一种pH敏感型口服蛋白疫苗的制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及医药领域，尤其设及一种pH敏感型口服蛋白疫苗的制备方法。
【背景技术】
[0002] 口服免疫能够产生有效的局部黏膜免疫和机体系统免疫，是一种有效的免疫途 径。但是，口服递送蛋白抗原要面对诸多挑战，一是经口服蛋白抗原需要克服胃内酸降解和 胃肠道内蛋白酶的降解，二是免疫系统对抗原摄取量低的问题。
[0003] 为了增加机体免疫细胞对抗原的摄取，我们利用了甘露糖受体在巨隧细胞和树突 状细胞等抗原提呈细胞表面大量表达运一特点，发明了一种简便的甘露糖化壳聚糖(MCS) 的制备方法（中国专利，CN102477107B，授权日：2013年10月9日）。用甘露糖基修饰壳聚糖， 能选择性提高抗原提呈细胞对疫苗的摄取、提高祀向效率，增强疫苗的免疫效果。我们制备 了MCS抗肿瘤DNA疫苗，结果表明该疫苗经粘膜免疫具有显著的效果（Mo Iecular pharmaceutics. 2013，10:2904-14)，说明MCS用于粘膜免疫可W祀向APC并增加其对抗原的 摄取。
[0004] 蛋白疫苗在胃肠道中容易失活和降解是口服疫苗有效性的最大阻碍。而将MCS纳 米粒用于疫苗的口服给药时，也存在运一问题。由于其在胃部酸性环境会破坏形成的纳米 粒结构，从而导致包载的蛋白在胃内突释及水解。因此，本发明选择了抑敏感型材料包覆壳 聚糖纳米粒，由于抑敏感型材料在胃内抑条件下不溶，可保护MCS纳米粒在酸性环境中的稳 定性。常用的抑敏感型材料如丙締酸树脂类(Molecules,2013,18(6) :6734-6747.)、海藻酸 盐（Journal of Drug l'argeting，2011,20(1):76-84.)等，但是已报道的制备方法多为乳 化法，设及有机溶剂W及较为剧烈的制备条件，在制备过程中对蛋白药物可能产生破坏，影 响其活性。发明所采用的聚合物为甲基丙締酸-甲基丙締酸甲醋（商品名:Eudragi化100)， 利用静电作用将抑敏感型聚合物包覆于MCS纳米粒上。运种聚电性纳米粒结构较为致密，比 较一些"包裹"技术，没有蛋白泄露问题。另外，在纳米粒外巧妙的包覆一薄层肠溶衣，在胃 中可W有效保护蛋白结构完整性。且本发明所述疫苗为纳米级颗粒，比较大粒径的微粒系 统在肠道派尔氏集合淋己结的摄取效果更佳。
[0005] 目前未见用该方法制备pH敏感型MCS纳米粒作为口服蛋白疫苗的相关文献和专 利。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是克服目前口服蛋白疫苗存在的胃肠道稳定性低和体内吸收差的 问题，提供一种抑敏感型的口服蛋白疫苗的制备方法。
[0007] 本发明提供的抑敏感型口服蛋白疫苗，是用聚合物材料MCS制备包覆蛋白抗原的 纳米粒，再利用抑敏感型材料对纳米粒进行包覆，使载有蛋白抗原的纳米粒具有抑敏感性。 [000引本发明制备的疫苗经口服后，能够在通过胃部时保护蛋白抗原不被酸和酶降解破 坏，进入小肠后，具有pH敏感性的衣膜溶解，通过MCS的甘露糖配体与抗原提呈细胞表面的 甘露糖受体结合，通过糖类识别机制，借助受体介导的抗原提呈细胞主动祀向作用，增加机 体免疫系统对抗原的摄取，有效激活免疫应答，增强抗原特异性抗体。
[0009]本发明提供一种制备前述纳米粒的方法，采用的材料为甲基丙締酸-甲基丙締酸 甲醋共聚物化Udragit LlO(T)，该共聚物在抑大于6的条件下溶解，其簇基荷负电，在pH小于 6的条件下不溶。本发明利用静电结合作用自组装形成纳米粒，再通过调节抑的方法将pH敏 感型材料固化在纳米粒表面，形成致密的衣膜。该过程无需有使用机溶剂，制备条件溫和， 有利于保护蛋白药物的活性。本发明所述的纳米粒能够抵抗胃肠道环境中低抑W及酶等对 蛋白抗原的破坏，因而可W作为口服蛋白疫苗的载体。
[0010]具体制备方法如下；
[0011]精密称取一定量的MCS，加入醋酸溶液中，配制为一定浓度的甘露糖化壳聚糖溶 液。另外配制一定浓度S聚憐酸钢、蛋白药物和抑敏感型聚合物溶液。取MCS溶液，室溫下 磁力揽拌，滴加蛋白药物溶液，揽拌5min，再滴加入S聚憐酸钢溶液，维持揽拌30min，即形 成MCS纳米粒混悬液。将上述MCS纳米粒混悬液滴加入pH敏感型聚合物溶液中，持续磁力揽 拌20min，用肥1溶液调节混悬液的抑值，固化纳米粒，室溫揽拌20min，即得抑敏感型口服蛋 白疫苗。抑敏感型口服蛋白疫苗的透射电镜图见图1。
[0012] W牛血清白蛋白（a化umin from bovine serum,BSA)为模型蛋白抗原，按上述方 法制备BSA/MCS/Eu化agit L100纳米粒（BSA/MCS/Edu NPs) W及BSA/MCS纳米粒（BSA/MCS NPs)在酸中的释放结果如图2所示。由图2可见，BSA/MCS纳米粒在0.1 M肥1溶液中释放速度 很快，化内的累积释放超过70%，而BSA/MCS/Edu纳米粒在0.1 M HCl中72h的累积释放小于 10%，表明包覆EiKlragit LlOO的BSA/MCS/Edu纳米粒在胃中可W保持颗粒完整性，有效保 护蛋白免受胃酸的破坏。
[0013] 采用SDS-PAGE凝胶电泳考察考察BSA/MCS/Eu化agit Lioo纳米粒在人工胃液中蛋 白结构的影响。将纳米粒置于人工胃液(含1 %胃蛋白酶的0.1 M HCl)中释放蛋白化，离屯、分 离纳米粒和上清液(上清液A)，将收集的纳米粒再置于pH6.8的憐酸盐缓冲液中释放蛋白， 离屯、分离收集上清液(上清液B)，用SDS-PAGE凝胶电泳考察蛋白结构的完整性，结果如图3 所示。条带1和条带2分别是BSA/MCS/Edu纳米粒经释放得到的上清液A和上清液B，条带3和 条带4分别是BSA/MCS纳米粒经释放得到的上清液A和上清液B。由凝胶电泳图可见，BSA/ MCS/Edu纳米粒与人工胃液共解育化，上清液中几无蛋白，表明纳米粒的结构完整，蛋白仍 然包裹于纳米粒中，纳米粒在憐酸盐缓冲液中释放出蛋白。而BSA/MCS纳米粒与人工胃液共 解育化，上清液中释放大量蛋白，表明纳米粒结构被破坏。实验结果证明，BSA/MCS/Edu纳米 粒能够在胃液中有效保护蛋白结构的完整性。
[0014] 本发明所述的甘露糖化壳聚糖分子量为5~500W)a。
[0015] 本发明所述的抑敏感型共聚物包括但不限于丙締酸树脂类共聚物、纤维素衍生物 等。
[0016] 本发明所述的口服蛋白疫苗是由抑敏感型共聚物包裹的载有蛋白抗原的甘露糖 化壳聚糖纳米粒，粒径范围在200~SOOnm，ze化电位在10~20mV。
【附图说明】
[0017]图巧本发明制备的抑敏感型口服蛋白疫苗透射电镜图；
[0018] 图2为本发明制备的pH敏感型口服蛋白疫苗与其他载体在酸中的体外释放曲线；
[0019] 图3为本发明制备的抑敏感型口服蛋白疫苗及其他载体的SDS-PAGE凝胶电泳分析 结果。
【具体实施方式】
[0020] 实施例1:纳米粒的制备
[0021] 取2mg/mL的MCS溶液，室溫下磁力揽拌，滴加牛血清白蛋白（BSA)溶液，揽拌5min， 再滴加入Img/mL的S聚憐酸钢溶液，维持揽拌30min，即形成包载有BSA的MCS纳米粒混悬 液。将上述BSA/MCS纳米粒混悬液滴加入2mg/mL的Eudragit LlOO溶液中，持续磁力揽拌 20min，室溫揽拌20min，即得BSA/MCS/Edu纳米粒。
[0022] 实施例2:纳米粒的制备
[0023] 取2mg/mL的MCS溶液，室溫下磁力揽拌，滴加 BSA溶液，揽拌5min，再滴加入Img/mL 的S聚憐酸钢溶液，维持揽拌30min，即形成包载有BSA的MCS纳米粒混悬液。将上述BSA/MCS 纳米粒混悬液滴加入2mg/mL的EiKlragit LlOO溶液中，持续磁力揽拌20min，用HCl溶液调节 pH至5.5，室溫揽拌20min，即得BSA/MCS/Edu纳米粒。
[0024] 实施例3:纳米粒的制备
[0025] 取Img/mL的MCS溶液，室溫下磁力揽拌，滴加 BSA溶液，揽拌5min，再滴加入Img/mL 的S聚憐酸钢溶液，维持揽拌30min，即形成包载有BSA的MCS纳米粒混悬液。将上BSA/MCS 纳米粒混悬液滴加入Img/mL的Eiulragit LlOO溶液中，持续磁力揽拌20min，用HCl溶液迅速 调节抑至5.0，室溫揽拌20min，即得BSA/MCS/Edu纳米粒。
【主权项】
1. 一种pH敏感型口服蛋白疫苗，其特征是该疫苗通过pH敏感型材料对载有蛋白多肽抗 原的甘露糖化壳聚糖纳米粒进行包裹，使甘露糖化壳聚糖纳米粒具有pH敏感性，在疫苗通 过胃部时保护纳米粒不被低pH环境和胃蛋白酶破坏，并在肠道中pH敏感型材料溶解，暴露 出的甘露糖化壳聚糖纳米粒通过甘露糖配体靶向树突细胞、巨噬细胞等抗原提呈细胞，增 加免疫细胞对蛋白抗原的摄取。2. 根据权利要求1所述的pH敏感型口服蛋白疫苗的制备方法，其特征在于，所述疫苗的 制备方法包括如下步骤:①用的甘露糖化壳聚糖溶液、蛋白抗原溶液、三聚磷酸钠溶液制备 载蛋白抗原甘露糖化壳聚糖纳米粒;②将甘露糖化壳聚糖溶液与pH敏感型聚合物溶液混 合，通过静电作用结合在纳米粒表面，接着迅速调节pH值，固化纳米粒，冷冻干燥后即为所 述纳米粒。3. 权利要求2中所述的pH敏感型材料包括但不限于丙烯酸树脂类共聚物、纤维素衍生 物、海藻酸盐等。4. 根据权利要求2方法制备的pH敏感型口服蛋白疫苗的粒径为200~800nm，zeta电位 在10~20mV〇5. 根据权利要求2方法制备的pH敏感型口服蛋白疫苗的包封率为70~95 %。
【专利摘要】本发明涉及一种药剂学领域的pH敏感型口服蛋白疫苗的制备技术。所述的口服蛋白疫苗是由pH敏感型材料包覆的甘露糖化壳聚糖纳米粒。本发明通过离子交联法制备包载抗原的甘露糖化壳聚糖纳米粒，再通过静电结合作用将pH敏感型材料包覆并固化于甘露糖化壳聚糖纳米粒表面，制备条件温和，方法简便，无需有使用机溶剂，在制备过程中最大程度保护药物的活性。本发明所制备的纳米粒在酸性条件下可以保持颗粒完整性，有效保护蛋白免受胃酸的破坏。
【IPC分类】A61K9/51, A61K39/00, A61K47/36
【公开号】CN105663086
【申请号】CN201610220564
【发明人】宗莉, 张文晶, 陈玉林, 姜雷, 王佳佳
【申请人】中国药科大学
【公开日】2016年6月15日
【申请日】2016年4月7日