用于进行抗葡萄球菌接种的免疫原性组合物的制作方法

专利名称：用于进行抗葡萄球菌接种的免疫原性组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及葡萄球菌免疫原性组合物和疫苗，它们的制备以及这些组合物在医学中的用途。更特别地，它涉及疫苗组合物，包含用于治疗或预防葡萄球菌感染的抗原的组合。也提供了所述疫苗在医学中的使用和它们的制备方法。
背景技术：
近年来，随着血管内设备的使用增加，在社区获得的和在医院获得的感染数量都已经增加了。在医院获得的(医源性)感染是发病和死亡的主要原因，更特别是在美国，它每年影响了超过200万患者。根据各种研究，美国患者的大约6%在他们呆在医院期间将获得感染。估计1992年在美国的经济负担超过45亿美元(Emori和Gaynes，1993，Clin.Microbiol. Rev. 6 ;428)。大多数频发感染是尿道感染(UTI-感染的33% )，接下来是肺炎(15. 5%)，外科手术部位感染(14.8%)以及原发血流感染(13%) (Emori和Gaynes，1993，Clin. Microbiol. Rev. 6 ；428)。金黄色葡萄球菌、凝固酶阴性的葡萄球菌(大多数是表皮葡萄球菌)、肠球菌种、大肠杆菌以及绿脓杆菌是主要的医源性病原体。尽管那些病原体差不多引起同样数量的感染，但是它们可引起的失调的严重性再加上抗生素抗性的分离菌的频率，对金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌的这个排位进行平衡，它们成为了最重要的医源性病原体。金黄色葡萄球菌是有着显著发病率和死亡率的医源性感染的最通常原因(Romero-Vivas et al 1995，Infect. Dis. 21 ; 1417)。它是骨髓炎、心内膜炎、脓毒性关节炎、肺炎、脓肿以及中毒性休克综合征的一些病例的原因。表皮葡萄球菌是正常的皮肤共生生物，也是引起植入的医疗设备的感染以及在外科手术部位的感染的重要机会致病菌。被金黄色葡萄球菌感染的医疗设备包括心脏起搏器、脑脊液分流器、连续流动的腹膜透析导管、整形外科设备以及人工心脏瓣膜。用抗生素治疗金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌感染，青霉素是首选药物，而万古霉素用于甲氧苯青霉素抗性的分离菌。自1980年代以来，对抗生素呈现广谱抗性的葡萄球菌菌株的百分比已经变得日益普遍(Panlilo et al 1992, Infect. Control. Hosp.Epidemiol. 13 ;582)，造成了对有效的抗菌治疗的威胁。此外，近来出现的万古霉素抗性的 金黄色葡萄球菌已经引起了恐惧，害怕甲氧苯青霉素抗性的金黄色葡萄球菌菌株将会产生并扩散，对此还没有可用的有效治疗。已经研究了在被动免疫疗法中使用抗葡萄球菌抗原的抗体这一备选方法。包括给予多克隆抗血清的疗法正在研发之中(wo 00/15238, WO 00/12132)，以及用抗脂磷壁酸的单克隆抗体进行治疗(W0 98/57994)。备选方法将是使用主动疫苗接种来产生对葡萄球菌的免疫应答。已经确定了用作疫苗组分而包含的几种候选物。这些候选物包括纤连蛋白结合蛋白(US5840846)、MHC II类似物(US5648240)、纤维蛋白原结合蛋白(US6008341)、GehD(US 2002/0169288)、胶原蛋白结合蛋白(US6288214)、SdrF、SdrG 和 SdrH(WC) 00/12689)、突变体 SEA 和 SEB 外毒素(WO00/02523)以及52kDa玻连蛋白结合蛋白(W0 01/60852)。金黄色葡萄球菌基因组已经被测序，并已经确定了许多编码序列(EP786519，WO02/094868)。对于表皮葡萄球菌同样如此(W0 01/34809)。作为该方法的改进，其他人已经确定了被来自患有葡萄球菌感染的患者的超免疫血清所识别的蛋白质(WO 01/98499，WO02/059148)。靶向金黄色葡萄球菌或靶向它所产生的外蛋白的疫苗的首次产生已经获得了有限成功(Lee 1996 Trends Microbiol. 4 ； 162) 0仍然存在研发针对葡萄球菌感染的有效疫、苗的需求。因此，本发明提供了包含至少两种不同的蛋白或其免疫原性片段的免疫原性组合物，所述蛋白或其免疫原性片段选自以下至少两组蛋白或免疫原性片段组a)至少一种葡萄球菌胞外成分结合蛋白或其免疫原性片段，其选自层粘连蛋白受体、SitC/MntC/唾液结合蛋白、EbhA、EbhB、弹性蛋白结合蛋白(EbpS)、EFB (FIB)、SBI、自溶素、ClfA、SdrC、SdrG> SdrH、酷酶 GehD、SasA、FnbA、FnbB、Cna、ClfB、FbpA、Npase、IsaA/PisA、SsaA、EPB、SSP-l、SSP-2、HBP、玻连蛋白结合蛋白、纤维蛋白原结合蛋白、凝固酶、Fig和 MAP ；组b)至少一种葡萄球菌转运蛋白或其免疫原性片段，其选自免疫优势的ABC转运蛋白、IsdA、IsdB、Mg2+转运蛋白、SitC和Ni ABC转运蛋白；组c)至少一种葡萄球菌毒力调节剂、毒素或其免疫原性片段，其选自a毒素(Hla)、a毒素H35R突变体、RNA III活化蛋白(RAP)。


图I-优选蛋白质的多肽序列。表I提供了有关每个SEQ ID代表哪个蛋白质的信
肩、O图2-编码优选蛋白质的核苷酸序列。表I提供了有关每个SEQ ID编码哪个蛋白质的信息。图3-天然条件下a毒素的纯化。图A显示了 a毒素纯化期间所制备样品的考马斯亮蓝染色的SDS-PAGE。第I道-分子量标志，第2道-含有过量表达a毒素的可溶性级分，第3道-从Ni-NTA柱流过，第4道-用10%缓冲液B洗脱的级分，第5道-用20%缓冲液B洗脱的级分，第6道-用30%缓冲液B洗脱的级分，第7道-用50%缓冲液B洗脱的级分，第8道-用75%缓冲液B洗脱的级分，第9道和第10道-用100%缓冲液B洗脱的级分，第11道-诱导前在T = 0时的细菌，第12道-诱导后在T = 4时的细菌，第13道-细胞溶胞产物，第14道-可溶性级分，第15道-不溶性级分。图B显示了 10、5、2和I ill纯化a毒素的考马斯亮蓝染色的SDS-PAGE。图4-变性条件下的SdrC的纯化。图A显示了 a毒素纯化期间所制备样品的考马斯亮蓝染色的SDS-PAGE。泳道M-分子量标志，泳道Start-由含有过量表达SdrC的不溶性级分所形成的上清液，泳道FTl-从Ni-NTA柱流过，泳道C-用漂洗缓冲液C洗脱的级分，泳道D-用缓冲液D洗脱的级分，道E-用缓冲液E洗脱的级分。图B显示了 1、2、5和10 ill纯化SdrC的考马斯亮蓝染色的SDS-PAGE。图5-在包被了纯化蛋白质的平板中抗葡萄球菌蛋白质抗血清的ELISA结果。合并小鼠pre_使用提取自接种前小鼠的合并的血清的结果。合并小鼠PostIII-使用免疫后提取的合并的小鼠血清的结果。合并兔Pre-使用提取自接种前兔的合并的血清的结果。合并兔Post III-使用免疫后提取的合并的兔血清的结果。Blc-阴性对照。图6-在包被了杀死的葡萄球菌的平板上产生的抗葡萄球菌蛋白质的小鼠抗血清 的ELISA结果。图A使用由金黄色葡萄球菌血清型5杀死的完整细胞所包被的平板。图B使用由金黄色葡萄球菌血清型8杀死的完整细胞所包被的平板。图C使用由表皮葡萄球菌杀死的完整细胞所包被的平板。用方块符号标记的线显示使用来自小鼠的抗血清的ELISA结果，该小鼠用所标明的葡萄球菌蛋白质免疫三次。用菱形符号标记的线显示免疫前小鼠血清的ELISA结果。图7-在包被了杀死的葡萄球菌的平板上产生的抗葡萄球菌蛋白质的兔抗血清的ELISA结果。图A使用由金黄色葡萄球菌血清型5杀死的完整细胞所包被的平板。图B使用由金黄色葡萄球菌血清型8杀死的完整细胞所包被的平板。图C使用由表皮葡萄球菌杀死的完整细胞所包被的平板。用方块符号标记的线显示使用来自兔的抗血清的ELISA结果，该小鼠用所标明的葡萄球菌蛋白质免疫三次。用菱形符号标记的线显示免疫前兔血清的ELISA结果。
具体实施例方式本发明公开了葡萄球菌抗原的特定组合，当其组合时，引起有效治疗或预防葡萄球菌感染的免疫原性组合物的产生。本发明的免疫原性组合物合适地掺入了参与不同葡萄球菌感染的抗原。所述免疫原性组合物以针对葡萄球菌功能的不同方面的免疫应答为目标，因此能够诱导特别优选的免疫应答。葡萄球菌感染的发展经过几个不同阶段。例如，葡萄球菌的生存周期包括共栖增殖、通过接触相邻组织或血流而开始感染、在血液中的厌氧增殖、金黄色葡萄球菌毒力决定子与宿主防御机制之间的相互作用以及诱导并发症包括心内膜炎、转移性脓肿形成和败血病综合征。细菌表面上的不同分子将参与感染周期的不同步骤。通过以针对参与葡萄球菌感染不同步骤的有效量的特定抗原的组合的免疫应答为目标，能够产生功效增强的葡萄球菌免疫原性组合物或疫苗。特别地，来自不同类型的某些抗原的组合，其中一些参与对宿主细胞的粘附，其中一些参与铁捕获或其它转运蛋白功能，其中一些是毒素或毒力调节剂和免疫优势抗原，能够引起防止多阶段感染的免疫应答。可以通过如实施例中描述的动物模型分析法测定和/或使用如实施例中描述的调理吞噬作用分析法测定免疫应答的有效性。本发明的一个额外优点是免疫原性组合物中来自不同蛋白家族的本发明的抗原组合将能够产生抗更广泛菌株的保护作用。本发明涉及包含多种蛋白的免疫原性组合物，所述蛋白选自至少两类不同的蛋白，具有具有葡萄球菌的不同功能。这样的蛋白质种类的例子是胞外结合蛋白质，转运蛋白诸如Fe捕获蛋白，毒素或毒力调节剂以及其它免疫优势蛋白质。本发明的疫苗组合能够有效抗同源葡萄球菌菌株(得到抗原的菌株)，并且优选也抗异源葡萄球菌菌株。本发明的免疫原性组合物包含等于或多于2、3、4、5或6种的选自2或3个以下组的多种蛋白质组a)至少一种葡萄球菌胞外成分结合蛋白或其免疫原性片段，其选自层粘连蛋白受体、Si tC/MntC/唾液结合蛋白、EbhA、EbhB、弹性蛋白结合蛋白(EbpS)、EFB (FIB)、SBI、自溶素、ClfA、SdrC、SdrG> SdrH、酷酶 GehD、SasA、FnbA、FnbB、Cna、ClfB、FbpA、Npase、IsaA/PisA、SsaA、EPB、SSP-l、SSP-2、HBP、玻连蛋白结合蛋白、纤维蛋白原结合蛋白、凝固酶、Fig和 MAP ； 组b)至少一种葡萄球菌转运蛋白或其免疫原性片段，其选自免疫优势的ABC转运蛋白、IsdA、IsdB、Mg2+转运蛋白、SitC和Ni ABC转运蛋白；组c)至少一种葡萄球菌毒力调节剂、毒素或其免疫原性片段，其选自a毒素(Hla)、a毒素H35R突变体、RNA III活化蛋白(RAP)。例如，第一种蛋白质选自组a)、b)或C)，第二种蛋白质选自一个组，该组选自组a)、b)和C)，其不包括第二种蛋白质。在一种优选实施方案中，本发明的免疫原性组合物含有至少一种选自组a)的蛋白质以及选自组b)和/或组c)的额外蛋白质。在另一种优选实施方案中，本发明的免疫原性组合物含有至少一种选自组b)的抗原以及选自组c)和/或组a)的额外蛋白质。在另一种优选实施方案中，本发明的免疫原性组合物含有至少一种选自组c)的抗原以及选自组a)和/或组b)的额外蛋白质。本发明的免疫原性组合物合适地含有来自金黄色葡萄球菌和/或表皮葡萄球菌的蛋白。蛋白质本发明的免疫原性组合物包含分离的蛋白质，其包含与图I的任意序列具有至少85%同一性、优选至少90%同一性、更优选至少95%同一性、最优选至少97-99%或完全同
一性的氨基酸序列。本文在明确提及蛋白质时，优选指天然或重组的、全长蛋白质或者任选地已经去除了任何信号序列的成熟蛋白质。蛋白质可直接从葡萄球菌菌株中分离或者通过重组DNA技术生产。可将蛋白质的免疫原性片段加入到本发明的免疫原性组合物中。这些片段是包含从蛋白质的氨基酸序列连续选取的至少10个氨基酸、优选20个氨基酸、更优选30个氨基酸、更优选40个氨基酸或50个氨基酸、最优选100个氨基酸的片段。此外，这样的免疫原性片段是与针对葡萄球菌蛋白质而产生的抗体有免疫反应的，或者是与通过用葡萄球菌感染而产生的抗体有免疫反应的。免疫原性片段也包括以有效剂量给予时，(单独或者作为结合到载体上的半抗原)，引起针对葡萄球菌感染的保护性免疫应答的片段，更优选地是对金黄色葡萄球菌和/或表皮葡萄球菌感染有保护性的。这样的免疫原性片段可包括例如缺少N末端前导序列、和/或跨膜结构域和/或C末端锚定结构域的蛋白质。在优选的方面，根据本发明的免疫原性片段包含蛋白质基本上所有的胞外结构域，所述蛋白质在片段序列的整个长度上具有与选自图I的序列至少85%同一性、优选至少90%同一性、更优选至少95%同一性、最优选至少97-99%同一性。本发明的免疫原性组合物还可以含有葡萄球菌蛋白质的融合蛋白质或者葡萄球菌蛋白质的免疫原性片段。这样的融合蛋白质可以重组制备，可包含至少2、3、4、5或6种葡萄球菌蛋白质的一个部分。作为选择,融合蛋白质可包含至少2、3、4或5种葡萄球菌蛋白质的多个部分。这些融合蛋白质可以将不同的葡萄球菌蛋白质或其片段组合到同一蛋白 质中。作为选择，本发明也包括葡萄球菌蛋白质或其片段的单独的融合蛋白质，作为与异源序列诸如T细胞表位或纯化标志的提供者的融合蛋白质，例如P -半乳糖苷酶，谷胱苷肽-S-转移酶，绿色荧光蛋白(GFP)，表位标志诸如FLAG、myc标志、聚组氨酸，或者病毒表面蛋白质诸如流感病毒血凝素，或者细菌蛋白质诸如破伤风类毒素、白喉类毒素、CRM197。表I下表列出了分别在图I和图2中发现的蛋白质序列和DNA序列的SEQ ID号。SA表示来自金黄色葡萄球菌的序列，SE表示来自表皮葡萄球菌的序列。
___蛋白质序列__DNA序列
免疫优势的ABC转运蛋白__
SASEQ ID I__SEQ ID 34
SE__SEQ ID 2__SEQ ID 35
层粘连蛋白受体___
SASEQ ID 3__SEQ ID 36
SE__SEQ ID 4__SEQ ID 37
分泌抗原A
SA ISEQ ID 5__SEQ ID 38
SA 2SEQ ID 6__SEQ ID 39
SE__SEQ ID 7__SEQ ID 40
SitC__
SASEQ ID 8__SEQ ID 41
SE_ SEQ ID 9SEQ ID 42 —IsaA / PisA (IssA )__
SASEQ ID 10__SEQ ID 43
SE__SEQ ID 11__SEQ ID 44
EbhA / B__
SA EbhASEQ ID 12__SEQ ID 45
SA EbhBSEQ ID 13__SEQ ID 46
SE EbhASEQ ID 14__SEQ ID 47
SE EbhB__SEQ ID 15__SEQ ID 48 累积-结合蛋白Aap__
SASEQ ID 16__SEQ ID 49
SE__SEQ ID 17__SEQ ID 50
RNA III激活蛋白RAP__
SASEQ ID 18SEQ ID 51
SE__SEQ ID 19__SEQ ID 52
FIG / SdrG__
SASEQ ID 20__SEQ ID 53
SE__SEQ ID 21__SEQ ID 54
烊性蛋白结合蛋白Ebps
SASEQ ID 22__SEQ ID 55
SE__SEQ ID 23__SEQ ID 56
胞外蛋白质 EFB SA__SEQ ID 24__SEQ ID 57
A 毒素 SA__SEQ ID 25__SEQ ID 58
SBI SA__SEQ ID 26__SEQ ID 59
IsdA SA__SEQ ID 27__SEQ ID 60
IsdB SA__SEQ ID 28__SEQ ID 61
SdrC SA__SEQ ID 29__SEQ ID 62
ClfA SA__SEQ ID 30__SEQ ID 63
FnbA SA__SEQ ID 31__SEQ ID 64
ClfB SA__SEQ ID 32__SEQ ID 65
凝固酶 SA__SEQ ID 33__SEQ ID 66
FnbB SA__SEQ ID 67__SEQ ID 71
MAP SA__SEQ ID 68__SEQ ID 72
SdrC SA__SEQ ID 69SEQ ID 73
SdrG SASEQ ID 70SEQ ID 74胞外成分结合蛋白胞外成分结合蛋白是结合宿主胞外成分的蛋白质。该术语包括但不限于粘附素。
胞外成分结合蛋白的例子包括层粘连蛋白受体(Naidu et al J. Med. Microbiol.1992,36 ;177)，Si tC/MntC/ 唾液结合蛋白(US5801234，Wiltshire 和 Foster Infec.Immun. 2001,69 ；5198), EbhA(Williams et al Infect. Tmmun. 2002, 70 ；6805), EbhB,弹性蛋白结合蛋白(EbpS)(Park et al 1999，J. Biol. Chem. 274 ;2845)，EFB (FIB)(Wastfelt 和 Flock 1995, J. Clin. Microbiol. 33 ；2347), SBI (Zhang et al FEMS Tmmun.Med. Microbiol. 2000, 28 ；211),自溶素(Rupp et al 2001, J. Infect. Dis. 183 ；1038),ClfA(US6008341，McDevitt et al Mol. Microbiol.1994,11 ；237), SdrC, SdrG(McCreaet al Microbiology 2000,146 ; 1535), SdrH(McCrea et al Microbiology 2000,146 ；1535)，脂肪酶 GehD (US2002/0169288)，SasA，FnbA(Flock et al Mol Microbiol. 1994,12 ；599, US6054572)，FnbB (WO 97/14799，Booth et al 2001 Infec. Immun. 69 ;345)，胶原蛋白结合蛋白 Cna(Visai et al 2000, J. Biol. Chem. 275 ；39837), ClfB (WO 99/27109)，FbpA (Phonimdaeng et al 1988 J.Gen Microbiol. 134 ;75) , Npase(Flock 2001J. Bacteriol. 183 ；3999), IsaA/PisA(Lonenz et al FEMS Tmmuno. Med. Microbiol. 2000,29 ; 145), SsaA (Lang et al FEMS Immunol. Med. Microbiol. 2000, 29 ；213), EPB(Hussain和 Hermann,丹麦 14_17th 关于葡萄球菌的研讨会,2000), SSP-1 (Veenstra et al 1996, J. Bacteriol. 178 ；537), SSP-2 (Veenstra et al 1996，J. Bacteriol. 178 ;537)，17kDa肝素结合蛋白 HBP (Fallgren et al 2001，J. Med. Microbiol. 50 ;547)，玻连蛋白结合蛋白(Liet al 2001，Curr. Microbiol. 42 ;361)，纤维蛋白原结合蛋白，凝固酶，Fig(W0 97/48727)以及 MAP (US5648240)。SitC/MntC/唾液结合蛋白这是ABC转运蛋白，它是肺炎葡萄球菌粘附素PsaA的同源物。它是高度免疫原性的 32kDa脂蛋白，分布在整个细菌细胞壁(Cockayne et al Infect. Immun. 199866 ;3767)。它在金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌中表达为32kDa脂蛋白，40kDa同源物存在于人葡萄球菌中。在表皮葡萄球菌中，它是铁调节操纵子的成分。它显示了与包括副血链球菌的FimA在内的粘附素有相当高的同源性，以及与具有证实的或推定的金属离子转运功能的ABC转运蛋白家族的脂蛋白具有相当高的同源性。因此SitC被包括为胞外结合蛋白和金属离子转运蛋白。披露于US5，801, 234的唾液结合蛋白也是SitC的形式，可被包括在本发明的免疫原性组合物中。ClfA 和 ClfB这两种蛋白质都具有纤维蛋白原结合活性，在存在血浆时引起金黄色葡萄球菌形成聚集。它们含有细胞壁相关蛋白质所共有的LPXTG基序。ClfA 描述于 US6008341，ClfB 描述于 WO 99/27109。凝固酶(FbpA)这是一种纤维蛋白原结合蛋白质，在存在血浆时引起金黄色葡萄球菌形成聚集。它描述于涉及到凝固酶的参考文献中Phonimdaeng et al (J. Gen. Microbio. 1988,134 75-83), Phonimdaeng et al. (Mol Microbiol 1990 ；4 :393-404), Cheung et al. (InfectImmun 1995 ；63 :1914-1920)以及 Shopsin et al. (J.CLin. Microbiol. 2000 ；38 3453-3456)。
包含在本发明的免疫原性组合物中的优选片段包括已经去除信号肽(C末端27个氨基酸)的成熟蛋白质。凝固酶具有三个明显的结构域。氨基酸59-297是卷曲螺旋区，氨基酸326-505是富含脯氨酸和甘氨酸的区域，从氨基酸506到645的C末端结构域具有P折叠构象。这些结构域的每一个都是本发明的优选片段。SdrG-Fbe-EfB/FIGFbe是在表皮葡萄球菌的许多分离株中发现的纤维蛋白原结合蛋白，具有119kDa的推断分子量(Nilsson et al 1998. Infect. Immun. 66 ；2666)。它的序列与金黄色葡萄球菌的聚集因子(ClfA)的序列相关。抗Fbe的抗体可阻断表皮葡萄球菌结合到纤维蛋白原包被的平板和导管上(Pei 和 Flock 2001，J. Infect. Dis. 184 ;52)。该蛋白在 WO 00/12689 中也描述为SdrG。SdrG在凝固酶阴性的葡萄球菌中被发现，是含有LPXTG序列的细胞壁相关蛋白质。SdrG含有信号肽(氨基酸1_51)，含有纤维蛋白原结合位点和胶原蛋白结合位点的区域(氨基酸51-825)，两个CnaB结构域(氨基酸627-698和738-809)，SD重复区(氨基酸825-1000)以及锚定结构域(氨基酸1009-1056)。Fbe具有推定的信号序列，在氨基酸51和52之间带有裂解位点。因此Fbe的优选片段含有Fbe的成熟形式，从氨基酸52延续到C末端(氨基酸1092)。Fbe从氨基酸52到氨基酸825的结构域负责纤维蛋白原结合。因此Fbe的优选片段包含或由氨酸52-825组成。Fbe的氨基酸373和516之间的区域显示了 Fbe和ClfA之间的最大保守性。因此优选片段将含有Fbe的氨基酸373-516。Fbe的氨基酸825-1041含有高度重复区，由串联重复的天冬氨酸和丝氨酸残基组成。SdrG的优选片段包括已经去除了信号肽和/或SD重复序列以及锚定结构域的多肽。这些多肽包括或者由SEQ ID NO :70的氨基酸50-825、氨基酸50-633、氨基酸50-597 (W0 03/76470 的 SEQ ID NO 2)、氨基酸 273-597 (W0 03/76470 的 SEQ ID NO 4)、氨基酸 273-577 (W0 03/76470 的 SEQ ID NO 6)、氨基酸 1-549、氨基酸 219-549、氨基酸 225-549、氨基酸219-528、氨基酸225-528所组成的多肽。优选地，将与SEQ ID NO :70、20或21的序列具有至少80%、85%、90%、92%、95%、97%、98%、99%或100%同源性的SdrG多肽加入到本发明的免疫原性组合物中。本发明的组合物任选包含上述SdrG多肽的片段。优选片段已经去除了信号肽和/或SD重复序列和/或锚定结构域。例如对应于SEQ ID 76 的氨基酸 1-713、1-549、225-549、225-529、24-717、1-707、1-690、1-680、1-670、1-660、1-650、1-640、1-630、1-620、1-610、1-600、34-707、44-697、36-689 的序列或者与 SEQID 70 或 20 或 21 具有 85%、90%、92%、95%、97%、98%、99%或 100% 同一性的序列。去除了信号肽的优选片段在片段的N末端具有甲硫氨酸残基以确保正确翻译。更优选的片段具有下面的序列MEENSVQDVKDSNTDDELSDSNDQSSDEEKNDVINNNQSINTDDNNQIIKKEETNNYDGIEKRSEDRTESTTNVDENEATFLQKTPQDNTHLTEEEVKESSSVESSNSSIDTAQQPSHTTINREESVQTSDNVEDSHVSDFANSKIKESNTESGKEENTIEQPNKVKEDSTTSQPSGYTNIDEKISNQDELLNLPINEYENKARPLSTTSAQPSIKRVTVNQLAAEQGSNVNHLIKVTDQSITEGYDDSEGVIKAHDAENLIYDVTFEVDDKVKS⑶TMTVDIDKNTVPSDLTDSFTIPKIKDNSGEIIATGTYDNKNKQITYTFTDYVDKYENIKAHLKLTSYIDKSKVPNNNTKLDVEYKTALSSVNKTITVEYQRPNENRTANLQSMFTNIDTKNHTVEQTIYINPLRYSAKETNWISGN ⑶ EGSTIIDDSTIIKVYKVGDNQNLPDSNRIYDYSEYEDVTNDDYAQLGNNNDVNINFGNIDSPYIIKVISKYDPNKDDYTTIQQTVTMQTTINEYTGEFRTASYDNTIAFSTSSGQGQGDLPPEKTYKI⑶YVWEDVDKDGIQNTNDNEKPLSNVLVTLTYPDGTSKSVRTDEDGKYQFDGLKNGLTYKITFETPEGYTPTLKHSGTNPALDSEGNSVWVTINGQDDMTIDSGFYQTPKYSLGNYVffYDTNKDGIQGDDEKGISGVKVTLKDENGNIISTTTTDENGKYQFDNLNSGNYIVHFDKPSGMTQTTTDS⑶DDEQDADGEEVHVTITDHDDFSIDNGYYDDEEbhA 和 EbhB
EbhA和EbhB是在金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌两者中都表达的蛋白质(Clarke and Foster Infect. Immun. 2002,70 ；6680,Williams et al Infect. Immun. 2002,
20;6805)，它们结合到纤连蛋白。由于纤连蛋白是胞外基质的重要成分，EbhA和EbhB在将葡萄球菌粘附到胞外基质方面具有重要功能。Ebh蛋白质较大，具有I. I兆道尔顿的分子量。由于生产和配制的容易性，使用Ebh蛋白质的片段而不是完整序列是有利的。蛋白质的中部区域含有不完全重复序列，其含有纤连蛋白结合位点。下述含有一个或多个重复结构域的片段是用来加入到本发明的免疫原性组合物中的优选片段。Ebh蛋白质含有127个氨基酸长度的不完全重复单元，其特征在于含有共有序列L.G. {10} A. {13} Q. {26} L. . . M. . L. {33} A优选地 {19} L. G. {10} A. {13} Q. {26} L. . . M. . L. {33} A. {12}更优选地.....I/V. . A. . . I/V. . AK. ALN/DG. NL. . AK. . A. {6} L. . LN. AQK. . L. . QI/V. . A..
V. . V. {6}A. . LN/D. AM. . L. . . I/V. D/E. . . TK. S. NY/F. N/DAD. . K. . AY/F. . AV. . A. . I/V. N/D.......其中”代表任意氨基酸，{10}”代表任意10个氨基酸，I/V表示氨基酸的备选。参考Kuroda et al (2001) Lancet 357 ; 1225-1240 中披露的序列以及表 2，很容易推知Ebh蛋白质中的重复序列。包括在本发明的免疫原性组合物中的优选片段包括含有一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或超过10个的127个氨基酸的重复单元的蛋白质。这样的片段可以由1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多的127个氨基酸的重复区的重复序列所组成，或者可以由在片段的任一末端或两个末端带有额外氨基酸残基的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多的重复序列所组成。另一种优选的片段是跨越三个重复序列(氨基酸 3202-3595)的大约 44kDa 的 H2 多妝，如 Clarke et al Infection and Immunity 70,6680-6687,2002中所描述的。这样的片段将优选能够结合纤连蛋白和/或引起针对整个Ebh蛋白质有活性的抗体。Ebh蛋白质能够结合纤连蛋白。这些多肽序列的优选片段保持了结合到纤连蛋白的能力。可通过由 Clarke et al (Infection and Immunity 70 ;6680_6687 2002)所描述的ELISA来评估对纤连蛋白的结合。还有另一种优选的片段是那些包含B细胞或T辅助细胞表位的片段，例如表3和4中描述的那些片段/肽。表2. Ebh全长序列中的重复序列。Ebh 全长序列披露于 Kuroda et al (2001) Lancet 357 ;1225_1240。下表显示了127个氨基酸的重复序列在全长序列中开始和结束位置的氨基酸残基。
权利要求
1.包含至少两种不同的蛋白或其免疫原性片段的免疫原性组合物，所述蛋白或其免疫原性片段选自以下至少两组蛋白或免疫原性片段 组a)至少一种葡萄球菌胞外成分结合蛋白或其免疫原性片段，其选自SdrG、层粘连蛋白受体、SitC/MntC/唾液结合蛋白、EbhA、EbhB、弹性蛋白结合蛋白(EbpS)、EFB(FIB)、SBI、IsaA/PisA、SsaA、EPB、SSP-l、SSP-2、HBP、玻连蛋白结合蛋白、纤维蛋白原结合蛋白、凝固酶、Fig和 MAP ； 组b)至少一种葡萄球菌转运蛋白或其免疫原性片段，其选自免疫优势的ABC转运蛋白、IsdA、IsdB、Mg2+转运蛋白、SitC和Ni ABC转运蛋白； 组c)至少一种葡萄球菌毒力调节剂、毒素或其免疫原性片段，其选自a毒素(Hla)、a毒素H35R突变体、RNA III活化蛋白(RAP)。
2.权利要求I的免疫原性组合物，其中至少一种蛋白或免疫原性片段选自组a)。
3.权利要求I或2的免疫原性组合物，其中至少一种蛋白或免疫原性片段选自组b)。
4.权利要求1-3的免疫原性组合物，其中至少一种蛋白或免疫原性片段选自组c)。
5.权利要求1-4的免疫原性组合物，其中至少一种蛋白或免疫原性片段选自组a)、组b)和组c)。
6 权利要求1-5的免疫原性组合物，包含至少一种来自金黄色葡萄球菌的蛋白或免疫原性片段。
7.权利要求1-6的免疫原性组合物，包含至少一种来自表皮葡萄球菌的蛋白或免疫原性片段。
8.权利要求1-7的免疫原性组合物，进一步包含PIA多糖或寡糖。
9.权利要求1-8的免疫原性组合物，进一步包含来自金黄色葡萄球菌的V型和/或VIII型荚膜多糖或寡糖。
10.权利要求1-9的免疫原性组合物，进一步包含来自表皮葡萄球菌的I型和/或II型和/或III型荚膜多糖或寡糖。
11.权利要求1-10的免疫原性组合物，进一步包含来自革兰氏阳性菌的脂磷壁酸。
12.权利要求11的免疫原性组合物，其中脂磷壁酸提取自葡萄球菌。
13.权利要求8-12的免疫原性组合物，其中葡萄球菌荚膜多糖缀合到蛋白质载体上。
14.权利要求11-13的免疫原性组合物，其中脂磷壁酸缀合到蛋白质载体上。
15.权利要求13-14的免疫原性组合物，其中蛋白载体选自破伤风类毒素、白喉类毒素、CRM197、流感嗜血杆菌蛋白D、肺炎球菌溶血素和a类毒素。
16.权利要求1-15的免疫原性组合物，其能够产生针对金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌两者的有效免疫应答。
17.包含权利要求1-16的免疫原性组合物和药学可接受赋形剂的疫苗。
18.制备疫苗的方法，包括混合抗原以制备权利要求1-16的免疫原性组合物的步骤以及加入药学可接受赋形剂的步骤。
19.预防或治疗葡萄球菌感染的方法,包括给予有此需要的患者权利要求17的疫苗的步骤。
20.权利要求1-16的免疫原性组合物在制备用于治疗或预防葡萄球菌感染的疫苗中的用途。
21.制备用于预防或治疗葡萄球菌感染的免疫球蛋白的方法，包括用权利要求17的疫苗免疫受体，并且从受体分离免疫球蛋白的步骤。
22.包含与权利要求1-16的任一项的免疫原性组合物的至少两种组分具有反应性的两种或更多种单克隆抗体或其片段的药物组合物，其中所述至少两种组分选自组a)、b)和c)的至少两个组。
23.包含权利要求22的免疫球蛋白和药学可接受赋形剂的药物组合物。
24.治疗或预防葡萄球菌感染的方法，包括给予患者有效量的权利要求22或23的药物组合物的步骤。
25.权利要求22或23的药物组合物在制备用于治疗或预防葡萄球菌感染的药物中的用途。
全文摘要
本发明涉及用于进行抗葡萄球菌接种的免疫原性组合物。具体地，涉及包含葡萄球菌抗原的混合物的免疫原性组合物，该混合物组合了具有不同功能的抗原，例如，包括葡萄球菌胞外成分结合蛋白和葡萄球菌转运蛋白或葡萄球菌胞外成分结合蛋白和葡萄球菌毒力调节剂或毒素或葡萄球菌转运蛋白和葡萄球菌毒力调节剂或毒素的组合。也描述了疫苗、治疗方法、用途和制备葡萄球菌疫苗的方法。
文档编号A61K39/085GK102657855SQ20121015426
公开日2012年9月12日 申请日期2005年9月20日 优先权日2004年9月22日
发明者C·A·尼特, C·卡斯塔多, J·普尔曼, N·P·F·勒克雷尼耶 申请人:葛兰素史密丝克莱恩生物有限公司