA序列(美国典型培养物保藏中心，Rockville，MD)；7-乙氧基-十七烷基香豆素，BCECF-AM(分子探针，Oregon)；3-甲基苯甲酸盐，3-氯甲苯，间甲苯甲酸盐，四环素，氯霉素，乙酰氨基酚，砷，锑，顺-顺粘康酸盐，以及除非另有说明的其它化学试剂(Sigma)；和Dynabeads，MPC-M(Dynal，Inc.，Lake Success，NY)。6.1.1.培养基的制备通常用在培养基和溶液中的纯化水(ddH2O)通过软化，反渗透和去离子作用来纯化。太平洋海水(海水)从Scripps Institute ofOceanography(La Jolla，CA)获得并在使用前过滤。通过加入盐(45.2mm NaF，48.8mm SrCl2，0.324mM H3BO3，0.563mMKBr，6.25mM KCl，4.99mM CaCl2，0.7mM Na2SO4，16.4mMMgCl2，268mM NaCl，45.8mM Na2SiO3，1.10mM EDTA，1.58mM NaHCO3)和海洋微量元素(0.01％Mira Trip)从ddH2O制备合成海水(SSW)。
用1％胰蛋白酶解胨，0.5％酵母提取液，1％NaCl从ddH2O制备LB培养基。用0.25％胨，0.15％酵母提取液，0.6％(vol/vol)乙二醇从75％海水或SSW制备W2-B1。
从含有2.5％可溶性土豆淀粉，0.2％葡萄糖，0.5％酵母提取液，0.5％胨，0.5％Distiller溶液(Nutrition Products Co.Louisville，KY)，0.3％碳酸钙，pH被调节至7的ddH2O制备F10A。6.2.通过平板复制和粗滴包被预筛选放线菌/浅青紫链霉菌组合天然途径表达文库被鉴定为种#501-534的34种放线菌种类，被用作供体生物。分别将微生物培养在F10A培养基，并如节5.3.1中描述的提取和纯化基因组DNA。
得到约100μg基因组DNA/种，并如节5.4.2中描述的将它们混合在一起用于Sau 3A的部分限制性消化。将基因组DNA片段通过蔗糖梯度密心进行大小分级分离，收集含有20-40kb片段的级分，并用Klenow片段部分补平以与下面类似制备的载体相容(Korch 1987，核酸研究153199 3220；Loftus等1992，生物技术12172-175)。在多批中将0.5-3.0μg 收集的片段连接到0.5-3.0μg用BamHI或XhoI制备的pIJ 922和pIJ 903中(Hopwood 1985，supra)。将被连接的表达构建物转化到宿主生物浅青紫链霉菌菌株TK64中，该菌株通过用溶菌酶去除细胞壁而变得适合(Hopwood 1985，supra)。产生约11,000个单独的克隆，扩增并以菌丝体形式贮存在20％乙二醇中，以及以孢子悬浮液形式贮存在-70℃下50％乙二醇中。
为了制备用于筛选各个克隆的文库，将转化的TK64宿主细胞铺开装有F10A琼脂的150mm平皿中。铺开后，30℃让平皿保温21小时。用5μg/ml，1ml/平板的硫链丝菌肽覆盖平皿来进行选择。48-72小时后，用灭菌牙签挑取菌落并一孔一个地转移到96孔平皿中。各孔含有F10A培养基。在30℃，让接种的主皿放置1-4天。将过夜主96-孔平皿用作源平皿复制到一个或多个工作96孔平板或Omni-Trays中。接着分别包被主96孔平皿并在-80℃冷冻。用在每次使用之前用燃烧灭菌的96-针头复制仪进行复制。
将工作96孔平皿用作源平皿将文库复制到一系列分化和/或选择培养基和指示平板中。选择性抗生素包括红霉素，新生霉素和新霉素。分化培养基包括含有底物X-吡喃葡糖苷和X-葡糖酸的F10A和R5培养基。指示平皿包括生长在F10A上，接着用肠球菌(E.faecalis)，枯草芽孢杆菌(B.subtilis)或SOS Chromotest(具有X-gal)的指示菌苔覆盖的文库克隆。汇编结果并与链霉菌宿主TK64的图谱进行比较。
还通过粗滴包被预筛选文库克隆。对于每次预筛选，用如节5.4.13中描述的方法包被文库的50,000个扩增的克隆。6.3.通过粗滴包被预筛选放线菌/大肠杆菌组合嵌合途径表达文库将如节6.2描述的从34个放线菌种(鉴定为种501-534)获得的基因DNA用于在浅青紫链霉菌中制备组合嵌合途径基因表达文库。收集包含Sau 3A消化的基因组DNA的2-7kbp的片段。
如节5.5.3中描述的将基因组DNA片段的等分试样连接到不同的启动子上以分别形成基因盒。通过使用用于每次循环的不同库的基因盒的8次循环的连接和脱保护形成多联体，这样产生的多联体各自具有8个包含与基因组DNA片段相连的8个不同的启动子的基因盒。
将10μg多联体环化并在BamHI位点与0.5μg SuperCos 1载体连接以形成表达构建物，根据生产商的说明(Stratagene)在体外包装该构建物以用于大肠杆菌宿主细胞的感染。获得约1,000,000个单个克隆，扩增并收集形成扩增的文库。将文库贮存于-70℃。如节5.4.10中描述的包被扩增的细胞并如节5.4.14中描述的进行预筛选。6.4.通过粗滴包被预筛选真菌/粟酒裂殖糖酵母组合嵌合途径表达文库使用从ATCC获得的下面真菌供体生物制备两个组合嵌合途径表达文库木霉(Trichoderma reesei)，尖孢镰孢，娄格法尔特氏青霉，寡孢根霉，粗糙链孢霉，布拉氏须霉，烟曲霉，黄曲霉，Emericellaheterothallica，毛壳霉(C.gracile)，点青霉，产黄青霉。
以中等转速将各种分别在500ml土豆葡萄糖琼脂(PDA；Difco)麦芽提取液琼脂(MEA；Difco)中培养48-72小时，将1×104-1×106孢子/ml的孢子接种物放到1升培养烧瓶中的500ml土豆提取液或麦芽提取液肉汤中，并在22℃，225转数/分下生长48-72小时。
真空下通过用Miracloth(Calbiochern)过滤收集培养物。将收集到的菌丝体固体用2升ddH2O洗涤，并且在冷冻干燥之前空气干燥10分钟。如节5.3.1和5.3.2中描述的，从菌丝体提取和纯化真菌基因组DNA和mRNA。将部分收集的菌丝体冷冻干燥并在-70℃下贮存。
如节5.4.2所描述的制备真菌基因组DNA片段。根据标准方法将真菌mRNA转化为cDNA(Sambrook等1989，Watson CJ和JacksonJF(1985)DNA克隆实践方法79-88，IRL Press)。从各种中收集重量相等的DNA片段以产生基因组DNA库和cDNA库。
将包含约5-10μg DNA的各库独立地用来装配重组嵌合途径表达文库。如节5.5.2中描述的制备下面粟酒裂殖糖酵母相容的启动子和终止子CMV速发/早期，SV40早期，RSV，HSV胸苷激酶，CaMV，nmtI，adh1和uva4启动子。如节5.5.4中描述的将启动子和终止子片段与cDNA和基因组DNA库混合。如节5.5.5中描述的将平均大小为5kb的各基因盒多联体化。将各自包含8个基因盒的最终的多联体环化并插入载体修饰的pDblet中(Brun等，1995，基因，Vol.164 pp.173-177)。借助于Gietz和Woody的乙酸锂法将表达构建物转化到粟酒裂殖糖酵母细胞中(FD Gietz和RA Woody，酵母的分子遗传学实践方法，第8章，pp 121-134)。在选择Ura4标记的存在时，获得并扩增110,000个粟酒裂殖糖酵母的克隆。收集克隆形成准备用预筛选的被扩增文库。进行下面的预筛选酶底物试验，抗微生物活性，抗生素抗性。6.5.通过平板复制预筛选海洋革兰氏( )菌/大肠杆菌文库从Bahamas岛附近收集的海水中获得的海洋细菌由Harbor BranchOceanographic Institute提供。在制备DNA文库以确定重复性并有利用于确定在完成的文库中进行预筛选的顺序之前，检测每种野生类型的革兰氏阴性着色的海洋细菌种类在亲本种类的海洋革兰氏阴性菌/大肠杆菌文库中进行下面分析，结果如下分析 37种中的阳性种类Chromazurol S(CAS) 27酿脓链球菌 0肠球菌(E.faecalis) 3奇异变形菌 1橙色八叠球菌 10金黄色葡萄球菌 6淀粉消化液 17在这些分析中，下面步骤被选择在大肠杆菌；CAS；金黄色葡萄球菌；橙色八叠球菌；淀粉消化液中的组合基因表达文库的细胞中进行。
简而言之，将40种亲本种类的每一种接种到5ml B3培养基中并在30℃，以300转/分的转速在Falcon 2059管中培养过夜。沉淀过夜的培养物并用标准方法提取全部基因组DNA。通过在琼脂糖凝胶中显象定量基因组DNA，将5μg 40种的每一种放到总共为200μg的库。如节5.1.4中描述的在大肠杆菌中装配组合天然连径表达文库。根据SuperCos 1生产商的说明(Stratagene)将DNA部分消化，连接到SuperCos 1中并包装在λ噬菌体，以导入大肠杆菌。产生5×106单个克隆，通过标准方法扩增到7×108/ml cfu。-70℃下，将扩增的贮液贮存在15％乙二醇中以备后面使用。
为了制备用于筛选各克隆的文库，将扩增的文库细胞铺在含有50mlLB，100mg/ml氨苄青霉素和50mg/ml卡那霉素的150mm平皿中。室温下在黑暗中将平皿预先干燥24小时，将7×108/ml cfu贮存用LB稀释至500cfu/ml。将1ml涂布各个150mm平皿中，涂布后，37℃下，让平皿保温过夜。用灭菌的牙签挑取产生的菌落并一个孔一个地转移到384孔平皿中。挑选6400个菌落并堆成堆。各孔含有75μl LB，50μg/ml氨苄青霉素，7％乙二醇。不接种外面的行(总共80孔)，但类似地装有培养基以在后面保温和冷冻干燥期间提供一个蒸发屏障。37℃，将这些接种的主皿不振荡放置16小时。过夜的主384孔平皿被用作源平板复制到一个或多个工作多孔平皿或Omn1-Trays中。接着分别包被主384-孔平皿并在-80℃下冷冻。用多针头复制仪进行复制，在每次使用之前和之后，在燃烧之前顺序地将384针头复制仪浸入漂白液中20秒，水中30秒，接着在乙醇中5秒。
工作多孔平皿或Omni-Trays被用作源平皿以将DNA文库复制到一系列分化和/或选择培养基中(例如铁载体检测培养基(CAS)或抗微生物菌苔)。汇编结果并与用于构建DNA文库的野生型海洋细菌的图谱比较。
分离6个对淀粉消化活性阳性的克隆。检测这些克隆抑制金黄色葡萄球菌或橙色八叠球菌的能力，发现一个克隆抑制橙色八叠球菌的生长。将该克隆进行进一步分析，包括DNA序列分析，并且发现其包含编码与聚酮化合物合成途径中的那些同源的蛋白质的DNA序列。图10表现来自克隆CXC-AMN 20的DNA序列的预测的氨基酸序列与天蓝色链霉菌的放线紫素脱水酶基因的一致性。
通过用有机溶剂提取对来自该克隆的活性成分进行进一步分析并根据抗微生物测定进行纯化。
通过复合PCR对该克隆含有的DNA序列进行进一步测定以确定同种亲本种类。根据克隆的序列选择和合成PCR引物。高度保守的核糖体RNA引物序列在PCR中被用作阳性对照物。该阳性对照物产生约2kb的片段。从该克隆或其同种亲本种类产生的扩增子小于600bp。起初，通过使用亲本种类的一组四个库的基因组DNA的标准方法进行复合PCR反应。来自库1-3的基因组DNA在扩增时产生扩增子。参见图11。用各亲本种类的基因组DNA重复复合PCR反应。图12表明在PCR反应中来自库1种类#6，库2种类#18和库3种类#31的基因组DNA为阳性。这表明被鉴定的DNA序列可能来自这三种海洋细菌的任何种类。
因此，结果表明组合基因表达文库包含带有来自海洋细菌，编码感兴趣代谢途径的遗传物质的克隆。而且，还表明文库中的这些克隆可被鉴定并通过预筛选分离。6.6.通过粗滴预筛选海洋革兰氏(-)菌/大肠杆菌文库通过称量藻酸钠(Protanol LF 20/60，Pronova Biopolymer，Drammer，Norway)并使用压力混合器以2000转/分以1％的浓度将其溶解于100ml无菌水中来包被30,000个克隆。加入1ml含有30,000个细胞的文库悬浮液以使每滴中埋入1-5个克隆。让混合物静置30分钟放气。接着让混合物从25号针中挤出。将这些流体滴至装有135mM氯化钙的0.5L轻轻搅拌的烧杯中。让滴变硬10分钟并随后转移到灭菌的烧瓶中，并除去氯化钙，用LB/Amp培养基和80ug/ml底物X-氨基葡糖苷代替。其它底物为X-乙酸盐，X-吡喃葡糖苷，X-gal和与聚酮化合物途径相关的特定的常规底物。30℃下，将含滴的烧瓶振荡过夜并且第二天早上检测由兰色菌落的出现所代表的阳性克隆。还如节5.414中描述的将克隆与指示细胞一起其包被。指示细胞包括金黄色葡萄球菌，橙色八叠球菌。
将滴以单层放置在一大的干净盘并用眼睛观察。回收一个X-氨基葡糖苷阳性菌落，重新悬浮于15％乙二醇中并在-70℃贮存。回收其它阳性菌落，并放在含有LB/Amp和50mM柠檬酸钠pH 7.4的96孔主皿中以溶解基质，并在37℃下让其生长过夜。将这些过夜的主96孔平皿用作源平皿复制到一个或多个工作多孔平皿或Omni-Trays中。接着分别包被主96孔平皿并-80℃冷冻，将阳性克隆送去对产物进行特定检测或送去进行另一轮预筛选或筛选。进一步筛选通过使用多针头复制仪进行复制来完成。
由此公开了本发明的示范性实施方案，本领域技术人员应认识到公开的仅是示范性的，可在本发明范围内进行各种其它选择，改进和修改。因此，本发明不受本文举例的具体实施方案限制，但仅受下面权利要求书的限制。
权利要求
1.一种组合基因表达文库，包括表达构建物库，每个表达构建物包含来自多种供体生物的cDNA或基因组DNA片段，其中cDNA或基因组DNA片段可操作性地与一个或多个引起由适宜宿主生物中的cDNA或基因组DNA片段编码的基因表达的调节区相联。
2.一种组合嵌合途径基因表达文库，包括表达构建物库，每个表达构建物包含来自一种或多种供体生物的随机多联体化的cDNA或基因组DNA片段，其中多联体cDNA或基因组DNA片段可操作性地与一个或多个引起由适宜宿主生物中的多联体cDNA或基因组DNA片段编码的基因表达的调节区相联。
3.一种偏倚性的组合基因表达文库，包括表达构建物库，每个表达构建物包含cDNA或基因组DNA片段，它们的一些由于特定性质被从多种供体生物中预选择，其中cDNA或基因组DNA可操作性地与一个或多个引起由适宜宿主生物中的cDNA或基因组DNA片段编码的基因表达的调节区相联。
4.权利要求1，2或3的基因表达文库，其中表达构建物包括质粒载体，噬菌体，病毒载体，粘粒载体或人工染色体。
5.权利要求4的基因表达文库，其中载体为能在不同宿主细胞种类或菌株中复制的穿梭载体
6.权利要求1，2或3的基因表达文库，其中cDNA或基因组DNA片段来自细菌，真菌，藻类，地衣，植物，原生动物，后生动物，腔肠动物，昆虫，软体动物，海绵，蠕虫，两栖动物，爬行动物，被囊动物，鸟或哺乳动物。
7.权利要求1，2或3的基因表达文库，其中供体生物包括陆生微生物或海洋微生物的混合物，或陆生微生物和海洋微生物的混合物。
8.权利要求1，2或3的基因表达文库，其中cDNA或基因组DNA片段来自环境样品。
9.权利要求7的基因表达文库，其中cDNA或基因组DNA片段包括一个或多个供体生物的操纵子或其一部分。
10.权利要求9的基因表达文库，其中操纵子或其一部分编码完整或部分代谢途径。
11.权利要求1，2或3的基因表达文库，其中各表达构建物包含在宿主细胞中。
12.权利要求11的基因表达文库，其中宿主细胞通过导入，诱导或过量产生活性外排系统来进行修饰。
13.权利要求11的基因表达文库，其中宿主细胞被通过导入，诱导或过量产生感兴趣的已知的代谢途径或其一部分来进行修饰。
14.权利要求11的基因表达文库，其中宿主细胞为细菌，真菌，植物细胞，昆虫细胞或动物细胞。
15.权利要求14的基因表达文库，其中宿主细胞为大肠杆菌，枯草芽孢杆菌，浅青紫链霉菌，天蓝色链霉菌，啤酒糖酵母，粟酒裂殖糖酵母，Spodoptera frugiperda，构巢曲霉，Arabidopsis thaliana，烟草，COS细胞，293细胞，VERO细胞，NIH/3T3细胞或CHO细胞。
16.权利要求1的基因表达文库，其中宿主细胞进一步包含被剪接的(tailored)适合于鉴定文库中表达所需代谢途径或化合物的克隆的报道体系(regimen)。
17.权利要求16的基因表达文库，其中报道体系包括编码可操作性与可被宿主细胞表达的所需代谢途径或化合物诱导或调节的调节区相联的报道基因的DNA。
18.权利要求11的基因表达文库，其中宿主细胞位于含有适合于鉴定文库中的表达所需代谢途径或化合物的克隆的剪接的报道体系的基质中。
19.一种制备组合基因表达文库的方法，包括将DNA载体与从多种供体生物获得的cDNA或基因组DNA片段连接，产生表达构建物文库，其中cDNA或基因组DNA片段中包含的基因可操作性与引起基因在适宜宿主细胞中表达的它们的天然或异源调节区相联。
20.一种制备嵌合途径基因表达文库的方法，包括将从一种或多种供体生物获得的cDNA或基因组DNA片段随机地多联体化，并且将多联体化的DNA片段与DNA载体连接以产生表达构建物文库，其中包含在cDNA或基因组DNA片段中的基因可操作性地与引起基因在适宜宿主细胞中表达的它们天然或异源调节区相联。
21.一种制备偏倚性组合基因表达文库的方法，包括将DNA载体与从一种或多种供体生物获得的cDNA或基因组DNA片段连接，其中一些由于特定性质被选择产生表达构建物文库，其中包含在cDNA或基因组DNA片段中的基因可操作性地与引起基因在适宜宿主细胞中表达的它们的天然或异源调节区相联。
22.权利要求19，20或21的方法，其中DNA载体为质粒载体，噬菌体，病毒载体，粘粒载体或人工染色体。
23.权利要求22的方法，其中载体为能在不同宿主细胞种类或菌株中复制的穿梭载体。
24.权利要求19，20或21的方法，其中cDNA或基因组DNA片段来自细菌，真菌，藻类，地衣，植物，原生动物，后生动物，腔肠动物，昆虫，软体动物，海绵，蠕虫，两栖动物，爬行动物，被囊动物，鸟类或哺乳动物。
25.权利要求19，20或21的方法，其中供体生物包括陆生微生物或海洋微生物混合物，或陆生微生物和海洋微生物的混合物。
26.权利要求19，20或21的方法，其中cDNA或基因组DNA片段来自环境样品。
27.权利要求25的方法，其中cDNA或基因组DNA片段至少包括供体微生物的操纵子或其一部分。
28.权利要求27的方法，其中操纵子编码完整或部分代谢途径。
29.权利要求19，20或21的方法，进一步包括将表达构建物文库导入宿主细胞。
30.权利要求29的方法，其中宿主细胞为细菌，真菌，植物细胞，昆虫细胞或动物细胞。
31.权利要求30的方法，其中宿主细胞为大肠杆菌，枯草芽孢杆菌，浅青紫链霉菌，天蓝色链霉菌，啤酒糖酵母，粟酒裂殖糖酵母，Spodopterafrugiperda，构巢曲霉，Arabidopsis thaliana，烟草，COS细胞，293细胞，VERO细胞，NIH/3T3细胞或CHO细胞。
32.权利要求29的方法，其中宿主细胞进一步包含剪接的适合于鉴定文库中的表达所需代谢途径或化合物的克隆的报道体系。
33.权利要求32的方法，其中报道体系包括编码可操作性地与可通过宿主细胞表达的所需代谢途径或化合物诱导或调节的调节区相联的报道基因的DNA。
34.权利要求29的方法，其中宿主细胞被通过导入、诱导或过度产生活性排出系统来修饰。
35.权利要求29的方法，其中宿主细胞被通过导入，诱导或过量产生感兴趣的已知代谢途径或其一部分来进行修饰。
36.一种鉴定基因表达文库中的感兴趣化合物的方法，包括(a)培养权利要求11的基因表达文库；和(b)筛选产生化合物的克隆的基因表达文库。
37.一种筛选感兴趣化合物的基因表达文库的方法，包括(a)培养权利要求16的基因表达文库；和(b)检测报道体系产生的信号；从而鉴定产生化合物的克隆。
38.一种筛选感兴趣化合物的基因表达文库的方法，包括(a)培养权利要求18的基因表达文库；和(b)检测报道体系产生的信号；从而鉴定产生化合物的克隆。
39.一种制备感兴趣化合物的方法，包括(a)培养权利要求36鉴定的克隆；以及(b)从鉴定的克隆的培养物中回收化合物。
40.一种制备感兴趣化合物的方法，包括(a)培养权利要求37鉴定的克隆；以及(b)从鉴定的克隆的培养物中回收化合物。
41.一种制备感兴趣化合物的方法，包括(a)培养权利要求38鉴定的克隆；以及(b)从鉴定的克隆的培养物中回收化合物。
全文摘要
本发明涉及用于产生和筛选分子多样性的新的药物发现系统。该系统提供了混合和克隆来自组合基因表达文库中的多种生物的遗传物质,产生新的代谢途径或新类型的化合物的方法。该系统还包括预筛选或鉴定包含能产生新途径和化合物的文库的宿主生物的方法。该宿主生物可用于对特定疾病的药物筛选,以及感兴趣化合物的商业生产中。本发明的方法还可用于保存已知或为有希望的药物资源的生物的基因组。
文档编号C12Q1/68GK1189191SQ96194988
公开日1998年7月29日 申请日期1996年4月24日 优先权日1996年4月24日
发明者K·A·汤普森, L·M·霍斯特尔, T·C·佩特森 申请人:克罗马克索姆公司