增强蛋白类疫苗免疫效果的含CpG单链脱氧寡核苷酸的制作方法

专利名称：增强蛋白类疫苗免疫效果的含CpG单链脱氧寡核苷酸的制作方法
技术领域：
本发明涉及数种含CpG单链脱氧寡核苷酸，特别是涉及可增强狂犬疫苗、乙型肝炎疫苗、流感病毒疫苗和其它蛋白类疫苗免疫效果的含CpG单链脱氧寡核苷酸；以及这些含CpG单链脱氧寡核苷酸用于制备可增强狂犬疫苗、乙型肝炎疫苗、流感病毒疫苗和其它蛋白类疫苗免疫效果的生物制剂的用途。
背景技术：
100多年前，Coley在世界上第一个开展了应用细菌提取物治疗细菌感染性疾病的实验，他得出结论细菌的提取物是一种可以用于治疗传染性疾病的制剂。
1984年，Tokunaga T等发现从卡介苗(BCG)提取的DNA能抑制多种动物肿瘤的生长，具有激活人外周血单个核细胞和小鼠脾脏天然杀伤(NK)细胞的活性，诱导干扰素(IFN)的产生。非脊椎动物的DNAs有上述功能，脊椎动物和植物的DNA则不然，这些功能依赖于DNA分子中CpG结构(Tokunaga T，Antitumor activity of deoxyribonucleic acid fractionfrom Mycobacterium bovis BCG.I.Isolation，physicochemical characterization，and antitumor activity，JNCI，72955.1984)。
CpG是由胞嘧啶和鸟嘌呤通过磷酸连接成的二核苷酸。C代表胞嘧啶，G代表鸟嘌呤，p代表磷酸，胞嘧啶位于5’端。多种具有CpG结构的细菌和病毒DNA对脊椎动物的免疫系统均为危险的信号，可激活多种免疫细胞启动对细菌和病毒的抵抗机制。近年来的研究表明，人工合成的含一个或多个CpG的寡核苷酸单链DNA(CpG ODN)也可表现强效的免疫增强和免疫调节作用。CpG ODN可强力增强B细胞、T细胞、NK细胞、抗原提呈细胞(单核细胞、巨噬细胞和树突状细胞)和中性粒细胞的功能，表现出明显的临床应用前景(Weiner GJ，The immunobiology andclinical potential of immunostimulatory CpG oligodeoxynucleotides.J LeukocBiol 2000 Oct；68(4)455-63)。
由于序列，尤其是CpG两侧的序列的不同，CpG ODN可有多种多样的形式，表现不同性质、不同强度的免疫增强和免疫调节作用。CpG ODN可表现出种属依赖性，即对一种动物表现免疫增强功能的CpG ODN，在另一种动物或人则未必表现出同样的或等效的免疫增强功能(Kamstrup S，et al.Response of porcine peripheral blood mononuclear cells to CpG-containing oligodeoxynucleotides，Vet Microbiol 2001 Feb 26；78(4)352-62；Gunther Hartmann，et al.Delineation of a CpG PhosphorothioateOligodeoxynucleotide for Activating Primate Immune Responses In Vitro andIn Vivol The Journal of Immunology，2000，1641617-1624)。
研究表明，某些CpG ODN有强效的免疫增强作用，可增强B细胞、T细胞、NK细胞、抗原提呈细胞(单核细胞、巨噬细胞和树突状细胞)和中性粒细胞的功能，表现出明显的临床应用价值(Weiner GJ，Theimmunobiology and clinical potential of immunostimulatory CpGoligodeoxynucleotides.J Leukoc Biol 2000 Oct；68(4)455-63)。Cynthia L.等证明，CpG ODN可明显增强重组乙型肝炎表面抗原(HBsAg)的免疫效果(Cynthia L.et al.CpG DNA can induce strong Th1 humoral and cell-mediatedimmune responses against hepatitis B surface antigen in young mice.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.Vol.95，26，15553-15558，December 22，1998)。与HBsAg单独免疫相比，HBsAg和CpG ODN一起免疫BALB/c小鼠可使其抗HBsAg抗体的滴度增加5-到40-倍(Gunther Hartmann，et al.Delineation of a CpGPhosphorothioate Oligodeoxynucleotide for Activating Primate ImmuneResponses In Vitro and In Vivol The Journal of Immunology，2000，1641617-1624)。
此外，CpG ODN可明显增强狂犬疫苗，流感嗜血杆菌疫苗，白喉-百日咳-破伤风疫苗以及其他蛋白类疫苗诸如呼吸道合胞病毒(RSV)疫苗，口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus)疫苗，免疫缺陷病毒疫苗(HIV gp120)等许多疫苗的免疫效果，CpG ODN可明显增强外周血中单个核细胞增生以及表达CD19，促进TNF以及IL-6的表达。

发明内容
发明概述本发明的目的之一是提供数种含CpG单链脱氧寡核苷酸，特别是可增强狂犬疫苗、乙型肝炎疫苗、流感疫苗和其它蛋白类疫苗免疫效果的含CpG单链脱氧寡核苷酸。它们由含一个或多个CpG的寡核苷酸单链DNA分子构成，其磷酸二酯键可以是部分硫化的，全部硫化的，也可以是未硫化的。
优选地，本发明的含CpG单链脱氧寡核苷酸具有SEQ ID NO1-81所示的序列。
本发明的目的之二是提供含有本发明的含CpG单链脱氧寡核苷酸和狂犬疫苗、乙型肝炎疫苗、流感病毒疫苗和其它蛋白类疫苗的生物制剂。较之于普通的狂犬疫苗、乙型肝炎疫苗、流感疫苗和其它蛋白类疫苗，这些生物制剂的免疫效果有了明显的提高。
本发明的目的之三是提供本发明的含CpG单链脱氧寡核苷酸用于制备可增强狂犬疫苗、乙型肝炎疫苗、流感病毒疫苗和其它蛋白类疫苗免疫效果的生物制剂的用途。
另外，需要指出的是，在本申请的上下文的公开内容的基础上，本发明的其它具有实质性特点的方面和创造性的有益效果对本领域的普通技术人员来说是可以直接推知的。
附图简要说明

图1显示了CpG刺激外周血单个核细胞(48h)产生CD19的实验结果。
图2显示了CpG刺激外周血单个核细胞产生IL-6的实验结果。
具体实施例方式
在本发明的上下文中，所使用的术语除非另外说明，一般具有本领域的普通技术人员通常理解的含义。
本发明的数种含CpG单链脱氧寡核苷酸，特别是可增强狂犬疫苗、乙型肝炎疫苗、流感疫苗和其它蛋白类疫苗免疫效果的含CpG单链脱氧寡核苷酸由含一个或多个CpG的寡核苷酸单链DNA分子构成，其磷酸二酯键可以是部分硫化的，全部硫化的，也可以是未硫化的。优选地，本发明的含CpG单链脱氧寡核苷酸具有如下所示的序列1015’-TcgTCgAgggCgCCggTgAC-3’1025’-TCgTCgCCggTgggggTgTg-3’1035’-TCgTCgTACgCAATTgTCTT-3’1045’-TCgCCTCgTCgCCTTCgAgC-3’2015’-TCgCCCACCggTgggggggg-3’2025’-TCgTCgCAgACCggTCTgggg-3’2035’-gggggACgTCgCCggggggg-3’2045’-ggATCCgTACgCATgggggg-3’2055’-TCgTCgCggCCggCgCCCCC-3’2065’-TCgTCgCggCCgCgAggggg-3’3015’-TCgTCgTTACCgATgACgTCgCCgT-3’3025’-TCgTCgggTgCgACgTCgCAgggggg-3’3035’-TCgTCgggTgCgACgATCgTCgggggg-3’3045’TCgTCgTTTgCATCgATgCAgTCgTCgTT-3’3055’-TCgTCgTTTgCATCgATgCAggggggg-3’3065’-ACCggTATCgATgCCggTgggggg-3’3075’-ggggTCCATgACgTTCCTgAAgggggg-3’3085’-TCgTCgTTTTgACgATCgTCgggggg-3’3095’-TTCgTCgTTTgATCgATgTTCgTTgggggg-3’3105’-TTCgTCgTTgTgATCgATgggggg-3’3115’-TATCgATgTTTTCgTCgTCgTTgggggg-3’3125’-TTCgTTgCATCgATgCATCgTTgggggg-3’3135’-TTCgCTTCgCTTTTCgCTTCgCTT-3’6015’-TCgAggACAAgATTCTCgTgC-3’6025’-TCgAggACAAgATTCTCgTgCAggCC-3’6035’-TCgTgCAggCCAACgAggCCg-3’
604 5’-ACCgCCAAggAgAAgCCgCAggAggg-3’605 5’-TCgTTgCCgTCggCCC-3’606 5’-TACAACggCgAggAATACC-3’607 5’-TCggCACgCgACgTgCTggCCgTCgTTTCC-3’608 5’-gTACAACggCgAggAATACCT-3’609 5’-ACCgTCgTTgCCgTCggCCC-3’610 5’-TgCTggCCgTCgTT-3’611 5’-gTCggCACgCgACg-3’612 5’-gTCggCACgCgACgggggg-3’613 5’-gTCggCACgCgACgCCCCCC-3’614 5’-TCgTTgCCgTCggCCCCCCCCC-3’615 5’-TCgTTgCCgTCggCCCCCC-3’616 5’-TCgTTgCCgTCggCCCCC-3’617 5’-TCgTTgCCgTCggCCCC-3’618 5’-TCgTTgCCgTCggCCCCCCC-3’619 5’-TCgTTgCCgTCgg-3’620 5’-TCgTTgCCgTCggg-3’621 5’-TCgTTgCCgTCgggg-3’622 5’-TCgTTgCCgTCggggg-3’623 5’-TCgTTgCCgTCgggggg-3’624 5’-TCgTTgCCgTCggggggg-3’625 5’-TCgTTgCCgTCgggggggg-3’626 5’-TCgTTgCCgTCggggggggg-3’627 5’-TCgAggACAAgATTCTCgT-3’628 5’-TCCCgCTggACgTT-3’629 5’-TCggCACgCgACgTgCTggCCgTCgTT-3’631 5’-TCgTCgCgCCgTCACgggggg-3’632 5’-TCgTgTgCgTgCCgTTggg-3’633 5’-TCgTCgCCgTTgggCggg-3’634 5’-TCgTCgACgTCgTTgggCggg-3’
635 5’-TCgCAgTTgTCgTAACgTTgggCggg-3’636 5’-TTACCggTTAACgTTggCCggCC-3’637 5’-ACCggTTAACgTTgTCCCCgggg-3’638 5’-TCgTCgTTggTATgTT-3’639 5’-TCgTCgTCgTCgTTgTCgTT-3’640 5’-TCgTCgTCgTCgTTgTCgTTgggg-3’641 5’-TCgTTCggggTgCCg-3’642 5’-TCgTTCggggTAACgATT-3’643 5’-TCgTTCggggTAACgTT-3’644 5’-TCgTTCggggTACCgAT-3’645 5’-TCgTTCggggTACCgATgggg-3’646 5’-TCgTTgCgCTCCCATgCCgggggg-3’647 5’-TCgTCgTTTCgTCgTTgggg-3’648 5’-TCgTTgTCgTTTCgCTgCCggCggggg-3’649 5’-CgTTgACgATCgTCCCATggCggg-3’650 5’-TCTgCggCCTTCgTCg-3’651 5’-TAgTAACCggTCCggCgCCCCC-3’652 5’-TTgCAgCgCTgCCggTggg-3’653 5’-TCgTACggCCgCCgTACggCggg-3’654 5’-CggCCCATCgAgggCgACggC-3’655 5’-TCgCgTCgACTCCCCTCgAgggg-3’656 5’-TCgTCgTCgACTCgTggTCggggg-3’657 5’-TCgggCgCCCgATCgggggg-3’658 5’-TCgTCggTCTTTCgAAATT-3’659 5’-TCgTgACgTCCTCgAgTT-3’以上所述的序列可以是部分硫化的，全部硫化的，也可以是未硫化的。
本发明的CpG单链脱氧核苷酸可通过已知的方法生产，例如采用固相亚磷酰胺三酯法进行生产。以下的实施例详细地例举了一种生产本发明的CpG单链脱氧核苷酸的方法。
在这些含CpG单链脱氧寡核苷酸用于制备可增强狂犬疫苗、乙型肝炎疫苗、流感病毒疫苗和其它蛋白类疫苗免疫效果的生物制剂的用途中，含CpG单链脱氧寡核苷酸与狂犬疫苗、乙型肝炎疫苗、流感病毒疫苗和其它蛋白类疫苗的使用量的比例为1∶1-100∶1(摩尔比)。
本发明的含CpG单链脱氧寡核苷酸的使用方式包括与常规蛋白类疫苗、DNA疫苗混合使用，与常用的佐剂(如铝佐剂、弗氏佐剂等)联合应用来增强疫苗免疫效果、与常规蛋白类疫苗通过交联剂共价偶联使用；免疫方式包括皮下应用、粘膜表面应用、肌肉应用、胃肠应用、腹腔应用等常用的免疫方式。
CpG单链脱氧寡核苷酸使用时间可为常规疫苗免疫前应用、与常规疫苗同时应用、常规疫苗免疫后应用。
在小鼠试验中CpG单链脱氧寡核苷酸的使用量为1-500微克/小鼠，如进行人体试验则按标准的换算方法进行换算。
下面结合具体的制备实施例和生物学效果实施例，并参照附图进一步详细地描述本发明。应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。
实施例在如下实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法，例如合成采用固相亚磷酰胺三酯法、ELISA采用间接法。
在如下实施例中，所用试剂的来源、商品名和/或有必要列出其组成成分者，均只标明一次。在其后所用相同试剂如无特殊说明，不在赘述上述内容。
实施例1CpG单链脱氧核苷酸的制备(上海生工合成)合成采用固相亚磷酰胺三酯法，合成方法(上海生工提供)如下材料和方法三氯乙酸(Trichloroacetic Acid，TCA)、可控多孔玻璃(Controlled PoreGlass)、DMT(二甲氧基三苯甲基)、四氮唑活化剂、乙酸酐、N-甲基咪唑、ABI DNA合成仪、高效液相色谱层析仪等。
A、T、C、G四种核苷酸单体合成所用单体为核苷亚磷酰胺，是经过化学修饰的核苷酸，含下面几个功能基团1.3’位P上二异丙胺基，缩合所用的功能基2.3’位P上晴乙基，保护基，合成完毕后脱去。
3.5’-Dmt，保护基，缩合前脱去。
4.A和C的杂环氨基上的苯甲酸保护基，合成完毕后脱去。
5.G上嘌呤环氨基上的异丙酰保护基，合成完毕后脱去。
具体的反应步骤如下一、脱保护基用三氯乙酸(Trichloroacetic Acid，TCA)脱去连结在可控多孔玻璃(Controlled Pore Glass)上的核苷酸的保护基团二甲氧基三苯甲基(DMT)，获得游离的5’-羟基端，以供下一步缩合反应。
二、活化将亚磷酰胺保护的核苷酸单体与四氮唑活化剂混合并进入合成柱，形成亚磷酰胺四唑活性中间体(其3’-端已被活化，但5’-端仍受DMT保护)，此中间体将与可控多孔玻璃上的已脱保护基的核苷酸发生缩合反应。
三、连接亚磷酰胺四唑活性中间体遇到可控多孔玻璃上已脱保护基的核苷酸时，将与其5’-羟基发生亲合反应，缩合并脱去四唑，此时合成的寡核苷酸链向前延长一个碱基。
四、封闭缩合反应后为了防止连在可控多孔玻璃上的未参与反应的5’-羟基在随后的循环反应中被延伸，常通过乙酰化来封闭此端羟基，一般乙酰化试剂是用乙酸酐和N-甲基咪唑等混合形成的。
五、氧化缩合反应时核苷酸单体是通过亚磷酯键与连在可控多孔玻璃上的寡核苷酸连接，而亚磷酯键不稳定，易被酸、碱水解，此时常用碘的四氢呋喃溶液将亚磷酰转化为磷酸三酯，得到稳定的寡核苷酸。
经过以上五个步骤后，一个脱氧核苷酸就被连到可控多孔玻璃的核苷酸上，同样再用三氯乙酸脱去新连上的脱氧核苷酸5’-羟基上的保护基团DMT后，重复以上的活化、连接、封闭、氧化过程即可得到一DNA片段粗品。最后对其进行切割、脱保护基(一般对A、C碱基采用苯甲酰基保护；G碱基用异丁酰基保护；T碱基不必保护；亚磷酸用腈乙基保护)、纯化(常用的有HAP，PAGE，HPLC，C18，OPC等方法)、定量等合成后处理即可得到符合实验要求的寡核苷酸片段。
未硫化的CpG单链脱氧核苷酸在ABI 3900 DNA合成仪上合成(上海生工生物技术服务有限公司)，而全硫化及部分硫化的CpG单链脱氧核苷酸的合成采用置换法，在ABI 394 DNA合成仪上合成(上海生工生物技术服务有限公司)。
实施例2CpG刺激人外周血单个核细胞增生实验(一)人外周血单个核细胞的分离1、试剂和材料肝素抗凝的人全血长春市中心血站。
聚蔗糖-泛影葡胺比重1.077±0.001，北京鼎国生物技术有限公司。
细胞培养常用的仪器设备低温冰箱、二氧化碳孵箱、超净工作台、倒置显微镜、液氮罐、蒸馏水器、真空泵、细胞培养瓶、滤菌器、滤过瓶、各种规格的吸管、加样器、滴管、血球计数板、水平式离心机等。
RPMI1640培养液含L-谷氨酰胺的RPMI1640(GIBCOBRL) 10.4克碳酸氢钠 2.0克庆大霉素 10万单位加三蒸水至体积1000毫升0.22微米的滤膜真空泵抽滤除菌、分装。
小牛血清灭活小牛血清(Invitrogen)-20℃取出，4℃冰箱融化后，56℃水浴30min。
10％小牛血清的RPMI1640灭活的小牛血清 10毫升RPMI 1640培养液 90毫升Hank’s液(无钙离子、镁离子)的配制氯化钠 8.0克氯化钾 0.4克磷酸氢二钠(带一个结晶水)0.06克磷酸二氢钾 0.06克碳酸氢钠0.35克葡萄糖 1.0克酚红0.02克加入双蒸水至1000毫升。
将上列成分混合后溶化，8磅15min灭菌，4℃冰箱保存。临用时用7.4％NaHCO3调pH至7.3～7.6。
2％台酚兰染色液台酚兰 2克生理盐水100毫升2、方法肝素抗凝的人外周血缓慢沿管壁缓慢加于比重为1.077±0.001的聚蔗糖-泛影葡胺淋巴细胞分层液面上，分离液与外周血的比例约为2∶1。
水平离心机离心1,000xg 15-20min，离心后管内分为3层，用吸管吸取白色云雾层狭窄带，置入另一管中。
加入等倍或以上体积的Hank’s液(无血清)，800-1,000xg 10-15min，弃上清，加入Hank’s液，洗涤细胞两次。
末次离心后，弃上清，加入培养基2ml，重悬细胞。
取一滴细胞悬液与一滴0.2％台盼兰染液混合，于血球计数板计数四个大方格内的细胞总数，单个核细胞浓度(细胞数/1毫升细胞悬液)＝4个大方格内细胞总数/4×104×2(稀释倍数)。
(二)3H-TDR掺入试验1、器材和试剂RPMI1640培养液含L-谷氨酰胺的RPMI1640(GIBCOBRL) 10.4克碳酸氢钠 2.0克庆大霉素 10万单位加三蒸水至体积1000毫升0.22微米的滤膜真空泵抽滤除菌、分装。
小牛血清灭活小牛血清(Invitrogen)-20℃取出，4℃冰箱融化后，56℃水浴30min。
10％小牛血清的RPMI1640灭活的小牛血清10毫升RPMI 1640培养液 90毫升TE缓冲液TE缓冲液(10mM Tris，1mM EDTA，HCl调节pH至7.0。高压灭菌，滤膜过滤)配制的CpG ODN3H-TDR(25μl中含25μCi3H-TDR)96孔板(平底)Eppendorf管(0.5ml、1.5ml)细胞收集器液闪计数器37℃ CO2孵箱2、方法用完全培养基调节人外周血单个核细胞(PBMC)至终浓度3×106个/ml。
将PBMC加到96孔板中，每孔100μl(3×105个/孔)，其中含终浓度为0.6μg/ml的硫代的CpG，每个CpG三复孔。
培养24-48小时后，每孔加入稀释后的3H-TDR(3H-TDR用完全培养基稀释至25μCi/ml)20μl，即每孔内含0.5μCi3H-TDR，继续培养16-18d。
用细胞收集器收集细胞到滤纸上，60℃孵箱烘烤滤纸2-3h，将滤纸放入液闪瓶内，加入闪烁液，测cpm值(三)实验结果(cpm值)阴性对照(未加CpG ODN)三个复孔的cpm值574 544 390以下为各CpG ODN刺激组三个复孔的cpm值203826 1450 13022051251410594110063027252 6630 62483035284 5624 53963052950 9136 101203066770 3830 38443071740 1718 1962304115241314811574310；1085410210102586071240615204141106083118 2446 29946104228 4362 46246192196 7738 73046238598 8056 75766316152 6688 62406341203812068124786394194 17894176526401607816966170266451210012424115566471702214588163726545246 4272 50106561170412446123786574244 3910 4200658162061660215506
65943321639216284实施例3CpG ODN刺激人外周单个核细胞表达CD19(一)人外周血单个核细胞的分离1、试剂和材料肝素抗凝的人全血长春市中心血站。
聚蔗糖-泛影葡胺比重1.077±0.001，北京鼎国生物技术有限公司。
细胞培养常用的仪器设备低温冰箱、二氧化碳孵箱、超净工作台、倒置显微镜、液氮罐、蒸馏水器、真空泵、细胞培养瓶、滤菌器、滤过瓶、各种规格的吸管、加样器、滴管、血球计数板、水平式离心机等。
RPMI1640培养液含L-谷氨酰胺的RPMI1640(GIBCOBRL) 10.4克碳酸氢钠 2.0克庆大霉素 10万单位加三蒸水至体积1000毫升0.22微米的滤膜真空泵抽滤除菌、分装。
小牛血清灭活小牛血清(Invitrogen)-20℃取出，4℃冰箱融化后，56℃水浴30min。
10％小牛血清的RPMI1640灭活的小牛血清10毫升RPMI 1640培养液 90毫升Hank’s液(无钙离子、镁离子)的配制氯化钠8.0克氯化钾0.4克磷酸氢二钠(带一个结晶水) 0.06克磷酸二氢钾0.06克碳酸氢钠 0.35克葡萄糖1.0克酚红 0.02克加入双蒸水至1000毫升。
将上列成分混合后溶化，8磅15min灭菌，4℃冰箱保存。临用时用7.4％NaHCO3调pH至7.3～7.6。
2％台酚兰染色液台酚兰2克生理盐水 100毫升2、方法肝素抗凝的人外周血缓慢沿管壁缓慢加于比重为1.077±0.001的聚蔗糖-泛影葡胺淋巴细胞分层液面上，分离液与外周血的比例约为2∶1。
水平离心机离心1,000xg 15-20min离心后管内分为三层，用吸管吸取白色云雾层狭窄带，置入另一管中。
加入等倍或以上体积的Hank’s液(无血清)，800-1,000xg 10-15min，弃上清，加入Hank’s液，洗涤细胞两次。末次离心后，弃上清，加入培养基2ml，重悬细胞。
取一滴细胞悬液与一滴0.2％台盼兰染液混合，于血球计数板计数四个大方格内的细胞总数，单个核细胞浓度(细胞数/1毫升细胞悬液)＝4个大方格内细胞总数/4×104×2(稀释倍数)。
3、用流式细胞仪测定人外周血单个核细胞(PBMC)表达的CD191)用完全培养基调人外周血单个核细胞(PBMC)至终浓度3×106/ml。将PBMC加到96孔板中，每孔100μl(3×105个/孔)。
2)每孔加入硫代的CpG ODN，终浓度为0.6μg/ml，每种CpG ODN设三复孔。37℃5％ CO2培养24-48h。
3)将96孔板4℃ 1260转/分钟离心5min。
4)弃上清，以PBS缓冲液4℃ 1260转/分钟离心5min洗两次。
5)弃上清，以50微升PBS缓冲液重悬细胞。
6)每孔按1∶50加入异硫氰酸荧光素标记的CD19抗体，轻弹96孔板混匀。冰上避光孵育30min。
7)以PBS缓冲液4℃ 1260转/分钟离心5min洗两次。
8)以200μlPBS缓冲液重悬细胞，并移入测试管中，进行流式细胞仪(FACS)检测。结果如图1所示。
实施例4刺激外周血单个核细胞产生IL-6(一)人外周血单个核细胞的分离1、试剂和材料肝素抗凝的人全血长春市中心血站。
聚蔗糖-泛影葡胺比重1.077±0.001，北京鼎国生物技术有限公司。
细胞培养常用的仪器设备低温冰箱、二氧化碳孵箱、超净工作台、倒置显微、液氮罐蒸馏水器、真空泵、细胞培养瓶、滤菌器、滤过瓶、各种规格的吸管、加样器、滴管、血球计数板、水平式离心机等。
RPMI1640培养液含L-谷氨酰胺的RPMI1640(GIBCOBRL) 10.4克碳酸氢钠 2.0克庆大霉素 10万单位加三蒸水至体积1000毫升0.22微米的滤膜真空泵抽滤除菌、分装。
小牛血清灭活小牛血清(Invitrogen)-20℃取出，4℃冰箱融化后，56℃水浴30min。
10％小牛血清的RPMI1640灭活的小牛血清10毫升RPMI 1640培养液 90毫升Hank’s液(无钙离子、镁离子)的配制氯化钠8.0克氯化钾0.4克磷酸氢二钠(带一个结晶水) 0.06克磷酸二氢钾0.06克碳酸氢钠 0.35克葡萄糖1.0克酚红 0.02克加入双蒸水至1000毫升。
将上列成分混合后溶化，8磅15min灭菌，4℃冰箱保存。临用时用7.4％ NaHCO3调pH至7.3～7.6。
2％台酚兰染色液台酚兰 2克生理盐水 100毫升2、方法肝素抗凝的人外周血缓慢沿管壁缓慢加于比重为1.077±0.001的聚蔗糖-泛影葡胺淋巴细胞分层液面上，分离液与外周血的比例约为2∶1。
水平离心机离心1,000xg 15-20min，离心后管内分为三层，用吸管吸取白色云雾层狭窄带，置入另一管中。
加入等倍或以上体积的Hank’s液(无血清)，800-1,000xg 10-15min，弃上清，加入Hank’s液，洗涤细胞两次。
末次离心后，弃上清，加入培养基2ml，重悬细胞。
取一滴细胞悬液与一滴0.2％台盼兰染液混合，于血球计数板计数四个大方格内的细胞总数，单个核细胞浓度(细胞数/1毫升细胞悬液)＝4个大方格内细胞总数/4×104×2(稀释倍数)。
3、IL-6的测定用完全培养基调节人外周血单个核细胞(PBMC)至终浓度3×106个/ml。
将PBMC加到96孔板中，每孔100μl(3×105个/孔)，其中含终浓度为0.6μg/ml的硫代的CpG ODN，每个CpG ODN，三复孔。培养24-48小时后，取上清测IL-6。
ELISA试剂盒(Quantikine R & D)测定IL-6的步骤(1)备齐各种试剂和标准品；
(2)每孔加入100ul RD1A试验稀释液；(3)加入IL-6标准品或样品(即上清)100μl/孔，置室温孵育2h；(4)甩干并以缓冲液洗4次；(5)加入200μl/孔酶标抗体，置室温孵育2h；(6)甩干并以缓冲液洗4四次；(7)加入200μl/孔底物，置室温20min；(8)加入50μl/孔终止液，450nm处读值，结果如图2所示。
实施例5增强狂犬疫苗免疫效果实验(病毒攻击法)狂犬病疫苗增效试验(NIH法)(1)实验材料攻击毒株的制备攻击毒株CVS由卫生部中国药品生物制品检定所提供，启开冻干毒种稀释成10-2悬液，用体重11-13g小鼠脑内接种0.03ml连续传2-3代，收脑时选择4-5d出现典型狂犬病症状的小鼠，将鼠脑研磨加入适量含正常马血清或小牛血清蒸馏水制成20％悬液，1000r/min离心10min，用体重18-20g小鼠10只做病毒滴定，符合要求，分装小管，-60℃保存。标准狂犬疫苗由中国药品生物制品检定所提供(2)实验步骤狂犬疫苗分组①狂犬疫苗(长春生物制品研究所提供)；②狂犬疫苗+AL(OH)3③CpG640(10微克/小鼠)+狂犬疫苗；④CpG647(10微克/小鼠)+狂犬疫苗；⑤CpG640(10微克/小鼠)+AL(OH)3+狂犬疫苗；⑥CpG647(10微克/小鼠)+狂犬疫苗+AL(OH)3。每组狂犬疫苗取5×、25×、125×三个稀释浓度。
标准狂犬疫苗取25×、125×、625×三个稀释浓度。选用体重12-14g小鼠15只，每只腹腔接种0.5ml，间隔一周后再免疫一次，并预留40只同批小鼠用来测定攻击病毒的LD50。
攻击小鼠第一次免疫后14d，预先测定毒株CVS的效力为每0.03ml含5-100×LD50病毒量。将病毒液按100、10-1、10-2、10-3稀释。然后用各个稀释度的病毒(0.03ml)分别对各组小鼠进行脑内攻击，每组10只小鼠。CpG+狂犬疫苗组15只小鼠。所有小鼠自攻击之日起观察14d，攻击后最初4日内死亡的小鼠不作统计，第5d后死亡和呈现典型脑病症状的小鼠进行计算统计。疫苗效力测定不低于2.5国际单位(IU)/剂为合格。 结果见下表(表1-表8)。
表1狂犬疫苗(长春生物制品研究所)免疫效果效力试验 疫苗(长春生物制品研究所)免疫日期 1次免疫日期2002.7.26 攻击日期2002.8.092次免疫日期2002.8.02. 判定日期2002.8.23组 疫苗浓 小鼠数 死亡日期及死亡数 14日 换算ED50别 度生 死 生 死 死亡％被 5×15 7191132 30 2检 25× 15 7292114 17 6 26.1苗 125×15 74941116 9 6 15 71.4ED50＝1.4+(50-26.1)×0.7/(71.4-26.1)＝1.77IU＝10(1.77-2.29)×6.7＝2.02表2狂犬疫苗(长春生物制品研究所)+AL(OH)3组免疫效果效力试验 疫苗(长春生物制品研究所)免疫日期 1次免疫日期2002.7.26 攻击日期2002.8.092次免疫日期2002.8.02. 判定日期2002.8.23组 疫苗浓 小鼠数 死亡日期及死亡数 14日 换算ED50别 度生 死 生 死 死亡％被 5×15 9114 1 34 1检 25× 15 719212 3 20 420苗 125×15 739211287 8 11 57.9ED50＝1.4+(50-20)×0.7/(57.9-20)＝1.95
IU＝10(1.95-2.29)×6.7＝3.06表3CpG640+狂犬疫苗(长春生物制品研究所)组免疫效果效力试验 疫苗(长春生物制品研究所)免疫日期 1次免疫日期2002.7.26 攻击日期2002.8.092次免疫日期2002.8.02. 判定日期2002.8.23组 疫苗浓 小鼠数 死亡日期及死亡数 14日 换算 ED50别 度生 死 生 死 死亡％被 5× 15 91141 33 1检 25×15 7191132 19 313.6苗 125× 15 74941116 9 612 66.7ED50＝1.4+(50-13.6)×0.7/(66.7-13.6)＝1.88IU＝10(1.88-2.29)×6.7＝2.60表4CpG647+狂犬疫苗(长春生物制品研究所)组免疫效果效力试验疫苗(长春生物制品研究所)免疫日期 1次免疫日期2002.7.26攻击日期2002.8.092次免疫日期2002.8.02. 判定日期2002.8.23组 疫苗浓 小鼠数 死亡日期及死亡数 14日 换算 ED50别 度 生死 生 死 死亡％被 5× 15 9114 1 32 1检 25×15729112 3 18 418.2苗 125× 1575931116 9 613 68.4ED50＝1.4+(50-18.2)×0.7/(68.4-18.2)＝1.84IU＝10(1.84-2.29)×6.7＝2.37
表5CpG640+狂犬疫苗(长春生物制品研究所)+AL(OH)3组免疫效果效力试验 疫苗(长春生物制品研究所)免疫日期 1次免疫日期2002.7.26 攻击日期2002.8.092次免疫日期2002.8.02. 判定日期2002.8.23组 疫苗浓 小鼠数 死亡日期及死亡数 14日 换算ED50别 度生 死 生 死 死亡％被 5× 15 9114 1 34 1检 25× 15 9111113 2 20 313苗 125× 15 739411178 711 61.1ED50＝1.4+(50-13)×0.7/(61.1-13)＝1.94IU＝10(1.94-2.29)×6.7＝2.99表6CpG647+狂犬疫苗(长春生物制品研究所)+AL(OH)3免疫效果效力试验 疫苗(长春生物制品研究所)免疫日期 1次免疫日期2002.7.26 攻击日期2002.8.092次免疫日期2002.8.02.判定日期2002.8.23组 疫苗浓 小鼠数 死亡日期及死亡数 14日 换算 ED50别 度生 死 生 死死亡％被 5× 15 7114 1 33 1检 25× 15 719111112 3 19 417.4苗 125× 15 739411178 712 63.2ED50＝1.4+(50-17.4)×0.7/(63.2-17.4)＝1.90IU＝10(1.90-2.29)×6.7＝2.73
表7标准苗(中国药品生物制品检定所)组免疫效果效力试验 疫苗免疫日期 1次免疫日期2002.7.26 攻击日期2002.8.092次免疫日期2002.8.02. 判定日期2002.8.23组 疫苗浓 小鼠数 死亡日期及死亡数 14日 换算ED50别 度 (只)(dn)生 死 生 死 死亡％标 25× 15 719113 226 2准 125× 15 72931119613 8 38.1苗 625× 15 7482103122411 41982.6ED50＝2.1+(50-38.1)×0.7/(82.6-38.1)＝2.29IU＝6.7表8攻击毒测定结果毒株CVS的效力 攻击日期2002.8.09判定日期2002.8.23组 病毒稀 小鼠数 死亡日期及死亡数 14日 换算 ED50别 释度(只) 生 死 生 死死亡％攻 10010 710010 0241.91击 10-110 76931911493.3毒 10-210 73925565 45.5测 10-310 10 0160定(3)结论各组IU值如下表1狂犬疫苗组2.02表2狂犬疫苗+AL(OH)3.06表3CpG640+狂犬疫苗组2.60
表4CpG647+狂犬疫苗组2.37表5CpG640+狂犬疫苗+AL(OH)2.99表6CpG647+狂犬疫苗+AL(OH)2.73从各组结果中可以看出，除了第1组(狂犬疫苗组IU＝2.02)和第4组(CpG647+狂犬疫苗组IU＝2.37)IU＜2.5之外，其余各组IU均大于2.5，证明CpG ODN确实可以增强狂犬疫苗的免疫效果。
在狂犬疫苗的稀释度为25倍稀释时各组受试小鼠的死亡率分别为表1狂犬疫苗组26.1表2狂犬疫苗+AL(OH)20表3CpG640+狂犬疫苗组13.6表4CpG647+狂犬疫苗组18.2表5CpG640+狂犬疫苗+AL(OH)13表6CpG647+狂犬疫苗+AL(OH)17.4上述结果表明CpG640、CpG647对狂犬疫苗有增效作用。
实施例6增强狂犬疫苗免疫效果实验(抗体检测法)一、实验动物及分组70只7周龄昆明种小鼠，体重20±2克，随机分为14组，每组5只，分笼饲养，免疫前先适应2天。
二、免疫途径及剂量1-13组小鼠肌肉注射1μg重组狂犬疫苗(长春生物制品研究所)/100μl PBS加10μg CpG ODN，分两点注射，即双后肢肌肉每点注射50μl。
14组肌肉注射1μg重组重组狂犬疫苗(长春生物制品研究所)/100μlPBS，(无CpG ODN)，分两点注射，即双后肢肌肉每点注射50μl。
三、免疫程序于0、21d免疫，第二次免疫后7d经尾动脉采血，每只小鼠分离10ul血清，直接检测抗体滴度或置-20℃冻存。
四、抗体效价的测定(间接法ELISA)试剂器材包被缓冲液(0.05mol/L碳酸盐缓冲液，pH9.6)Na2CO31.59克NaHCO32.93克加蒸馏水至1000毫升洗涤缓冲液(PBS-T)含0.05％吐温-20，pH7.4K2HPO40.2克Na2HPO4·12H2O 2.9克NaCl 8.0克KCl 0.2克Tween-20 0.5毫升加蒸馏水至1000ml样品稀释液牛血清白蛋白(BSA)0.1克加洗涤缓冲液至100毫升封闭液(2％BSA)牛血清白蛋白(BSA)2克加PBS(pH7.4)至100毫升底物缓冲液(磷酸-柠檬酸缓冲液，pH＝5.0)●甲液(0.1mol/L柠檬酸)柠檬酸 1.92克加蒸馏水至100毫升●乙液(0.2mol/L Na2HPO4)Na2HPO4·12H2O 7.17克加蒸馏水至100毫升取甲液24.3mL，乙液25.7mL，加蒸馏水至100毫升四甲基联苯胺溶液(TMB)2毫克/毫升TMB 10毫克乙醇 5毫升底物溶液底物缓冲液 10毫升TMB(2毫克/毫升) 0.5毫升30％H2O210微升终止液浓H2SO422ml蒸馏水 178ml步骤1.包被用包被缓冲液稀释狂犬疫苗(中国长春生物制品研究所提供)至1-10微克/毫升，加入酶标板，100ul/孔，4℃，过夜。
2.洗涤用洗涤缓冲液洗板3次，5min/次。
3.封闭加入2％BSA封闭，200ul/孔。37℃，1.5h。
4.洗涤用洗涤缓冲液洗板3次，5min/次。
5.加样将待测血清用样品稀释液做400倍稀释，100ul/孔。空白对照孔加样品稀释液，100ul/孔，每个样品设3个复孔。37℃，60min。
6.洗涤用洗涤缓冲液洗板3次，5min/次。
7.加酶标抗体将兔抗鼠IgG-HRP(北京鼎国生物0.1ml，1∶1000)用洗涤缓冲液稀释500倍，100ul/孔，37℃，60min。
8.洗涤用洗涤缓冲液洗板3次，5min/次。
9.显色加入底物溶液，100ul/孔。室温避光反应10-30min。
10.终止50ul/孔2M H2SO4。
11.酶标仪(BIO-RAD Model 550)测A450。
五、结果
1-13组小鼠(肌肉注射1μg狂犬病毒疫苗/100μl PBS加10μg CpG ODN)14组小鼠(肌肉注射1μg狂犬病毒疫苗/100μl PBS)1组(205)1).0.5760.5660.5872).0.6820.6180.6573).0.5100.5380.5664).0.6560.7510.7155).0.6580.6890.6112组(302)1).0.7750.7340.6912).0.7590.7900.7193).0.6300.6150.6264).0.6880.6570.6635).0.9430.8470.8993组(304)1).0.8240.8340.8102).0.6810.6580.6153).0.6190.6470.6564).0.6070.6340.6125).0.7870.7680.7544组(310)1).0.6450.6740.6522).0.7490.6900.7243).0.7750.7840.7324).0.6440.6740.6465).0.6880.6930.6485组(607)1).0.7230.7190.7472).0.7020.6350.6973).0.8180.7870.8004).0.7900.7860.6915).0.8900.8310.8176组(634)1).0.7540.6990.6582).0.6550.6060.6773).0.7270.7870.719
4).0.6930.6850.7325).0.5560.5880.5437组(639)1).0.9760.9190.9232).0.7680.7170.6993).0.8860.8760.8324).1.0121.0071.1885).0.8680.8390.8618组(640)1).0.8190.8360.8222).0.6700.6250.6113).1.2831.1861.0054).1.3661.2121.2665).0.9750.9800.9319组(645)1).0.8760.8270.8342).0.9250.8980.9533).0.7320.7440.7124).0.8500.8240.8335).0.6890.7230.75610组(647)1).0.9680.9780.9512).0.9830.9821.0023).0.9880.9800.9854).1.1791.2801.2145).1.0060.9790.98011组(656)1).0.6820.6720.6562).0.7960.7520.7433).0.6580.6860.6194).0.6150.5970.6375).0.6870.6900.71112组(657)1).0.7780.7290.7102).0.6280.7100.6993).0.6760.6670.701
4).0.6350.7210.6775).0.6900.6820.73513组(658)1).0.6730.6670.7122).0.6150.7100.6943).0.8340.8760.8874).0.8700.8180.8235).0.6730.6850.65514组(659)1).1.3271.2891.0172).0.9680.9720.9913).1.1171.2760.9914).0.8600.8740.8705).0.8860.8160.85415组(对照)1).0.477 0.4230.4562).0.5060.4970.4863).0.3990.4010.4354).0.4550.4270.4175).0.3680.3980.406背景值0.332 0.287 0.319上述结果表明，1-13组内抗体效价都明显高与对照组，其中以第7组(CpG ODN 639)，第8组(CpG ODN 640)，第10组(CpG ODN 647)，第14组(CpG ODN 659)抗体滴度升高最明显。
实施例7增强乙型肝炎疫苗的免疫效果实验一.实验动物及分组156只7周龄昆明种小鼠，体重20±2克，随机分为26组，每组6只，分笼饲养，免疫前先适应2d。
二.免疫途径及剂量1-25组小鼠肌肉注射1μg重组HBsAg(中国长春生物制品研究所提供)/100μl PBS加10μg CpG ODN，分两点注射，即双后肢肌肉每点注射50μl。
26组肌肉注射1μg重组HBsAg/100μl PBS，未加CpG ODN，分两点注射，即双后肢肌肉每点注射50μl。
三.免疫程序0d、21d免疫，第二次免疫后7天静脉采血，每只小鼠分离10ul血清，直接测抗体滴度或置-20℃冻存。
四、抗体效价的测定(间接法ELISA)试剂器材包被缓冲液(0.05mol/L碳酸盐缓冲液，pH9.6)Na2CO31.59克NaHCO32.93克加蒸馏水至1000毫升洗涤缓冲液(PBS-T)含0.05％吐温-20，pH7.4K2HPO40.2克Na2HPO4·12H2O 2.9克NaCl 8.0克KCl 0.2克Tween-20 0.5毫升加蒸馏水至1000ml样品稀释液牛血清白蛋白(BSA) 0.1克加洗涤缓冲液至100毫升封闭液(2％BSA)牛血清白蛋白(BSA) 2克加PBS(pH7.4)至100毫升底物缓冲液(磷酸-柠檬酸缓冲液，pH＝5.0)●甲液(0.1mol/L柠檬酸)柠檬酸1.92克加蒸馏水至100毫升●乙液(0.2mol/L Na2HPO4)
Na2HPO4·12H2O7.17克加蒸馏水至100毫升取甲液24.3mL，乙液25.7mL，加蒸馏水至100毫升四甲基联苯胺溶液(TMB)2毫克/毫升TMB 10毫克乙醇 5毫升底物溶液底物缓冲液10毫升TMB(2毫克/毫升) 0.5毫升30％H2O210微升终止液浓H2SO422ml蒸馏水178ml步骤1.包被用包被缓冲液稀释HBsAg(中国长春生物制品研究所提供)至1-10微克/毫升，加入酶标板，100ul/孔，4℃，过夜。
2.洗涤用洗涤缓冲液洗板3次，5min/次。
3.封闭加入2％BSA封闭，200ul/孔。37℃，1.5h。
4.洗涤用洗涤缓冲液洗板3次，5min/次。
5.加样将待测血清用样品稀释液做400倍稀释，100ul/孔。空白对照孔加样品稀释液，100ul/孔，每个样品设3个复孔。37℃，60min。
6.洗涤用洗涤缓冲液洗板3次，5min/次。
7.加酶标抗体将兔抗鼠IgG-HRP(北京鼎国生物0.1ml，1∶1000)用洗涤缓冲液稀释500倍，100ul/孔，37℃，60min。
8.洗涤用洗涤缓冲液洗板3次，5min/次。
9.显色加入底物溶液，100ul/孔。室温避光反应10-30min。
10.终止50ul/孔2M H2SO4。
11.酶标仪(BIO-RAD Model 550)测A450。
四、结果1-25组小鼠(肌肉注射1μg重组HBsAg/100μl PBS加10μg CpGODN)1组(203)1).0.5620.5730.5752).0.5810.5730.5703).0.5800.5800.5764).0.5610.5550.5605).0.5770.5780.5736).0.5550.5480.5592组(205)1).0.7620.7770.7752).0.5890.5820.5903).0.6810.6840.6864).0.6000.6550.6615).0.8780.8850.8666).0.6440.6540.6683组(302) 1).0.7620.7770.7752).0.5890.5820.5903).0.6810.6840.6864).0.6000.6550.6615).0.8780.8850.8666).0.6440.6540.6684组(303) 1).0.4440.4790.5002).0.4980.5000.4903).0.5800.5840.5684).0.4430.4550.4625).0.4780.4810.4866).0.6400.6450.6815组(305)1).0.6450.7000.665
2).0.7490.6650.6913).0.8800.8830.8004).0.9200.8950.9145).0.9000.8790.8866).0.8860.8760.8116组(306)1).0.5450.6010.5772).0.5570.6060.6093).0.7800.8930.7894).0.6910.6770.6945).0.5670.5790.5596).0.6660.6770.6327组(307)1).0.7620.7750.7572).0.6580.6650.6613).0.5830.5860.5794).0.6650.6560.6685).0.7570.8000.7546).0.5550.5480.5598组(304)1).0.8760.8870.8542).0.9580.8890.9593).0.7660.7490.7764).0.8600.8450.8665).0.8790.8580.7866).0.4640.4550.4589组(310)1).0.7730.7010.6902).0.8790.8660.8823).0.8800.8000.8544).0.7920.8050.8115).0.6690.7390.8086).0.6680.6780.65110组(607)1).0.676 0.6800.733
2).0.9680.8900.9553).0.5880.5860.5734).0.6650.7210.7765).0.8870.8020.8116).0.8750.8850.65911组(608)1).0.7760.7690.7172).0.6580.7150.6913).0.7760.7680.7614).0.7600.7160.7765).0.6870.6810.6666).0.7640.7860.77812组(610)1).0.7620.7770.7752).0.5890.5820.5903).0.6810.6840.6864).0.6000.6550.6615).0.8780.8850.8666).0.6440.6540.66813组(619)1).0.7325 0.6970.7652).0.6740.6560.6823).0.8800.8830.8004).0.9200.8950.9145).0.9000.8790.8866).0.6880.6750.68414组(623)1).0.5440.5870.5452).0.6950.6680.6593).0.5570.5170.5654).0.6000.6450.5865).0.5870.5570.4996).0.5640.5550.61215组(631)1).0.8170.8550.823
2).0.9120.8990.8873).0.5760.6770.6054).0.8160.8240.8005).0.7890.7580.7156).0.5900.6120.63016组(634)1).0.6680.6120.6342).0.7580.7810.7963).0.6660.7120.7344).0.6860.6840.7855).0.6470.5850.7036).0.8440.8200.89417组(639)1).1.2771.1011.1692).1.1181.0081.0823).9.8809.9089.4854).9.7799.8119.9985).0.8660.7990.8186).1.2661.3441.11618组(640)1).1.1331.1121.3312).1.2161.2001.2283).0.7710.9120.8844).0.8780.8330.7735).0.9440.8990.9126).1.4411.4321.50019组(645)1).0.7220.7540.7332).0.6850.6710.6573).0.8140.8510.8114).0.9710.9180.9325).0.7660.7450.7896).0.8660.7010.81620组(647)1).1.3271.3101.216
2).1.2221.1081.1303).9.9999.9049.7494).1.2771.3111.2915).0.8670.8130.8286).1.1261.1351.13121组(654)1).0.6670.7360.7282).0.7760.7660.7523).0.9770.9120.8994).0.7510.7130.7225).0.6110.6440.6016).0.8760.8890.79322组(656)1).0.5670.5680.5362).0.8960.8110.8953).0.6580.6510.6624).0.8860.8210.7795).1.1180.9801.1986).0.7690.8020.79823组(657)1).1.2221.1981.0092).0.6890.5850.5993).0.7680.7140.7454).0.7600.6720.6115).0.8120.8560.8256).0.6490.6570.68924组(658)1).0.7770.7680.7052).0.6990.6580.6433).0.5810.6050.6164).0.6560.6780.6905).0.8110.8560.8446).0.7640.7760.80025组(659)1).1.1271.1111.136
2).1.0081.0081.0323).0.7800.8110.8544).1.0021.2381.3495).0.9860.9890.8116).1.1261.1341.11726组小鼠(对照，肌肉注射1μg重组HBsAg/100μl PBS)1).0.4410.4560.3992).0.4580.4730.4123).0.3970.4010.4234).0.5000.5150.4925).0.4450.4130.5236).0.3870.3920.328背景值0.311 0.2590.289上述实验结果显示，1-25组HbsAb的滴度普遍高于26组(对照)，其中以20组(647)和25组(659)最高，其次为17组(639)，18组(640)，22组(656)以及23组(657)，说明CpG ODN增强了HbsAg的免疫原性，促进HbsAb的产生。
实施例8增强流感病毒疫苗的免疫效果一.实验动物及分组70只7周龄昆明种小鼠，体重20±2克，随机分为14组，每组5只，分笼饲养，免疫前先适应2d。
二.免疫途径及剂量1-13组小鼠肌肉注射1μg流感病毒疫苗(长春生物制品研究所)/100μlPBS加10μg CpG ODN，分两点注射，即双后肢肌肉每点注射50μl。
14组肌肉注射1μg流感病毒疫苗(长春生物制品研究所)/100μlPBS，(无CpG ODN)，分两点注射，即双后肢肌肉每点注射50μl。
三.免疫程序0、21d免疫，第二次免疫后7d经尾动脉采血，每只小鼠分离10ul血清，直接测抗体滴度或置-20℃冻存。
五、抗体效价的测定(间接法ELISA)试剂器材包被缓冲液(0.05mol/L碳酸盐缓冲液，pH9.6)Na2CO31.59克NaHCO32.93克加蒸馏水至1000毫升洗涤缓冲液(PBS-T)含0.05％吐温-20，pH7.4K2HPO40.2克Na2HPO4·12H2O 2.9克NaCl8.0克KCl 0.2克Tween-20 0.5毫升加蒸馏水至1000ml样品稀释液牛血清白蛋白(BSA)0.1克加洗涤缓冲液至100毫升封闭液(2％BSA)牛血清白蛋白(BSA)2克加PBS(pH7.4)至100毫升底物缓冲液(磷酸-柠檬酸缓冲液，pH＝5.0)●甲液(0.1mol/L柠檬酸)柠檬酸 1.92克加蒸馏水至100毫升●乙液(0.2mol/L Na2HPO4)Na2HPO4·12H2O 7.17克加蒸馏水至100毫升取甲液24.3mL，乙液25.7mL，加蒸馏水至100毫升四甲基联苯胺溶液(TMB)2毫克/毫升TMB 10毫克乙醇5毫升底物溶液底物缓冲液 10毫升TMB(2毫克/毫升) 0.5毫升30％H2O210微升终止液浓H2SO422ml蒸馏水 178ml步骤1.包被用包被缓冲液稀释流感病毒疫苗(中国长春生物制品研究所提供)至1-10微克/毫升，加入酶标板，100ul/孔，4℃，过夜。
2.洗涤用洗涤缓冲液洗板3次，5min/次。
3.封闭加入2％BSA封闭，200ul/孔。37℃，1.5h。
4.洗涤用洗涤缓冲液洗板3次，5min/次。
5.加样将待测血清用样品稀释液做400倍稀释，100ul/孔。空白对照孔加样品稀释液，100ul/孔，每个样品设3个复孔。37℃，60min。
6.洗涤用洗涤缓冲液洗板3次，5min/次。
7.加酶标抗体将兔抗鼠IgG-HRP(北京鼎国生物0.1ml，1∶1000)用洗涤缓冲液稀释500倍，100ul/孔，37℃，60min。
8.洗涤用洗涤缓冲液洗板3次，5min/次。
9.显色加入底物溶液，100ul/孔。室温避光反应10-30min。
10.终止50ul/孔2M H2SO4。
11.酶标仪(BIO-RAD Model 550)测A450。
四、结果
1-13组小鼠(肌肉注射1μg流感病毒疫苗/100μl PBS加10μg CpG ODN)14组小鼠(肌肉注射1μg流感病毒疫苗/100μl PBS)1组(205)1).0.6320.5980.6532).0.6280.6750.6343).0.5280.5630.5774).0.6330.7010.6805).0.6950.6390.6292组(302)1).0.7230.7690.6932).0.7340.7860.7233).0.6130.6780.6454).0.6360.6680.6545).0.8990.8640.8743组(304)1).0.8370.8980.8292).0.6760.6690.6323).0.6960.6370.6854).0.7070.6890.6705).0.8870.9120.9434组(310)1).0.6230.6590.6722).0.7200.7900.7283).0.7670.7450.7444).0.6740.6140.6755).0.6170.6350.6775组(607)1).0.8720.8190.8562).0.6700.6350.6903).0.8350.8870.8764).0.6790.7050.6915).0.8340.8250.8566组(634)1).0.7450.6780.6772).0.6340.6550.6893).0.7660.7460.734
4).0.8690.8760.8215).0.7340.7970.7387组(639)1).0.9130.9450.9492).0.6760.6170.6903).0.7820.7850.7324).1.1011.2061.2185).0.7680.7350.7958组(640)1).0.7780.8210.8232).0.7670.7680.7533).1.0081.3181.1044).1.2371.1341.2315).0.9000.9180.9229组(645)1).0.8870.8980.8252).0.8920.8750.8953).0.7670.7350.7234).0.7850.7560.8015).0.6380.7760.73210组(647)1).0.974 0.9320.9982).0.9120.9671.0553).0.8980.9980.9384).1.2171.2231.0215).1.1050.9560.92311组(656)1).0.6580.6440.6892).0.8130.8760.8743).0.7680.6950.6844).0.6340.6120.6735).0.6110.6490.67312组(657)1).0.7690.7140.7832).0.6340.7050.7013).0.6540.6980.708
4).0.7630.7650.6995).0.7900.7450.78313组(658)1).0.7670.7450.7982).0.7610.7030.6853).0.7900.8040.8124).0.7520.7580.7825).0.6880.6750.68514组(659)1).0.9320.9781.0152).0.8960.9210.9433).1.0071.2340.9954).0.7860.7230.7595).0.9880.9080.95415组(对照)1).0.4440.4280.4322).0.5010.4890.4733).0.3760.4000.3874).0.4780.4650.4435).0.3960.4000.412背景值0.301 0.298 0.289。
SEQUENCE LISTING<110>长春华普生物技术有限公司<120>增强蛋白类疫苗免疫效果的含CpG单链脱氧寡核苷酸<130>I030020<160>81<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>20<212>DNA<213>Artificial<400>1tcgtcgaggg cgccggtgac 20<210>2<211>20<212>DNA
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权利要求
1.含CpG单链脱氧核苷酸，它们由含一个或多个CpG的寡核苷酸单链DNA分子构成。
2.按照权利要求1所述的含CpG单链脱氧核苷酸，它们的磷酸二酯键可以是非硫化的，部分硫化的也可以是完全硫化的。
3.按照权利要求1所述的含CpG单链脱氧核苷酸，它们具有SEQ IDNO1-81所示的序列。
4.按照权利要求1-3中任一项所述的含CpG单链脱氧核苷酸用于制备用于刺激人外周单个核细胞的分化增殖的药物的用途。
5.按照权利要求1-3中任一项所述的含CpG单链脱氧核苷酸用于制备用于刺激人外周单个核细胞表达CD19的药物的用途。
6.按照权利要求1-3中任一项所述的含CpG单链脱氧核苷酸用于制备用于刺激外周血单个核细胞产生肿瘤坏死因子的药物的用途。
7.按照权利要求1-3中任一项所述的含CpG单链脱氧核苷酸用于制备用于刺激外周血单个核细胞产生IL-6的药物的用途。
8.按照权利要求1-3中任一项所述的含CpG单链脱氧核苷酸用于制备可增强狂犬疫苗免疫效果的生物制剂的用途。
9.按照权利要求1-3中任一项所述的含CpG单链脱氧核苷酸用于制备可增强乙型肝炎疫苗免疫效果的生物制剂的用途。
10.按照权利要求1-3中任一项所述的含CpG单链脱氧核苷酸用于制备可增强流感病毒疫苗免疫效果的生物制剂的用途。
全文摘要
本发明提供了数种含CpG单链脱氧寡核苷酸，特别是可增强狂犬疫苗、乙型肝炎疫苗、流感病毒疫苗和其它蛋白类疫苗免疫效果的含CpG单链脱氧寡核苷酸；这些含CpG的单链脱氧寡核苷酸和狂犬疫苗、乙型肝炎疫苗、流感病毒疫苗和其它蛋白类疫苗的生物制剂；以及这些含CpG单链脱氧寡核苷酸用于制备可增强狂犬疫苗、乙型肝炎疫苗、流感病毒疫苗和其它蛋白类疫苗免疫效果的生物制剂的用途。
文档编号A61K31/7042GK1526719SQ0311984
公开日2004年9月8日 申请日期2003年3月5日 优先权日2003年3月5日
发明者王丽颖, 包木胜, 于永利 申请人:长春华普生物技术有限公司