专利名称：一种农杆菌介导的植物无选择基因转化及无选择标记基因转化方法
技术领域：
本发明为一种农杆菌介导的植物无选择基因转化方法，特别是一种直接的获得无选择标记转基因植株的方法。涉及到基因工程技术，特别针对无选择标记转基因植株的生产。属于生物学领域。
背景资料转基因技术业已成为解决多细胞生物，特别是植物重要生物学问题最强有力的工具。许多利用传统遗传学方法不能完成的任务通过利用转基因技术则可使之成为现实，如具有修饰与不同功能的同源或异源基因可通过转基因的方式引入植物，使植物快速获得人们所需要的性状。
植物基因转化技术在近十多年来发展迅速，通过农杆菌(包括由其衍生的内吸法)、基因枪、原生质体、针刺、超声波、花粉管通道等方法获得的转基因材料仅在美国进行田间实验的迄今已超过8925份，涵盖了玉米、水稻、大豆、油菜、土豆、西红柿等98个物种(www.nbiap.vt.edu/cfdocs/fieldtestsl.cfm)。在众多的转基因技术中，农杆菌介导的基因转化是最常使用的一种基因转化方法。这一技术的成功应用得益于或者说依赖于选择标记基因的使用。选择标记基因的使用使我们能够利用相应的选择试剂将稀有的转化细胞与数目庞大的非转化细胞通过抑制非转化细胞的生长发育而区分开来。因此，选择标记基因被广泛应用于植物基因转化。利用选择标记基因就是利用其表达产物能对相应的选择试剂进行修饰，从而使携带有该基因的转化细胞对相应的选择试剂产生抗性。
目前广泛使用的选择标记基因常常是一些显性基因的编码抗生素抗性或除草剂抗性基因(Yoder and Goldsbrough，1994)。在进行基因转化时，相应的选择试剂是抗生素或除草剂。尽管这些选择标记基因对基因转化过程来说是非常有用的，但它也存在一些致命的弱点(1)抗生素或抗除草剂的使用常常对转化细胞的分化与再生产生负面影响，它能抑制不定芽的分化(Ebinuma et al.，1997)；(2)对于一些不敏感或耐选择的品种，这些选择试剂不能很好地区分转化与非转化细胞，因而不能起到其应有的作用(Ebinuma et al.，1997)；(3)这些选择标记基因常常与目的基因连锁，一起整合到植物基因组中，从而对转化植株产生一系列不良的影响(a).这些选择标记基因的构成性表达，一般不能对转基因植株的生长与发育产生积极的影响，反而不必要地耗费了转基因植株的生物能；(b).这些选择标记基因表达产物在食品中的存在，产生了潜在的食品安全性问题，使得广大消费者对转基因食品产生戒备心理；(c).这些选择标记基因向其它物种的漂移，可能造成难以估量的环境与生态安全性问题，极大地影响了转基因作物的推广与应用；(d).当对同一品种进行多功能修饰时，可能涉及多次重复转化，因而需要多个有效的选择标记基因。因此，选择标记基因在转化体中的存在，能够阻碍多个功能基因在同一转化株系上的叠加。
为了避免上述问题的发生，最好的方式是用不含选择标记基因的转化植株(Marker-free transgenic plants)代替含有选择标记基因的转化植株。理论上，获得无选择标记基因转化植株的方法有两种(1)在基因转化过程中利用选择标记基因及其相应的选择试剂；当转化的细胞、组织或植株获得后，再切除或分离选择标记基因；(2)通过无选择基因转化(Nonselective gene transformation)方法，即在转化载体的构建时就剔除选择标记基因，在基因转化过程中不使用选择试剂。
1994年，Yoder等总结了三种通过先利用后切除获得无选择标记基因转基因植株(marker-free transgenic plants-MFTPs)的方法(1)共转化法其原理是将传统上串联在一起的选择标记基因与目的基因分别构建在不同的表达载体或不同的T-DNA上，同时转化共同的外植体。通过选择，以期获得不仅含有选择标记基因，同时还含有目的基因的转基因植株；通过选择这类转基因植株的有性生殖后代，即可获得不含选择标记基因只含目的基因的转基因株系。尽管这一方法在烟草、油菜等作物上获得了MFTPs，但效率很低，未见有进一步应用于商业系统中的报导。1996年，Komari等运用超级双元载体质粒系统对水稻、烟草进行了基因共转化研究，获得了较为理想的结果，并于1998年获得运用超级双元载体进行基因共转化的专利。其共转化率达到50％，分离整合率也达50％，即从25％的共转化植株的有性生殖后代中可分离得到MFTPs。
(2)转座法将选择标记基因或目的基因与转座元相连一同转入受体中，利用转座元受激转座的特性(在转座酶或组织培养的诱导下)，打破目的基因与选择标记基因的连锁状态，从而可从转基因植株的杂交后代中获得无选择标记基因的转基因植株。
(3)重组法如Cre/lox系统，当两个34bp的loxp序列以相同顺序排列时，其间插入的基因将在Cre酶的作用下被剪切和重组，从而可从转基因植株的有性杂交后代中分离得到MFGPs。
1997年，Ebinuma等利用农杆菌Ti质粒中的异戊烯基转移酶(ipt)基因代替传统的抗生素抗性基因及抗除草剂基因作为选择标记基因，并将其与玉米转座元Ac相连进行转化，通过再生芽的形态变化，即从无激素(细胞分裂素)培养基上无顶端优势芽的再生到正常苗的分化，判断基因是否已转化及选择标记基因是否剔除，从而建立了从转化体中剔除选择标记基因，使转化体获得多次重复转化(multi-auto transformation-MAT)的体系，MFGPs的获得率达5％。该体系的优点在于MFGPs的获得无需经过有性生殖。1999年，该研究小组对上述MAT体系进行了改进，用R/RS重组系统代替Ac转座元，使得MFGPs的获得率大幅度提高。2000年，他们又对上述体系做了进一步的改进，用一种化学诱导型启动子GST(glutathione-S-transferase)代替35S构成性启动子驱动R重组酶基因，使得MFGPs的获得率达到14％。就目前情况分析，GST-MAT体系代表了生产MFGPs的最高水平。
除上述三种方法外，还有一种方法就是以一类所谓“无害”的基因来替代抗生素抗性等“有害”基因作为选择标记基因。如磷酸甘露糖异构酶(phosphomannoseisomerase-PMI)基因。PMI能将甘露糖转化为果糖，故而可用甘露糖作为碳源代替一般培养基中的葡萄糖或蔗糖从而选择已转入PMI基因的细胞。综上所述，为解决选择标记基因的问题，上述思路是先利用，后剔除，如前三种方法；另一思路是谋求所谓“无害”的基因。但是，这两种思路都没有从根本上摆脱对选择标记基因的依赖性。
发明者认为上述目的可以通过无选择基因转化的方式达到；即在构建转载体的T-DNA时，切除已有的选择标记基因或视所有基因为目的基因；但是，这就产生了另外一个问题即在利用这样的载体进行目的基因的转化过程中，由于没有可供利用的选择试剂，能否有效地获得含目的基因的转基因植株。利用普通的农杆菌介导的基因转化程序与方法，在缺少选择标记基因及相应的选择试剂的条件下，是不能有效地获得含目的基因的转基因植株的。因此，必须发明新的转基因程序来解决这一问题，从而在没有选择的条件下也能有效地获得含有目的基因的转基因植株。
普通的农杆菌介导的基因转化方法包括如下几个过程(1)含目的基因及适当的选择标记基因的农杆菌的培养；(2)植物外植体的制备；(3)农杆菌对外植体的侵染与共培养；(4)在含选择试剂的选择培养基上扩增转化细胞与组织；(5)在含选择试剂的选择培养基上再生转化植株；普通的农杆菌介导的基因转化方法需要选择标记基因，需要使用选择试剂，我们认为是有如下三个因素a.转化外植体太大，在一个外植体中能再生的转化细胞在能再生的非转化细胞中所占的比例太低，往往不到百分之一乃至千分之一，使得这些转化细胞如无选择试剂对非转化细胞的生长与分化的抑制，很难或只能以极低的频率再生成为转基因植株。b.大部分的已转化细胞是一些充分暴露给农杆菌的细胞，这些细胞极易受农杆菌的侵染而死亡，从而使已转化细胞与非转化细胞的比例进一步下降。c.普通的转化程序中农杆菌与转化外植体的共培养皆是在含有充足营养的培养介质中进行；我们认为这样营养充足的环境是不利于农杆菌对植物材料的侵染及目的基因的转化；我们认为农杆菌对植物的侵染是一耗能过程，在不危及繁殖与生存的条件下，农杆菌没有必要进行这一耗能的过程。
普通的农杆菌介导的基因转化方法需要选择标记基因，其根本的原因在于转化频率低下，转化细胞在非转化细胞中所占的比例太低。如果要在无选择试剂的条件下获得转基因植株，就必须提高转化细胞在非转化细胞中所占的比例，提高基因的转化频率。
发明内容
本专利提供了一种农杆菌介导的植物无选择基因转化方法。特别地，该专利发明提供了制备缩小的外植体的方法、抑制农杆菌诱导的受侵染细胞死亡的方法、在营养缺失条件下共培养的方法。本发明提供了这些方法的优化组合，且在无选择条件下，高频率地获得转基因植株。
本发明为植物基因工程提供一种新的农杆菌介导的转基因方法。通过该方法，可以直接地、高频率地获得所需的含目的基因的转化植株；选择标记基因在该转化方法中是可有可无的，与选择标记基因相对应的选择试剂在本方法中是不需要的。
本发明为植物基因工程提供一种新的获得无选择标记转基因植株的方法。通过在转化载体T-DNA上不附加或切除已有的选择标记基因，再利用本发明的转化程序，在再生的转基因植株中即有一定比例的植株是含目的基因的转基因植株，这类转基因植株的选择与鉴定可通过分子生物学或化学的方法进行。
本发明还为植物基因工程提供了一种可提高转化频率的农杆菌介导的转基因方法，无论使用或不使用选择标记基因或选择试剂。
本发明是这样完成的一种农杆菌介导的植物无选择基因转化方法，其特征在于所说的无选择是指在基因转化过程中不使用选择试剂对转化的植物细胞或组织进行差别选择，则转化的T-DNA中不含有选择标记基因。所说的无选择包括以下内容和步骤(1)构建适用于农杆菌介导的基因转化载体，无论在T-DNA上含有或不含有选择标记基因，所有的基因皆视为目的基因；(2)使用缩小的外植体，一般地，这类外植体或外植体的受侵染截面含有1-20个可再生细胞；(3)外植体通过预处理或预培养，减少农杆菌作用所引起受侵染细胞的死亡；(4)将这类通过预处理或预培养的外植体与农杆菌在近似农杆菌自然侵染的营养缺失条件下共培养；(5)使用抗生素抑制农杆菌的生长；(6)在不含有选择试剂的培养基中诱导外植体愈伤组织；(7)在不含有选择试剂的分化培养基中获得再生植株；(8)通过分子生物学或化学分析鉴定转基因植株。
在无选择的条件下高频、高效且可大量地生产转基因植株，其关键步骤包括以下四个方面(1)使用缩小的外植体，一般地，这类外植体或外植体的受侵染截面含有1-20个可再生细胞；(2)外植体通过预处理或预培养，以减少由于农杆菌的作用引起受侵染细胞的死亡；(3)将这类通过预处理或预培养的外植体与农杆菌在近似农杆菌自然侵染的营养缺失条件下共培养；(4)在不含选择试剂的培养基上扩增、分化转基因细胞及组织，最终获得转基因植株。
本发明一种农杆菌介导的植物无选择基因转化方法其T-DNA是任何意义上的核酸序列，但一定包括T-DNA左右边界。不使用的选择试剂，包括抗生素、除草剂等一切有利于已转化细胞或组织生长发育的化学药品与试剂及有利于已转化细胞或组织的识别的化学药品与试剂。所指的农杆菌是土壤农杆菌Agrobacteriumtumefaciens；所指的植物是甘蓝型油菜Brassica napus。在不使用选择试剂的条件下，有效地获得含目的基因转基因植株的基因转化方法；这种有效性是指在再生的植株中，含目的基因的转基因植株所占的百分数为5％至20％。在转化载体T-DNA上不含选择标记基因时进行基因转化的方法。
本发明所述的一种农杆菌介导的植物无选择转基因及无选择标记基因转化方法，其特征是缩小外植体的方法，包括机械或手工切割、酶解和营养缺失培养。抑制农杆菌侵染引起的植物细胞、组织死亡的方法，包括热击处理，添加能抑制侵染细胞死亡的化学试剂如硝酸银、PVP、活性炭、维生素C、谷胱甘肽或半胱氨酸。在近似农杆菌自然侵染的营养缺失条件下的共培养方法；包括吸干培养基或不含营养物质的共培养方法。
本发明转化方法同样适用于有选择标记基因及有选择试剂的转基因程序中，它有助于提高转化频率，转基因植株的选择与鉴定是通过分子生物或化学的方法；抗生素是卡那霉素、潮霉素、庆大霉素、博莱霉素、链霉素、壮观霉素、氯霉素、新霉素等一切能影响植物细胞与织组生长发育的抗生素；除草剂是草甘膦、草酰膦、磺酰脲等一切能影响植物细胞与织组生长发育的除草剂；选择试剂还包括如氨甲蝶呤钠等一切能影响植物细胞与织组生长发育的酶抑制剂；选择试剂还包括甘露糖醇等一切能差别已转化的植物细胞与织组生长发育的化学药品与试剂；有利于已转化细胞与组织识别的化学药品与试剂是在特定酶的作用下生色或产生荧光的物质。
本发明农杆菌介导的植物无选择基因转化方法为1.T-DNA的构成本发明所涉及的T-DNA的构建与构成与普通的农杆菌介导的基因转化所构建的T-DNA没有特异之处。但利用该专利发明的方法进行无选择标记基因转化时，应当在构建的T-DNA上不含或切除已有的选择标记基因。
2.缩小的外植体的制备转基因植株获得的关键在于农杆菌对外植体细胞、对外植体可再生细胞(全能性细胞)的有效侵染，这种受侵染细胞的快速扩增、繁殖及重新组织化与有效分化。为达到上述目的，外植体的缩小是一个重要的步骤。第一，它有利于增加外植体外表面受侵染细胞占外植体细胞总数的比值，有利于农杆菌的侵染；第二，它有利于受侵染细胞少受未侵染细胞的影响而更为独立地扩增、繁殖，从而有利于转化细胞与组织的再生。本专利发明所指的缩小的外植体，一般指的是可再生细胞的总数或受侵染截面可再生细胞数1-20个的外植体，它们可通过以下三种方式获得(1)机械与手工切割法。将含有可再生细胞(全能性细胞)的植物植株、器官、组织利用机械(如匀浆器)或手工在无菌条件下切割在细小的颗粒。通过一定孔径的筛网，收集适于农杆菌侵染的颗粒。一般地，这些颗料直径的大小在35um到500um之间；更好地，在46um到230um之间。
(2)酶解法。将含有可再生细胞(全能性细胞)的植物植株、器官、组织利用酶(通常地，是纤维素酶和果胶酶)剥离细胞壁及其外部组织，形成单个分离的原生质体，收集并培养这样的原生质体，使之用于农杆菌的转化。
(3)营养缺失培养(或饥饿培养)法。植物的植株、器官、组织在营缺失条件下，如在无光照及无无机盐、无有机成份的培养基上培养时，所形成的外植体切口处细胞总量与对照(未经这样的处理，在正常基质及光照条件下培养)相比明显下降，从而达到缩小外植体的目的。
3.抑制农杆菌诱导的受侵染细胞死亡农杆菌诱导的侵染细胞的死亡能够通过热击处理植物组织或外植体的方式降低或抑制。这种热击处理是先于农杆菌的侵染的，最佳热击温度是30-45℃，特别地，在32-37℃；处理时间一般在0.1h-24h之间；最佳地，在8h-16h之间。
农杆菌诱导的侵染细胞的死亡能够通过使用化学抑制剂(如乙烯抑制剂，硝酸银)、非极性有机物质吸附剂(如PVP和活性炭)、活性氧化性物质还原剂(如VC、谷胱甘肽及半胱氨酸)降低或抑制。硝酸银的使用浓度一般在1-10mg/L；PVP和活性炭的使用量在0.1-0.5g/L；VC的使用量在0.5-10g/L；谷胱甘肽及半胱氨酸的使用量一般在10-100mg/L。这种抑制物的处理同样是先于农杆菌的侵染的，并且延续到共培养及转化细胞的扩增与繁殖阶段；预处理时间(先于农杆菌侵染)一般在16-72h之间，后处理时间(与农杆菌共培养后)一般在7-14天之间。
4.营养缺失条件下共培养将制备与预处理后的外植体与一定浓度的农杆菌混合在液体的含有植物细胞生长激素(如2，4-D)的具有正常营养成份的培养基(如MS培养基)及缺乏营养成份的介质(只含有激素、渗透压调节成份以及上述的农杆菌诱导的细胞死亡抑制剂成份的介质)中浸染10-120min；然后，吸干液体介质，在保持一定湿度的情况下，使外植体与农杆菌在营养缺失的条件下共培养2-7天。
5.转化细胞的扩增与繁殖共培养后的外植体被转移到液体或固体的添加有植物细胞生长激素(如2，4-D)及农杆菌生长抑制剂(如羧苄青霉素)并上述的农杆菌诱导的细胞死亡抑制剂的MS培养基上培养7-20天，此时的转化的细胞被扩增到几十到几百个细胞的团块。
6.转化植株的再生被扩增了转化细胞的外植体被转移到液体或固体的添加有植物细胞分裂素(如6-BA，Zt等)的MS培养基上培养10-40天。再生技术是众所周知的，对于本发明来说是不重要的，任何能产生可育的再生植株的培养技术都能用于本专所涉及的无选择基因转化。
7.转化植株的分析鉴定通过上述方法产生的再生植株，由于在转化过程中没有使用任何选择试剂，在再生的植株中相当一部份是未转化植株；只有5％，最佳地，20％左右的再生植株是转基因植株。利用常用的分子生物学方法(如点杂交法，PCR扩增法)及化学分析法(分析转基因的表达产物、代谢产物等)可以区分、区别这些再生的转基因植株。
本发明专利将进一步通过下列实例加以说明，但它将不对专利要求书中的条款产生限制。
图1采用本发明农杆菌介导的植物无选择基因转化及无选择标记基因转化方法在植株叶片材料的染色结果图。
图2本发明农杆菌介导的植物无选择基因转化及无选择标记基因转化方法在愈伤组织阶段转化材料的染色结果图。
图3本发明农杆菌介导的植物无选择基因转化及无选择标记基因转化方法，在农杆菌介导的油菜无选择基因转化技术路线。
具体实施例方式下述实例转基因植株能够通过农杆菌介导的无选择基因转化方法获得。当然，这种无选择基因转化需要特殊的组织培养及农杆菌侵染程序。
实例1缩小的外植体的制备方法1-机械切割法用升汞或20％的商品次氯酸钠溶液灭菌甘蓝型油菜品种威斯塔(Brassica napuscv Westar)种子，播种于MS培养基上培养7-10天。切割并收集幼苗1-2cm带芽尖及子叶组织的上半部份，用已灭菌的不锈钢细胞匀浆器在液体介质中将其切碎。一般地，每200棵幼苗使用30-50ml液体MS培养基。匀浆后的混合液用一系列不同孔径的滤网过滤，收集46-230um直径大小的组织颗粒。将这些小颗粒的外植体在预培养介质(见后述文字)中预培养1-3天即成为合适大小的可用于农杆菌侵染试验的缩小的外植体。后续的转化实验的结果表明，外植体的缩小明显提高了外植体受侵染的效率及转化细胞在外植体中的百分率(见表1)。
表1 机械切割缩小的外植体的大小对外植体受侵染效率的影响
上述实验是基于农杆菌侵染及共培养后再培养一周，经X-Gluc染色后统计的结果。转化细胞所占的百分率是指在含有转化细胞的组织中转化细胞与非转化细胞比值的平均值。
实例2缩小的外植体的制备方法2-酶解法将甘蓝型油菜品种威斯塔播种于温室(17-23℃)。20天后，取植株的第3-10片真叶在20％的商品次氯酸钠溶液及0.1％的吐温20中灭菌5-15min。用细砂纸打磨叶片的背面，于含有纤维素酶2mg/ml、果胶酶0.25mg/ml及甘露糖醇100mg/ml的酶解液中酶解8-20h。按普通的原生质体分离程序分离及洗涤，并将洗涤后的原生质体于60mm直径的培养皿中培养3-12天；原生质体培养密度为1×105个/ml，培养基为1/2MS加2，4-D0.5mg/L，NAA0.5mg/L，6-BA0.5mg/L及甘露糖醇100g/L。收集培养后的原生质体及其愈伤，在预培养介质(见后述文字)中预培养1-3天即成为合适大小的可用于农杆菌侵染试验的缩小的外植体。后续的转化实验的结果表明，不同大小的原生质体愈伤外植体对外植体受侵染的效率及转化细胞在外植体中的百分率有着明显的影响(见表2)。
表2不同大小的原生质体愈伤外植体对外植体受侵染的效率影响
上述实验是基于农杆菌侵染及共培养后再培养一周，经X-Gluc染色后统计结果。转化细胞所占百分率是指在含有转化细胞的组织中转化细胞与非转化细胞比值的平均值。
实例3缩小的外植体的制备方法3-营养缺失培养(或饥饿培养)法用升汞或20％的商品次氯酸钠溶液灭菌甘蓝型油菜品种威斯塔(Brassica napuscv Westar)种子，播种于1/4MS或无营养物质的培养基上暗培养7-10天。将幼苗的下胚轴切成0.7-1.0cm的片段，在预培养介质(见后述文字)中预培养1-3天即成为合适大小的可用于农杆菌侵染试验的缩小的外植体。后续的转化实验的结果表明，采用或不采营养缺失培养(CK，用正常的MS并含有蔗糖10g/L的培养基且在有光照周期的条件下培养)对外植体受侵染的效率及转化细胞在外植体中的百分率有着明显的影响(见表3)表3营养缺失培养对外植体受侵染的效率影响
上述实验是基于农杆菌侵染及共培养后再培养一周，经X-Gluc染色后统计的结果。转化细胞所占的百分率是指在含有转化细胞的组织中转化细胞与非转化细胞比值的平均值。
实例4农杆菌诱导的受侵染细胞死亡的抑制方法1-热击处理法将用上述方法获得的或经过预培养的缩小的外植体于30-45℃，特别地，在32-37℃的培养箱中处理0.1h-24h；最佳地，8h-16h。处理后的外植体再进行农杆菌的侵染、共培养、转化细胞的扩增(见后述文字)，结果表明热击处理明显地增加了转化细胞的存活率(见表4)。
表4热击处理对外植体受侵染的效率影响
上述实验是基于农杆菌侵染及共培养后再培养一周，经X-Gluc染色后统计的结果。转化细胞所占的百分率是指在含有转化细胞的组织中转化细胞与非转化细胞比值的平均值。CK表示相同组织但未经热击处理。
本发明通过利用热击及一些能抑制农杆菌诱导转化细胞死亡的试剂预处理外植体，提高了转化细胞的存活率，从而提高了转化细胞在可再生细胞中的比例。
本发明通过改善农杆菌与外植体的共培养环境与条件，在营养缺失的条件下使得农杆菌对植物细胞的侵染效率得以提高。
本发明通过上述三个转化条件的改变，大大提高了外植体的转化频率，使之达到90％以上。在无选择条件下再生的植株中转基因植株的比例达到5％以上，一般地，可达20％以上。
特别地，本发明所采用的缩小外植体、防止农杆菌引起受侵染细胞死亡的抑制措施、在营养缺失条件的共培养等方法对甘蓝型油菜以外的植物转化都具有有益的作用。
本发明通过降低外殖体中可再生细胞的总数(优势地，在10-20个之间)，即缩小外植体的方法，使得只要一旦在外植体中存在有转化细胞，其所占的比例即可大于5％，以有利于该转化细胞最终成为转化植株。
权利要求
1.一种农杆菌介导的植物无选择基因转化及无选择标记基因转化方法，其特征在于所说的无选择是指在基因转化过程中不使用选择试剂对转化的植物细胞或组织进行差别选择，如在转化的T-DNA中不含有选择标记基因，则该方法即为无选择标记基因转化法。
2.根据权利要求1所述的一种农杆菌介导的植物无选择基因转化及无选择标记基因转化方法，其特征在于所说的无选择基因转化包括以下内容和步骤(1)构建适用于农杆菌介导的基因转化载体，无论在T-DNA上含有或不含有选择标记基因，所有的基因皆视为目的基因；(2)使用缩小的外植体，一般地，这类外植体或外植体的受侵染截面含有1-20个可再生细胞；(3)外植体通过预处理或预培养，减少农杆菌作用所引起受侵染细胞的死亡；(4)将这类通过预处理或预培养的外植体与农杆菌在近似农杆菌自然侵染的营养缺失条件下共培养；(5)使用抗生素抑制农杆菌的生长；(6)在不含有选择试剂的培养基中诱导外植体愈伤组织；(7)在不含有选择试剂的分化培养基中获得再生植株；(8)通过分子生物学或化学分析鉴定转基因植株；
3.根据权利要求1或2所述的一种农杆菌介导的植物无选择基因转化及无选择标记基因转化方法，其特征在于无选择标记基因转化法是指在构建T-DNA时不附带或切除已有的选择标记基因并应用上述步骤进行基因转化的方法。
4.根据权利要求1或2所述的一种农杆菌介导的植物无选择基因转化及无选择标记基因转化方法，其特征是在无选择的条件下高频、高效且可大量地生产转基因植株，其关键步骤包括以下四个方面(9)使用缩小的外植体，一般地，这类外植体或外植体的受侵染截面含有1-20个可再生细胞；(10)外植体通过预处理或预培养，以减少由于农杆菌的作用引起受侵染细胞的死亡；(11)将这类通过预处理或预培养的外植体与农杆菌在近似农杆菌自然侵染的营养缺失条件下共培养；(12)在不含选择试剂的培养基上扩增、分化转基因细胞及组织，最终获得转基因植株。
5.根据权利要求1或2所述的一种农杆菌介导的植物无选择基因转化及无选择标记基因转化方法，其T-DNA是任何意义上的、一定包括T-DNA左右边界核酸序列。
6.根据权利要求1或2所述的一种农杆菌介导的植物无选择基因转化及无选择标记基因转化方法，其特征在于不使用的选择试剂，包括抗生素、除草剂等一切有利于已转化细胞或组织生长发育的化学药品与试剂及有利于已转化细胞或组织的识别的化学药品与试剂。
7.根据权利要求1或2所述的一种农杆菌介导的植物无选择基因转化及无选择标记基因转化方法，其特征是所指的农杆菌是土壤农杆菌Agrobacteriumtumefaciens；所指的植物是甘蓝型油菜Brassica napus。
8.根据权利要求1和2所述的一种农杆菌介导的植物无选择基因转化及无选择标记基因转化方法，其特征是在不使用选择试剂，有效地获得含目的基因转基因植株的基因转化方法；其有效性是指在再生的植株中，含目的基因的转基因植株所占的百分数为5％至20％。
9.根据权利要求1和2所述的一种农杆菌介导的植物无选择转基因及无选择标记基因转化方法，所指的缩小外植体的方式包括机械或手工切割、酶解和营养缺失培养。
10.根据权利要求1和2所述的一种农杆菌介导的植物无选择基因转化及无选择标记转基因方法，所指的抑制农杆菌侵染引起的植物细胞、组织死亡的方式包括热击处理，添加能抑制侵染细胞死亡的化学试剂如硝酸银、PVP、活性炭、维生素C、谷胱甘肽或半胱氨酸。
11.根据权利要求1和2所述的一种农杆菌介导的植物无选择基因转化及无选择标记转基因方法，其特征是在近似农杆菌自然侵染的营养缺失条件下的共培养方法；包括吸干培养基或不含营养物质的共培养方法。
全文摘要
本发明涉及一种农杆菌介导的植物无选择基因转化方法，步骤为构建适用于农杆菌介导的基因转化载体；使用缩小的外植体，这类外植体或外植体的受侵染截面含有1－20个可再生细胞；外植体被通过预处理或预培养，以减少由于农杆菌的作用引起的受侵染细胞的死亡；将这类外植体与农杆菌在营养缺失的条件下共培养；使用抗生素抑制农杆菌的生长；在不含有选择试剂的培养基中诱导外植体愈伤组织；在不含有选择试剂的分化培养基中获得再生植株；通过分子生物学或化学分析鉴定转基因植株；转基因植株在所有再生植株中所占的比例高于20％。
文档编号C12N15/74GK1515671SQ0311712
公开日2004年7月28日 申请日期2003年1月6日 优先权日2003年1月6日
发明者王敬乔, 李根泽, 陈薇, 和江明, 寸守铣 申请人:云南省农业科学院生物技术研究所