专利名称：Fgfr3的特异性配体fgf9的制作方法
技术领域：
本发明涉及成纤维细胞生长因子9(FGF9)，一种成纤维细胞生长因子受体3(FGFR3)的新的高亲和性配体、用所述配体检测FGFR3的方法和用于调节FGFR3活性的包含FGF9，它的拮抗剂或FGF9结合剂的药学组合物。
成纤维细胞生长因子(FGF)包含至少有9种涉及各种生物过程包括形态发生、血管生成和组织重建的多功能多肽的家族。它们可刺激间充质至上皮和神经外胚层起源细胞的繁殖。FGF在结构上相似，但在其靶特异性和空间及时间的表达格局上不同。已对编码跨膜蛋白质酪氨酸激酶的四种FGF受体(FGFR)基因在哺乳动物中进行了克隆和鉴定，并且有在鸟类、非洲爪蟾属和果蝇属中它们的同系物的描述(Givol和Yayon，FASEB J.，633623369(1992))。然而功能受体蛋白质的实际数量更多，因为不同的RNA剪接和多个聚腺苷酸化位点将产生大量细胞结合的或分泌形式的变异体。除了这些高亲和性受体外，FGF可与低亲和力、高数量结合位点的硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(HSPG)牢固结合。这些硫酸乙酰肝素调节FGF-受体结合和生物活性，并作为FGF、FGFR和适当的HSPG的功能性三联复合物形成时的一个专性内在组分。
由于配体和受体的变异体很多，关于FGF功能的一个主要问题是它们的配体-受体特异性。FGFR1和FGFR2与酸性FGF/FGF1及碱性FGF/FGF2的结合有相似亲和力(Dionne等人，EMBO J.，92685-2692(1990))。实际上所有如此测试的FGFR与FGF1和FGF4(hst/kfgf)的结合有中度至高度亲和力，这证明FGF系统有明显的丰余性。与FGFR1和2相反，发现FGFR3只与FGF1和FGF4以中度亲和力结合(Orntiz和Leder，J.Biol.Chem.，26716305-16311(1992)；Chellaiah等人，J.Biol.Chem.，269(15)11620-11622(1994))。现在还没有鉴定出这个受体的任一剪接形式的特异性配体。
最近，FGFR3的突变导致了软骨发育不全这种最常见的遗传侏儒症。经对软骨发育不全患者的FGFR3测序，发现在受体的跨膜区域有突变。
出于研究这种疾病和开发其可能的治疗药物的要求，涉及软骨发育不全的受体FGFR3的研究就需要有一种针对这种受体的、基本上不与其它三种FGFR结合的特异性配体。
通过同源性研究发现一种从人神经胶质瘤细胞系的培养物上清液纯化获得的肝素结合的神经胶质激活因子，它是FGF家族中的第九种，因此称为FGF9。发现人的FGF9可编码208个氨基酸的蛋白质，它有独特的刺激神经胶质细胞、PC-12细胞和BALB/C 3T3成纤维细胞增殖的生物活性光谱，但对内皮细胞无促细胞分裂作用(Miyamote等人，Mol.Cell.Biol.，13(7)4251-4259(1993)；Naro等人，J.Bio1.Chem.，26716305-16311(1993))。
发明概要根据令人惊奇的发现，本发明涉及成纤维细胞生长因子受体3(FGFR3)的高亲和性(kD0.25nM)配体成纤维细胞生长因子9(FGF9)，它不与FGFR1或FGFR4结合且与FGFR2仅以极低的亲和力结合。
因此，本发明首先提供FGFR3特异性配体成纤维细胞生长因子9(FGF9)。这个特异性FGFR3配体用于检测和药物治疗。
这种新的FGFR3的特异性配体可用于检测样品或组织中的FGFR3，方法包括(i)使FGF9与样品或组织接触，使得形成受体-配体对，和(ii)检测FGFR3-FGF9对的存在，阳性的检测结果表示样品或组织中有FGFR3存在。
样品可以是体液如血液样品，其中有可溶的FGFR3，组织可以是从患者处例如通过软骨活检获得的组织，或者，也可以是个体的体内组织，在这种情况下检测在体内进行。
检测的进行是例如用合适的可检测标记标记FGF9，然后测定任何标记是否结合到样品中的蛋白质上或结合到组织中的细胞表面上来测定FGFR3的存在。另一种检测方法可以通过用标记过的针对FGF9的抗体来进行，它可识别与FGFR3结合的FGF9。
根据本发明，发现FGF9是肝素依赖的FGFR3配体。因此，根据用FGF9配体来检测FGFR3的方法，肝素最好存在于检测基质中。
根据本发明，还发现FGF9不仅与FGFR3特异性结合，也可特异性激活该受体而不激活FGFR1和FGFR4受体，而且，如果选择合适的浓度，它不会显著地激活FGFR2。这一发现使得可以制备药物组合物，它包含药学上可接受的载体和作为活性组分的有效治疗量的FGF9。这种药物组合物可用于刺激FGFR3的活性。
这一发现也使得可以制备药物组合物，它包括药学上可接受的载体和作为活性组分的FGF9拮抗剂，或一种FGF9结合剂如针对FGF9的一种抗体。
包含FGF9拮抗剂的药物组合物可直接弱化FGFR3的活性，包含FGF9结合剂如针对FGF9的抗体的药物组合物可中和循环的天然FGF9，因此间接弱化了FGFR3的活性。
普通的软骨和骨生长及软骨和骨损伤的修复需要FGFR3活性正调节和负调节间有一个特定和准确的平衡。不是理论上希望结合，假定活性FGFR3在软骨-骨分化的最初阶段是必需的，在分化后，是软骨-骨修复所需的。因此，可用包含刺激FGFR3活性的活性组分FGF9的药物组合物，通过如对损伤部位给药来促进软骨和骨修复。而且，FGFR3通常存在于间充质干细胞中，在其分化后消失。施用FGF9可稳定FGFR3，从而延长了它在分化前的有活性的时间。FGF9对于携带FGFR3的细胞也有趋化作用，并可促进这种携带FGFR3细胞(典型的为间充质干细胞)迁移至希望的部位，例如通过注射FGF9至柱的生长盘顶部。
根据这个理论，在最初的骨和软骨细胞分化阶段后的FGFR3过度激活将导致生长停止，这可能就导致软骨发育不全。因此，包含可弱化FGFR3活性的活性组分FGF9的拮抗剂的药物组合物，或包含中和天然循环的FGF9的FGF9结合剂(如针对FGF9的抗体)的药物组合物可用于已分化组织中FGFR3受体过度活化的情况(这种情况形成骨和软骨生长停止)，这种骨和软骨生长停止将导致软骨发育不全侏儒症，或其它骨和软骨生长畸形，例如多发性遗传外生骨疣，单发性遗传外生骨疣、趾外翻畸形、滑液软骨瘤和内软骨瘤。
上述疾病可用包含FGF9的拮抗剂或可中和天然循环的FGF9的FGF9结合剂的药物组合物来治疗，其中两种组分均可弱化FGFR3的活性。
本发明也涉及一种新的重组鼠FGF9，和一种新的重组鸡FGF9以及编码这些新的重组蛋白的DNA序列。
本发明还涉及一种包含FGF9序列的用强启动子(如CMV或SV40)或软骨/骨启动子(如胶原2型启动子)控制表达的表达载体。这种表达载体可形成一个过量表达FGF9的转基因哺乳动物，导致FGFR3受体的过度激活从而引起生长停止。这种动物可用作生长停止性疾病如遗传性软骨发育不全的模型。
下面发明将参照一些无限制性的附图和实施例来描述。
附图详述
图1-鼠FGF9的核苷酸和氨基酸序列，其中显示了FGF9pET-3C和推导的氨基酸序列。
图2-鸡FGF9的核苷酸和氨基酸序列，其中显示了FGF9pET-3C和推导的氨基酸序列。
图3A、3B、3C显示了鼠，大鼠和人FGF9的氨基酸和核苷酸序列的比较。
图4-FGF9的纯化。部分纯化的FGF9与肝素琼脂糖凝胶结合并用0.2-2M盐梯度洗脱，蛋白质含量用分光光度计(A)测定。为鉴别洗脱组分中的FCF9，将每一组分10ml用15％SDS PAGE分离，转移至硝基纤维素上，用特异性抗体(抗SP32)(B)进行免疫印迹。组分的纯度通过在15％SDS PAGE(C)中分离的每一个组分中加入5ml银染色剂来测定。
图5-FGF9的结合特异性。将纯化的FGF9固定在肝素琼脂糖凝胶珠上，测定FGF9与碱性磷酸酶连接的各种FGFR的可溶胞外区域的结合能力(A)。FGFR的量根据碱性磷酸酶活性(B)来估计。FGFR1、2、7-IIIb、3、3-IIIb和4碱性磷酸酶融合蛋白的等量的可溶胞外区域可用抗碱性磷酸酶抗体来免疫沉淀。在有或没有0.5μg/ml肝素及百倍过量的未标记的FGF9(过量未标记)时用所述的材料和方法使125I-FGF9结合和交联。
图6-与可溶性FGFR2和FGFR3结合的FGF9的分析。在所述的材料和方法下，使浓度增加的125I-FGF9与吸附在maxisorb板盘上的FGFR2(A)和FGFR3(B)的可溶胞外区域结合。结合结果用Scatchard分析法(插入小图)分析。
图7-FGF9与表达FGFR3的CHO细胞的肝素依赖性交联。如所述40℃时在有或没有1mg/ml肝素及100倍过量的未标记过FGF9(过量未标记)下，5ng/ml125I-FGF9与单层的FGFR3转染的K1和A745 CHO细胞培育。如用所述材料和方法进行交联和电泳分离。
图8-肝素和肝素组分依赖的FGF9诱导的DNA合成。使单层FGFR3转染的CHO-A745细胞处于血清饥饿状态，并和10ng/ml FGF9、指定量的肝素(A)或2mg/ml指定数目单糖单元的肝素组分(B)进行培育。
图9-由胶原2型启动子控制的FGF9的质粒。
发明详述I.材料和方法(a)细胞用F12培养基附加10％胎牛血清来培育Dr.J.D.Esko(生物化学系，伯明翰大学，阿拉巴马州)提供的野生型(KI)和CHO突变型细胞系A745。用有新霉素抗性的pZL质粒中的10μgFGFR3转染CHO细胞是通过用Gene Pulcer(Bio-Rad)在960微法，250伏下进行电穿孔来实现的。用G418(0.5mg/ml)来选择单个稳定的克隆。
(b)抗体抗FGF9多克隆抗体是通过对新西兰白兔注射并在两个附加的剂量后收集血清来产生。抗FGF9抗体用MBS针对与KLH(匙孔血蓝蛋白)偶连的两个肽段(SP31Cys-Ser-Asn-Leu-Tyr-Lys-His-Val-Gln-Thr-Gly-Arg-Arg-Tyr，SP32Asp-His-Leu-Lys-Gly-Ile-Leu-Arg-Arg-Arg-Gln-Leu-Tyr-Cys)来制备。获得的血清在蛋白质A琼脂糖凝胶(Repligen)上进一步纯化来获得IgG组分。
(c)FGF9的放射性标记重组鼠FGF9用Na125I(0.5mCi)通过氯胺T方法作标记，并在肝素琼脂糖凝胶柱上与游离的碘分离。比活范围是0.5-2×105cpm/ng。
实施例1FGF9的鼠同系物的克隆和表达从12.5天的鼠胚胎中抽提出全部RNA用于基于FGF9克隆的聚合酶链反应(PCR)。用人FGF9的特异性引物(正向GGGAATTCCATATGGCTCCCTTAGGTGAAG；反向CGGGATCCTCAACTTTGGCTTAGAATATCC)及鼠RNA模板进行PCR。(35个循环，每个循环在94℃变性1分钟，在56℃退火2分钟，72℃延伸3分钟)。获得单一的预计大小为630bp的DNA产物，其直接用于亚克隆人pET-3C细菌表达载体(Novagene)。
序列分析揭示预计为672bp长的转录物(图1)与人FGF9 cDNA有93％相同。FGF9pET-3C质粒用于转化大肠杆菌的B1-21菌株。在对数生长期，转化的细菌用lmMIPTG诱导2小时，在7000RPM下离心沉淀，并用探头超声发生器(Soniprep150，MSE)在冰上超声处理3个15秒。将细菌超声破碎物离心后获得的上清液上样于肝素琼脂糖凝胶柱(Pharmacia，Upsala，Sweden)，柱用10倍柱体积的0.15MNaCl，0.05％Chaps，20mM Tris pH7.4和10倍柱体积的0.7M NaCl，0.05％Chaps，20mM Tris pH7.4充分洗涤，然后，结合的蛋白质在0.5ml的2M NaCl，0.05％Chaps，10mM Tris pH7.4组分处洗脱，用水1∶10稀释并重新上柱于预平衡的1ml肝素琼脂糖凝胶小型FPLC柱(Pharmacia，Upsala，Sweden)。在充分洗柱后，柱用连续的0.2-2M NaCl梯度洗脱，并通过280nm处的吸光度来决定蛋白质曲线。组分通过在BALB/c-3T3成纤维细胞中掺入3H-胸苷来测定其生物活性，通过Western印迹法用在兔中产生的针对FGF9特异性多肽的多克隆抗体来测定特异性。在预计分子量27kDal处获得的主要蛋白质条带可与两个不同的特异性针对FGF9肽段的抗体发生特异性反应。
用从12.5天的鼠胚胎RNA制得的cDNA进行PCR以克隆鼠FGF9(mFGF9)。鼠FGF9 cDNA与人和大鼠的FGF9分别有93％和98％的序列同源性(图3A-3C)。mFGF9的氨基酸序列与大鼠FGF9的氨基酸序列相同，与人FGF9的氨基酸序列仅在位置9处不同(其为丝氨酸，而人FGF9为天冬酰胺)。重组的鼠FGF9在大肠杆菌的B1-21菌株中表达，并从细菌裂解物中通过在肝素琼脂糖凝胶柱上纯化两个循环而获得。FGF9用1.0-1.2M NaCl从肝素琼脂糖凝胶上洗脱，并在280nm测定吸光度(图4A)。组分中FGF9的存在通过免疫印迹用针对FGF9特异性肽段的多克隆抗体来测定，这证明在预计分子量处的主要蛋白质条带是27kDal的非糖基化蛋白质(如图4B)。每一个制剂的纯度还用银染法(图4C)来进一步测定。重组鼠FGF9有生物活性，它以剂量依赖性方式刺激BALB/C 3T3成纤维细胞中的DNA的合成，最大3H-胸苷掺入值的一半为0.5ng/ml(未显示)，这与从纯化的人FGF9获得的结果相同(Nauro等人，J.Bio1.Chem.，26716305-16311(1993))。
实施例2鸡FGF9同系物的克隆和表达鸡FGF9同系物的克隆和表达用从鸡上衍生获得的mRNA如实施例1所述的方法进行。
实施例3无细胞结合测定以前已经描述了鼠FGFR1，FGFR2，角质形成细胞生长因子受体(KGFR)和碱性磷酸酶表达载体中的FGFR3的两种同工型的胞外区域(Givol D.和YayonA.，Adv.Cancer Res.160，1-41(1993)；(Lev等人，生物化学，267，15970-15977(1992))。从NIH 3T3转染细胞的条件培养基中收集FGFR-碱性磷酸酶融合蛋白并直接用于结合测定。受体蛋白质的含量通过在405nm用对硝基苯酚磷酸酯作为底物(如Lev等人，同上所描述的)对碱性磷酸酶的活性进行分光光度计检测来确定。可溶的受体结合反应混合物包括受体-AP条件培养基、放射性标记的配体和肝素或其它HSPG。结合的复合物用抗碱性磷酸酶的多克隆抗体(Zymed)和蛋白质A琼脂糖凝胶(Repligen)来免疫沉淀。所有的组分在室温下混合在总体积为250ml的结合缓冲液(DMEM，其中另加入25mMHepes，pH7.4和0.1％牛血清白蛋白)中。结合反应在室温下进行2小时。结合的配体用微离心机(-2000g)在6000rpm离心10秒来回收，并用150nM NaCl，0.1％Triton-X-100和50mM Hepes，pH7.4(HNTG)的溶液来洗三次。125I-结合的因子通过γ-计数器直接计数管子来测定。在洗涤后，室温下将0.15mM二琥珀酰亚胺基辛二酸酯(disccinimidyl，DSS)或1mMBis(磺基琥珀酰亚胺基)辛二酸酯(BS3)加入磷酸盐缓冲液(PBS)中进行交联反应30分钟。复合物用PBS洗涤两次，并用样品缓冲液煮沸5分钟。样品在SDS聚丙烯酰胺凝胶上在还原条件下用电穿孔法分离，干燥凝胶并将其置于Kodak(Eastman Kodak Co.，Rochester，NY)X-Omat AR胶片下。
或者，使预先过夜包被抗人胎盘碱性磷酸酶的单克隆抗体(Sigma Chemicals，Isrcal)的96孔maxisorb板(Nunk)与受体-AP融合蛋白在室温下反应2小时。在用结合缓冲液洗涤后，板在室温下与不同浓度的125I标记的FGF9在有或没有肝素时培育2小时。在培育时间的最后，板用结合缓冲液洗涤两次，并用含1.6MNaCl的20mM，pH5.4的醋酸钠洗脱。酸抽提物在γ计数器中计数。
为说明FGF9的受体结合性质，利用了一系列的与人胎盘碱性磷酸酶偶连的FGF受体的胞外区域。如前面所证实的，FGF受体的可溶胞外区域可成功地特异性地与配体反应，从而为分析配体-受体的特异性提供了一个很好的工具(Rimion，D.L，Prof.Clin.Bi01.Res.187,131-140(1985)，Lev等人，同上)。FGF9与可溶受体间的反应首先通过测定固定在肝素-琼脂糖凝胶上的FGF9的碱性磷酸酶活性来分析。固定在肝素-琼脂糖凝胶上的FGF9与FGFR2和FGFR3融合蛋白结合，但不与FGFR1或FGFR4结合(图5A)。仅仅FGFR2和FGFR3的IIIc同I型与FGF9结合，而这些受体的IIIb同I型没有显示出与FGF9特异性结合。FGF9与可溶受体间的反应进一步通过直接使放射性标记过的FGF9结合和交联来分析(图5B)。在0.5mg/ml肝素存在时，FGF9只与FGFR2和FGFR3结合而不和FGFR1或FGFR4结合以及不和测试的任何一种IIIb剪接同I型结合。在无肝素时，没有发现有显著的结合，这表示肝素对高亲和性FGF9-受体结合的专性作用。FGF9与FGFR2和FGFR3的共价连接的两个复合物更有可能是受体-配体复合物的单体和二聚体形式。用125I-FGF9亲和标记的可溶的FGFR2和FGFR3蛋白质在100倍摩尔过量的未标记配体中消除，这表明这些受体的结合和标记是特异性的。
为定量描述FGF9和FGFR2及FGFR3的结合，进行放射性标记的FGF9与可溶受体的直接结合测定。FGF9与两个受体的结合是特异性的并是饱和的(图6A和6B)。通过Scatchard分析方法的分析结果(图6，插入小图)表明FGF9与FGFR2结合的解离常数为2.38nM，与FGFR3反应的解离常数为0.78nM。两个附加的试验得到非常相似的结果。在单一试验中，与FGFR2的亲和力与FGFR3相比要低约3倍。FGF9与FGFRI的结合没有显著性和特异性(未显示)。
实施例4FGF9与细胞表面受体的高亲和性结合和交联将24了孔盘(Nunk)中的铺满培养物预冷至4℃并用结合缓冲液洗涤两次。然后使它们在4℃与不同浓度的125I-FGF9在有或没有肝素情况下在结合缓冲液中培育2小时。弃去结合培养基，细胞用结合缓冲液洗涤两次，用含0.5M NaCl的25mM Hepes pH7.5洗涤一次。用含1.6M NaCl的20mM，pH4.5乙酸钠洗脱结合的因子并在γ计数器中计数来测定高亲和性结合的因子。根据在100倍过量的无标记因子中的高亲和性结合获得的数值确定结合反应无特异性。为进行交联，在PBS中进行结合反应，在培育1小时后，加入DSS至最终浓度为0.15M并反应1小时以上。细胞在PBS中洗涤两次，在小体积的裂解缓冲液中刮碎并裂解，裂解缓冲液含有150mM NaCl，20mM Tris(pH8.0)，1mM MgCl2，0.1mM ZnCl2，0.5％NP-40，1mg抑蛋白酶肽，1mg/ml亮抑蛋白酶肽和2mM PMSF。使离心澄清化的细胞裂解物煮沸并在还原条件下在SDS聚丙烯酰胺凝胶上进行电穿孔。
如上所述，FGF9与FGFR2和FGFR3的结合严格依赖于肝素的存在。为比较FGF9与每个受体的结合对肝素的特异性需要，我们首先测定FGF9与可溶FGFR2和FGFR3的结合所需的肝素量。在交联试验中，在FGFR2或FGFR3中没有加入肝素时只发现很少的复合物。然而，随着肝素浓度的增加，发现两种受体对肝素的需求有显著的不同。
与碱性磷酸酶相连的FGFR2和FGFR3的可溶胞外区域用抗碱性磷酸酶的抗体来免疫沉淀，并与5ng/ml125I-FGF9及增加浓度的肝素培育。交联和电泳分离如实施例3所述的那样进行。FGF9与FGFR2(图5A)和FGFR3(图5B)的结合量用光密度测定法来定量。
FGF9与FGFR2的结合对肝素很敏感，只要加入少达0.5ng/ml的肝素就可使结合有明显的增加，最大受体结合为约5ng/ml。然而，FGF9与FGFR3的结合需要约20倍的较高水平的游离肝素，而最大受体结合只有约100ng/ml肝素，在肝素浓度大于500ng/ml时结合稍有抑制。
FGF9与FGFR2或FGFR3的结合所需肝素水平间的不同可能说明，FGFR3结合需要一个更有特异性的肝素结构，其包含所用肝素混合物的相对较小的部分。为研究促进FGF9结合所需的肝素结构，我们测定了一系列大小为4至18的单糖单元的肝素组分对于FGF9与FGFR2和FGFR3的可溶胞外区域的结合的影响。
为了确定体内观察到的高亲和性、依赖于肝素的FGF9与FGFR3间的反应的生理关系，在野生型(KI)和硫酸乙酰肝素缺陷的突变型(745pgs)CHO细胞(该细胞已知可低水平表达内源性FGFR(Yayon A.，等人，细胞，64841-848(1991)))中表达全长鼠FGFR3。由于未转染的细胞没显示出可检测的放射性标记FGF9的结合，也没表示出共价交联的蛋白质，FGFR3转染的CHO-KI细胞显示出145kDal的蛋白质条带，其与受体FGF9复合物的单体相对应(图7)。如所预料的，125I-FGF9与表达FGFR3的野生型CHO-KI细胞的结合和交联不受外源性肝素的影响。然而，在没有肝素时，没有检测到FGF9与表达FGFR3的突变型HS缺陷型CHO-745细胞有交联(图7)，这支持了FGF9高效亲和反应需要有肝素类分子的观点。当加入肝素后，745-FGF3与125I-FGF9亲和标记是显著的，与野生型细胞无法区分，这说明肝素可支持FGF9和FGFR3间的高亲和性结合。两种细胞上的结合均是特异性的和饱和的(在1mg/ml肝素存在时)，CHO-KI细胞和CHO745细胞的kD分别为0.06和0.1nM。在FGF9与CHO 745-FGFR3转染细胞结合时获得典型的肝素剂量依赖型增长，最大特异性结合为约500ng/ml的肝素(数据未列出)。
实施例5DNA合成测定用在24孔板中，附加10％胎牛血清的F12培养物中生长的铺满培养物可测定掺入CHO的胸苷。使细胞在无血清下饥饿24小时，然后与或不与各种浓度的FGF9或与10％血清(作为对照)再培育14小时，然后加入3H-胸苷(0.5mCi/ml)再反应2小时。在培育的最后，细胞用冷的PBS洗涤两次，用冰冷的5％三氯乙酸固定20分钟，用95％乙醇洗涤并溶解在0.1MNaOH中。用液体闪烁计数来测定DNA相关的放射性。
为测定FGFR3的活化是否也需要肝素，我们研究了FGF9诱导表达FGFR3的HS-缺陷性CHO 745细胞内DNA合成所需的肝素量。没有外源性肝素时，则通过FGF9掺入3H-胸苷没有发现有显著的增加(图8A)，这与受体结合的缺少一致且与其它研究的FGF对肝素的严格需要相似。加入低浓度的肝素可显著地以与剂量依赖的方式促进依赖于FGF9的DNA合成，并且最大效应的一半和最大效应分别在100ng/ml和2mg/ml。单独施用肝素对DNA合成无影响，且CHO-KI中FGF9诱导的DNA合成与外源性肝素无关(未显示)。
为研究肝素促进FGF9结合所需的结构，我们分析了一系列大小为6至18个单糖单元的肝素组分对于FGF9诱导DNA合成的效应。尽管6单体的肝素组分抑制了FGF9的效应，但是在8-10单体组分发现有DNA合成诱导，当肝素片段为14-16单体时，FGF9有最大效应(图8B)。这些结果表示FGFR3被FGF9激活需要一个特定大小的肝素。
实施例6表达FGF9的质粒构建物为表达重组的FGF9，用细菌表达载体pET-3C的Ndel/BamH位点来亚克隆鼠FGF9的cDNA。在BL-21细胞转化与1mM IPTG诱导后，裂解细胞并在肝素-琼脂糖凝胶柱上纯化FGF9。
将全长鼠FGF9 cDNA亚克隆人胶原IIAl基因的剪接受体位点的下游，胶原IIAl基因位于其启动子和软骨特异性增强子后。构建物被线性化，并用于注射入受精的鼠卵中以产生转基因鼠。
实施例7转基因动物的FGF9过量表达转基因鼠用上述的过量表达FGF9的载体转化。这些转基因鼠与用FGFR3-Ach突变(有软骨发育不全的FGFR3突变)的转基因鼠非常相似，只是体形小，短尾和短后肢的特征。这种转基因鼠可作为各种侏儒症和由FGF9过量导致的异常症状的模型。
权利要求
1.一种检测样品或组织中的成纤维细胞生长因子受体3(FGFR3)的方法，包括(i)使成纤维细胞生长因子9(FGF9)与样品或组织接触，使得形成受体-配体对，和(ii)检测FGFR3-FGF9对的存在，阳性的检测结果表示样品或组织中有FGFR3存在。
2.根据权利要求1所述的方法，其中样品或组织与FGF9的接触是在肝素存在下进行。
3.一种调节FGFR3活性的药物组合物，包括一种药学上可接受的载体和作为活性组分的有效治疗量的FGF9。
4.根据权利要求3所述的药物组合物，其用于提高FGFR3的活性。
5.根据权利要求4所述的药物组合物，其用于促进骨和软骨的修复。
6.一种调节FGFR3活性的药物组合物，包括一种药学上可接受的载体和作为活性组分的FGF9的拮抗剂，或一种FGF9结合剂。
7.根据权利要求6所述的药物组合物，其中FGF9结合剂是针对FGF9的抗体。
8.根据权利要求6或7所述的药物组合物，其用于降低FGFR3的活性。
9.根据权利要求8所述的药物组合物，其用于治疗选自多发性或单发性遗传外生骨疣、趾外翻畸形、软骨发育不全、滑液软骨瘤和内软骨瘤的疾病。
10.一种有图1所示的核酸序列的重组鼠FGF9 DNA。
11.一种有图2所示的核酸序列的重组鸡FGF9 DNA。
12.一种多肽，包含权利要求10所述的重组鼠FGF9 DNA编码的氨基酸序列。
13.一种多肽，包含权利要求11所述的重组鸡FGF9 DNA编码的氨基酸序列。
14.一种表达载体，包含在强启动子和/或软骨/骨组织特异性启动子控制表达下的权利要求10所述的重组鼠FGF9 DNA或权利要求11所述的重组鸡型FGF9DNA。
15.根据权利要求14所述的表达载体，其中启动子是胶原2型启动子。
16.一种用权利要求14或15所述的表达载体转染的转基因动物。
17.一种促进软骨或骨修复的方法包括对所需修复的部位施加有效治疗量的FGF9，及任意一种药学上可接受的载体。
18.一种药物治疗由FGF9过多或FGFR3过度活性而引起的疾病的方法，包括对需要治疗的对象施加有效治疗量的FGF9-结合剂或FGF9的拮抗剂。
19.根据权利要求18所述的方法，其中FGF9-结合剂是针对FGF9的抗体。
20.根据权利要求18或19所述的方法，其中疾病选自多发性或单发性遗传外生骨疣，趾外翻畸形，软骨发育不全，滑液软骨瘤和内软骨瘤的疾病。
全文摘要
本发明涉及成纤维细胞生长因子受体3(FGFR3)的高亲和性配体成纤维细胞生长因子9(FGF9),配体可特异性结合并激活FGFR3。本发明也涉及用FGF9检测FGFR3的方法,和调节FGFR3活性的药物组合物,组合物包含作为活性组分的FGF9、其拮抗剂或中和天然循环FGF9的FGF结合剂,本发明还涉及新的重组鼠和鸡FGF9,包含这些重组FGF9的表达载体和用所述表达载体转化的转基因动物。
文档编号C12N15/00GK1187754SQ96194720
公开日1998年7月15日 申请日期1996年6月12日 优先权日1996年6月12日
发明者A·雅因 申请人:依达研究发展有限公司