专利名称：Il－12对新生儿免疫的刺激的制作方法
相关申请本申请是一个基于申请日为1998年3月5日的美国专利09/035，593的部分继续申请，该在先申请的全部内容在此通过引用被合并于本文。
背景技术：
传统上新生儿的免疫系统被认为是未发育完全的且在功能上依赖母亲的抗体来用于保护以抵抗致病生物。事实上，伯涅特和芬乃尔(Burnet，F.M.and Fenner，F.，Macmillan，Melbourne)在《抗体的生产》中[The Production of antibodies，102-105(1949)]认为对人类新生儿接触包括传染性因子在内的抗原，将诱导产生一种对这些抗原的特殊的免疫耐受状态。在后来麦德瓦尔和其同事[Medawar and colleagues，Billingham，R.E.et.al，Nature，172603(1952)]通过暴露于外源白细胞的新生小鼠能够如同成年鼠一样从相同的供体中接受外源组织从而为这个假说提供了实验证据。
在新生儿的免疫系统中诱导对病原体的免疫性的有效的方法是急切需要的。
发明的概述本发明涉及一种增强新生宿主(例如诱导)的免疫应答的方法，在一个实施例中，本发明涉及一种在新生宿主(哺乳动物，包括人类)中诱导免疫反应的方法，其包括向宿主给药有效量的IL-12和病原体的抗原(例如蛋白，碳水化合物，脂类，重组DNA，所有的生物，毒素，有机分子)。在另一个实施例中，本发明涉一种新生宿主增强对病原体免疫应答的方法，其包括给药宿主有效量的IL-12和病原体的抗原。如同这里所述，新生儿的被诱导或增强的免疫应答可以是，例如一种细胞因子免疫应答和/或一种体液免疫应答(例如抗原-特异性)。
本发明也涉及一种在宿主中诱导细胞因子应答抵抗病原体的方法，其包括给宿主给药有效量的IL-12和病原体的抗原。
本发明也包括一种克服干扰素-γ(IFN-γ)在新生宿主中表达的抑制的方法，其包括给宿主给药有效量的IL-12和病原体的抗原。
本发明也涉及一种增强新生宿主的细胞因子表达或对病原体的应答的方法，其包括给宿主给药有效量的IL-12和病原体的抗原。
在新生宿主中诱导对病原体的免疫应答的方法和组合物是急切需要的。本发明提供了在新生宿主中增强免疫性和诱导保护应答的方法及组合物。
图ⅠA-ⅠC是血清稀释度相对于光密度(O.D.)的对数曲线，其显示IL-12对新生儿DNP结合不完全Freund｀s佐剂(IFA)中的DNP-OVA加上IL-12(黑色三角形)或IFA中的DNP-OVA加上磷酸盐缓冲液生理盐水(PBS)载体(空心的环)或仅在PBS载体(空心的方形)中的DNP-OVA注射的小鼠中的接触卵清蛋白(DNP-OVA)后的血清抗-二硝基半抗原(DNP)水平的影响；每一曲线代表来自各自小鼠的血清的集合；小鼠在5-6周龄后用带有DNP-OVA的完全Freund佐剂(CFA)攻击，然后七天后通过ELISA检测血清的抗DNP抗体；用DNP-OVA和IL-12接触抗原与用DNP-OVA和PBS接触抗原的小鼠的IgG2a以及IgG2b在p＜0.05时的差别是显著的。
图1D-1F是血清稀释度相对于O.D的对数曲线。显示了在用带有HEL的IFA加上IL-12(实三角)，带有HEL的IFA加上PBS载体(空圆环)或仅PBS载体(空方形)感染的小鼠的接触+/-IL-12的HEL后，其IL-12对血清抗-鸡白蛋溶菌酶(HEL)的影响；每一曲线代表来自各自小鼠的血清的集合；小鼠5-6周龄后用带有HEL的CFA攻击然后七天后通过ELISA检测血清的抗HEL抗体；用HEL与IL-12和用HEL与PBS接触过抗原的小鼠之间的集合的差异其IgG1在p＜0.05是显著的。
图2A-2C是血清稀释度相对于O.D的对数曲线。显示了在用带有DNP-OVA的明矾加上IL-12(实三角)，带有DNP-OVA的明矾加上PBS载体(空圆环)或仅PBS载体(空方形)感染的小鼠的DNP-OVA经过接触+/-IL-12后，其IL-12对血清抗-DNP水平的影响；每一曲线代表来自各自小鼠的血清的集合；小鼠5-6周龄后用带有DNP-OVA的CFA攻击然后七天后通过ELISA检测血清的抗-DNP抗体；用DNP-OVA与IL-12和用DNP-OVA与PBS接触过抗原的小鼠之间的集合的差异对于所有的同位型在p＜0.05是显著的。
图3A-3B是血清稀释度相对于405nm O.D.的对数曲线。显示了皮下在用带有DNP-OVA的明矾加上IL-12(实三角)，带有DNP-OVA的明矾加上PBS载体(空圆环)或仅PBS载体(空钻石形)感染怀孕的小鼠的影响；小鼠9-10周龄后用带有DNP-OVA的明矾攻击，七天后通过ELISA检测血清的抗-DNP抗体；每一曲线代表来自各自小鼠的血清的集合。
图4A-4B是血清稀释度相对于405nm O.D.的对数曲线。显示了在新生儿HANA接触+/-IL-12后，IF-12对得自流感病毒(HANA)的血清抗-纯化血球凝集素和神经氨酸苷酶的水平的影响，小鼠在1天龄时用带有HANA的明矾加上IL-12(实三角)，带有HANA的明矾加上PBS载体(空圆环)或仅PBS载体(空方形)注射；所有的小鼠5-6周龄后用带有HANA的明矾攻击然后七天后通过ELISA检测血清的抗-HANA抗体；每一曲线代表来自各自小鼠的血清的集合。
图5A-5D曲线显示了在用带有H1N1的明矾加上IL-12(实三角)，带有H1N1的明矾加上PBS载体(空圆环)或仅PBS载体(空方形)感染的小鼠的H1N1经过接触+/-IL-12后，IF-12对血清抗-H1N1水平的影响；所有的小鼠5-6周龄后用带有H1N1的明矾攻击，然后七天后使用H1N1包被的微滴度平板通过特异性同型ELISA来检测血清。血清稀释液的相应滴度给出了50％的最大集合。每一符号代表各自小鼠的结果。出生时用H1N1±IL-12接触抗原的小鼠与仅用PBS载体接触抗原的小鼠在p＜0.05时其总Ab，IgM，IgG1和IgG2的差异是很明显的。出生时用H1N1和IL-12接触抗原的小鼠与用H1N1与PBS载体接触抗原的小鼠在p＜0.05时的IgG2的差异是很明显的。
图6A-6B曲线显示在出生时用流感亚疫苗加IL-12共同给药增强了随后流感病毒感染的保护。一天龄的小鼠用带有H1N1的明矾加上IL-12(实三角)、疫苗加上PBS载体(空圆环)或仅PBS载体(空方形)免疫。所有的小鼠(每组7-8只)用103 pfu的MPRI8/345流感病毒鼻内攻击4-5周。每天监测小鼠精神和体重的减轻。在出生后即严格共同给药带有H1N1的明矾加上IL-12h和那些严格的在出生后只给H1N1或只给PBS载体的小鼠相比其生存力的差别在p＜0.05时是显著的。
图7曲线显示了从出生时即用流感病毒亚基加IL-12对小鼠进行免疫的血清进行被动转移增强了对流感病毒攻击的保护。收集分别用带有H1N1的流感病毒疫苗亚基加IL-12(闭三角)，疫苗加PBS(闭环)或只用PBS载体(空心方形)免疫小鼠的血清。混合血清用无菌PBS进行1∶5的稀释，然后用0.1ml/每鼠的剂量i.p.注射。所有的小鼠(每组8只)用A/PR/8/34的103 pfu流感病毒鼻内攻击6小时。
本发明的详细描述如上所述，将IL-12给药于新生宿主加强(例如诱导)了生命早期的免疫功能并且诱导了对保护反应的记忆。因此本发明涉及到增强新生宿主对病原体或抗原免疫功能的方法。在一个实施例中，本发明涉及了一种诱导新生宿主对一种病原体免疫应答的方法，其包括对新生宿主给药有效剂量的IL-12及一种病原体的抗原。另外一个实施例中，本发明涉及了一种增强了对新生宿主一种病原体免疫应答的方法，其包括对新生宿主给药有效剂量的IL-12和一种病原体的抗原。
如上所述，术语“增强”和/或“增强了”指增强(增加)一种新生宿主对一种病原菌的现存免疫应答。本术语也指刺激(诱导)一个新生儿对一种病原体的一种免疫应答。
用于本发明的抗原(一个或多个)包括，但不限于，蛋白质或片段(例如蛋白水解的片段)，肽(例如合成肽，多肽)，糖蛋白，碳水化合物(例如，多糖)，脂类，糖脂，半抗原偶合物，重组DNA，整个有机体(灭活或减毒)或部分，毒素及类毒素(例如，破伤风，白喉，霍乱)和/或有机分子。用于本发明的抗原的特别实施例包括得到或衍生于流感病毒的血球凝集素及神经氨酸苷酶。
抗原可以得自或衍生于多种病原体或有机体，例如细菌(例如，杆菌属，B组链球菌属，博代氏杆菌属，李司忒氏菌属，anthracis芽胞杆菌属，S.pneumoniae，N.mening～itzs，Hinfluenza)，病毒(例如肝炎，麻疹，脊髓灰质炎病毒，人免疫缺陷病毒，流感病毒，副流感病毒，呼吸合胞体病毒)，分支杆菌目(M.tubercu′osis)，寄生虫(利什曼原虫属，血吸虫，Tranpanosomes，弓形体属，卡氏肺囊虫)及真菌(例如，念珠菌属，隐球菌属，球孢子菌的，曲霉属)，在宿主中希望有免疫反应来抵抗它们，病原体抗原可利用本领域熟知的技术来获得。例如，抗原可以直接从病原体，利用重组技术得到或利用化学和成衍生被分离(纯化，本质上纯)。另外，抗原可以从商业来源获得。用于本发明的合适的抗原是一种至少含有一种B或T细胞抗原决定簇(例如，T辅助细胞或杀伤T细胞抗原决定簇)。其他合适的用于本发明的抗原组分可以由本领域熟知来测定。
IL-12是一种近来鉴定的异源二聚体细胞因子，分子量75kDa，由二硫键连接40 kDa和35 kDa两个亚基。其由抗原呈递细胞例如巨噬细胞，与受体连接激活T、B、以及NK细胞[Desai，B.B.，et aL，J ImmunoL，1483125-3132(1992)；Vogel，L.A～，et a1.，Int.Immuno1.，81955-1962(1996)]。其具有很多功能，包括1)增强T细胞及NK细胞的增殖，2)提高T细胞，NK细胞，以及巨噬细胞的溶解细胞活性，3)诱导IFN-γ的产生，以及少量的TNF-α和GM-CSF，以及4)TH1细胞的激活[“Trinchieri，G.，etal.，Blood，8440084027(1994)]。已显示IL-12是Th1的克隆增殖中一个重要的协同刺激因子(Kennedy et al.，Eur.J.Immunol.242271-2278，1994)并且导致在血清中IgG2a抗体产量的增加[Morris，S.C.，et al.，J.Immunol 1521047-1056(1994)；Germann，T.M.，et al.，Eur.J.Immunol，25823-829(1995)；Sher，A.，et al.，Ann.NY Acad.Sci，795202-207(1996)；Buchanan，J.M.，et al.，Int.Immunol，71519-1528(1995)；Metzger，D.W.et al.，Eur.J.Immunol.，271958-1965(1997)]。IL-12的给药可以暂时减少IgG1抗体的产量[Morris，S.C.，et al.，J.Immunol.，1521047-1056(1994)；McKnight，A.J.，J.Immunol.，1522172-2179(1994)；Buchanan，J.M.，et al.，Int.Immunol.，71519-1528(1995)]，表明对Th2应答的抑制。IL-12的纯化与克隆公开在PCT申请WO92/05256和WO 90/05147以及欧洲专利申请公开EP 322，827上(被称为“CLMF”)。所有上述功能均用成年动物观察。
此处所用的“白介素-12”和“IL-12”是指白介素12蛋白，其单个的亚基，单个亚基的多聚体，IL-12的功能片段，及其功能等价物和/或“白介素-12”和“IL-12”的类似物。如同这里所定义的，IL-12的功能片段是指例如当用一种抗原给药时，在新生宿主中诱导对抗原的免疫反应。同样如同这里所定义的，“白介素-12”和“IL-12”的功能片段或等价物包括被修饰的IL-12蛋白以致于结果IL-12产物具有类似于此处所述的IL-12的活性(例如，当用一种抗原给药时，新生宿主中诱导对抗原的免疫反应的能力)。“白介素-12”的功能等价物或片段也包括核苷酸序列(例如，DNA，RNA)及其一部分，它们编码一种具有此处所述的IL-12活性的蛋白或肽(例如，当用一种抗原给药时，新生宿主中诱导对抗原的免疫反应的能力)。此外，此术语包括一段核苷酸序列其通过遗传密码的兼并编码如同IL-12和具有此处所述的IL-12活性的相似肽基因产物。例如，“白介素-12”和“IL-12”的功能等价物包括一段核苷酸序列其含有一个“静止”密码子代替物(例如，一个编码一个氨基酸的密码子代替另一个编码相同氨基酸的密码子)或一段氨基酸其含有一个“静止”氨基酸代替物(例如，一个氨基酸的密码子对另一个相同氨基酸的替代)。
适用于本发明方法的IL-12可被通过不同的来源获得或利用已知的技术合成。例如，IL-12可从自然资源(例如，哺乳动物，如人资源)中纯化(分离，纯化)得到，通过化学合成产生或通过重组DNA技术获得。此外，本发明所用的IL-12可通过商业途径获得。
本发明方法中IL-12给药的有效量是指在新生宿主中能增强对抗原的免疫应答的量。特定地，“IL-12的有效量”是这样的量当对新生宿主给药时，相对于没有给药的新生宿主产生基本的免疫调控；并且当用抗原给药时，相对于没有给药IL-12的新生宿主其诱导和/或增强在新生宿主中对抗原的免疫应答。也就是说，IL-12的“有效量”是在新生宿主中调节免疫性的量，和/或当用抗原给药时，相对于没有给药IL-12的新生宿主，诱导和/或增强在新生宿主中对抗原的免疫应答。
此处所用的“新生宿主”是一种哺乳动物宿主，例如一种灵长目动物(例如，人类)，鼠科动物，猫科动物，犬科动物，牛或猪宿主。此外，术语包括一种新生宿主且其生命期延伸为出生前7个月到出生后2年。一些疫苗对宿主是无效的直到其大约2岁龄。在另一个实施例中，新生宿主是指其生命期延伸为出生前1周到出生后1年的宿主。在本发明的方法中，IL-12或IL-12和抗原可被直接给药或间接给药。也就是说，IL-12或IL-12和抗原可被直接给药于子宫内或出生后的宿主。可选择地，IL-12或IL-12和抗原可被间接给药，其中的组分被给药于怀孕的母体，通过胎盘被间接传递至新生宿主。
IL-12和/或抗原可被给药作为一种预防疫苗或治疗疫苗。也就是说，IL-12给药可在病原体在新生宿主中出现和/或显示显然的作用之前(用于预防)或之后(用于治疗)。因此，IL-12和/或抗原可被给药于新生宿主其显示出由从其中获得或得到抗原的病原体引起的疾病，或仍未显示出由从其中获得或得到抗原的病原体引起的疾病。因此，IL-12和/或抗原可被给药于新生宿主在显示出疾病的症状之前或之后，并且导致在由其中获得或得到抗原的病原体引起的疾病状态的起始起到保护，改善，消除或延迟的作用。
IL-12和/或抗原可被通过不同的途径给药于新生宿主。给药的路径包括真皮内的，经眼的(例如，缓慢释放多聚体)，肌内的，腹膜内的，静脉内的，皮下用的，口服.的，硬膜外的以及鼻内的途径。其它的任意的合宜的途径均可被使用，例如，浸剂或大丸药注射，或通过上皮的或粘膜皮lining的吸收。此外，IL-12和/或抗原可被给药同其它的组分或生物活性因子一起，例如，佐剂(明矾)，药学上可接受的表面活性剂(例如，甘油酯)，赋形剂(例如，乳糖)，脂质体，载体，稀释剂和载体。如需要，也可加入一定的甜味剂，调味料和/或着色剂。
此外，IL-12和/或抗原在一个实施例中，其中的抗原是一种蛋白(肽)，可被通过体内编码此蛋白的多核苷酸的表达来给药。例如，IL-12或抗原给药于新生宿主通过使用一个活性载体，其中含有IL-12和/或抗原核苷酸序列的活性载体在IL-12和/或抗原在体内表达的条件下给药。新生宿主也可被注射联合IL-12蛋白或肽，或联合一个在体内编码和表达IL-12蛋白的载体的在体内编码与表达抗原的载体。可选择地，新生宿主可被联合注射蛋白或肽形式的抗原，或联合一个在体内编码和表达抗原的载体的在体内编码与表达IL-12的载体。单独的载体和IL-12蛋白在本发明的方法中也是有用的。
一些表达载体系统可通过商业的途径获得或通过重组DNA与细胞培养技术得到。例如，载体系统例如酵母或牛痘病毒表达系统，或病毒载体可被用于本发明的方法和组成[Kaufinan，R.J.，A Jof Meth.in Cell and Molec.Biol，2221-236(1990)]。其它利用无修饰质粒或DNA，包被在靶脂质体或红血球细胞中的克隆基因的技术在可被用于导入IL-12多核苷酸到宿主中[Freidman，T.，Science，2441275-1281(1991)；Rabinovich，N.R.，et al.，Science，2651401-1404(1994)]。表达载体的构建以及载体和核苷酸的转移到宿主中可通过利用基因工程技术来完成，如《分子生物学中的分子克隆和当前标准手册》(Molecular Cloning and CurrentProtocols in Molecular Biology)所述，其内容通过在此引用被合并于本文，或通过商业途径获得的试剂盒(Sambrook，J.，et al.，Molecular Cloning，冷泉港出版社，1989；Ausubel，F.M.，et al.，Current Protocols in Molecular Biology，Greene PublishingAssociates and Wiley-Interscience，1989)。
如此处所述的，对新生宿主的L-12和抗原的给药引起或增强在接受者新生宿主的免疫应答。在一个实施例中，本发明涉及一种诱导细胞因子(例如，类Th1)在新生宿主内抵抗病原体的反应的方法，其包括给药于新生宿主有效量的IL-12和一种病原体的抗原。在另一个实施例中，本发明涉及一种在新生宿主中克服其取决于新生宿主对病原体或抗原的暴露的干扰素-γ表达抑制的方法，其包括给药于新生宿主有效量的IL-12和抗原。本发明包括一种增强细胞因子表达在新生宿主内抵抗或对病原体反应的方法，其包括给药于新生宿主有效量的IL-12和一种病原体的抗原。
例如，在新生宿主中用IL-12和抗原处理引起一种免疫反应其中增强了IFN-γ和/或IL-10的表达。此外，用IL-12和抗原处理体液免疫应答在新生宿主中(例如，特异性抗原)被诱导和/或增强。在一个实施例中，通过IL-12和一种抗原给药产生的体液免疫应答导致接受者新生宿主和未接受IL-12和抗原的新生宿主相比其总抗体的水平增强了。在一个特定地实施例中，抗体反应在受体新生宿主中产生特异性IgG1、IgG2a和/或IgG2b。
在增强新生宿主内对抗原的免疫应答的方法中，有效量的IL-12被给药于宿主，其为增强新生宿主内对抗原的免疫应答的量并且产生新生宿主的改良的条件(例如，由其获得抗原的病原体引起的疾病或机能紊乱被预防，消除或减少)。用于诱导或增强对新生宿主内的抗原的免疫应答的IL-12的量依据因素的不同而变化，因素包括宿主的大小，年龄，体重，健康状况，性别和日常饮食以及给药的时间，持续时间或疾病的特性。合适的IL-12d的剂量范围一般大约为0.5μg到大约150μg每公斤体重。在一个实施例中，剂量范围一般大约为2.75μg到大约100μg每公斤体重。在另一个实施例中，剂量范围一般大约为5μg到大约50μg每公斤体重。有效剂量可从由体外或在动物实验模式得出的剂量应答曲线外推而得到。
在本发明的方法中，有效量的IL-12被联合一种抗原给药。也就是说，在涉及带有抗原的新生宿主的免疫的时候IL-12被给药，因此，相对于没有IL-12给药的新生宿主的免疫，在新生宿主中对抗原的免疫应答被诱导产生或增强。因此，IL-12可被给药早于，优选恰好早于免疫；在免疫时(例如同时发生)；或免疫后(随后)。此外，IL-12可被早于用抗原免疫随后在用抗原免疫后用IL-12给药。
如同此处所证明的，IL-12的给药于新出生的老鼠重新引导小鼠的细胞因子表达和启动动物增强抗体象成年的个体一样应答。因此，新生儿接种IL-12对于在生命早期增强免疫和在新生儿中帮助诱导保护应答的记忆是一种有用的方式。
最近的成果显示只要在适当的条件下进行接触抗原，新生的小鼠能够被启动去识别外源抗原。Matzinger和其同事[Ridge，J.E.et.Al.，Science，2711723-1726(1996)]发现了在无论抗原接毒的结果是新生儿忍受或免疫时被检测的呈递抗原细胞的特性。特别地，它们发现如果新生儿的树状细胞允许它们去被启动而不耐受同种异基因的脾细胞。最近H.Influenzae菌结合疫苗的成功论证了非响应能力可被克服如果对新生儿的B细胞提供适当的帮助，但是疫苗偶联物抵抗其它的TI抗原仍未被有效的克服。此外，用偶联疫苗诱导的抗-多糖应答仍保留许多TI应答的特征[Mond，J.J.et a1.，Annu.Rev.Immunol，13655～92(1995)]。Sarzotti，M.等人在《Science》2711726-1728(1996)报道了新生儿接毒少量的抗原，即假设其没有超越动物自己的树枝状的细胞，事实上导致免疫而不是耐受。Lfhmann和同事[Forsthuber，T.et.al.，Science，2711728-1730(1996)]证明了新生儿的对蛋白抗原的“耐受”实际上诱导免疫偏差并且引起对的限制，Th2应答是通过IL-4，IL-5，IL-6，以及IgG1抗体的表达来表征的。Th2记忆的建立将因此显现在诱导对外源移植物耐受上，从而Th2应答抑制涉及IFN-γ产物和激活的T细胞和NK细胞的特异性Th1应答，基本的原理认为是可能对移植物排斥起主要作用。有其它的类似报告新生儿免疫系统显示Th2细胞因子和抗体同位型的极化表达[Adkins，B.et.Al.，J.Immunol.，1516617-6626(1993)；Coutinho，G.et.al.，Eur.J.Immunol，241858-1862(1994)；Early，E.M.and Reen，D.J.，Eur.J.Immunol.，262885-2889(1996)；Barrios，C.et.Al.，Eur.J.Immunol，261489-1496(1996)and Barrios，C.et.al.，Eur.J.Immunol，26266～2670(1996)]。
Th1途径的起始诱导物IL-12是一个70kD的异源二聚体蛋白质，其对免疫有多向性的作用。已显示IL-121)增强T细胞和NK细胞的增殖，2)增加T细胞，NK细胞以及巨噬细胞的细胞溶解活性，3)激活Th1细胞，和4)诱导IFN-γ和其它细胞因子的产生[参见Trinchieri G.，Blood，8440084027(1994)和Buchanan J.M.et.Al.，Int J.Pediat Hematol.Oncol，3123-131(1996)的最近的综述]。
如同此处所描述的，IL-12在新生儿周围淋巴系统组织中的表达是不足的。此外，给药或重组IL-12重新引导新生儿的免疫系统为Th1-型细胞因子分布并且增强了抗体记忆应答的开发。
在成年个体中，IL-12刺激T细胞和NK细胞的增殖，增加CD8+T细胞和NK细胞的细胞溶解活性，并且增加IFN-γ和其它细胞因子的产量[Trinchieri，G.，Res.ImmunoL，146423431(1995)；Trinchieri，G.，Immunol.，Today，14335-338(1993)]。新生儿的IL-12的表达的不足因此对弱的响应能力和向Th2应答的偏差起主要作用。不足的原因尚不知道，尽管其可能涉及事实即树突细胞是IL-12的主要来源[Macstonia，S.E.，et al.，J.Immunol.，1545071-5079(1995)]，并且树突细胞在新生儿中的数目是很低的。事实上，树突细胞直到3-4周龄才达到成人的水平[Steinman，R.，et al.，J.Exp.Med.，1391431-1445(1974)]。通过证实了新生动物的树突细胞允许其成为免疫应答的Matzinger及其同事的发现可以理解树突细胞的重要性[Ridge，P.G.，et al.，Science，2711723-1726(1996)]。IL-12的增强涉及新生儿的用体内需要代替树突细胞的免疫能力的原理是可能的。
尽管在周边缺少IL-12，新生的小鼠明显地能够对外源的IL-12注射应答，增加IFN-γ和IL-10的表达。在对照中，在接受单独抗原或载体的小鼠中观察不到IFN-γ转录物的水平。IFN-γ是一种有效的Th亚效应功能免疫调节剂并且在激活巨噬细胞和转化B细胞为IgG2a产物的同位型中起到关键的作用，其特性为Th1免疫应答[Snapper，C.M.，et a1.，Science，236944～947(1987)；Finkelman，F.D.，et al.，J.Immunol.，1401022-1027(1988)；Snapper，C.M.，et al.，J.Immunol，1402121-2127(1988)]。类似地，另一个T细胞应答的重要的调节剂是IL-10，其通过IL-12被诱导[Gerosa，F.，et al.，J.Exp.Med，1832559-2569(1996)；Sher，A.，et al.，Ann.N.Y.Acad.Sci.，795202-207(1996)；Meyaard，L.，et al.，J.Immunol.，1562776-2782(1996)；Dafiarian，P.M.，et al.，J.Immunol.，15712-20(1996)]，并且被认为涉及到设计来调整Th1途径和减小IFN-γ的影响的负反馈原理，该观点完全地与此处所述的结果相符。当增加了IFN-γ和IL-10的产物时，IL-12对新生儿的IL-4与IL-5的表达没有什么影响。这些结果用Shu等[Shu，U.，et al.J.Clin.Invest.，941352-1358(1994)]和Sornasse等人[Sornasse，T.，et al.，J.Exp.Med.，184473-483(1906)]的结果相反，他们发现用IL-12对人类新生儿的T细胞的体外治疗刺激了IFN-γ和IL-4的表达。不同结果的原因尚不知晓，但也许能和体内对体外IL-12接毒以及靶细胞的不同来源等联系起来(脾对脐带的血，小鼠对人，等等)。
在出生时IL-12给药也可以增加新生儿的B细胞响应能力。特别地，在出生时用抗原和IL-12接触，当成年时用同源抗原加强免疫的小鼠和仅在成年接触抗原的小鼠相比，显示出IgG1、IgG2a和IgG2b的抗体水平的明显增加。这些结果通过使用两种不同的模型蛋白抗原和两种不同的佐剂而获得的。以前揭示了IL-12的改变成年小鼠的同位型受限制的抗体对HEL的反应能力[Buchanan，J.M.，et al.，Int.Immunol.，71519-1528(1995)]。具体地讲，IL-12加HEL的非肠道的注射明显增加特异性HEL血清IgG2a的产量且暂时抑制IgG1抗体的产量。此外，其他人[McKnight，A.J.，et al.，J.Immunol.，1522172-2179(1994)；Morris，S.C.，et al.，J.ImmunoL，1521047-1056(1994)；Germann，T.，et al.，Eur.J.Immunol.，25823-829(1995)；Wynn，T.A.，et al.，J.Immunol.，1574068-4078(1996)]已经证明了IL-12给药增强了血清IgG2a、IgG2b和IgG3抗体对蛋白抗原的应答。因此，IL-12对成年体液免疫的作用被很好地建立了。此处描述的结果显示出新生小鼠对IL-12治疗的应答在相似的形式下通过重新引导抗体应答于Th1，增强了IgG2a和IgG2b抗体。已知同型IgG2a的鼠科动物抗体在调理素作用以及补体的固定上是非常有效的，且实际上IL-12增强这种同型对包括这种保护机理的新生儿免疫策略是特别有效的。
由于正常新生儿免疫系统的TH2偏差以及新生儿对传染性试剂的独特的易损性，人们继续发展刺激Th1的免疫策略和免疫佐剂[Van Regenmortel，M.，ASM News，63136-139(1996)]。目前可接受的人用佐剂例如明矾缺乏产生细胞-介导的免疫(Th1)的应答的容量，而这正是宿主抵抗病原体变种的必要的组分[Gupta，R.K.，et al.，Novel Strategies in Design and Production ofVaccines，eds.Cohen，S.&Shafferman，A.(Plenum Press，NewYork)，pp.105-113]。最近，Martinez等人[Martinez，X.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，948726-8731(1998)]论证了新生小鼠用基于DNA的疫苗免疫导致了以增加IFN-γ和IgG2a产量为特性的Th1免疫应答的诱导产生。新生动物的带有一个表达流感血球凝集素质粒的DNA接种疫苗也被显示诱导Th1应答和赋予抵抗流感病毒致死攻击的保护[Bot，A.，et al.，Int.J.Immunol.，91641-1650(1998)]。此外，也显示了用抗原加带有CpG序列的合成寡脱氧核苷酸免疫诱导通过IL-12产物刺激的Th1应答[Chu，R.S.，et al.，J.Exp.Med.，1861623-1631(1997)]。因此，IL-12给药是一种用于刺激人类新生儿免疫系统的强烈与直接的方法。
新生动物通常对外源抗原显示出弱响应能力，并且已知显示类Th2细胞因子的极化表达以及抗体反应。如此处所述，新生小鼠对诱导Th1的细胞因子，即对IL-12的外周表达是不足的。对用IL-12在出生时进行免疫和治疗来克服这种不足所进行的尝试，使得和仅用抗原接毒的动物相比小鼠脾脏中的IFN-γ和IL-10mRNA水平提高了。此外，这样的动物和用单独抗原接触的小鼠相比，在成年时进行攻击则获得了其成年个体的IgG2a和IgG2b抗体水平的显著性的增强。IgG1抗体的水平，即Th2活性的大小，不受影响甚至通过新生儿IL-12治疗被增强。总的来说，这些结果提供了第一证据，即IL-12给药在新生儿中诱导了Th1类cytokine应答，并且引起在体内的对接触抗原的增强了的应答记忆。此处描述的发现证明了IL-12可被用作新生儿疫苗的佐剂来诱导产生抵抗普通儿童期病原体的保护。
因此，此处所描述的方法可被用于治疗和/或预防在新生宿主中的与带有一个或多个抗原的病原体相关的疾病。此处所描述的方法可利用有效量的IL-12，结合一个单一抗原，或从相同的病原体衍生的多个抗原，或从一种病原体的不同菌株或从不同的病原体中获得的多个抗原，将它们结合起来使用。因此，IL-12和一种或多种抗原可被用来治疗和/或预防与从其中获得抗原的病原体相关的疾病。
本发明通过下面的实施例来举例说明，这些实施例不以任何的方式限制本发明。
实施例实施例1IL-12是一种有效的疫苗佐剂材料与方法小鼠BALB/c小鼠从国家癌症研究所(Bethesda，MD)获得，4～6周龄，且在俄亥俄州医学院饲养。食物和水充足提供。动物照料和实验步骤都遵从于俄亥俄医学院的公共动物照料和使用委员会(IACUC)的标准。
新生儿免疫步骤一天龄的小鼠被腹膜内(i.p.)注射100μg DNA-OVA(Biosearch Technologies，San Raphael，CA)或100μg HEL。抗原在不完全Freund｀s佐剂中被乳化(IFA；Life Technologies，Gaithersburg，MD)通过Forsthuber等人的方法[Forsthuber et al.，Science，2711728-1730(1996)]，或与2 mg/ml的明矾混合(Rehydrogel Low Viscosity Gel，Reheis，Inc.，Berkeley Heights，NJ)并且总注射体积为25μl/小鼠。实验小鼠在一天龄时被用1μg在含有1％正常BALB/c小鼠血清(PBS-NMS)PBS中稀释的重组鼠IL-12来腹膜内注射；对照小鼠仅接受PBS-NMS。小鼠被允许长到成年期，然后在5-6周龄时，它们被用乳化在完全Freund｀s佐剂(CFA；Gibco-BRL)或明矾中的相同抗原量加强。小鼠被以一周的间隔从后orbital帕尼扎氏丛取血。在子宫内治疗的情况下，在分娩前大约7天时，怀孕的小鼠被皮下注射在明矾中+/-IL-12的相同量的抗原。
RNA分离3天龄小鼠的速冻的脾脏，肝脏，以及胸腺中总RNA的分离用Trizol试剂(Gibco-BRL Gaithersburg，MA)依据制造商的说明书来进行。简言之，冰冻的组织被用研钵和研棒匀浆，并立即转入含有1ml Trizol试剂的聚苯乙烯管。匀浆的样品在室温下培养5分钟使得核蛋白复合物分离并在12000g，4℃下离心10分钟。上清液然后与0.2ml的氯仿混合15秒，在冰中培养15分钟，12000g，4℃下离心15分钟，离心后，液相中的RNA通过在-20℃加入1.0ml的异丙醇被沉淀，样品以12，000g离心15分钟，并且RNA颗粒用1.0ml 75％乙醇洗涤两次。颗粒在空气中干燥2-5分钟，溶解在DEPC处理的水中，并保存在-80℃。总RNA的浓度通过用于单链RNA的A260值来计算(1A260单位=40μg的单链RNA/ml)。总RNA的终浓度的260/280比率为1.7-2.0。
第一条cDNA链的合成第一条cDNA链的合成是依据制造商的说明书(Gibco-BRL)来进行的。简言之，1μg的o1igo(dT)，3μg的总RNA，以及用DEPC处理的无菌水被加至eppendoff管至终体积为11μl。混合物在70℃温浴10分钟，然后在冰中冷却。随后，依次添加下列组分4.0μl的5X第一链缓冲液，2μl的0.1M DTT，1μl的dNTP混合物(dATP，dGTP，dCTP，和dTTP各10mM)。试管的内容物被轻轻地混合并温浴在42℃下2分钟，接着加入1μl(200U)的Supersciript Ⅱ逆转录酶(RT)。反应混合物轻轻地混合并温浴在42℃1小时。通过70℃温浴15分钟终止反应。
聚合酶链反应(PCR)50μl的反应混合物是在无菌的eppendorf管中加入下列成分来制备的31.3μl的DEPC处理的水，10.0μl 5X的Tris-HCl缓冲液(对每套引物确定其最佳镁含量和pH)，2μl第一链合成的cDNA，2μl引物(原液浓度为20μm)，5.0μl的dNTP混合物(2.5mM dATP，2.5mM dCTP，2.5mM dGTP，和2.5mMdTTP，pH8.0)(Invitrogen Corporation)，以及0.5μl(2.5U)的Taq DNA聚合酶(Gibco-BRL)。管被置入Pericin Elmer ThermalCycler 480的反应池中(Perkin Elmer Cetus，Norwalk，CT)，95℃温浴5分钟，然后继续下面的扩增方案95℃1分钟，56℃1分钟，72℃1分钟，持续35个循环。接着72℃温浴10分钟，然后在4℃浸泡一个循环。PCR产物在2.5％琼脂糖凝胶上分离并用EB进行染色。用UV透照法观察并拍照条带。次黄嘌呤转磷酸核糖基酶(HPRT)被用作一种常用对照以确保所有的梯度上相等的RNA的加样量，以及一个100 bp DNA梯度(Gibco-BRL)被用作一个分子量标记。
引物序列HPRT5′GTT GGA TAC AGG CCA GAC TTT GTT G3′(SEQ ID NO1)5′GAT TCA ACT TGC GCT CAT CTT AGG C3′(SEQ IDNO2)IL-45′GTT GTC ATC CTG CTC TTC TTT 3′(SEQ ID NO3)
5′CTC TCT GTG GTG TTC TTC GTT 3′(SEQ ID NO 4)IL-55′GAC AAG CAA TGA GAC GAT GAG 3′(SEQ ID NO 5)5′GTT ATC CTT GGC TAC ATT ACC 3′(SEQ ID NO6)IL-105′ATG CAG GAC TTT AAG GGT TAC TTG GGT T3′(SEQ IDNO7)5′ATT TCG GAG AGA GGT ACA AAC GAG GTT T3′(SEQID NO8)IL-12p405′CTC ACA TCT GCT GCT CCA CAA 3′(SEQ ID NO9)5′CTC CTT CAT CTT TTC TTT CTT 3′(SEQ ID NO10)IFN-γ5′TGA ACG CTA CAC ACT GCA TCT TGG 3′(SEQ ID NO11)5′CGA CTC CTT TTC CGC TTC CTG AG 3′(SEQ ID NO12)抗体和同型的水平通过ELISA方法的检测抗-DNP和抗-HEL抗体水平通过所述的特异性同型ELISA被检测[Buchanan，J.M.et.Al.，Int.Immunol.，71519-1528(1995)和Metzger，D.W.et.al.，Eur.J.Immunol.，271958-1965(1997)]。简言之，微量滴定板(Nalge Nunc International，Rochester，NY)用10μg/ml DNP-牛血清白蛋白(BSA)或100μg/ml带HEL的PBS过夜包被。滴定板用含0.1％(W/V)明胶以及0.05％(V/V)吐温20的PBS冲洗。加入系列稀释的血清，滴定板在室温下培养2个小时。滴定板再次冲洗，用山羊抗-鼠IgG1、IgG2a或IgG2b偶联碱性磷酸盐共培养1小时(SouthernBiotechnology Associates，Birmingham，AL)。冲洗滴定板，并且加入ρ-硝基酚磷酸盐底物获得最佳色层。在405nm波长下用ELISA微板读数仪读数(Bio-Tek Instruments，Winooski，VT)。抗-HEL抗体用除板被包被100μg/ml的HEL不同的类似的方式检测[Buchanan，J.M.，et al.，Int.Immunol.，71519-1528(1995)]。在所有的情况下，适当的工作稀释以及二次抗体偶合物的同型特异性都利用已知同型的纯化骨髓瘤蛋白来检测(Sigma，St.Louis，MO)。本方法中的特异性抗原是由PBS包被的滴定板来制备的。统计分析利用Mann-Whitney U试验来进行的。如果p＜0.05则认为数据在统计学上是显著的。
结果新生小鼠在脾脏中的IL-12的表达是不充分的利用RT-PCR法来进行在两天前用DNP-OVA免疫的三天龄和成年小鼠IL-12 p40 mRNA的检测。只接受PBS-NMS，只接受抗原或加入IL-12的抗原的新生小鼠被发现在脾脏中都缺乏IL-12 p40 mRNA的表达。相反，只接受PBS-NMS或只接受抗原的成年小鼠在脾脏中确实表达了IL-12 p40 mRNA，并且通过IL-2处理被进一步加强。
与上述得到的结果相比，未免疫的新生小鼠和接触抗原的新生小鼠的胸腺中都显著地表达了IL-12 p40 mRNA。此外，在接种IL-12后的胸腺中IL-12 p40 mRNA的表达显著加强了。免疫的成年小鼠在胸腺中以同样的方式显示了IL-12表达的相似模式。同时HPRT mRNA的扩增证实每一次RT-PCR反应利用了相同量的RNA。这些结果表明，尽管新生儿能够在胸腺这种主要的淋巴器官中表达IL-12，但是在周边淋巴器官中却不能表达IL-12。
IL-12在新生小鼠中诱导类Th1细胞因子反应为了进一步鉴定新生儿免疫反应的特异性，在接触DNP-OVA或HEL后，IFN-γ以及IL-10 mRNA的表达被检测。发现接受了PBS-NMS或抗原的小鼠在其脾脏中并没有表达可测的IFN-γ或IL-10 mRNA的水平。然而，用DNP-OVA或HEL免疫的同时用IL-12处理的小鼠的确表现出显著地诱导IFN-γ以及IL-10 mRNA的表达。已知通过IL-12处理在成年小鼠中IFN-γ和IL-10被诱导产生[Gerosa，F.，et al.，J.Exp.Med.，1832559-2569(1996)；Sher，A.，et al.，Ann.NY Acad.Sci.，795202-207(1996)]，并且在实验中对成年小鼠脾脏mRNA的分析得到预料的结果。尤其地，与新生小鼠比较，只用抗原处理的成年小鼠的确在脾脏中诱导了低水平但可检测的IFN-γmRNA。这些结果表明新生小鼠中IL-12以与成年小鼠中可观察的相同的方式调节抗原推动的细胞因子的反应，结果显著加强了IFN-γ以及IL-10 mRNA的表达。
在出生时用抗原和IL-12接触的小鼠显示出类Th1血清抗体反应IL-12对B细胞的接触作用通过用带有抗原的CFA加强免疫在新生时期处理过的成年小鼠并通过特异性ELISA检测抗体的水平被测得。在出生时用DNP-OVA免疫并用同源抗原在成年期加强免疫的小鼠与只在成年期接触抗原的动物比较显示出IgG1、IgG2a和IgG2b抗体水平的提高(图1A-1C)。因此，新生期DNP-OVA免疫导致小鼠的接触抗原增强了抗-DNP抗体对于成年时攻击的应答，这个结果肯定了Forsthuber等人[ForsthuberT.et al.，Science，2711728-1730(1996)]的结果。出生时用抗原加IL-12处理的动物显示出相对于只用抗原免疫的小鼠对成年时攻击其抗体水平显著地加强了。然而用抗原和IL-12接种的小鼠和只用抗原(对照组)接种的小鼠之间的IgG1抗体的水平没有区别。
这些结果通过使用另一个模型抗原，即HEL而被证实，HEL在成年小鼠中通常诱导通过IL-12给药可被显著改变的IgG限制性同型反应[Buchanan，J.M.，et al.，Int.Immunol.，71519-1528(1995)]。用HEL攻击的在其出生时并未免疫的成年小鼠显示出低水平的IgG1应答，该应答可以通过在新时期免疫而被加强(图1D-1F)。同前面的工作一样，两种情况下产生的IgG2a或IgG2b很少[Buchanan，J.M.，et a1.，Int.Immunol.，71519-1528(1995)]。然而，在出生时用HEL和IL-12接触抗原的三个小鼠中的两个对成年攻击显示出强烈的IgG2a和IgG2b抗体应答。进一步，用IL-12处理的小鼠其IgG1的抗体量增加，再一次与前面的发现一致，即经过最初的抑制期IL-12可以加强成年小鼠IgG1抗体的水平[Buchanan，J.M.，et al.，Int.Immunol.，71519-1528(1995)；Metzger，D.W.，et al.，Ann.N.Y Acad.Sci.，79510～115(1996)]。用DNP-OVA或HEL免疫后，IgG3血清抗体水平检测不到。
由于Freund｀s佐剂是高度炎症性的并且限制于动物应用，利用DNP-OVA在钾铝明矾中沉淀制备出一种人用的已被许可的佐剂的实验被实施。在用IFA免疫后利用明矾得到的结果进一步证实前面的结果(图2A-2C)。用抗原加IL-12处理的动物与只用抗原免疫的小鼠相比显示出更显著的IgG2a和IgG2b的水平。另外，相对于仅用抗原免疫的小鼠，IL-12处理的小鼠中IgG1抗体的水平得到了加强。
子宫内DNP-OVA+/-IL-12免疫后IL-12对血清抗-DNP水平的影响怀孕的小鼠用明矾中的DNP-OVA加IL-12，DNP-OVA加PBS载体，或单独的PBS载体皮下注射。出生的小鼠在9-10周龄时用明矾中的DNP-OVA攻击并在7天后通过ELISA来检测血清中的抗-DNP抗体。参见图3A-3B。结果显示出新生的小鼠相对于用DNP-OVA加IL-12处理的母鼠IgG2a抗-DNP抗体水平显著增加。如果说对IgG1抗体的水平有影响也是很小的。
因此，IL-12对新生儿与成年个体的体液免疫的影响是相似地。此处所述的发现表明，出生时给药IL-12能够诱导强烈的Th1型细胞因子和抗体对T细胞依赖的抗原的反应。由于新生儿对多种疫苗抗原的反应趋向于Th2方式[Forsthuber，T.，et al.，Science，2711728-1730(1996)；Adkins，B.，et al.，J.Immunol.，1533378-3385(1994)；Coutinho，G.，et al.，Eur.J.Immunol.，241858-1862(1994)；Early，E.M.，et al.，Eur.J.Immunol.，262885-2889(1996)；Barrios，C.，et al.，Eur.J.Immunol.，261489-1496(1996)；Kobayashi，M.，et al.，J.Exp.Med.，170827-845(1989)]，在幼儿免疫期给药的IL-12为一种有效的佐剂。
在新生小鼠的脾脏中表达IFN-γ和IL-10 mRNA在1天龄时用明矾中的HANA加IL-12或PBS载体腹腔内注射新生小鼠。对照小鼠只接受没有抗原的PBS载体。处理两天后，小鼠被处死，并且从3-4池的新生小鼠脾脏中分离总RNA。通过RT-PCR测定IFN-γ(459 bp)，IL-10(455 bp)和HPRT(162 bp)的表达。
新生和成年小鼠脾脏和胸腺中IL-12 p40 mRNA的表达在1天龄时用明矾中的HANA加IL-12或PBS载体腹腔内注射新生小鼠。对照小鼠只接受没有抗原的PBS载体。处理两天后，小鼠被处死，并且从3-4池的新生小鼠脾脏和胸腺中分离总RNA。通过RT-PCR测定IL-12 p40(525 bp)和HPRT(162 bp)和HPRT(162 bp)的表达。
新生小鼠接种HANA+\-IL-12后，IL-12对血清中来源于流感病毒(HANA)的抗-纯化的血球凝集素以及神经氨酸苷酶的影响新生小鼠接种HANA+\-IL-12后IL-12对血清抗-HANA水平的影响被检测。小鼠在1天龄时用明矾中的HANA加IL-12，明矾中的HANA加PBS载体，或单独的PBS载体注射。所有的小鼠在5-6周龄时用明矾中的HANA攻击并在7天后通过ELISA来检测血清中的抗-HANA抗体。参见图4A-4B。
实施例2新生儿给药白介素-12增强了抗病毒疫苗的保护效力材料和方法小鼠BALB/c小鼠从国家癌症研究所(Bethesda，MD)获得，4～6周龄且饲养在俄亥俄州医学院。食物和水充分提供。动物照料和实验步骤遵从于俄亥俄医学院的公共动物照料和使用委员会(IACUC)的标准。
新生儿免疫步骤一天龄的小鼠被腹腔内注射1μg的亚流感病毒，其中亚流感病毒含有由Dons Bucher博士提供的(Dr.Dons Bucher，NewYork Medical College，New York，NY)流感病毒A/PR8/34纯化得到的可溶性血球凝集素亚型1(H1)和神经氨酸苷酶亚型1(N1)。抗原与100μg的明矾混合(Rehydrogel Low Viscosity Gel，ReheisInc.，Berkeley Heights，NJ)。第一天时，对实验小鼠腹腔内注射1μg在含有1％正常BALB/c小鼠血清(PBS-NMS)的PBS中稀释的重组鼠IL-12；对照小鼠仅接受PBS-NMS。小鼠被允许长到成年期然后在5-6周龄时，它们被用混合在明矾中的相同量的抗原加强。用该处理方法没有观察到毒性。在加强后7天通过眼眶取血制备小鼠的血清。
RNA分离和RT-PCR通过制造商的说明书利用Ambion总RNA分离试剂盒(Austin，TX)从速冻的脾脏分离总RNA。扼要地，冰冻的组织被用研钵和研棒匀浆，并立即转入含有1.0ml变性溶液的管中。通过酚-氯仿抽提，匀浆的样品在在10000g，4℃下离心10分钟。上清液进行另一个酚-氯仿抽提并且得到的RNA用异丙醇沉淀，用75％乙醇洗涤两次并溶解于DEPC处理的水中。
通过分光光度分析在260 nm下检测总RNA的浓度。3微克的总RNA被通过逆转录试剂盒(Life Technologies，Gaithersburg，MD)用oligo(dT)16-18引物逆转录为cDNA。用IFN-γ和IL-10特异性引物扩增cDNA，以次黄嘌呤转磷酸核糖基酶(HPRT)引物做为对照。正义引物和反义引物具有如下的序列
IFN-γ5′-TGAACGCTACACACTGCATCTTGG-3′(SEQ ID NO11)，5′-CGACTCCTTTTCCGCTTCCT-GAG-3′(SEQ ID NO12)；IL-105′-ATGCAGGACTTTAAGGGTTACTTGGGTT-3′(SEQ ID NO7)，5′-ATTTCGGAGAGAGGTACAAACGAGGTT-3′(SEQ IDNO8)；HPRT5′-GTTGGATACAG-GCCAGACTTTGTT-3′(SEQ IDNO1)，5′-GATTCAACTTGCGCTCATCTTAGGC-3′(SEQ ID NO2).
通过混合2μl的cDNA，0.25 mM dNTPs(InvitrogenCorporation，San Diego，CA)，0.8μM 引物与2.5U的Taq DNA聚合酶(Life Technologies)，加入60 mM Tris-HCI(pH8.5)，15 mM(NH4)2SO4，0.4 mM MgCl2，直至终体积为50μl来进行PCR扩增。混合物温浴在95℃5分钟，然后进行下列的扩增方案95℃1分钟，56℃1分钟，72℃1分钟，持续35个循环。接着72℃温浴10分钟。PCR产物在2.5％琼脂糖凝胶上分离并用EB进行染色。用UV透照法观察。核糖核酸酶保护的检测细胞因子mRNA的水平通过利用RiboQuant多探针核糖核酸酶保护测定系统(Pharmingen，San Diego，CA)依据制造商的说明书来检测。简言之，10μg的总RNA与32p标记的RNA探针杂交56℃过夜。核苷酸用核糖核酸酶处理30℃45分钟以降解单链RNA，并且剩下的核苷酸进行酚-氯仿抽提并且溶解在6％的变性聚丙烯酰胺凝胶中。转录水平利用Storm 840PhosphorImager(Molecular Dynamics，Sunnyvale，CA)进行定量测定。总RNA被标准化为管家基因甘油醛3-磷酸脱氢酶并且相关细胞因子mRNA水平以任意值表达。抗体和同型水平通过ELISA的检测通过经微小修改的ELISA[Buchanan，J.M.，et a1.，Int.Immuno1.，7159(1995)；Buchanan，R.M.，J.Immunol.，1615525(1998)]检测血清中抗H1N1的水平。简言之，微量滴定板(NalgeNunc International，Rochester，NY)用PBS中的1μg/ml H1N1过夜包被。用含有0.3％Brij-35(Sigma，St.Louis，MO)的PBS冲洗并在室温下用含5％的胎牛血清{Hyclone实验室，Logan，UT)以及0.1％的Brij-35的PBS阻遏1小时。加入血清的系列稀释液且滴定板在室温下培养2个小时。滴定板再次冲洗，用山羊抗-鼠所有的Ig、IgM、IgG1或IgG2偶联碱性磷酸盐(SouthernBiotechnology Associates，Birmingham，AL)培养。共培养1小时后，冲洗滴定板，并且加入ρ-硝基酚磷酸盐底物获得色层。在405 nm波长下用ELISA微板读数仪读数(Bio-Tek Instruments，Winooski，VT)。在所有的情况下，适当的工作稀释以及二次抗体偶合物的同型特异性都利用已知同型的纯化骨髓瘤蛋白来检测(Sigma，St.Louis，MO)。统计分析利用Mann-Whitney U试验来进行的。如果p＜0.05则认为数据在统计学上是显著的。
病毒攻击为了研究保护，一天龄的小鼠用1μg的混合了明矾的H1N1亚病毒疫苗接种免疫。小鼠也接受1μg的在PBS-NMS中的IL-12或单独的PBS-NMS。一些小鼠仅接受PBS-NMS(无H1N1亚疫苗)。在最初的免疫后大约4-5周后，利用40μl的无菌PBS中的传染性A/PR8/34流感病毒(由Dr.Doris Bucher提供)对产期内被麻醉的小鼠给药进行病毒攻击。每天对小鼠进行称重并监测发病率和死亡率。
血清的被动转移在被动转移实验中，血清从在出生时仅用PBS-NMS，疫苗或疫苗加IL-12接触抗原的成年小鼠中获得。正常的成年受体用100μl的1∶5稀释的混合血清注射而后用传染性流感病毒鼻内攻击6小时。
结果HIN1亚疫苗加IL-12对新生小鼠给药加强Th1型细胞因子的表达IL-12对免疫系统有很强的作用，通过其优先激活Th1和NK细胞的能力，并且诱导IFN-γ的产生[Trinchieri，G.，and Scott，P.，Res.Immunol.，146423(1995)and Gately，M.K.，et al.，Annu.Rev.Immunol.，16495-521(1998)]。为了检测疫苗和IL-12给药对新生小鼠的影响，在两天前用HIN1亚疫苗混合凝胶免疫的3天龄小鼠的脾脏的细胞因子的基因表达被检测。新生小鼠脾脏的IFN-γ和IL-10的mRNA的表达。新生小鼠在1天龄时用明矾的HIN1加IL-12或PBS载体注射。对照小鼠只接受不带抗原的PBS载体。处理后两天小鼠被处死并且从3-4池新生小鼠的脾脏中分离总RNA。用RT-PCR检测IFN-γ(459 bp)，IL-10(455 bp)以及HPRT(162 bp)的表达。
发现出生后24小时接触PBS-NMS或抗原的新生小鼠并不表达相当水平的脾脏IFN-γmRNA。然而用HIN1亚疫苗接触免疫同时用IL-12处理的新生小鼠表现出显著诱导IFN-γ的表达。
在实施例1中，已知通过IL-12处理在新生小鼠和成年小鼠中被诱导的IL-10的表达被检测[Gerosa，F.，et al.，J.Exp.Med.，1832559(1996)；Sher，A.，et al.，Ann.NY Acad.Sci.，795202(1996)]。新鲜脾脏mRNA的分析显示，只接受疫苗或只接受PBS的动物中没有IL-10的表达。而用IL-12处理的动物脾内的IL-10mRNA明显增加。HPRT mRNA的同时扩增确保了在所有RT-PCR中使用了相同量的核酸。
为了定量和进一步检测用流感疫苗初次免疫后细胞因子的特性，通过多核苷酸酶保护实验来测定细胞因子的转录。给第一天的新生小鼠皮内注射H1N1混合明矾加IL-12，或者PBS赋形剂。对照小鼠只给予不含抗原的PBS赋形剂。给药两天后处死小鼠，从3-4个新鲜的脾脏中提取总RNA并通过多核苷酸酶保护实验进行分析。在6％的聚丙烯酰胺凝胶上分离被保护的mRNA，通过放射自显影来显像。
结果发现在出生时给予H1N1加IL-12的动物比只给予疫苗的动物IFN-γmRNA水平增加25倍。而且，给予IL-12后IL-10mRNA水平增加50倍。同时给予流感疫苗和IL-12能够使IL-10mRNA水平增加15倍。新生动物接种后未检测到其他细胞因子比如IL-4或IL-5的明显表达。出生时注射HIN1亚单位疫苗和IL-12的小鼠会产生Th1类的血清抗体反应此前已经证明腹腔内注射IL-12能够改变鸡溶解酵素受同型体限制的抗体反应[Buchanan，J.M.，et al.，Int.Immunol.，71519(1995)and Metzger，D.W.，et al.，Ann.N.Y.Acad.Sci.，795100(1996)]。如实施例1中所叙述的，给予新生动物IL-12能够增强DNP半抗原和溶解酵素的血清抗体水平。该实施例也表明，给予新生动物IL-12对于抗HIN1抗体的表达具有同样的效果。在出生时用H1N1免疫的动物在成年时用同种抗原加强免疫后，比只在成年时施以抗原的动物显示出抗HIN1血清抗体滴度的明显增加(图5A-5B)。实施例1中，在出生时用疫苗处理的小鼠的IgM、IgG和IgG2a的水平都有明显的增加，验证了模式蛋白和半抗原载体系统的的结果。重要的是，在出生时用H1N1加IL-12处理，会使在成年时用抗原处理后IgG2a的水平有更明显的增加。然而，在出生时接种H1N1和IL-12，与那些只接种H1N1的小鼠的IgM及IgG1抗体水平没有明显的差别。在所有动物的血清中都没有检测到IgA。在出生时给予IL-12能够增加流感亚单位接种的保护性作用在出生时同时给予H1N1和IL-12对于用流感病毒感染后存活率和临床效果的影响，将通过给予一天龄的小鼠HIN1疫苗和12μgIL-12或者PBS赋形剂作进一步的评定。免疫5周后，小鼠鼻内接种A/PR8/34流感病毒，然后每天检测感染率和死亡率。结果发现只在出生时用PBS-NMS(不含HIN1亚单位疫苗)处理的小鼠表现出持续的体重减轻并在病毒感染的13天内死亡(图6A-6B)。
在出生时只接种H1N1的小鼠具有55％的存活率。然而，在新生动物免疫时加入IL-12的会产生100％的存活率。通过体重的恢复来证明存活小鼠的感染恢复。因此，将IL-12结合到免疫疗法中能够提高疫苗的效果并且对随后的流感病毒感染产生明显的保护作用。在出生时接种H1N1和IL-12后的所增加的抗流感感染的保护作用是由抗体介导的为了确定在接种H1N1和IL-12的新生小鼠中所观察到的抗流感病毒的保护作用是血清抗体来介导的，将从这些小鼠中所收集的血清转移到未感染小鼠的体内，然后用A/PR8/34流感病毒感染。结果发现接受从在出生时只用疫苗免疫的小鼠的血清的动物表现出60％的存活率，而除了一只以外所有的接受从用IL-12处理的小鼠的血清的动物都从病毒感染中存活过来。
表用流感亚单位疫苗免疫的新生小鼠脾的细胞因子mRNA水平*
*用明矾中的H1N1加上IL-12或者PBS赋形剂皮下注射的一天龄小鼠。对照小鼠只给予不含抗原的PBS赋形剂。给药两天后处死小鼠，从3-4个收集的新生小鼠脾中分离总RNA并用多核苷酸酶保护实验进行分析。在磷酸盐测定仪上测定RNA的相对水平，并使之符合甘油醛-3-磷酸脱氢酶的规格。细胞因子的mRNA水平用arbritary单位来表示。
讨论新生儿和幼儿有很高的遭受感染的危险，缺乏一种合适的可以安全施予婴儿并激发强烈的Th1类免疫反应的抗病毒疫苗佐剂。如本专利所述，在出生时同时给予IL-12和流感亚单位疫苗会诱导Th1类细胞因子增加，使动物提高IgGa抗体反应，增加以后在成年时抗病毒感染的保护作用。
具体地，在出生时注射流感亚单位疫苗和IL-12并在成年时只用疫苗免疫的小鼠，比起在出生时只用疫苗免疫的小鼠，血清IgGa抗体的滴度具有明显的增加。实施例1中叙述的发现显示出在出生时给予IL-12能够明显增加B细胞对模式T-依赖型抗原的记忆反应，这些结果证实并扩展到临床相关的抗原。如实施例1所叙述的，在出生时给予动物IL-12和蛋白或半抗原载体，并在成年后只用抗原加强，比只注射抗原的动物显示出IgG1、IgG2a和IG2b抗体水平的增加。
本发明描述的一个主要的发现是，在出生时同时给予IL-12和流感亚单位疫苗提高了疫苗的保护作用，显示为在流感病毒感染后存活率提高。例如IL-12介导的保护可以通过血清向未感染动物体内转移，表明了这种保护作用是由抗体介导的。应相信，细胞介导的免疫作用对于病毒感染的恢复是重要的，而体液反应在防止病毒感染中起到中枢作用[Palladino，G.K.，et al.，J.Virol，692075(1995)]。尽管如此，有几组B细胞在小鼠从流感病毒感染的恢复中也发挥了重要作用[Graham，M.B.，and Braciale，T.J.，J.Exp.Med.，1862063(1997)；Mozdzanowska，K.，et al.，Virol，239217(1997)；Gerhard，W.K，et al.，Immunol.Rev.，15995-103(1997)and Topham，D.J.and Doherty，P.C.，J.Virol.，72882(1998)]。IL-12增加保护性新生动物B细胞记忆的能力显示出IL-12能够用作很有效的疫苗佐剂。等同物尽管通过相关的优选实施方案具体展示和描述了本发明，本领域的技术人员应该理解的是，其中的形式和细节可以作不同的改变而不偏离本申请权利要求中所定义的本发明的内涵和范围。仅仅使用常规的实验方法，本领域的技术人员可以辨认或者能够确定本发明中描述的具体实施方案的同等物。这些等同物已经包括在本发明权利要求的范围内。
权利要求
1．一种诱导在新生动物宿主中诱导对病原的免疫反应的方法，包括给药新生动物宿主有效量的白介素-12和病原抗原。
2．根据权利要求1的方法，其中的抗原选自细菌，病毒，寄生物，真菌和酵母。
3．根据权利要求2的方法，其中的细菌选自；芽孢杆菌属(bacillus)，B群链球菌(Group B streptococcus)，博代菌属(Bordetella)，李斯特菌属(Listeria)，Bacillus anthaacis，肺炎链球菌(S.pneumoniae)，脑炎病菌(N.Meningiditis)和流感病毒(H.Influenza)。
4．根据权利要求1的方法，其中的免疫应答是细胞因子反应。
5．根据权利要求4的方法，其中的细胞因子反应导致干扰素-γ和白介素-10的增强表达。
6．根据权利要求1的方法，其中的免疫反应是体液反应。
7．根据权利要求6的方法，其中的体液反应导致宿主IgG1、IgG2a和IgG2b抗体水平的增强表达。
8．一种在新生动物宿主中增强免疫反应的方法，包括给药新生动物宿主有效量的白介素-12和病原抗原。
9．权利要求8的方法，其中的抗原选自细菌，病毒，寄生物，真菌和酵母。
10．权利要求9的方法，其中的细菌选自；芽孢杆菌属(bacillus)，B群链球菌(Group B streptococcus)，博代菌属(Bordetella)，李斯特菌属(Listeria)；Bacillus anthaacis，肺炎链球菌(S.pneumoniae)，脑炎病菌(N.Meningiditis)和流感病毒(H.Influenza)。
11．根据权利要求8的方法，其中的免疫反应是细胞因子反应。
12．根据权利要求11的方法，其中的细胞因子反应导致干扰素-γ和白介素-10的增强表达。
13．根据权利要求8的方法，其中的免疫反应是体液反应。
14．根据权利要求13的方法，其中的体液反应导致宿主IgG1、IgG2a和IgG2b抗体水平的增强表达。
15．一种在新生动物宿主中诱导对于抗原的细胞因子反应的方法，包括给予新生动物宿主有效量的白介素-12和病原抗原。
16．根据权利要求15的方法，其中的抗原选自细菌，病毒，寄生物，真菌和酵母。
17．根据权利要求16的方法，其中的细菌选自；芽孢杆菌属(bacillus)，B群链球菌(Group B streptococcus)，博代菌属(Bordetella)，李斯特菌属(Listeria)，Bacillus anthaacis，肺炎链球菌(S.pneumoniae)，脑炎病菌(N.Meningiditis)和流感病毒(H.Influenza)。
18．根据权利要求15的方法，其中的细胞因子反应导致干扰素-γ和白介素-10的增强表达。
19．根据权利要求15的方法，还包括体液免疫反应。
20．根据权利要求19的方法，其中的体液反应导致宿主IgG1，IgG2a and IgG2b抗体水平的增强表达。
21．一种对由于新生动物宿主接触抗原而使干扰素-γ在新生动物宿主中的表达被抑制的克服方法，包括给予新生动物宿主有效量的白介素-12和病原抗原。
22．根据权利要求21的方法，其中的抗原选自蛋白质，肽，糖蛋白，糖，脂质，糖脂，半抗原化合物，重组DNA，整个有机体，毒素和有机分子。
23．一种在新生动物宿主中增强抵抗病原的细胞因子反应的方法，包括给予新生动物宿主有效量的白介素-12和病原抗原。
24．根据权利要求23的方法，其中的抗原选自细菌，病毒，寄生物，真菌和酵母。
25．根据权利要求24的方法，其中的细菌选自；芽孢杆菌属(bacillus)，B群链球菌(Group B streptococcus)，博代菌属(Bordetella)，李斯特菌属(Listeria)，Bacillus anthaacis，肺炎链球菌(S.pneumoniae)，脑炎病菌(N.Meningiditis)和流感病毒(H.Influenza)。
26．根据权利要求23的方法，其中干扰素-γ和白介素-10在宿主细胞中的表达增强。
27．根据权利要求2的方法，其中的病毒是流感病毒。
28．根据权利要求9的方法，其中的病毒是流感病毒。
29．根据权利要求16的方法，其中的病毒是流感病毒。
30．根据权利要求24的方法，其中的病毒是流感病毒。
全文摘要
本发明涉及一种诱导产生抵抗新生儿宿主的病原体的类Th1应答的方法,其包括给药新生宿主有效量的IL－12和病原体的抗原。本发明也包括一种克服暴露于病原体或抗原的新生宿主中干扰素－γ(IFN－γ)表达抑制的方法,其包括给药新生宿主有效量的IL－12和抗原。本发明也涉及一种增强细胞因子表达抵抗或在新生宿主中对病原体进行应答的方法,其包括给药新生宿主有效量的IL－12和病原体的抗原。
文档编号A61P37/04GK1296415SQ99803680
公开日2001年5月23日 申请日期1999年3月4日 优先权日1998年3月5日
发明者丹尼斯·W·梅特泽杰, 伯纳德·P·阿鲁兰达姆 申请人:俄亥俄医学院