用于接种疫苗的免疫原性络合物及其获得方法
【专利说明】用于接种疫苗的免疫原性络合物及其获得方法
[0001] 本发明设及包含聚合抗原、甘露聚糖和二醒的免疫原性复合物，包含该免疫原性 复合物的组合物，W及其作为免疫应答刺激物和疫苗的用途。同样地，本发明设及使用二 醒，基于抗原和甘露聚糖同时进行聚合和缀合而获得所述的免疫原性复合物的方法。因此， 本发明属于免疫学和疫苗生产领域的范围内，W及治疗和预防过敏反应的领域范围内。
【背景技术】
[0002] 树突状细胞(DC)是专口高效地刺激T细胞的抗原呈递细胞，并且鉴于此，它们基本 用于诱导特异性免疫应答。未成熟的DC策略性地分布于组织和器官中，其中它们作为哨兵， 在它们的微环境中不断地取得抗原样品。作为对不同刺激(包括抗原本身、微生物有机体的 产物W及组织危险物信号）的应答，DC开始成熟过程，运使得DC在周围携带由它们本身所负 载的抗原迁移至次级淋己器官的T区。在此，显示HLA-II和共刺激分子表达增多的成熟DC与 T细胞相互作用，将抗原性的肤(经DC加工后）呈递给T细胞，并刺激T细胞开始特异性的应 答。
[0003] 未成熟的DC通过受体介导的内吞作用、微胞钦作用和吞隧作用捕获抗原。有多种 不同的受体与内吞摄入有关，其中发现了甘露糖受体(MRKCD206和CD209)。它们通过碳水 化合物识别结构域而识别末端甘露糖残基、海藻糖和/或N-乙酷氨基葡萄糖。天然配体包括 细菌来源的产物(糖蛋白和糖脂），W及具有高的甘露糖含量的哺乳动物糖蛋白。MR在巨隧 细胞和未成熟的DC中表达，与甘露糖基化的抗原的内吞作用有关，用于其加工和T细胞呈 递。
[0004] 在I巧抗体介导的过敏状况中，免疫治疗是W给予治疗疫苗为基础的，运些疫苗抗 原与过敏患者所敏感的那些为相同的变应原。变应原为得自于花粉、尘蛾、上皮细胞等的蛋 白质，它们是患者所呼吸(环境吸入器)的空气中所携带的超级结构。广泛接受的是，运些疫 苗的临床功效与所传递的变应原的剂量有关，运样WHO和得自于科学社会的共同指导原则 建议应该使用足够的变应原浓度来制备疫苗。运种要求意味着患者对疫苗剂量的过敏反应 设及不利作用的风险，而根据规定所述的作用应该受到限制。避免运种风险的方式在于基 于改性的变应原(类变应原）来制备疫苗，其中所述的变应原显示出针对I巧抗原的较低的 反应能力(较低的变应原性）。
[0005] 基于使用甲醒和/或戊二醒来处理变应原的化学修饰在疫苗制造商中最广泛地使 用。醒基(R-CHO)与存在于变应原氨基酸中的氨基(R-NH2)(例如赖氨酸）的反应是此类修饰 的基础。与甲醒(其为单醒)相反，戊二醒为具有2个R-C册基的二醒，其中所述的R-CHO基能 够与不同分子中存在的赖氨酸R-NH2反应。运导致变应原聚合，W及与特异性I巧抗体(通过 甲醒形成的类变应原是基于蛋白质的结构修饰，而不是基于它们的聚合)的反应性受损。由 于I巧抗体失去了与它们的抗原决定簇(变应原结合位点)反应的可及度，并减少了 I巧致敏 的肥大细胞(其被I巧所活化)的数量，所W认为运种聚合确定了类变应原较低的变应原性。 聚合的变应原的变应原性损失可W意味着免疫原性损失，运可W降低运些制备物的临床功 效。已经表明聚合会降低DC中MR与变应原甘露糖残基的接近，W及运对于聚合的变应原的 免疫原性损失而言是决定性的。运由W下事实所支持:就变应原摄入而言，甘露糖残基为DC 所用的主要配体之一，并且运些细胞在将变应原呈递给应答T细胞中起重要的作用。
[0006] 用于将糖与蛋白质缀合的方法主要基于通过氧化过程来活化糖，从而通过Cis-乙 二醇基的转化而生成反应性醒基(R-CHO)。在使用例如高舰酸盐处理后在氧化的糖中生成 的R-C册可W与赖氨酸的E-氨基反应，从而形成Schiff碱。由于它们的碳水化合物残基用于 缀合并避免了与其生物学活性有关的蛋白质部分，所W运种方法学非常适用于缀合糖蛋白 (例如酶、抗体）。
[0007] 尽管使用高舰酸盐的糖氧化也已经报告为对蛋白质(包括变应原(Weinberger et al.2013.J Control Release,165:101-109))进行甘露糖基化的方式（Masarova et al. 2002. Int .J.Polymer .Anal .Qiaract. ,7:106-116)，但是将聚合的抗原进行甘露糖基化 的使用具有2个主要的缺点：
[0008] a)糖的氧化使得相邻的碳原子之间的键产生了断裂，其中所述的碳原子包含径基 (OH)并且为反应性醒生成的基础。所述的断裂影响了甘露糖的结构（Shibuya，N.，et al. 1988. J. Biol. Chem.，263: 728-7:34)，从而改变了其结合识别甘露糖的凝集素的能力 (Masarova et al.2001,Chem.化P.55:130-135)，及其DC活化能力（Sheng et al, 2006. Immunology, 118:372-383)。尽管甘露糖结构整体性的损失可W通过降低氧化程度而 减小至最低(Masarova et al.2001 ,Chem.Pap.55:130-135)，但是在轻度条件下的缀合效 率服从于待甘露糖基化的蛋白质的本性(Weinberger et al. 2013, J.Conhol Release, 165:101-109)。为了保护天然形式的甘露糖，已经试图在高溫下通过糖基化来实施蛋白质 的甘露糖基化，但是在氧气缺乏下，结果为阴性（K a n S k a e t al.2008.Biotechnol.Appl.Biochem.49:57-64)。
[0009] b)在氧化后活化的甘露糖生成了反应性醒，其必须与待甘露糖基化的蛋白质的游 离氨基反应。但是，蛋白质与戊二醒的聚合使得运些氨基急剧减少，因为它们已经用于它们 与戊二醒本身的反应中。在运些条件下，经活化用于将蛋白质（之前使用戊二醒处理过)甘 露糖基化的甘露糖的效率可能极低，运是因为当缺乏甘露糖可W结合的氨基时，其为戊二 醒的聚合能力（Silva et al.2004.Food Technol.Biotechnol.42:51-56)。运种不便性不 仅影响聚合的变应原的甘露糖基化，而且影响与戊二醒(最终认为其可W被甘露糖基化)聚 合的任何蛋白质的甘露糖基化。
[0010] Patterson等人 1977Q Allergy Clinical Immunology 59:314-319)描述了变应 原与戊二醒的聚合(禾本科花粉）。由于聚合的变应原显示I姐抗体致敏的肥大细胞的活化 能力降低，所W聚合的变应原是低变应原的。
[0011] Subiza等人2008(Clinical and Experimental Allergy,39:987-994)描述了用 于过敏中免疫治疗的戊二醒（也称为类变应原）修饰的变应原（禾本科花粉、Trisetum paniceum和喜马拉雅鸭茅(喜马拉雅鸭茅））的用途。研究者报告使用通过与戊二醒聚合而 得到的禾本科类变应原的接种疫苗是有效的。
[0012] fleydenreich 等人2012 (Immunology, 136:208-217)描述 了在由梯牧草(梯牧草)和 垂枝枠 (Betula verrucosa)物种的完整花粉得到的变应原提取物与它们相应的戊二醒或 甲醒修饰的类变应原之间，免疫原性和变应原性的差异比较研究。报告，使用戊二醒进行修 饰比使用甲醒进行修饰会使得类变应原的变应原性和免疫原性降低更多，并且DC不会高效 地捕获运种类型的修饰的变应原。
[0013] Weinberger等人2013(Journal of Control Release, 165:101-109)描述了变应 原蛋白质（卵清蛋白和木瓜蛋白酶)与甘露糖的缀合，其中通过使用高舰酸盐进行轻度氧化 而活化糖。根据待甘露糖基化的蛋白质而得到不同的效率程度。报告，甘露糖基化的缀合物 在体内被DC所捕获，并且在小鼠中产生免疫应答，因此它们可W用于免疫治疗。
[0014] 因此，在本领域的水平下，需要提供基于聚合的且甘露糖基化的抗原而获得疫苗 的方法，该方法为目前本领域水平下所使用的那些方法的备选方法，并且其允许抗原聚合 W及W高效的方式与甘露糖缀合，而不会使糖损失它们的结构完整性并且不会使聚合性质 (较低的变应原性)受到影响，因此基于聚合的且甘露糖基化的蛋白质的疫苗通过改善它们 被DC的摄入而增加其免疫原性。
[001引发明概述
[0016] 本发明的发明人发现向天然蛋白质抗原与甘露聚糖的混合物中加入二醒允许抗 原聚合，同时使抗原与甘露聚糖缀合，运可W获得免疫原性复合物或疫苗，该免疫原性复合 物或疫苗在个体中能够刺激或降低免疫应答的，而不会引发对该复合物的过敏反应，并且 能够被树突状细胞(DC)所识别并捕获。
[0017] 基于上述发现，已经研发了本发明的一系列的方面，在下文中将详细描述运些方 面。
[001引本发明的免疫复合物
[0019] 如之前所提及，向蛋白质(抗原)和甘露聚糖的混合物中加入二醒(特别是戊二醒） 允许抗原聚合，同时抗原与甘露聚糖缀合，运可W获得免疫原性复合物或疫苗。
[0020] 因此，在本发明的一个方面中，设及免疫原性复合物，下文称为"本发明的免疫原 性复合物"，其包含聚合的抗原、甘露聚糖和二醒。
[0021] 在本发明中，"免疫原性复合物"可理解为一个或两个单元的结合，其中所述的单 元通过化学键(化学缀合)和通过物理诱捕(物理缀合)而保持彼此缀合，所述的多个单元为 聚合的抗原、甘露聚糖和二醒。
[0022] "聚合的抗原"是指抗原单体彼此键合而形成的聚合物，其中所述的抗原单体可W 不同或相同。因此，在具体的实施方案中，聚合物的抗原包含彼此相同或不同的至少2个抗 原。"抗原"是指在受试对象(人类或动物）的有机体中在体液和细胞水平下能够诱导免疫应 答的，或者在与免疫细胞接触时能够诱导细胞免疫应答(免疫细胞扩增、活化和/或成熟、产 生细胞因子或抗体）的任何物质。具体而言，抗原为可W为变应原的蛋白质，由感染试剂衍 生的蛋白质，肿瘤细胞，所述的蛋白质的肤或片段，由所述的蛋白质得到的重组蛋白质，或 者甚至能够诱导指定的应答的合成肤。在具体的实施方案中，所述的抗原为变应原。
[0023] "变应原"是指在个体中能够引起过敏的物质，换言之，是指被个体的免疫系统识 别为外来的，导致免疫应答(主要是产生E型免疫球蛋白（I巧））的物质。变应原的实例包括 但不限于花粉变应原提取物，由节肢动物得到的变应原提取物，由食物或食物产品得到的 变应原提取物，在昆虫的唾液、爪或刺上存在的成分(在受试对象中会诱导敏感反应)等。因 此，可W使用花粉蛋白质提取物，例如禾本科花粉（多年生黑麦草化olium perenne)，草地 早熟禾(Poa pratense),梯牧草（Phleum pratense),狗牙根（切nodon dactylon),高羊茅 草地早熟禾（Festuca pratensis),喜马拉雅鸭茅（Dactylis glomerata),黑麦（Secale cereale),大麦（Hordeum vulgare),燕麦（Avena sativa) ,Triticum sativa)，其他草花粉 (例如艾草（Al" temisia vulgaris),襲（加 enopodium album),长叶车前（Plantago Ianceolata),蒲公英茵香（Taraxacum vulgare) ,Parietaria judaica,刺沙蓬（Salsola kali),异株等麻(U;rtica dioica))，或者树花粉(例如橄揽(Olea europaea),悬铃木属， Cuppresus SPP)等。此外，还可W使用由节肢动物得到的蛋白质提取物，例如尘蛾(例如欧 妍怪尘蛾（Dermstophsgoides pteronyssinus),美妍|尘蛾（Dermstophsgoides f曰rin曰e), Acaro siro,Blomia tropicalis,梅氏嗜霉蛾化 uroglyphus maynei),家甜食蛾 (Glyciphagus domesticus),害嗜鱗蛾化epidoglyphus destructor),腐食酸蛾 (Tyrophagus PUtrescentiae))等。其他变应原提取物可W得自真菌抱子(烟草赤星病菌 (Alternaria alternate),蜡叶芽枝霉（Cladosporium herbarum),特异青霉（Penicilium notatum))和动物上皮细胞(狗上皮细胞、猫上皮细胞、马上皮细胞、羽毛混合物），W及得自 食物成分等。如本领域专业人员所理解的那样，皮肤和皮肤上的附属物(例如头发)包含在 术语"上皮细胞"内。实际上，任何变应原都可W用于免疫原性复合物中，然而，在具体的实 施方案中，变应原选自花粉、充满、上皮细胞、真菌抱子和它们的组合。
[0024] 在另一个具体的实施方案中，得自物种梯牧草，喜马拉雅鸭茅，狗牙根，多年生黑 麦草，S毛草属，橄揽，Cuppresus spp.，豚草属，枠木属，悬铃木属，欧棲（Corylus avellana)或欧洲档木(Alnus glutinosa)。
[0025] 在另一个具体的实施方案中，虫蛾术语物种欧洲室尘蛾，美洲尘蛾或Blomia tropicalis。
[00%]在另一个具体的实施方案中，上皮细胞属于物种化Iis domesticus或家犬(Canis familiaris)。
[0027] 在另一个具体的实施方案中，真菌抱子属于物种烟草赤星病菌或细链格抱 (Alternaria tenuis)。
[0028] 在本发明中，"甘露聚糖"是指碳水化合物聚合物，其由甘露糖和W下类型的糖巧 键组成:a-1，6-糖巧，a-1，2-糖巧，a-1，3-糖巧或0-1，3-糖巧。甘露糖是指由6个碳原子形成 的单一的糖或单糖，并且其功能化学基团在碳1或异头碳中为醒。甘露聚糖可W包含得自甘 露糖蛋白的肤残基（其与甘露糖蛋白天然结合）。任何甘露聚糖都可W用于本发明的内容 中。甘露聚糖的实例包括但不限于聚甘露糖，半乳甘露聚糖，葡萄甘露聚糖，乙酷化甘露聚 糖和芦苔多糖(aloeride)。
[0029] 甘露聚糖可W理解为甘露糖通过Q-D-(I^e)键结合而形成的线性结构，其具有主 要通过a-D-(1^2)键(而且还通过a-D-(1^3)键)形成的不同单元的常见的短的支链。
[0030] "半乳甘露聚糖"可W理解为甘露糖链彼此通过0(1^4)键结合而形成的化合物， 在多数情况下，其具有半乳糖单元通过0(1^6)键与甘露糖结合而形成的支链。根据提取半 乳甘露聚糖的植物，半乳甘露聚糖具有不同的支化程度。
[0031] "葡萄甘露聚糖"应该理解为W下化合物，其化学结构通过e(i^4)键连接的比例 分别为8: 5的D-甘露糖和D-葡萄糖。例如葡萄甘露聚糖在植物魔芋（Amorphophal Ius konjac)的块茎中发现。
[0032] "乙酷化甘露聚糖"应该理解为(6(1-4)-甘露聚糖型的0-乙酷化复合多糖的混合 物。例如乙酷化甘露聚糖在植物(Aloe vera)中发现。
[0033] "芦苔多糖"可W理解为由葡萄糖、半乳糖、甘露糖和阿拉伯糖构成的具有高分子 量的多糖。例如芦苔多糖在植物真芦苔中发现。
[0034] 甘露聚糖(聚甘露糖，半乳甘露聚糖，葡萄甘露聚糖等)可W得自天然来源，例如得 自真菌、酵母菌和植物，或者使用本领域的专业人员普遍已知的技术通过化学合成而获得。 在具体的实施方案中，作为本发明的免疫原性复合物的一部分的甘露聚糖得自酵母菌、植 物或真菌。在另一个具体的实施方案中，酵母菌选自酵母属、毕赤酵母属和假丝酵母属。 [00巧]酵母属的实例。酵母菌包括但不限于S. bayanus ,布拉迪酵母（S. boulardii ), S . bulderi , S . cariocanus , S . cariocus ,酉良酒酉奉母（S . cerevisiae) , S. cheval ieri , S.d曰irenensis,S. elIipsoideus,S.eub曰y曰nus,S.exiguus,S.fIorentinus,S.kluyveri, S . martiniae , S . monacensis ,S.norbensis,奇异酉奉母（S. paradoxus ),己其if 德酉奉母 (S.P曰Stori曰nus),S.spencerorum,S.turicensis,S.unisporus,S.UV曰rum和S.zon曰tus。在 更具体的实施方案中，酵母菌为酿酒酵母。