专利名称：Sars病毒的基因检测试剂盒及检测方法
技术领域：
本发明涉及一种的基因检测试剂盒及用该试剂盒检测样品中是否含有SARS病毒的基因检测方法。
背景技术：
非典型肺炎是一种急性呼吸道传染病，国外称其为重症急性呼吸综合征(Severe Acute Respiratory Syndrome，SARS)，简称为SARS。主要通过近距离空气飞沫和密切接触传播，起病急、传播快，病死率超过于5％。从2002年11月我国广东省出现第一个病例开始，短短半年时间，目前涉及到世界近30个国家和地区，全球患者已达6000多例，且发病人数仍有不断增加的趋势。由于其通过近距离空气飞沫和密切接触传播，目前还没有疫苗及特效的药物，多数人对SARS没有免疫力，切断传源就成了阻断SARS传播重要方法。但是目前的几项临床诊断标准，总要在SARS病人发病甚至病重后才能被确诊。这显然很不利于控制疫情。寻找一个能迅速准确诊断SARS的方法至关重要。
2003年4月16日，世界卫生组织在瑞士日内瓦宣布，经过全球10个国家和地区13个实验室的通力合作，在全球多个国家快速传染的非典型肺炎，英文名称为SARS，的病原体最终被确认。这是一种冠状病毒，SARS病原体完整的基因组被破解。它是由加拿大科学家在4月12日首先宣布的，几天后，美国疾病控制中心也作了类似的宣布。加拿大范库弗迈克·史密斯基因组科学中心的研究人员破译了这种病毒的基因图谱。
SARS的病原体的发现及这种病毒基因图谱的破译，使得寻找一个快速准确的能检测SARS病毒的基因诊断方法成为可能。
近年来迅速展起来的荧光PCR技术是人PCR技术(聚合酶链式反应技术)基础上发展起来的，可以从核酸水平上检测病毒。荧光PCR技术对PCR产物的检测原理做了很大的改进，可动态实时监测核酸产物的形成，无须后处理过程，这样在一定程度上避免了扩增产物的污染，既缩短了检测时间，又节省了特殊仪器及专业人员的配备。
荧光PCR技术的原理荧光PCR不同于其它PCR之处在于利用荧光染料在激发光的作用下所释放的荧光光能的变化来动态直接反映出PCR扩增产物量的变化。因荧光信号变量与扩增产物量成正比，通过足够灵敏的自动化仪器对荧光的采集与分析来实现对初始模板的定量。
荧光染料的引入有以下几个途径直接结合核酸产物、标记引物或标记特异性探针，而荧光标记的探针共有三类(1)分子信标探针；(2)杂交双探针；(3)Taqman双标记探针。在PCR反应体系中除常规一对引物外，另有一个能与PCR产物杂交的荧光双标记探针。该探针的5’端与3’端分别标记上不同的荧光基团，探针5′端标记一报告荧光基团(reporter，R)，3′端标记一淬灭荧光基团(quencher，Q)，当探针保持完整时，5’端荧光基团R吸收光能后会将能量转移给临近3’端荧光淬灭基团Q，其Q基团抑制了R基团的荧光信号，该检测，5’所以正常情况下检测系统将不能检测到该探针5’端荧光基团所发出的荧光信号。但在PCR延伸反应过程中，DNA聚合酶(Taq)的5’-3’外切酶活性将5’端荧光基团从探针上切割下来，使之游离于反应体系中，从而脱离了3’端荧光淬灭基团的屏蔽，即能接受光刺激而发出可供仪器检测的荧光，(仪器检测出荧光值出峰的最低循环数(cycle threshold，Ct)与检测病毒核酸量对数值呈线性负相关)，因而根据荧光PCR反应中的荧光Ct值)就能算出原始的模板量。
本发明就是根据上述原理，设计适合SARS病毒的特异性引物和特异性探针，发明目的在于提供一种能快速准确检测SARS病毒的基因检测试剂盒及基因检测方法，从而快速诊断病人是否携带SARS病毒并可测出病毒的数量。
发明内容
为实现本发明目的，解决无法快速准确诊断病人的血液及呼吸道分泌物样品中SARS的病毒是否存的检测试剂及检测方法。为此，本发明采取以下技术方案一种SARS病毒的基因检测试剂盒，包括SARS病毒特异性核酸定量标准品，即SARS的部分序列5’TACCGTAGACTCATCTCTATGATGGGTTTCAAAATGAATTACCAAGTCATGGTTACCCTAATATGTTTATCACCCGCGAAGAAGCTATTCGTCACGTTCGTGCGTGGATTGGCTTTGATGTAGAGGGCTGTCATGCAACTAGAGATGCTGTGGGTACTAACCTACCTCTCCAGCTAGGATTTTCTACAGGTGTTAACTTAGTAGCTGTACCGACTGGTTATGTTGACACTGAAAATAACACAGAATTCACCAGAGTTAATGCAAAACCTCCACCAGGTGACCAGTTTAAACATCTTATACC-3’所述的试剂盒还包括以下组分(1)荧光扩增检测试剂由一步法RT-PCR缓冲液、脱氧三磷酸核苷(dNTP)混合物、特异性扩增引物及特异性探针以蒸馏水为溶剂混合而成，所述的特异性引物是引物S1引物序列为5′-CCAAGTCAATGGTTACCCTAATATGTT-3′引物S2引物序列为5′-GTTAGTACCCACAGCATCTCTAGTT-3′所述的特异性探针是
探针S3探针序列为5′-R-AGCCCTCTACATCAAAGCCAATCCACGC-Q-3′R为报告荧光基团，Q为淬灭荧光基团。(2)DNA聚合酶(3)防止污染的尿嘧啶糖基酶(UNG)；(4)用于逆转录的逆转录酶。
所述的SARS病毒的基因检测试剂盒，所述的荧光扩增检测试剂由下列组分以蒸馏水为溶剂混合而成一步法RT-PCR缓冲液 含量体积百分比10％脱氧三磷酸核苷(dNTP混合物 含量100-300μM特异性引物S1 含量0.05-1.5μM特异性引物S2 含量0.05-1.5μM特异性探针S3 含量0.05-1.0μM余量为蒸馏水本发明是SARS病毒PCR荧光定量检测试剂，采用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)结合技术，对SARS病毒的特异性RNA核酸片段进行荧光定量检测。该试剂适用于对血液和脱落细胞(上呼吸道，泌尿道)中的SARS病毒的特异性RNA核酸片段进行荧光的检测。该检测试剂的核心是荧光扩增检测试剂中针对SARS病毒的特异性引物和探针，SARS特异性核酸定量标准品。特异性引物S1，S2；特异性探针S3。SARS特异性核酸定量标准品核心是一段SARS病毒特异性核酸序列。特异性探针S3是TaqMan聚合酶链反应技术(TaqMan-PCR)的核心，该探针5′端标记一报告荧光基团(reporter，R)，3′端标记一淬灭荧光基团(quencher，Q)。报告荧光R基团有FAM(羧基荧光黄)，HEX(6-氯荧光黄)，TAMARA(四甲-6羧罗丹明)，CY3(吲哚二羧菁)，CY5(吲哚二羧菁)，ROX(6-羧-X-罗丹明)；淬灭基团Q有TAMARA(四甲-6羧罗丹明)，BHQ，DABSYL(二甲氨基偶氮苯甲酰基)。报告荧光基团R及淬灭基团Q可以根据方便选用。
TaqMan聚合酶链反应技术(TaqMan-PCR)是一种最新的荧光定量基因扩增技术之一。大多数Taq酶不仅有5′→3′DNA聚合酶活性，能在引物的引导下延伸DNA链，还具有5′→3′外切酶活性，荧光定量基因分析法就是巧妙地运用了Taq酶的这两种酶活性而发展起来的。在扩增反应体系中加入一条与待扩增的目的片段互补荧光标记探针，该探针5′端标记一报告荧光基团(reporter，R)，3′端标记一淬灭荧光基团(quencher，Q)，当探针保持完整时，其Q基团抑制了R基团的荧光信号，该检测系统将不能检测到报告荧光的信号；一旦探针被切割，R基团游离，Q基团的抑制作用消失，该检测系统便可检测到R基团的荧光信号。PCR反应前，探针与模板互补结合，PCR反应开始后，随着产物链的延伸，Taq酶沿着DNA模板移动到荧光标记探针结合位置，发挥5′→3′外切酶活性，将荧光探针切断，使报告荧光基团游离，Q基团的抑制作用消失，该检测系统便检测到报告荧光信号，(仪器检测出荧光值出峰的最低循环数(cycle threshold，Ct)与检测病毒核酸量对数值呈线性负相关)，因而根据荧光PCR反应中的荧光Ct值)就能算出原始的模板量。
根据上述原理设计的试剂盒中的试剂只需按通用的方法将各组分分别溶解于蒸馏水配成混合物即可。
克隆到质粒PUmC18载体。通过PCR和核酸序列测定筛选到重组有上述序列的质粒PUmC18-SARS，用Qiagen公司质粒抽提试剂盒抽提质粒PUmC18-SARS，用紫外分光光度计分析质粒纯度并测定其浓度。应用如下公式将浓度成拷贝数/mlY(拷贝数/ml)＝X(μg/ml)÷106÷976590×6.23×1023用蒸馏水将质粒PUmC18-SARS浓度调试成107拷贝数/ml，106拷贝数/ml，105拷贝数/ml，104拷贝数/ml。
用外标法定量实时荧光PCR过程中，cycler threshold value(Ct值)与样品中核酸模板量对数值呈线性负相关。用标准品建立标准曲线，根据样品检测的Ct值，可以通过标准曲线计算出样品中SARS病毒核酸含量。
所述的SARS病毒的基因检测试剂盒中的一步法RT-PCR缓冲液优选下列化合物组成500mM氯化钾(KCl)、100mM Tris-Cl、25mM氯化镁(MgCl2)、0.1％聚乙二醇6000、0.1％1，4-二巯基苏糖醇(DTT)、1％牛血清白蛋白(BSA)，其中的含量按荧光扩增检测试剂总体积计算。
一步法RT-PCR缓冲液可以根据需要有不同的组合，也可以有其它的组配代替，但上述组合是较理想的选择。
所述的SARS病毒的基因检测试剂盒，所述的脱氧三磷酸核苷(dNTP)混合物选用dATP、dTTP、dCTP、dGTP、dUTP组合，可以是下式之一(1)dATP，dCTP，dGTP，dTTP配比为1∶1∶1∶1(2)dATP，dGTP，dCTP，dUTP配比为1∶1∶1∶1(3)dATP，dCTP，dGTP，dTTP，dUTP配比为4∶4∶4∶4∶1其中组所述的dATP，dCTP，dGTP，dTTP，dUTP组合，配比为4∶4∶4∶4∶1的脱氧三磷酸核苷(dNTP)混合物最优选组合。
所述的SARS病毒的基因检测试剂盒，所述的尿嘧啶糖基酶(UNG)使用浓度为100-300酶活力单位/反应(U)，所述的DNA聚合酶使用浓度为0.5-5酶活力单位/反应(U)，所述的DNA聚合酶可以是可以是下式之一Ampli TaqR DNA聚合酶(2)rTth DNA聚合酶(3)rTth DNA聚合酶XL。
通常选用的尿嘧啶糖基酶(UNG)使用浓度为200酶活力单位/反应(U)，DNA聚合酶使用浓度可有不同变化，本发明优选Ampli TaqR DNA聚合酶。
荧光PCR技术避免了核酸产物的后检测，从原理本身就防止了污染的发生；特殊的防污系统更进一步杜绝了污染。原理主要基于在尿嘧啶糖基酶(UNG)的作用下，核酸发生水解，并经PCR过程中的高温处理断裂成碎片而无法成为下一轮PCR反应的模板。
所述的逆转录酶使用浓度是6-300酶活力单位/反应，可以是下式之一(1)M-MuLV逆转录酶(2)AMV逆转录酶所述的荧光扩增检测试剂优选下列组分以蒸馏水为溶剂混合而成一步法RT-PCR缓冲液为500mM氯化钾(KCl)、100mM Tris-Cl、25mM氯化镁(MgCl2)、0.1％聚乙二醇6000、0.1％1，4-二巯基苏糖醇(DTT)、1％牛血清白蛋白(BSA)脱氧三磷酸核苷(dNTP混合物)为200μMdATP，200μM dCTP，200μMdGTP，200μM dTTP，50μM dUTP特异性引物S1 0.6μM特异性引物S2 0.6μM特异性探针S3 0.2μM。
余量为蒸馏水所述的试剂盒优选方案如下包括(1)荧光扩增检测试剂由下列组分以蒸馏水为溶剂混合而成一步法RT-PCR缓冲液为500mM氯化钾(KCl)、100mM Tris-Cl、25mM氯化镁(MgCl2)、0.1％聚乙二醇6000、0.1％1，4-二巯基苏糖醇(DTT)、1％牛血清白蛋白(BSA)；脱氧三磷酸核苷(dNTP混合物)为200μMdATP，200μM dCTP，200μMdGTP，200μM dTTP，50μM dUTP特异性引物S1 0.6μM特异性引物S2 0.6μM特异性探针S3 0.2μM(2)DNA聚合酶选用Ampli TaqR DNA聚合酶2.0酶活力单位/反应(U)(3)尿嘧啶糖基酶(UNG)200酶活力单位/反应(U)(4)逆转录酶选用M-MuLV 200酶活力单位/反应(U)。
一种SARS病毒的基因检测方法，以SARS病毒特异性核酸定量标准品为对照，即SARS的部分序列5’-TACCGTAGACTCATCTCTATGATGGGTTTCAAAATGAATTACCAAGTCAATGGTTACCCTAATATGTTTATCACCCGCGAAGAAGCTATTCGTCACGTTCGTGCGTGGATTGGCTTTGATGTAGAGGGCTGTCATGCAACTAGAGATGCTGTGGGTACTAACCTACCTCTCCAGCTAGGATTTTCTACAGGTGTTAACTTAGTAGCTGTACCGACTGGTTATGTTGACACTGAAAATAACACAGAATTCACCAGAGTTAATGCAAAACCTCCACCAGGTGACCAGTTTAAACATCTTATACC-3’包括RNA提取，聚合物酶链反应(PCR)扩增及荧光检测，所述的检测方法直接用待测病人的静脉血标本或漱口液或呼吸道分泌物为分析样本，提取出样本中的RNA作为核酸模板，再对核酸模板进行荧光聚合物酶链反应扩增，所用的荧光扩增检测试剂包括一步法RT-PCR缓冲液、脱氧三磷酸核苷(dNTP)混合物、特异性扩增引物及特异性探针，所述的特异性扩增引物是引物S1引物序列为5′-CCAAGTCAATGGTTACCCTAATATGTT-3′
引物S2引物序列为5′-GTTAGTACCCACAGCATCTCTAGTT-3′所述的特异性探针是探针S3探针序列为5′-R-AGCCCTCTACATCAAAGCCAATCCACGC-Q-3，其中R为报告荧光基团，Q为淬灭荧光基团。用荧光扩增检测试剂扩增时还需加入DNA聚合酶与防污染的尿嘧啶糖基酶及用于逆转录的逆转录酶。
所述的检测方法步骤如下(1)提取RNA采取待测病人一定量的标本经前处理，按常规方法提取RNA样本为血标本静脉血5mL(EDTA抗凝)，用淋巴细胞分离液Ficoll400分离有核细胞，将有核细胞收集到1.5mL管中(进口、无菌)，加入Trizol 500μL混匀，加入氯仿100μL混匀，4℃10000rpm离心10分钟，吸取上层水相于1.5mL管中，并加入等倍体积的异丙醇(预冷)混匀，置冰上20分钟，4℃15000rpm离心15分钟(沉淀RNA)。弃上清液，用75％酒精1.0mL漂洗一次，快速离心吸干液体(注意保留沉淀的RNA)，气干后加入10μL DEPC H2O溶解RNA。直接进行RT-PCR操作或置于-80℃保存。
样本为漱口液3ml漱口液5000rpm离心5分钟，弃上清，加入Trizol500μL混匀，其他同上处理。(咽拭子、上呼吸道分泌物加入3mL生理盐水)。
采取待测病人一定量的标本经前处理，按上述方法提取RNA，气干后加入10μLDEPC H2O溶液溶解RNA，该溶解的RNA作为核酸模板，直接进行荧光PCR扩增操作或置于-80℃保存；(2)荧光PCR扩增取定量荧光扩增检测试剂，加入适量DNA聚合酶与防污染的尿嘧啶糖基酶，逆转录酶于薄壁试管中，混匀，3000rpm离心数秒，取上述混合液于薄壁管中，同时至少预备两份装有上述混合液的薄壁管，一份别加入步骤(1)制备的RNA溶液，另一份加入已经标定的标准品作为对照，立即进行聚合物酶链(PCR)扩增反应；(3)荧光检测样品反应管及对照标准品反应管置于定量荧光PCR仪检测，设置循环条件设置，进行荧光检测；(4)结果分析选择荧光检测模式FAM荧光，基线调整取6-16个循环的荧光信号；阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品的最高点；荧光增长曲线超过阈值线，并呈良好的对数增长，判断为阳性。
在于选用本发明试剂盒优选方案时，所述的检测方法步骤(2)荧光PCR扩增为具体步骤为取35μL荧光扩增检测试剂，，加入0.4μLDNA聚合酶与防污的尿嘧啶糖基酶(Taq+UNG)，1μL逆转录酶于薄壁试管中，混匀，3000rpm离心数秒，取上述混合液于薄壁管中，同时预备两份装有上述混合液的薄壁管，一份加入步骤(1)制备的RNA溶液4μL，另一份加入已标定好的标准品作对照，立即进行聚合物酶链(PCR)扩增反应；所述的检测方法步骤(3)荧光检测为反应管及对照标准品管置于定量荧光PCR仪检测，FTC2000或PE5700或PE7700仪器推荐循环条件设置45℃×30min；94℃×5min；再按93℃×10sec→56℃×10sec→72℃×10sec，循环10次；再按93℃×10sec→60℃×40sec，循环40次；单点荧光检测在60℃。lightcycler推荐循环条件设置45℃×20min；94℃×2min；再按93℃×2sec→55℃×15sec→72℃×12sec，循环50次；单点荧光检测在55℃。
本发明的优点体现在1.早期诊断。免疫学诊断主要是抗原抗体反应，应用于临床通常在体内产生抗体以后，而许多病原体的免疫学检测存在较长的“窗口期”，不利于对疾病的早期诊断；PCR方法直接检测病原体的RNA，能大大缩短“窗口期”，其高灵敏度的检测显然也有利于疾病的早期诊断。特别是可以在SARS疑似病人及曾与非典确诊病人有过密切接触者，在潜伏期或发病早期症状不典型时期，比如还没有出现高烧、干咳的时候就可以检测出是否有SARS病毒特异基因，为及早隔离、确诊和治疗提供方便。
2.取样简单方便，可用在潜伏期或发病早期临床症状不典型SARS病人的血液、漱口液及呼吸道的分泌物标本中检出SARS病毒特异基因，以明确诊断；3.与传统的基因扩增技术相比，本发明提供的检测此法省时不少，对病毒含量高的标本2小时即可检测到，对病毒含量低的标本也可在3小时内检测到。
4.灵敏度高，由于采用了特异性基因扩增与特异性基因探针杂交结合的双重技术，诊断的特异性更高。
5.采用计算机实时监测技术，在实验进程中即可自动判断是否有病毒基因存在，且实验结果的判断方便准确。
6.本发明从多方面设计了防污染措施，这对极易传染的SARS病毒检测尤为重要，荧光PCR技术避免了核酸产物的后检测，从原理本身就防止了污染的发生；全封闭反应，保证了结果的可靠可重复。
7.可实现单管双检或多检，还可设计针对性内标，监控模板抽提效率及排除抑制剂干扰。
四
图1为本发明荧光PCR技术的原理图。
图2为SARS病毒的基因定量检测方法中定量检测的标准曲线。
图3为SARS病毒的基因定量检测方法中荧光增长曲线。
图4为本发明实施例1与德国ARTUS公司基因检测试剂对SARS病毒标准品检测结果图。
五具体实施例方式
下面结合附图对本发明的实施例作进一步说明
克隆到质粒PUmC18载体。通过PCR和核酸序列测定筛选到重组有上述序列的质粒PUmC18-SARS，用Qiagen公司质粒抽提试剂盒抽提质粒PUmC18-SARS，用紫外分光光度计分析质粒纯度并测定其浓度。应用如下公式将浓度成拷贝数/mlY(拷贝数/ml)＝X(μ g/ml)÷106÷976590×6.23×1023用蒸馏水将质粒PUmC18-SARS浓度调试成107拷贝数/ml，106拷贝数/ml，105拷贝数/ml，104拷贝数/ml.
用外标法定量实时荧光PCR过程中，cycler threshold value(Ct值)与样品中核酸模板量对数值呈线性负相关。用标准品建立标准曲线，根据样品检测的Ct值，可以通过标准曲线计算出样品中SARS病毒核酸含量。
使用上述优选试剂盒时，SARS病毒的基因检测方法，检测步骤如下(1)提取RNA样本取病人的血标本静脉血5ml(EDTA抗凝)，用淋巴细胞分离液Ficoll400分离有核细胞，将有核细胞收集到1.5ml管中(进口、无菌)，加入Trizol 500μl混匀，加入氯仿100μl混匀，4℃10000rpm离心10分钟，吸取上层水相于1.5ml管中，并加入等倍体积的异丙醇(预冷)混匀，置冰上20分钟，4℃15000rpm离心15分钟(沉淀RNA)。弃上清液，用75％酒精1.0ml漂洗一次，快速离心吸干液体(注意保留沉淀的RNA)，气干后加入10μl DEPCH2O溶解RNA。直接进行RT-PCR操作或置于-80℃保存。(2)荧光PCR扩增取35μL荧光扩增检测试剂，加入0.4μLDNA聚合酶与防污的尿嘧啶糖基酶(Taq+UNG)，1μL逆转录酶于薄壁试管中，混匀，3000rpm离心数秒，取上述混合液于薄壁管中，同时预备两份装有上述混合液的薄壁管，一份加入步骤(1)制备的RNA溶液4μL，另一份加入已标定好的标准品作对照，立即进行聚合物酶链(PCR)扩增反应；(3)荧光检测样品反应管及对照标准品管置于定量荧光PCR仪检测(可选FTC2000或PE5700或PE7700)。推荐循环条件设置37℃×30min；94℃×5min；再按93℃×10sec→56℃×10sec→72℃×10sec，循环10次；再按93℃×10sec→60℃×40sec，循环40次；单点荧光检测在60℃。(4)结果分析选择荧光检测模式FAM荧光，基线调整取6-16个循环的荧光信号；阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品的最高点；荧光增长曲线超过阈值线，并呈良好的对数增长，判断为阳性。
临床应用用上述试剂盒，运用上述方法分别对3例临床非典型肺炎(SARS)病人；7例非典型肺炎疑似病人；及10例体温增高，但不符合国家疾病控制中心推荐的非典型肺炎诊断标准中非典型肺炎病人和非典型肺炎疑似病人要求；30例健康体检者结果如表1。表1
上述定量值单位为拷贝数/ml本试剂盒与德国ARTUS公司生产的SARS病毒荧光诊断试剂盒同时用于临床病例，检测结果见表2。表2
表1与表2的结果基本相同，7例非典型肺炎疑似病人中出现的1例阳性反应者为同一检测目标。
使用上述试剂盒时，SARS病毒的基因检测方法，检测步骤如下(1)提取RNA方法同实施例1。(2)荧光PCR扩增取定量荧光扩增检测试剂，加入适量DNA聚合酶与防污的尿嘧啶糖基酶(Taq+UNG)，逆转录酶于薄壁试管中，混匀，3000rpm离心数秒，取上述混合液于薄壁管中，同时预备两份装有上述混合液的薄壁管，一份加入步骤(1)制备的RNA溶液4μL，另一份加入已标定好的标准品作对照，立即进行聚合物酶链(PCR)扩增反应；(3)荧光检测同实施例1(4)临床检测结果见表3，表3
实施例3将本发明的优选SARS病毒的基因试剂盒与德国ARTUS公司生产的同类试剂相比较样品1号号为空白对照；样品2～6号选用实施例1的试剂盒及检测方法检测不同稀释梯度的SARS标准品结果；样品8～12采用德国ARTUS公司SARS病毒基因检测试剂检测不同稀释梯度的SARS标准品结果。
检测结果见表4，图4可知两者检测结果基本相同表4
实施例4-20实施例4-20是采用配制好一定浓度的标准品为摸拟检测样品，以检测所用试剂盒对样品的检测能力及准确性。
实施例4-20的试剂选择及对SARS病毒核酸标准品(标定浓度为1×106拷贝/ml)检测效果数据如表5所示，所用的试剂配制方法及对摸拟检测样品的检测方法如实施例2。
结果表明实施例4-21所选试剂对摸拟检测样品的检测结果基本准确。表5(所检标准品标定浓度为1×106拷贝/ml所检标准品)
权利要求
1.一种SARS病毒的基因检测试剂盒，包括SARS病毒特异性核酸定量标准品，即SARS的部分序列5’-TACCGTAGACTCATCTCTATGATGGGTTTCAAAATGAATTACCAAGTCAATGGTTACCCTAATATGTTTATCACCCGCGAAGAAGCTATTCGTCACGTTCGTGCGTGGATTGGCTTTGATGTAGAGGGCTGTCATGCAACTAGAGATGCTGTGGGTACTAACCTACCTCTCCAGCTAGGATTTTCTACAGGTGTTAACTTAGTAGCTGTACCGACTGGTTATGTTGACACTGAAAATAACACAGAATTCACCAGAGTTAATGCAAAACCTCCACCAGGTGACCAGTTTAAACATCTTATACC-3’其特征在于所述的试剂盒还包括以下组分(1)荧光扩增检测试剂由一步法RT-PCR缓冲液、脱氧三磷酸核苷(dNTP)混合物、特异扩增引物及特异探针以蒸馏水为溶剂混合而成，所述的特异性引物是引物S1引物序列为5′-CCAAGTCAATGGTTACCCTAATATGTT-3′引物S2引物序列为5′-GTTAGTACCCACAGCATCTCTAGTT-3′所述的特异性探针是探针S3探针序列为5′-R-AGCCCTCTACATCAAAGCCAATCCACGC-Q-3′R为报告荧光基团，Q为淬灭荧光基团。(2)DNA聚合酶(3)防止污染的尿嘧啶糖基酶(UNG)；(4)用于逆转录的逆转录酶。
2.如权利要求1所述的SARS病毒的基因检测试剂盒，其特征在于所述的荧光扩增检测试剂由下列组分以蒸馏水为溶剂混合而成一步法RT-PCR缓冲液 占反应总体积百分比10％脱氧三磷酸核苷(dNTP)混合物 100-300μM特异性引物S1 0.05-1.5μM特异性引物S2 0.05-1.5μM特异性探针S3 0.05-1.0μM余量为蒸馏水
3.如权利要求1所述的SARS病毒的基因检测试剂盒，其特征在于所述的一步法RT-PCR缓冲液由下列化合物组成500mM氯化钾(KCl)、100mM Tris-Cl、25mM氯化镁(MgCl2)、0.1％聚乙二醇6000、0.1％1，4-二巯基苏糖醇(DTT)、1％牛血清白蛋白(BSA)，其中的含量按荧光扩增检测试剂总体积计算。
4.如权利要求1所述的SARS病毒的基因检测试剂盒，其特征在于所述的脱氧三磷酸核苷(dNTP)混合物选用dATP、dTTP、dCTP、dGTP、dUTP的若干组合，可以是下式之一(1)dATP，dCTP，dGTP，dTTP配比为1∶1∶1∶1(3)dATP，dGTP，dCTP，dUTP配比为1∶1∶1∶1(4)dATP，dCTP，dGTP，dTTP，dUTP配比为4∶4∶4∶4∶1
5.如权利要求1所述的SARS病毒的基因检测试剂盒，其特征在于所述的脱氧三磷酸核苷(dNTP)混合物选用dATP，dCTP，dGTP，dTTP，dUTP组合，配比为4∶4∶4∶4∶1。
6.如权利要求1所述的SARS病毒的基因检测试剂盒，其特征在于所述的尿嘧啶糖基酶(UNG)使用浓度为100-300酶活力单位/反应，所述的DNA聚合酶使用浓度为0.5-5酶活力单位/反应，所述的DNA聚合酶可以是可以是下式之一Ampli TaqR DNA聚合酶(2)rTth DNA聚合酶(3)rTth DNA聚合酶XL。
7.如权利要求1所述的SARS病毒的基因检测试剂盒，其特征在于所述的逆转录酶使用浓度是6-300酶活力单位/反应，可以是下式之一(1)M-MuLV逆转录酶(2)AMV逆转录酶
8.如权利要求1-7之一所述的SARS病毒的基因检测试剂盒，其特征在于所述的荧光扩增检测试剂由下列组分以蒸馏水为溶剂混合而成一步法RT-PCR缓冲液为500mM氯化钾(KCl)、100mM Tris-Cl、25mM氯化镁(MgCl2)、0.1％聚乙二醇6000、0.1％1，4-二巯基苏糖醇(DTT)、1％牛血清白蛋白(BSA)脱氧三磷酸核苷(dNTP混合物)为200μMdATP，200μM dCTP，200μM dGTP，200μM dTTP，50μM dUTP特异性引物S1 0.6μM特异性引物S2 0.6μM特异性探针S3 0.2μM余量为蒸馏水
9.如权利要求1所述的SARS病毒的基因检测试剂盒，其特征在于所述的试剂盒包括(1)荧光扩增检测试剂由下列组分以蒸馏水为溶剂混合而成一步法RT-PCR缓冲液为500mM氯化钾(KCl)、100mM Tris-Cl、25mM氯化镁(MgCl2)、0.1％聚乙二醇6000、0.1％1，4-二巯基苏糖醇(DTT)、1％牛血清白蛋白(BSA)脱氧三磷酸核苷(dNTP混合物)为200μMdATP，200μM dCTP，200μM dGTP，200μM dTTP，50μM dUTP特异性引物S1 0.6μM特异性引物S2 0.6μM特异性探针S3 0.2μM余量为水(2)DNA聚合酶选用Ampli TaqR DNA聚合酶 2.0酶活力单位/反应(U)；(3)尿嘧啶糖基酶(UNG)200酶活力单位/反应(U)；(4)逆转录酶选用M-MuLV 200酶活力单位/反应(U)。
10.一种SARS病毒的基因检测方法，以SARS病毒特异性核酸定量标准品为对照，即SARS的部分序列5’-TACCGTAGACTCATCTCTATGATGGGTTTCAAAATGAATTACCAAGTCAATGGTTACCCTAATATGTTTATCACCCGCGAAGAAGCTATTCGTCACGTTCGTGCGTGGATTGGCTTTGATGTAGAGGGCTGTCATGCAACTAGAGATGCTGTGGGTACTAACCTACCTCTCCAGCTAGGATTTTCTACAGGTGTTAACTTAGTAGCTGTACCGACTGGTTATGTTGACACTGAAAATAACACAGAATTCACCAGAGTTAATGCAAAACCTCCACCAGGTGACCAGTTTAAACATCTTATACC-3’，包括RNA提取，聚合物酶链反应(PCR)扩增及荧光检测，其特征在于所述的检测方法直接用待测病人的静脉血标本或漱口液或呼吸道分泌物为分析样本，提取出样本中的RNA作为核酸模板，再对核酸模板进行荧光聚合酶链反应扩增，所用的荧光扩增检测试剂包括一步法RT-PCR缓冲液、脱氧三磷酸核苷(dNTP)混合物、特异扩增引物及特异探针，所述的特异扩增引物是引物S1引物序列为5′-CCAAGTCAATGGTTACCCTAATATGTT-3′引物S2引物序列为5′-GTTAGTACCCACAGCATCTCTAGTT-3′所述的特异性探针是探针S3探针序列为5′-R-AGCCCTCTACATCAAAGCCAATCCACGC-Q-3，其中R为报告荧光基团，Q为淬灭荧光基团。用荧光扩增检测试剂扩增时还需加入DNA聚合酶与防污染的尿嘧啶糖基酶及用于逆转录的逆转录酶。
11.如权利要求10所述的SARS病毒的基因检测方法，其特征在于所述的检测方法步骤如下(1)提取RNA采取待测病人一定量的标本经前处理，按常规方法提取RNA，气干后加入10μlDEPC H2O溶液溶解RNA，该溶解的RNA作为核酸模板，直接进行荧光PCR扩增操作或置于-80℃保存；(2)荧光PCR扩增取定量荧光扩增检测试剂，加入适量DNA聚合酶与防污染的尿嘧啶糖基酶、逆转录酶于薄壁试管中，混匀，3000rpm离心数秒，取上述混合液于薄壁管中，同时至少预备两份装有上述混合液的薄壁管，一份别加入步骤(1)制备的RNA溶液，另一份加入已经标定的标准品作为对照，立即进行聚合物酶链(PCR)扩增反应；(3)荧光检测样品反应管及对照标准品反应管置于定量荧光PCR仪检测，设置循环条件设置，进行荧光检测；(4)结果分析选择荧光检测模式FAM荧光，基线调整取6-16个循环的荧光信号；阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品的最高点；荧光增长曲线超过阈值线，并呈良好的对数增长，判断为阳性。
12.如权利要求11所述的SARS病毒的基因检测方法，其特征在于选用如下优选SARS病毒的基因检测试剂盒，包括SARS病毒特异性核酸定量标准品及(1)荧光扩增检测试剂由下列组分以蒸馏水为溶剂混合而成一步法RT-PCR缓冲液为500mM氯化钾(KCl)、100mM Tris-Cl、25mM氯化镁(MgCl2)、0.1％聚乙二醇6000、0.1％1，4-二巯基苏糖醇(DTT)、1％牛血清白蛋白(BSA)脱氧三磷酸核苷(dNTP混合物)为200μMdATP，200μM dCTP，200μMdGTP，200μM dTTP，50μM dUTP特异性引物S1 0.6μM特异性引物S2 0.6μM特异性探针S3 0.2μM余量为蒸馏水(2)DNA聚合酶选用Ampli TaqR DNA聚合酶 2.0U(3)尿嘧啶糖基酶(UNG)200U(4)逆转录酶选用M-MuLV 200U使用上所述优选试剂盒时，所述的检测方法步骤(2)荧光PCR扩增为取35μL荧光扩增检测试剂，加入0.4μL DNA聚合酶与防污的尿嘧啶糖基酶(Taq+UNG)，1μL逆转录酶于薄壁试管中，混匀，3000rpm离心数秒，取上述混合液于薄壁管中，同时预备两份装有上述混合液的薄壁管，一份加入步骤(1)制备的RNA溶液4μL，另一份加入已标定好的标准品作对照，立即进行聚合物酶链(PCR)扩增反应；所述的检测方法步骤(3)荧光检测为样品反应管及对照标准品管置于定量荧光PCR仪检测，FTC2000或PE5700或PE7700仪器推荐循环条件设置45℃×30min；94℃×5min；再按93℃×10sec→56℃×10sec→72℃×10sec，循环10次；再按93℃×10sec→60℃×40sec，循环40次；单点荧光检测在60℃。lightcycler推荐循环条件设置45℃×20min；94℃×2min；再按93℃×2sec→55℃×15sec→72℃×12sec，循环50次；单点荧光检测在55℃。
全文摘要
一种SARS病毒的基因检测试剂盒及检测方法，以SARS病毒特异性核酸定量标准品为对照，包括RNA提取，聚合物酶链反应(PCR)扩增及荧光检测，所述的检测方法直接用待测病人的静脉血标本或漱口液或呼吸道分泌物为分析样本，提取出样本中的RNA作为核酸模板，再对核酸模板进行荧光聚合物酶链反应扩增，所用的荧光扩增检测试剂包括一步法RT－PCR缓冲液、脱氧三磷酸核苷(dNTP)混合物、及特异扩增引物及特异探针。这种检测方法快捷，方便，能够尽快确诊病人的分泌物或血液中是否存在SARS病毒，有效减少SARS病毒在人群中传播。
文档编号C12Q1/68GK1468965SQ03117040
公开日2004年1月21日 申请日期2003年5月16日 优先权日2003年5月16日
发明者李兰娟, 姜汉卿, 沃健儿, 吴南屏, 邵俊斌, 麻静明 申请人:浙江大学医学院附属第一医院, 杭州博赛基因诊断技术有限公司