专利名称：：老年性痴呆重组蛋白疫苗及其制备方法
技术领域：
：本发明涉及一种疫苗及其制备方法，特别是一种老年性痴呆重组多价13-淀粉样蛋白1-15(AU蛋白疫苗及其制备方法。
背景技术：
：老年性痴呆(Alzheimer'sdisease,AD)是一种神经细月包退4亍性疾病，临床以进^f亍性记忆和后天获得的知识丧失为特征，直到最后病人丧失生活能力。随着发病人数的增加，AD给家庭和社会带来沉重的负担，是一个重要的社会和医疗卫生问题。关于AD的治疗，目前尚无理想方法，现有的治疗策略主要着眼于緩解症状，并没有阻止AD的病理进程，其临床疗效并不理想。A13是老年性痴呆病理变化老年斑的主要成分，其由3942个氨基酸组成。近年来的研究表明，A15的集聚和沉积及其伴随的神经元损害是老年性痴呆病理机制的中心环节，因此，针对A15的治疗策略和方法相继寻皮才是出。研究表明，1999年Schenk首次报道{Immunizationwithamyloid-betaattenuatesAlzheimer-disease-likepathologyinthePDAPPmouse[seecomments].Nature,1999Jul8;400(6740):173-7}采用免疫学方法对转基因AD模型鼠(PDAPP鼠)治疗；目前，国外的老年性痴呆疫苗M42肽疫苗已进入IIa临床试验，由于部分试验病人出现了接种后综合症，包括无菌性脑膜炎，实验因此停止。尸检发现，在患者的软脑膜、血管间隙及脑实质内有T细胞浸润，由此推测脑膜脑炎的发生可能与八1342全肽C末端含有的毒性T细胞抗原表位(A1316-42)激发了机体Thl型自身免疫反应有关。因此，通过去除AfiT细胞抗原表位、保留其B细胞抗原表位的方法来制备第二代AD疫苗的方法成为了首选。最近文献报道的第二代AD疫苗仍有许多不尽人意的地方1)研究者们制备的抗原大多为化学合成，合成肽的化学修饰难度大，成本高，而且纯度不高。2)研究者们在制备含有A13N末端B细胞抗原表位的多价疫苗时，大多是将B细胞抗原表位片段直接与一个新的T细胞表位连接，或者B细胞抗原表位直接串联，容易影响抗原的空间结构，不利于Afi的B细胞抗原表位的暴露。
发明内容本发明的目的就是为了克服制备老年性痴呆疫苗的上述缺点，提供一种毒性小、免疫原性好、以柔性肽连接AfiB细胞抗原表位的一种老年性痴呆重组多价A13w5蛋白疫苗，本发明的一个实施例提供了重组四价ABws蛋白疫苗(4xA1315)。本发明的另一个目的是为了提供成本低、化学纯度高的生产该疫苗的方法。为实现上述目的，本发明采取以下设计方案合成多条寡核苷酸引物，通过基因扩增得到的两个或以上含有柔性连接肽基因的二价Afiws基因片断，克隆入pQE-30原核表达质粒(购自德国Qiagene公司的商业质粒)中，经细菌诱导表达、纯化，制备出能表达ABw5氨基酸序列间通过柔性连接肽连接形成柔性可折叠的多价ABw5的重组蛋白疫苗。其中，所述AJ3ws氨基酸序列为Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-His画Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu-Val-His-His-Gln柔性连接肽一般采用一个或数个(多为四个以下)分子量较小的人体必需氨基酸连接,如甘氨酸、丝氨酸等，其序列可以为Gly-Gly或Gly-Ser-Ser-Gly其中，柔性连接肽避免了多拷贝ABB细胞抗原表位的空间僵化结构，还使Al^表位更容易暴露，增强了免疫原性。同时也增加了免疫原的分子量，降低了降解的可能性。本发明优选AJ^5氨基酸序列为四价，即4xA1315。在这种情况下，蛋白疫苗具有较强的免疫原性，而同时其生产方法相对较为简单。本发明的老年性痴呆重组多价ABw5蛋白疫苗的生产方法包括以下步骤(1)合成多条寡核苷酸引物，通过基因扩增得到的两个或两个以上含有柔性连接肽基因的二价ABw5基因片断；Asp-Ala画Glu-Phe画Arg画His-Asp-Ser-Gly画Tyr-Glu画Val-His-His-Gln画G/,G/j;一Asp画Ala-Glu画Phe-Arg隱His-Asp陽Ser画Gly-Tyr-Glu-Val-His隱His-Gln-G7j;-5^-5^-G/少(2xA1^5-!)和G/_y-Ser-Ser-G/y-Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu-Val-His-His-Gln-G^-G/y-Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-ffis-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu-Val-His-His-Gin(2xA1515-2);(2)将两个或以上含有柔性连接肽基因的二价ABw5基因片断依次克隆入pQE-30原核表达质粒(购自德国Qiagene公司的商业质粒)中，制备重组质粒pQE-4xAfi15;(3)将重组质粒pQE-4xAJ315转化入含有pREP4质粒的表达菌M15[pREP4]中，IPTG(isopropyl-fi-D画thiogalactopyranoside,异丙基碌u代半乳糖苷)诱导表达4xAi^重组蛋白；(4)将表达的4xAJ^重组蛋白经his-tagNi^亲和纯化树脂(组氨酸标签的镍离子亲和纯化树脂，购自德国Qiagene公司)纯化后，透析获得高纯度的4xAl^重组蛋白；(5)将高纯度的4xA1315重组蛋白与佐剂等体积充分乳化混合后制备成4xA"5重组蛋白疫苗。本发明选择多价可折叠的AJ3w5为免疫原，避免了多拷贝ABB细胞抗原表位的空间僵化结构，还使Afi,5表位更容易暴露，增强了免疫原性。同时也增加了免疫原的分子量，降低了降解的可能性。选择原核表达系统来制备重组蛋白，避免了化学合成的高难度及高成本的缺点。本发明可以选择的佐剂有MF59及铝佐剂等，优选以MF59为佐剂，可以促进免疫反应向Th2方向纟及化。具体实施例方式下面结合实施例对本发明作进一步说明，本发明的实施例是用来对本发明的进一步说明，但不能理解为本发明的实施方式仅限于本发明的实施例。实施例一以四价可折叠的Afiw5为免疫原的重组蛋白疫苗的制备，包括以下步骤1重组质粒pQE-4xAfi15的制备1.1设计插入pQE-30的四价B细胞抗原表位片断4xAJ^s序列为A13M5+GG+Afiws+GSSG+ABw5+GG+Afiws1.2重组质粒pQE-4xA15i5构建1.2.1ABws+GG+A6w5+GSSG(&cI)(2xAfi15-l,即第一个二价ABws基因)片段的引物设计Pl引物5，-CGGGATCCGATGCAGAATTCCGACATGATTCAGGATATGAAGTTCATCATCAAGATGCAGAATTCCGA体加粗为甘氨酸连接肽，甘氨酸连接肽前后分别为Afi,5碱基序列，加粗分别为5a/wHI和5"acI酶切位点，下划线为引物配对的石威基。P2引物5，-CGAGCTCCCTTGATGATGAAC-3';加粗为SacI酶切位点，下划线为引物配对的碱基；1.2.2GSSG(&cI)+Afiw5+GG+A13w5(2xA1515.2，即第二个二价AfiM5基因)片段的引物设计P3引物5'-GGAGCTCGGGTGATGCAGAATTCCGACATGATTCAGGATATGAAGTTCATCATCAAGATGCAGAATTCCGACATGATTCAGGATATGAAGTTCATCATCAATGAAAGCTTGGG-3，;斜体加粗为甘氨酸连接肽，甘氨酸连接肽前后分别为A仏5碱基序列，加粗分别为&cl和历wdni酶切位点，下划线为引物配对的碱基；P4引物5，-CCCAAGCTTTCATTGATGATGAAC-3，;加粗为///wdni酶切位点，下划线为引物配对的i咸基；1.2.32xAJ3^片段的扩增Pl,P2为引物，以合成的Pl引物为模板，ExTaq酶，94。C预变性5min,然后94。C变性45s;52。C退火30s;72。C延伸45s,30次循环。最后72°C延伸7min，扩增P2xAAw片段。1.5%的琼脂糖电泳观测扩增结果，PCR产物纯化试剂盒纯化。1.2.42xAJ^.2片段的扩增P3,P4为引物及模板，ExTaq酶，94。C预变性5min,然后9《C变性45s;52。C退火30s;72。C延伸45s，30次循环。最后72。C延伸7min，扩增2xAfi,5.2片段。1.2.5pQE-4xA1^5的构建用SamHI和SacI双酶切2xA13w片段和pQE-30。回收线状pQE-30载体与2xA1315—i片段，T4DNA连接酶，16。C过夜连接，转化感受态E.coliDH5a,挑选转化子，含氨千青霉素的LB培养基过夜培养，Omega质粒小量制备试剂盒提取质粒，用SamHI/5"acI于37。C双酶切鉴定，阳性重组子命名为pQE-2xA13w。同样，用SacI和历"dIII双酶切2><八1315-2片段和pQE-2xAJ^5—p回收线状pQE-2xAi^5—i载体与2xA13!5-2酶切片段，T4DNA连接酶，16。C过夜连接，转化感受态E.coliDH5a,获得阳性重组子pOE-4xAfi二。2重组质粒pQE-4xAl^的表达及鉴定pQE-4xA仏5转化M15[pREP4]菌，lmMIPTG30。C诱导6小时，取对照菌体和表达4xAf^5菌体，以加样緩沖液裂解后，煮沸10min后，12000rpm，离心10min，取20(al上清上样。5%浓缩胶，20%的分离胶的制备的PAGE胶(PolyacrylamideGelElectrophoresis,聚丙烯酰胺凝胶电泳)，Tricine《三(羟曱基)曱基甘氨酸)电泳緩沖液进行SDS-PAGE(SodiumDodecylSulfatePolyacrylamideGelElectrophoresis,十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳)电泳，电泳条件先40v恒压约40min，待样品进入分离胶时，电压升至恒压60v,约3h。再100v电转1.5h至聚偏二氟乙烯(PolyvinylideneFluioride，PVDF)膜上，用5。/。脱脂奶粉封闭2h，加入抗A13单抗(1:2000，Sigma)孵育1h,TBST(TrisBufferSalineTween，吐温Tris石成緩冲液)緩冲液洗涤5次后，加入HRP-羊抗鼠IgG(1:4000),孵育1h。TBST緩沖液洗涤5次后，显影，同时以本申请人原核表达并纯化的GST-Afi42肽为免疫印迹(WesternBlotting)实-睑的阳性对照。3重组4xA1^5蛋白表达及纯化培养2000ml细菌培养物，600nm光学密度值(OD600)为0.6时加入1molIPTG2ml,30°C200rpm振摇11h。收获诱导后的培养物，12000g离心5min沉淀菌液，弃上清。往沉淀中加入100ml4。C预冷的lxPBS重悬。水浴超声，功率30%,超声10s，间隔30s,持续40min，避免起泡。液体变清亮后，4°C,13000g离心30min，取上清。上清中加入平衡后的his-tagN卜亲和纯化树脂(组氨酸标签的镍离子亲和纯化树脂，购自德国Qiagene^^司)2ml,室温:旋转混匀30min,500g离心5min,弃上清，沉淀中加入10ml洗涤緩冲液(Washingbuffer)重悬，反复颠倒混匀5min,500g离心5min，弃上清，重复2次。沉淀中加入1ml溶解緩冲液(ElutionBuffer),室温旋转混匀10min，500g离心5min,收集上清，重复2次，合并3次收集的上清，透析后，取5pl上样SDS-PAGE电泳及WesternBlotting鉴定。将4xA1315蛋白浓缩并测定蛋白浓度后低温保存下送至测试中心行电喷雾质谱观'J试其纯度。4重组4xAl^蛋白疫苗的制备重组4xA1^5蛋白与等量的佐剂MF59(鲨烯5ml，Tween800.5ml,span850.5ml，PBS94ml，配成100混合液，混合后乳化15min)混合充分乳化后制备成重组4xAfiu蛋白疫苗。本实施例中，八]315即为Afiw5。实例例二重组4xAl^蛋白疫苗接种Tg2576转基因小鼠后免疫学、病理学及行为学观察试验。1材料与方法1.1实验动物12只12月龄Tg2576转基因小鼠(Tg2576转基因小鼠为美国Taconic公司产品，并在本室繁育成功)。饲养到12月龄后随机分为2组4xA1315组和PBS对照组，每组各6只。1.2免疫接种重组4xA1315蛋白与等量的佐剂MF59(鲨烯5ml,Tween800.5ml,span850.5ml，PBS94ml，配成100混合液，混合后乳化15min)混合充分乳化后制备成重组4xAf^5蛋白疫苗，以100貼只/次背部皮下多点注射接种6只12月龄的Tg2576鼠，每次注射100pL，，第1次接种后,两周后加强1次,以后每隔4周接种一次。第6次接种后第7次不接种，进行抗体滴度测定。1.3间才妻酶耳关免疫吸附测定(enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA)法检测血清中抗A1342的滴度鼠尾采血，凝固后，离心分离血清，间接ELISA法检测AJ3抗体。用以本i果题组原核表达并纯化的GST-A1542肽(谷胱甘肽巯基转移酶，glutathioneS-transferase,GST)为抗原包被ELISA板，每孔1吗(0.05M碳酸盐緩冲液,pH9.0配制)，4。C包被过夜。PBST(phosphatebuffersalinetween,吐温磷酸盐緩冲液)洗板后，于37°C，3%BSA(BovineSerumAlbumin,牛血清白蛋白)封闭2h。血清样品从l:20开始倍比稀释，平行两孔，100pl/孔，37°C,2h;以PBS对照组免疫接种的小鼠血清为阴性对照，AB单抗为阳性对照。PBST洗板四次，拍干后，加入辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG(1:5000),37°C,1h;PBST洗4反四次，拍干后，加入TMB(3,3',5，5画Tetramethylbenzidine,3,3,5,5-四曱基联苯胺)底物，室温显色10min，2mol/LH2S04终止，酶标仪测定450nm的OD值(opticaldensity,光学密度)。(测定值OD画空白OD)/(阴性对照OD-空白OD)大于或等于2.1,且实验组OD值大于0.4，判断为阳性。1.4Moms水迷宫行为学测试Morris水迷宫主要由三部分组成，即内含平台的圓形水池、自动记录装置和电脑分析系统。水池由不锈钢板制成，直径100cm、水池深40cm，平台由透明有机玻璃制成，台高29cm,加水至30cm。水中加入奶粉成乳白色，使水面看不清平台，水温保持2(tc左右。按电脑分析系统内所标象限坐标，标记东(E,X轴正极)、南(S,Y轴负极)、西(W,X轴负极)、北(N,Y轴正极)4个入水点。自动记录装置包括摄像头、摄像仪和电脑组成，摄像仪与电脑相连。电脑Morris水迷宫自动分析软件，对动物游泳轨迹进行自动分析，分析结果包括小鼠游泳轨迹图，各象限游泳时间及距离，20%边缘区、40%边缘区和中心区域游泳路径占全部路径比，第一次找到平台的时间(逃避潜伏期)等。定位航行测试测试前，让少鼠自由游泳一天，上下午各一次，每次2min。测试时平台放在第一象限，小鼠分别从东、南、西、北(E、S、W、N)四个象限面对池壁放入水池，小鼠找到平台后在平台保持30s后，在行下一个入水点测试，超过60s未找到的按60s计算，取逃避潜伏期时间作统计。每天上下午各测试一单元(block),连续4天，共8个block。空间探索测试第8次定位航行实验结束后撤除平台，使小鼠在无平台情况下寻找记忆中的平台，游泳60s,取穿过平台的次数和平台象限游泳时间占总时间百分比作统计，无记忆障碍的老鼠穿过平台次数较多，平台象限的游泳时间百分比高。整个测试过程中，水池周围的参照物(包括实验者所站位置)不变，实验在安静环境中完成。1.5夹心法ELISA才企测^元原净争异'l"生(Enzyme-LinkedImmunosorbentAssay,间接酶联免疫吸附测定)y干扰素(IFN-力和白细素介素-4(IL-4)的合成将小鼠脾脏淋巴细胞悬液加入96孔聚苯乙烯细胞培养4反，每孔100pL，含2乂105个细胞。力。4xAB。和Afi42(先用双蒸水溶解，再与RPMI1640培养基混匀)，4xA13i5和AB42终浓度都是10)ig/ml。37°C,5%C02,培养72h。取出细胞培养板，吸取上清，-20。C冻存。将1:250的包被抗体加入96孔聚苯乙烯酶标反应板，每孔100iliL，4。C过夜。去掉液体，PBST(phosphatebuffersalinetween，吐温磷酸盐緩冲液)洗涤3次，每次5min。1%的BSA隱PBS(0.01MPBS配制,含0.3%TritonX-100,含1%牛血清白蛋白BSA)封闭，每孔200pL,室温孵育1h。去掉液体，PBST洗涤3次，每次5min。加倍比稀释的标准品和样本，每孔100|iL，室温孵育5h。去掉液体，PBST洗涤5次，每次5min。力。1:250的生物素标记的检测抗体，每孔100^L,室温孵育1h。去掉液体，PBST洗涤5次，每次5min。加1:250的HRP-抗生物素抗体(辣根过氧化物酶标记的抗生物素抗体)，每孔100|xL，室温孵育30min。去掉液体，PBST洗涤7次，每次5min。加底物液3，3,5，5-四甲基联苯胺(3,3',5,5-Tetramethylbenzidine,TMB),每孔100|iL，室温孵育15min。加终止液，每孑L50|liL。于波长450nm下测定每孔爿值，以P/N=2.1为阳性，在20min内测定实验结果。各组样本分别加4><AJ315和A154。。每个样本做3个复孔。阳性对照加入辅酶A(ConA)，每孔50^L,含ConA5|tig/ml。阴性对照只加培养液。实验步骤严格按照试剂盒的说明进行。为避免BSA中含有的IFN-y和IL-4对检测结果的影响，细胞培养时用不含BSA的RPMI1640培养液。根据标准品的测定结果，参照标准曲线，求得样本中的IFN-y和IL-4的含量。1.6老年斑的才企测和定量分析脑组织取材，4%多聚甲醛固定的全脑用于老年斑的4企测和定量分析。脑组织脱水、包埋，脑组织切片厚8pm，表于经黏附剂处理的载玻片上。采用免疫组织化学染色方法，曱醇(含3%11202)反应20min,0.01M磷酸盐緩冲液PBS(pH7.4)洗涤5minx3次，70%曱酸滴注于切片后静置5min,0.01MPBS洗涤5minx3次，1%BSA,37。C封闭30min,加抗AB42单克隆抗体(1:2000),37°C2h,再转至4。C过夜，0.01MPBS洗涤5minx3次，加过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG抗体(1:200),37。C孵育2h;0.01MPBS洗涤5minx3次，0.05%DAB(3,3，-diaminobenzidine，二氨基联苯胺)(含0.03%H202)显色5-10min，显微镜下见老年斑着色后，0.01MPBS洗涤终止液终止反应。脱水、透明、中性树胶封片，显微镜下观察。选背侧海马部位，每间隔40iLim取一张脑片，每只小鼠脑取6张脑片用于定量分析。分析的部位是整个海马及其上方顶叶联合皮质的老年斑。使用Leica显微镜及配套的软件系统和JVCky-F30B3-CCD彩色图像掇录系统对老年斑面积进行定量分析，计算顶叶联合皮质和海马部位淀粉样斑块面积占皮质和海马面积的百分比。每只小鼠脑6张切片的结果平均后作为一只小鼠顶叶联合皮质和海马部位的淀粉样斑块面积百分比计算。2结果2.1—般情况第一次采血(第2次接种后2周)实验组有抗Afi42抗体的产生，但各组产生抗体的量不同。随着接种次数的增多，各实验组抗体的滴度都在增高。各组鼠血清抗体的平均滴度显示实验组与对照组相比，PO.Ol。实验期间，各组Tg2576小鼠外观正常；饮食无明显变化；毛发无脱落；精神状态好；意识清醒；四肢运动正常；免疫部位未见明显炎症反应。脑、肝和肾HE染色显示脑皮质细胞清晰，层次分明细胞构筑无异常；肝细胞形态清晰，肝小叶结构正常；肾小球及肾小管形态结构正常；Perls染色呈阴性反应，表明疫苗接种没有引起Tg2576小鼠脑出血。2.2疫苗接种后免疫应答的分型(抗原特异性IFN-y和IL-4的合成)ConA作为阳性对照，PBS作为阴性对照，4xA1^5作为特异性抗原刺激，应用eBioscienceMouseThl/Th2ELISARead-SET-GO试剂盒检测上清中的IFN-y和IL-4。用4xA1^5刺激脾细胞3天后收集产生的上清液中，IL-4的含量高于IFN-y;与PBS组比较，有显著性差异(尸<0.01)，结果见表1。表明重组4xA1^5蛋白疫苗免疫转基因小鼠诱导了以Th2型为主的免疫反应。表1经不同抗原刺激后Tg2576小鼠脾细胞培养上清中细胞因子的含量<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>与PBS组相比，尸<0.01。2.3Morris水迷宫测试结果取每个block的三组小鼠的逃避潜伏期均值，可见随着小鼠学习次数的增加，各组的逃避潜伏期均逐渐缩短。每个block的逃避潜伏期，与PBS组相比，4xA1^5组差异均有显著性(尸O.Ol)。平台撤离后的穿环实验，以穿越平台次数、平台象限泳距百分比和20%边缘区泳距百分比来判断动物的学习记忆能力。PBS组、4xA13!5组小鼠穿过平台次数分别为1.17±0.89次和5.33±1.50次；4xA1315组较PBS组次数增多，差异有显著性(尸O.01);而平台象限游泳距离百分比分别为22.48±3.56y。和51.61土5.75。/。，4xA1^5组较PBS组有明显增高，差异有显著性(P0.01);20%边缘区泳距百分比分别为44.8±5.25%和13.8±5.02%,4xAi^组较PBS组明显下降，差异有显著性(尸O.Ol)。结果见表2。表2各组小鼠的空间探索实验结果<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>2.4老年斑的检测和定量分析疫苗接种6个月后，18月龄的4xAB,5组和PBS组鼠老年斑染色均可见淀粉样斑块，致密斑、弥散斑都存在，致密斑结构致密，边界清晰，多呈圆形，斑块的中心有一较为致密的核。有的在斑块的中心却呈现一不规则的淡染区。主要分布在胼胝体压部后方和枕叶的皮质、顶叶和额叶的皮质以及海马，白质及其它区域无斑块沉积发生。图像分析定量结果显示PBS组18月龄的Tg2576鼠淀粉样斑块面积占脑片面积平均为4.28±2.41%。而4xAB15组淀粉样沉积斑块明显减少，而且面积较小，平均斑块面积占相应面积的2.27±0.66%，与PBS组相比差异有显著性(尸O.OOl)。结果表明通过免疫Tg2576小鼠显示，原核表达制备的4xAl^蛋白疫苗可以诱导特异性抗体的产生，引起以Th2型为主的免疫应答。重组4xAB^蛋白疫苗可以阻止Tg2576鼠的认知功能的下降，改善其学习和记忆功能。疫苗接种组和对照组相比，其老年斑的数量明显减少。因此，本发明制备的重组四价A13w5蛋白疫苗将在AD的治疗中将具有广阔的前景。权利要求1、一种老年性痴呆重组蛋白疫苗，为重组多价Aβ1-15蛋白疫苗，所述Aβ1-15氨基酸序列为Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu-Val-His-His-GlnAβ1-15氨基酸序列间采用柔性连接肽连接形成多价Aβ1-15。2、根据权利要求1所述的一种老年性痴呆重组蛋白疫苗，其特征在于所说的柔性连接肽的序列为Gly-Gly或Gly-Ser-Ser-Gly。3、根据权利要求l或2所述的一种老年性痴呆重组蛋白疫苗，其特征在于所说的A15w5氨基酸序列为四价，即4xA13w5。4、根据权利要求1或2所述的一种老年性痴呆重组蛋白疫苗，其特征在于蛋白疫苗中以MF59为佐剂。5、如权利要求1所述的一种老年性痴呆重组蛋白疫苗的制备方法，包括如下步骤包括以下步骤(1)合成多条寡核苷酸引物，通过基因扩增得到的两个或两个以上含有柔性连接肽基因的二价ABw5基因片断；Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu-Val-His-His-Gln-G/y-G/y-Asp-Ala-Glu-Phe-Arg画His-Asp誦Ser-Gly-Tyr-Glu-Val-His-His-Gln隱G7;;H-G/j;(2x线w)和G/_yH-G(y-Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu-Val-His-His-Gln-G/;;-G/,Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu-Val-His-His-Gln(2xAfi15-2);(2)将两个或以上含有柔性连接肽基因的二价Afiw5基因片断依次克隆入pQE-30原核表达质粒中，制备重组质粒pQE-4xAJ315;(3)将重组质粒pQE-4xA1^5分别转化入表达菌M15[pREP4],IPTG诱导表达4xAJ^重组蛋白；(4)将表达的4xAl^重组蛋白经his-tagNi^亲和纯化树脂纯化后，透析获得高纯度的4xAfi15重组蛋白；(5)将高纯度的4xAJ315重组蛋白与佐剂等体积充分乳化混合后制备成4xA仏5重组蛋白疫苗。全文摘要一种老年性痴呆重组多价β-淀粉样蛋白1-15(Aβ<sub>1-15</sub>)蛋白疫苗及其制备方法，采取以下方案合成多条寡核苷酸引物，通过基因扩增得到的两个或以上含有柔性连接肽基因的二价Aβ<sub>1-15</sub>基因片断克隆入pQE-30原核表达质粒中，经细菌诱导表达、纯化，制备出能表达柔性可折叠的多价Aβ<sub>1-15</sub>的重组蛋白疫苗。本发明选择多价可折叠的Aβ<sub>1-15</sub>为免疫原，避免了多拷贝AβB细胞抗原表位的空间僵化结构，还使Aβ<sub>15</sub>表位更容易暴露，增强了免疫原性。同时也增加了免疫原的分子量，降低了降解的可能性。选择原核表达系统来制备重组蛋白，避免了化学合成的高难度及高成本的缺点。文档编号C12N15/12GK101318015SQ20081002900公开日2008年12月10日申请日期2008年6月25日优先权日2008年6月25日发明者姚志彬申请人:中山大学