专利名称：梅岭霉素c5-酮基还原酶基因的制作方法
技术领域：
本发明涉及的是一种将梅岭霉素糖苷配基C5-酮基还原为羟基的C5-酮基还原酶基因，特别是一种梅岭霉素C5-酮基还原酶基因，属于基因技术领域。
背景技术：
梅岭霉素(meilingmycin)是由南昌链霉菌(Streptomyces nanchangensis)产生的一种十六元大环内酯类抗生素，它的母核和世界著名抗生素阿弗菌素(avermectin)一致，而侧链则完全不同。由于阿弗菌素独特的作用机制，以及所具有的高效、毒副作用低、安全性高和对环境影响极小等优点，使这一大环内酯类抗生素逐渐成为目前世界上使用最广泛的驱线虫和除杀外寄生虫抗生素，尤其是该类抗生素防治节肢动物类寄生虫病的效果是当今其它抗生素不可替代的，阿弗菌素对防治全球性的畜禽寄生虫病起到了极为重要的作用并获得了巨大的经济效益，详见Haruo Ikeda and Satoshi Omura.Avermectin biosynthesis(阿弗菌素的生物合成).Chemical reviews(化学综述).1997，97，2591-2609。从母核相同的角度考虑，梅岭霉素与阿弗菌素有着相似的生物学活性。实验证明，梅岭霉素和阿弗菌素一样，完全无抗微生物活性，而有广谱杀虫活性，并且梅岭霉素也是通过破坏昆虫、螨类、圆虫类的神经系统而起作用的，而且杀虫谱及活性优于阿弗菌素。
发明内容
本发明的目的在于提供一种梅岭霉素C5-酮基还原酶基因，使其可用于医药、工业、农业的化合物或蛋白的创新和发展。本发明是通过以下技术方案实现的，本发明根据已知的阿弗菌素生物合成基因簇序列(国际GenBank数据库登录号AB032524)，通过聚合酶链式反应(PCR)扩增出阿弗菌素生物合成基因簇中负责催化梅阿弗菌素苷配基C5-酮基进行还原的C5-酮基还原酶基因(aveF)片段，并以之为探针进行Southern杂交，从南昌链霉菌基因文库中获得包含有其同源序列的阳性科斯质粒(cosmid)。对其进行核苷酸序列测定和分析后，从南昌链霉菌中获得了与C5-酮基还原酶基因高度同源的基因，被命名为meiF，其核苷酸序列长度为936个碱基对(bp)，编码311个氨基酸。由AveF的生物学功能类比，MeiF的生物学功能是催化梅岭霉素糖苷配基C5-酮基还原为羟基。
本发明利用已克隆的基因在抗生素生物合成基因簇中进行同源基因的定向敲除或增加，创造出非天然的“杂合”分子以开辟利用组合生物合成及遗传工程技术创新微生物药物的新途径，为已知生物活性分子的高产和新微生物农药的创新提供新的技术和手段。
在药物的创新方面，可利用已克隆的基因进行下述基因操作(1)基因敲除通过基因置换或基因中断技术定向去除或失活不同抗生素生物合成基因簇中的该同源基因，获得在相应化学结构处的酮基不发生还原的新的结构衍生物。
(2)基因加倍通过将该基因克隆至单拷贝或多拷贝基因表达载体上，在异源宿主进行表达，获得在相应化学结构处的酮基发生还原的新的结构衍生物。
图1由MeiF所催化的梅岭霉素糖苷配基C5-酮基还原为羟基示意图具体实施方式
如图1所示，由AveF的生物学功能类比，MeiF的生物学功能是催化梅岭霉素糖苷配基C5-酮基还原为羟基。以下进一步对本发明的实施具体描述1、从阿弗菌素产生菌Streptomyces avermitilis NRRL8165中PCR扩增aveF基因部分片段(1)按照《链霉菌遗传操作实验手册》(霍普伍德等著，邓子新等译，1988，湖南科学技术出版社)实验程序，从阿弗菌素产生菌Streptomyces avermitilisNRRL8165中提取总DNA。
(2)根据已知的阿弗菌素生物合成基因簇序列(GenBank数据库登录号AB032524)，在aveF基因内设计一对引物引物15’ATT CCC GTT GCC GTC ACT CG 3’引物25’GCG GTT CAT GTC GGT GGC GG 3’(3)按以下体系与条件进行PCR反应试剂 反应浓度 体积(μl)buffer(10x)1x 4DNTP(各2.5mM) 0.2mM 3.2MgCl2(25mM) 1.2mM 2引物1(4μM)0.5μM 5引物2(4μM)0.5μM 5模版总DNA(1μg/μl)1μg 1DMSO(50％) 2.5％ 2Taq DNA聚合酶(5U/μl) 5U 1H2O 16.8步骤 温度(℃)时间预变性 94 8分钟变性 94 30秒退火 60 40秒延伸 72 60秒循环 352、aveF PCR产物的测序验证纯化705bp PCR扩增产物并进行核苷酸序列测定，与aveF序列进行比较，验证一致。
3、aveF PCR产物与南昌链霉菌NS3226总DNA基因文库的Southern杂交以纯化测序的705bp PCR扩增产物为探针，进行α-P32放射性同位素标记后与南昌链霉菌NS3226总DNA基因文库进行Southern杂交，在高严谨度洗膜条件下(65℃，0.2×SSC)获得4个阳性科斯质粒(cosmid)。
4、阳性科斯质粒的测序与分析选取其中一个阳性科斯质粒16B1进行核苷酸序列测定。将DNA片段用550Sonic Dismembrator超声波(Fisher Scientific公司)断裂并0.7％用低熔点琼脂糖回收其中1.6-2.0kb片段，再经过Geneclean II reagent kit(Bio 101，Inc公司)纯化后克隆至pUC18的SmaI位点(预先经CIAP处理)，构建成一系列测序亚克隆。测序亚克隆质粒DNA的制备采用Prep 96 Plasmid Kit(Qiagen公司)。序列的测定采用BigDye Terminator Cycle Sequencing Kits(AppliedBiosystem Division，Perkin Elmer公司)在377 DNA Sequencers(PE/ABD)上自动完成，测序通用引物为5’GTA AAA CGA CGG CCA GT3’(forward)，5’GCGGAT AAC AAT TTC ACA CAG G 3’(reverse)。序列的ORF分析是通过日本国立卫生研究院的在线服务器http//watson.nih.go.jp/~jun/cgi-bin/frameplot.pl提供的Frame-Plot2.3.2在线软件进行。序列的同源性比较是通过美国国家生物技术信息中心的在线服务器提供的PSI-BLAST软件(http//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)进行。
序列1为催化梅岭霉素糖苷配基C5-酮基还原的基因meiF的核苷酸序列，长度为936个碱基对(bp)。
序列2为催化梅岭霉素糖苷配基C5-酮基还原的基因meiF的氨基酸序列，长度为311个氨基酸。
以下根据本发明的内容提供基因序列序列列表<110>上海交通大学<120>梅岭霉素C5-酮基还原酶基因(meiF)<160>1<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>936<212>DNA<213>南昌链霉菌NS3226(Streptomyces nanchangensis n.sp.NS3226)<400>1atggattacg agggcccggc agggtacccc gcgtggctcg gcttccggtg gagtccttct 60ccttggaatt ccggggtctt gagggggttc cgtgctgtgt gctcggttgc gatggtcgtc120gccatgaccc aaacagctgg aaaaaccgca ctggtgaccg gtgcgtcgcg gggcatcggc180gcggccatcg cccgaaggct cgccgccgaa ggtgttctgg tggccgtgca ctacgggcgg240tgcaaagcgg acgcggagga aacggtcgcg tcgatcgagc aggccggcgg gcaggcattc300gccatcaggg cggaccttgc ggccgacgac gccctcgaca cgctcttcag cgagctcgcg360accgggctcg ccggccggcc gctgaacatc ctggtgaaca acgccgccat ctacgccgac420ccggacgacc cggccgccgc gcaggcggac ggctatgtgg cgggcatttc cgaggtcact480caggaggagt tcgaccgtat cttcagcgtc aatgtacgtg ccccgttttt cgtcacccaa540cggtgtctgc cgctcctcgc cgacggcgga cggatcgtca acatctcttc cgccgtcacc600aggatcgcct ggccgctgct gccctacgcc atgagcaagg gcgccctcga gatcatggcg660cccaggctgg ccaatgagct gggacaccgg ggaatcaccg tcaacaccat cgcgccgggc720atcaccgaca acaccaaaac caacacgtgg ctgcacgata tgcccggggc ggccgagggc780gtggccgcca tgaccgcact gcgccgactc ggtcagccgt ccgacatcgc cgatgtcgtc840gccctcctcg cctcggacga ggcccgctgg gtcaccggac aactggtcga cgcctccggc900ggcatggccc tggcccccac accaccgggc atgtag 936<210>2<211>311<212>PRT<213>南昌链霉菌NS3226(Streptomyces nanchangensis n.sp.NS3226)<400>1Met Asp Tyr Glu Gly Pro Ala Gly Tyr Pro Ala Trp Leu Gly Phe Arg1 5 10 15Trp Ser Pro Ser Pro Trp Asn Ser Gly Val Leu Arg Gly Phe Arg Ala20 25 30Val Cys Ser Val Ala Met Val Val Ala Met Thr Gln Thr Ala Gly Lys35 40 45Thr Ala Leu Val Thr Gly Ala Ser Arg Gly Ile Gly Ala Ala Ile Ala5055 60Arg Arg Leu Ala Ala Glu Gly Val Leu Val Ala Val His Tyr Gly Arg65 70 75 80Cys Lys Ala Asp Ala Glu Glu Thr Val Ala Ser Ile Glu Gln Ala Gly85 90 95Gly Gln Ala Phe Ala Ile Arg Ala Asp Leu Ala Ala Asp Asp Ala Leu100105110Asp Thr Leu Phe Ser Glu Leu Ala Thr Gly Leu Ala Gly Arg Pro Leu115120 125Asn Ile Leu Val Asn Asn Ala Ala Ile Tyr Ala Asp Pro Asp Asp Pro130135 140Ala Ala Ala Gln Ala Asp Gly Tyr Val Ala Gly Ile Ser Glu Val Thr145 150 155 160Gln Glu Glu Phe Asp Arg Ile Phe Ser Val Asn Val Arg Ala Pro Phe165 170175Phe Val Thr Gln Arg Cys Leu Pro Leu Leu Ala Asp Gly Gly Arg Ile180185190Val Asn Ile Ser Ser Ala Val Thr Arg Ile Ala Trp Pro Leu Leu Pro195200205Tyr Ala Met Ser Lys Gly Ala Leu Glu Ile Met Ala Pro Arg Leu Ala210215220Asn Glu Leu Gly His Arg Gly Ile Thr Val Asn Thr Ile Ala Pro Gly225230235 240Ile Thr Asp Asn Thr Lys Thr Asn Thr Trp Leu His Asp Met Pro Gly245 250255Ala Ala Glu Gly Val Ala Ala Met Thr Ala Leu Arg Arg Leu Gly Gln260 265270Pro Ser Asp Ile Ala Asp Val Val Ala Leu Leu Ala Ser Asp Glu Ala275280285Arg Trp Val Thr Gly Gln Leu Val Asp Ala Ser Gly Gly Met Ala Leu290295 300Ala Pro Thr Pro Pro Gly Met305 310
权利要求
1.一种梅岭霉素C5-酮基还原酶基因，其特征在于它编码C5-酮基还原酶，催化梅岭霉素糖苷配基C5-酮基还原为羟基，基因的核苷酸序列长度为936个碱基对(bp)，编码311个氨基酸，序列分别如下atggattacg agggcccggc agggtacccc gcgtggctcg gcttccggtg gagtccttct 60ccttggaatt ccggggtctt gagggggttc cgtgctgtgt gctcggttgc gatggtcgtc120gccatgaccc aaacagctgg aaaaaccgca ctggtgaccg gtgcgtcgcg gggcatcggc180gcggccatcg cccgaaggct cgccgccgaa ggtgttctgg tggccgtgca ctacgggcgg240tgcaaagcgg acgcggagga aacggtcgcg tcgatcgagc aggccggcgg gcaggcattc300gccatcaggg cggaccttgc ggccgacgac gccctcgaca cgctcttcag cgagctcgcg360accgggctcg ccggccggcc gctgaacatc ctggtgaaca acgccgccat ctacgccgac420ccggacgacc cggccgccgc gcaggcggac ggctatgtgg cgggcatttc cgaggtcact480caggaggagt tcgaccgtat cttcagcgtc aatgtacgtg ccccgttttt cgtcacccaa540cggtgtctgc cgctcctcgc cgacggcgga cggatcgtca acatctcttc cgccgtcacc600aggatcgcct ggccgctgct gccctacgcc atgagcaagg gcgccctcga gatcatggcg660cccaggctgg ccaatgagct gggacaccgg ggaatcaccg tcaacaccat cgcgccgggc720atcaccgaca acaccaaaac caacacgtgg ctgcacgata tgcccggggc ggccgagggc780gtggccgcca tgaccgcact gcgccgactc ggtcagccgt ccgacatcgc cgatgtcgtc840gccctcctcg cctcggacga ggcccgctgg gtcaccggac aactggtcga cgcctccggc900ggcatggccc tggcccccac accaccgggc atgtag 936MDYEGPAGYP AWLGFRWSPS PWNSGVLRGF RAVCSVAMVV AMTQTAGKTA LVTGASRGIG 60AAIARRLAAE GVLVAVHYGR CKADAEETVA SIEQAGGQAF AIRADLAADD ALDTLFSELA120TGLAGRPLNI LVNNAAIYAD PDDPAAAQAD GYVAGISEVT QEEFDRIFSV NVRAPFFVTQ180RCLPLLADGG RIVNISSAVT RIAWPLLPYA MSKGALEIMA PRLANELGHR GITVNTIAPG240ITDNTKTNTW LHDMPGAAEG VAAMTALRRL GQPSDIADVV ALLASDEARW VTGQLVDASG300GMALAPTPPG M 31全文摘要
一种梅岭霉素C5－酮基还原酶基因，属于基因技术领域。本发明编码C5－酮基还原酶，催化梅岭霉素糖苷配基C5－酮基还原为羟基，基因的核苷酸序列长度为936个碱基对(bp)，编码311个氨基酸。根据已知的阿弗菌素生物合成基因簇序列，通过聚合酶链式反应扩增出阿弗菌素生物合成基因簇中负责催化阿弗菌素糖苷配基C5－酮基进行还原的C5－酮基还原酶基因片段，并以之为探针进行Southern杂交，从南昌链霉菌基因文库中获得包含有其同源序列的阳性科斯质粒，经过测序与功能分析，获得梅岭霉素C5－酮基还原酶基因。本发明开辟以利用组合生物合成及遗传工程技术创新微生物药物的新途径，为已知生物活性分子的高产和新微生物农药的创新提供新的技术和手段。
文档编号C12N15/53GK1472322SQ03116989
公开日2004年2月4日 申请日期2003年5月16日 优先权日2003年5月16日
发明者邓子新, 孙宇晖, 周秀芬 申请人:上海交通大学