专利名称：高度特异性的重组免疫毒素及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种以TH1细胞为靶细胞，特异攻击并杀伤活化的TH1细胞的重组免疫毒素及其制备方法。
背景技术：
免疫毒素(Immunotoxins，ITs)是由导向分子和毒素分子共同构成的杂合分子，又称生物导弹。最早的免疫毒素(即第一代免疫毒素)是将载体与毒素分子通过化学偶联而成，这类免疫毒素分子量大、稳定性及均一性较差，且难以大规模生产，因而限制了其应用。随着分子生物学的发展，近年来人们通过基因工程的重组技术，将载体基因与毒素基因融合，经表达及纯化制备而得重组免疫毒素。这种新工艺产生的免疫毒素能有效克服第一代免疫毒素的缺陷，极大地推动了免疫毒素在相关领域的深入研究。有关免疫毒素在生物医学的应用，主要都集中于对某些恶性肿瘤及与免疫相关的人类疾病的导向治疗。其中，以T细胞为靶细胞的免疫毒素在治疗T细胞性自身免疫性疾病及移植物抗宿主疾病(GvHD)取得了良好疗效(参见Hu HZ，et al.CellImmunol.1997，17726；BrennerT，et al.Immunol lett.1999，68403)。这些免疫毒素的作用靶点主要是选择针对T细胞表面抗原或细胞因子受体，如CD3、CD5、IL-2等，在接受这些免疫毒素的治疗后，相应的自身免疫性疾病或GvHD病情虽有减退，但毒副作用也较显著，甚至使临床治疗被迫终止。这些毒副作用的主要原因之一是由于这类免疫毒素所选择的导向分子特异性欠佳，往往导致无选择性地杀死所有T细胞。随着基础免疫学的研究进展，人们认识到识别各种自身抗原的自身反应性T细胞，实际上是由CD4+TH1细胞所承担的，而CD4+TH2仅具有一定的调节作用(参见LiblauRS，et al.Immunol.Today.1995，1634；Costa GL，et al.J.Immunol.2000，1643581)。由此提示，如果能利用特异性更高的免疫毒素只将这些活化的自身反应性TH1细胞杀死，则有可能弥补上述缺陷，建立相应的特异性自身免疫耐受，实现治疗自身免疫性疾病的目的。自身免疫性疾病(autoimmune disease)是由于各种原因导致免疫系统对自身抗原发起攻击，造成自身组织损伤和功能障碍的一大类疾病。目前的治疗措施主要是采用各种非特异的免疫抑制剂，但往往使患者免疫系统受到普遍性抑制而导致感染、肿瘤的发生及骨髓抑制等，且不能有效地防止疾病的复发。因而促使相关领域的研究者从免疫治疗的角度，寻求一种特异、安全、有效的治疗方法如MHC阻断法、CD4分子阻断法、TCR阻断法、细胞因子治疗、T细胞接种以及口服抗原诱导耐受等等，但这些方法或因特异性不高、疗效不稳定，或因技术难度大、难以克服的毒副作用等而不能顺利地过渡到临床(参见Waldor MK，et al.Science.1985，227415；ChenY，et al.Nature.1995，376177；Weiner HL，Immunology Today.1997，18355)，因而自身免疫性疾病的治疗至今仍然是困扰临床的一大难题。
发明内容
本发明针对现有技术存在的不足，提供一种新型的特异攻击TH1细胞的重组免疫毒素，为临床急待解决的自身免疫性疾病治疗提供一种新方案，为重组免疫毒素的应用开辟一条新途径。
本发明的技术方案是提供一种制备重组免疫毒素的质粒，此种质粒具有附图1所述的IL-18cDNA碱基序列(来自gene bank)和附图2所述的绿脓杆菌外毒素的活性片段PE38cDNA碱基序列(来自gene bank)连接而成。提供一种高度特异性的重组免疫毒素，此种重组免疫毒素由上述质粒表达、纯化形成，以IL-18为导向分子、以绿脓杆菌外毒素的活性片段PE38为毒素分子，具有特异攻击并杀伤活化的TH1细胞的特性。IL-18是近年发现的一种新型细胞因子，在免疫应答的过程中，活化的T细胞将表达多种受体，如细胞因子IL-2、IL-12、IL-18的受体以及多种化学趋化因子CCR-5，CXCR-3等的受体。这些T细胞的膜受体中，现已证实IL-18受体的表达仅限于活化的TH1细胞，而TH2细胞没有表达，并且这种膜受体的表达是稳定和持续的(参见Okamura H，et al.Nature.1995，37888；Chan WL，et al.J.Immunol.2001，1671238；Nakanishi K，et al.Annu.Rev.Immunol.2001，19423)，因此，IL-18受体不仅可以作为识别TH1细胞和TH2细胞的标志，也为相关的免疫治疗提供了一个理想的靶位。本发明选用IL-18为导向分子，绿脓杆菌外毒素的活性片段PE38为毒素分子，制备IL-18-PE38重组免疫毒素，特异攻击并杀伤活化的TH1细胞，诱导自身免疫耐受，从而解决了原有免疫毒素特异性欠佳的问题，实现有效治疗自身免疫性疾病的目的。
重组质粒的构建方法依次包括以下步骤1、将动物的IL-18基因用RT-PCR扩增；2、将上述扩增的IL-18基因片段按TA克隆法实现与质粒载体重组，再转染至感受态细菌中进行扩增，然后筛选出含有正确插入片段的克隆；3、限制性内切酶酶切图谱分析重组质粒，并进行DNA序列分析，以保证重组质粒中IL-18插入片段的正确性；4、限制性内切酶分别消化正确序列的IL-18及PE38的质粒DNA，纯化DNA片段，将IL-18和PE38片段连入质粒载体中，即构建成重组质粒；5、用TNT体外翻译试剂盒测定重组质粒的表达活性。
构建重组质粒可选用的质粒载体有pET27、PRKL459K、PGEX-2T。
重组免疫毒素IL-18-PE38的制备方法依次包括以下步骤1、上述重组质粒转染的工程菌的制备；2、免疫毒素的表达与纯化。
上述各步骤的具体操作如下1、制备重组质粒转染的工程菌(1)制备感受态细菌；(2)将上述重组质粒转入感受态细菌的细胞中；(3)通过蛋白合成抑制实验测定工程菌的表达活性。
2、免疫毒素的表达与纯化(1)将重组质粒转染的工程菌接种于培养基中培养；(2)收集高效表达的工程菌菌液并进行破菌处理，获取免疫毒素IL-18-PE38的粗提物；(3)用Glutahione Sepharose4B或亲和层析柱对免疫毒素IL-18-PE38粗提物进行纯化处理；
(4)通过蛋白合成抑制实验测定免疫毒素的表达活性。
制备重组质粒转染的工程菌可选用的感受态细菌有E.coli.BL21、DH5α、JM109。
本发明所涉及的新型免疫毒素及其制备方法具有以下优点和积极效果1、选择新型细胞因子IL-18为导向分子，由于IL-18受体只表达在活化的TH1细胞表面，TH2细胞表面没有表达，因而由IL-18导向的重组免疫毒素只针对TH1细胞，从而使导向攻击更特异、更有效，减少临床应用的毒副作用。
2、毒素分子选用的是绿脓杆菌外毒素的活性片段PE38，从而避免了血液中普遍存在的抗白喉外毒素抗体对免疫毒素生物活性的干扰。
3、PE38为绿脓杆菌外毒素的活性片段，较PE40进一步去除了PE分子的细胞结合区和一个二硫键，可进一步减少非特异性结合和降低不良反应。
4、免疫毒素IL-18-PE38是通过DNA重组技术来获得的重组免疫毒素制剂，它避免了原来化学偶联免疫毒素复杂的制备工艺和难以标化的缺点，使其更易产业化。
5、免疫毒素IL-18-PE38可通过多途径给药。①直接利用IL-18-PE38蛋白制剂；②利用IL-18-PE38 DNA制剂，即采用IL-18-PE38表达质粒转染活体肌肉细胞的方法，将IL-18-PE38表达质粒直接导入动物肌肉，使IL-18-PE38在骨骼肌内高效表达而起到治疗作用。
6、免疫毒素IL-18-PE38亦可用于移植排斥反应及某些肿瘤的防治。
四
图1是IL-18cDNA的碱基序列；图2是PE38cDNA的碱基序列。
五具体实施例方式
实施例1构建制备重组免疫毒素IL-18-PE38的原核表达质粒IL-18cDNA的碱基序列如图1所示，PE38cDNA的碱基序列如图2所示，载体选用pET27。具体步骤如下1、小鼠IL-18基因用RT-PCR扩增(1)异硫氰酸胍一步法提取激活巨噬细胞的总RNA，取10μg Oligo(dT)混合，行反转录。
(2)PCR扩增的引物为上游5′-CGGAATTCATAACTTTGCCGACTTCAGTGTAC下游5′-CGGAATTCACTAACTTTGATGTAAGTTAGTGAGAG(3)PCR反应条件94℃0.5分钟、56℃0.5分钟、72℃1分钟，30个循环后72℃延伸10分钟。
(4)扩增产物行2％琼脂糖凝胶电泳分析。
2、将上述扩增的IL-18基因片断按TA克隆法实现与质粒载体pET27重组，再转染至感受态细菌中进行扩增，筛选出含有正确插入片段的克隆。
3、限制性内切酶酶切图谱分析重组质粒，并进行DNA序列分析，以保证重组质粒中IL-18插入片段的正确性。
4、限制性内切酶分别消化正确序列的IL-18及PE38的质粒DNA，纯化DNA片段，将IL-18及PE38片段分别连入pET27表达质粒载体中，构成IL-18-PE38的原核表达质粒pET27-IL-18-PE38。
5、IL-18-PE38原核表达质粒的活性测定，用TNT体外翻译试剂盒，以pET27-IL-18-PE38质粒DNA作模板翻译出相应的蛋白质，再用ConA刺激小鼠脾脏细胞，活化其中的T细胞，这些活化的T细胞将作为靶细胞检定IL-18-PE38原核表达质粒的活性。
实施例2制备重组免疫毒素IL-18-PE38工艺步骤依次如下1、制备原核表达质粒pET27-IL-18-PE38转染的工程菌(1)制备感受态细菌A.将大肠杆菌E.coli BL21在琼脂培养基平板上划线接种，37℃培养12-16小时。
B.从平板中取出2-3mm大小的单菌落，移至含3mlLB培养基中，37℃振荡培养过夜。次日取菌液1ml接种至含有100mlLB培养基的的三角瓶中，37℃300rpm强烈振荡培养3小时，使细胞浓度达到5×107个细胞/ml，此时，细菌的OD600一般在0.4左右。
C.将培养的细菌在冰上放置10分钟，然后转移到无菌处理过的用冰预冷的50ml离心管中。
D.4℃离心，4000g×10分钟，弃去上清液，回收细胞。
E.用冰预冷的0.1mol CaCl210ml重悬菌体，置冰浴30分钟。
F.4℃离心，4000g×10分钟，弃去上清液。再加4ml冰预冷的0.1mol CaCl2重悬菌体，此即感受态细菌。
(2)将实施例1制备的原核表达质粒pET27-IL-18-PE38转入感受态细菌的细胞中A.无菌状态下取新鲜感受态细菌100μl置于无菌试管中，加入10ngpET27-IL-18-PE38质粒DNA，轻轻旋转混匀内容物，在冰上放置30分钟。
B.42℃热休克90秒钟，不要摇动试管，迅速放回冰中，将细胞冷却1-2分钟后，加入1000μlSOC培养基，37℃振荡培养45分钟。
C.取80μl转化混合物，用L型玻棒铺于含适当浓度抗生素的LB琼脂平板上，室温下放置20分钟，待溶液被琼脂吸收后，倒置37℃培养16-20小时；待菌落长出后，无菌挑取单菌落进行扩大培养。
(3)通过蛋白合成抑制实验测定工程菌的表达活性将ConA活化的T细胞接种于96孔细胞板培养(约5×104个细胞/孔)，加入不含亮氨酸的RPMI1640培养基和工程菌培养上清20μl，混匀后共同孵育20小时(37℃，5％CO2)，再加入H3亮氨酸(4.5μci/ml)10μl，4小时后收集细胞，测定并计算蛋白合成抑制百分率，确定工程菌的表达活性。
2、重组免疫毒素IL-18-PE38的表达与纯化(1)将带pET27-IL-18-PE38质粒的工程菌接种于含一定浓度抗生素的LB培养基中，30℃摇床培养至OD600达0.5，转至42℃继续培养5小时。
(2)收集培养的高效表达的工程菌菌液，4℃离心5000rpm，15分钟，弃上清。
(3)每克湿菌加3mlTE缓冲液，高强度超声(20kHz)进行破菌处理。
(4)离心10000g，30分钟，收集上清液。
(5)取10μl上清与10μl2×SDS样品缓冲液混匀，于沸水中煮5分钟，然后上样进行10％SDS-PAGE电泳(200V，50-60分钟)，凝胶用考马斯亮蓝染色。
(6)将IL-18-PE38蛋白粗提物用50％Glutahione Sepharose 4B或亲和层析柱进行纯化，纯化后的重组免疫毒素再通过SDS-PAGE电泳和Western blot做进一步的鉴定分析。
(7)重组免疫毒素IL-18-PE38生物活性的测定重组免疫毒素IL-18-PE38生物活性的测定采用蛋白合成抑制试验进行，即通过将ConA活化的T细胞接种子96孔细胞板培养(约5×104个细胞/孔)，加入不含亮氨酸的RPMI1640培养基和系列稀释的IL-18-PE38重组蛋白样品10μl(对照组为IL-18受体阴性的无关细胞)，混匀后共同孵育20小时(37℃，5％CO2)，再加入H3亮氨酸(4.5μci/ml)10μl，4小时后收集细胞，于Beckman闪烁计数仪上测定放射活性，计算蛋白合成抑制百分率，以确定IL-18-PE38重组免疫毒素的生物活性。
权利要求
1.一种制备重组免疫毒素的质粒，其特征在于它具有附图1所述的IL-18cDNA碱基序列和附图2所述的绿脓杆菌外毒素的活性片段PE38cDNA碱基序列连接而成。
2.一种高度特异性的重组免疫毒素，其特征在于该重组免疫毒素由权利要求1所述的质粒表达、纯化形成，具有特异攻击并杀伤活化的TH1细胞的特性。
3.一种权利要求1所述的重组质粒的构建方法，其特征在于依次包括以下步骤(1)将动物的IL-18基因用RT-PCR扩增，(2)将上述扩增的IL-18基因片段按TA克隆法实现与质粒载体重组，再转染至感受态细菌中进行扩增，然后筛选出含有正确插入片段的克隆，(3)限制性内切酶酶切图谱分析重组质粒，并进行DNA序列分析，以保证重组质粒中IL-18插入片段的正确性，(4)限制性内切酶分别消化正确序列的IL-18及PE38的质粒DNA，纯化DNA片段，将IL-18和PE38片段连入质粒载体中，即构建成重组质粒，(5)用TNT体外翻译试剂盒测定重组质粒的表达活性。
4.根据权利要求3所述的重组质粒的构建方法，其特征在于构建重组质粒可选用的质粒载体有pET27、PRKL459K、PGEX-2T。
5.一种权利要求2所述的高度特异性的重组免疫毒素的制备方法，其特征在于依次包括以下步骤(1)权利要求1所述的重组质粒转染的工程菌的制备，(2)免疫毒素的表达与纯化。
6.根据权利要求5所述的高度特异性的重组免疫毒素的制备方法，其特征在于(1)制备重组质粒转染的工程菌的具体步骤A.制备感受态细菌，B.将权利要求1所述的重组质粒转入感受态细菌的细胞中，C.通过蛋白合成抑制实验测定工程菌的表达活性，(2)免疫毒素表达与纯化的具体步骤A.将重组质粒转染的工程菌接种于培养基中培养，B.收集高效表达的工程菌菌液并进行破菌处理，获取免疫毒素的粗提物，C.用Glutahione Sepharose4B或亲和层析柱对免疫毒素的粗提物进行纯化处理，D.通过蛋白合成抑制实验测定免疫毒素的表达活性。
7.根据权利要求6所述的高度特异性的重组免疫毒素的制备方法，其特征在于蛋白合成抑制实验测定免疫毒素的表达活性是通过将ConA活化的T细胞接种于细胞板培养，加入不含亮氨酸的RPMI1640培养基和系列稀释的免疫毒素重组蛋白样品，混匀后在37℃、5％CO2共同孵育16～20小时，再加入3～4.5μci/ml的H3亮氨酸，2～4小时后收集细胞，于Beckman闪烁计数仪上测定放射活性，计算蛋白合成抑制百分率。
8.根据权利要求6或7所述的高度特异性的重组免疫毒素的制备方法，其特征在于制备重组质粒转染的工程菌可选用的感受态细菌有E.coli.BL21、DH5α、JM109。
全文摘要
一种高度特异性的重组免疫毒素，以IL－18为导向分子、以绿脓杆菌外毒素的活性片段PE38为毒素分子，通过基因重组构建而成。该免疫毒素的制备方法包括重组质粒的构建、重组质粒转染的工程菌的制备、免疫毒素IL－18－PE38的表达与纯化等步骤。该免疫毒素具有严格的靶向性，即通过IL－18的导向作用特异攻击活化的TH1细胞，诱导特异性免疫耐受，从而避免了无选择性地杀伤所有T细胞，特别适合于自身免疫性疾病和器官移植排斥反应的防治，亦可应用于某些肿瘤的治疗。
文档编号C12N15/31GK1431305SQ03117130
公开日2003年7月23日 申请日期2003年1月10日 优先权日2003年1月10日
发明者张 林, 李虹, 李明远, 胡怀忠, 蒋忠华 申请人:四川大学