专利名称：一种鱼类虹彩病毒dna疫苗制备方法
一种鱼类虹彩病毒DNA疫苗制备方法技术领域
本发明属于生物医药领域，特别涉及一种水产养殖中DNA疫苗制备方法，具体的说是防治虹彩病毒的DNA疫苗制备方法。
背景技术：
本发明涉及编码和表达鱼虹彩病毒免疫原的载体构建，虹彩病毒是造成渔业生产中巨大损失的一种致病病毒，致死率高达60%以上。本专利涉及到生产和制备该疫苗的方法，也涉及到了虹彩病毒DNA疫苗的接种方法。
虹彩病毒主要感染无脊椎动物和低等脊椎动物，是大型20面体状DNA病毒， 分为虹彩病毒属(Iridovirus),绿虹彩病毒属(Chloriridovirus),淋巴囊肿病毒属 (Lymphocystivirus),娃病毒属(Ranavirus)和细胞肿大病毒属(Megalocytivirus)。在水产业中造成巨大损失的虹彩病毒有红鲷鱼虹彩病毒(red sea bream iridovirus)、台湾石斑鱼虹彩病毒(Taiwan Grouper iridovirus)、传染性脾肾坏死病毒(Infectious spleen and kidney necrosis virus)、大黄鱼虹彩病毒(Large yellow croaker iridovirus)和大菱鲆红体病虹彩病毒(Turbot reddish body iridovirus)。
病毒类疾病没有有效的药物来控制，接种疫苗预防是针对病毒类疾病的一种经济有效的手段。目前世界上应用的虹彩病毒疫苗只有日本鲷鱼虹彩病毒疫苗(Kazuhiro Nakajima etc, Effectiveness of a vaccine against red sea bream iridovirus disease in a field trial test, Dis Aquat Org, Vol. 36: 73-75，1999),其疫苗米用灭活方法制备。国内研发中的虹彩病毒疫苗也都采取灭活方法制备，病毒的培养使疫苗的生产成本非常昂贵，这限制了疫苗的推广。
主要衣壳蛋白是虹彩病毒的重要免疫原，ankyrin repeat containing protein 也有文献报道其具有免疫原性(Yun Im Kim etc, Production of polyclonal antibody against recombinant ORF 112L of rock bream iridovirus and in vitro neutralization)。
本发明为一种DNA疫苗,通过免疫接种，使鱼自身表达虹彩病毒major capsid protein和ankyrin repeats containing protein这两种病毒蛋白，通过抗原提呈，使鱼的免疫细胞产生针对这两种蛋白质的抗体，从而达到免疫保护的作用。发明内容
本发明的目的是构建一个DNA疫苗，通过接种，鱼类自身能够表达虹彩病毒的具有免疫原性的蛋白质，进而产生对虹彩病毒的抗体，保护鱼类免受虹彩病毒的侵害。
本发明提供的DNA疫苗，包括以下内容a)质粒构建 氨苄青霉素抗性筛选比较和原核复制起始位点取自质粒PBR322，NdeI和EcoRI酶切， Agrose 胶回收 2Kb 的片段；MCP 基因和 ankyrin repeats containing protein 基因为全基因合成，其前面加上真核启动子，后面加上终止子。基因拼接成一条片段，通过同源重组与质粒PBR322的ori和amp片段连接，转化大肠杆菌DH5a (图1)。挑选阳性克隆，DNA测序验证；b)以上构建的质粒和生理盐水、佐剂混合后，得到DNA疫苗。
以下结合
本发明的特征和有益效果。
图1是表达载体不意图。
该DNA疫苗与其他技术路线构建的疫苗相比具有如下优点a、生产成本低,适合大批量生产；DNA分子稳定,适合储藏和运输；b、安全，DNA疫苗表达的是一段病毒基因，不会发生病毒逆变；C、该DNA疫苗同时表达MCP和ankyrin repeats protein,它是一个两价疫苗，同时DNA 分子本身就可以作为佐剂，可以与生理盐水混合直接注射。
具体实施方式
实施例1 :DNA疫苗的制备载体构建全基因合成片段 Pcmv-MCP_SV40 pA-Pcmv-ankyrin repeats_SV40 pA, MCP 和 ankyrin repeats核苷酸序列见附件。此片段同质粒pBR322上的2k片段同源重组 (GBI)，反应体系为15ul GBclonart反应液；Iul pBR322片段；2ul全基因合成片段；2ul ddH20。50°C孵育30min后，取5ul转化大肠杆菌DH5a。氨苄青霉素LB固体平板筛选。测序验证正确克隆，500ml LB培养基扩大培养，大量抽提质粒备用。液体LB培养基的配方为 O. 5%的酵母提取液；1%的蛋白胨；1%的氯化钠，条pH值至7. 0,121°C，15分钟灭菌。固体 LB培养基为在液体LB培养基的基础上添加1. 5%的琼脂粉；DNA疫苗配方生理盐水配方为O. 65%的氯化钠溶解于蒸馏水，氯化钠的浓度可以使O. 5%到O. 9%之间。也可以是任氏生理盐水或者乐氏生理盐水。推荐DNA疫苗配方为=IugDNA溶解在Iul 生理盐水中。
实施例2 以大菱鲆为对象的注射给药免疫保护实验试验大菱鲆随机分为14组，每组3个水槽，10尾/槽。将制备的DNA疫苗采用肌肉注射方式免疫，注射量为Iug/尾和IOug/尾，对照为生理盐水。免疫4周后，用虹彩病毒攻毒 (105CFU/尾)。15天后观察死亡数，计算每组的免疫保护率(见表I)。
表 I
权利要求
1.一种虹彩病毒DNA疫苗制备方法，其特征在于，该DNA载体 a)含有编码和表达虹彩病毒衣壳蛋白(MCP)的基因； b)含有编码ankyrinrepeats基因； c)可以是同时含有衣壳蛋白和ankyrinrepeats两个基因的混合物。
2.如权利I所描述的DNA载体，载体上的免疫原性基因的启动子和增强子可以是常用的强启动子如Pcmv等，也可以是使真核细胞尤其是鱼类来源的组成型或者组织特异性的启动子，如ATP酶启动子、肌动蛋白启动子等。
3.如权利I和2所描述的DNA疫苗在制备养殖鱼类虹彩病毒防治中的应用。
4.如权利3所描述的应用，其特征在于，其中所说的制备是如权利I和2所描述的DNA载体、生理盐水和免疫佐剂。
5.如权利3所描述的应用，其特征在于，其中所制备的DNA疫苗通过注射方式给药，给药浓度为1-1Oug/尾。
6.如权利3所描述的应用，其特征在于，其中所制备的DNA疫苗通过浸泡给药，给药浓度为1-1Oug/尾。
全文摘要
本发明为一种鱼类虹彩病毒的DNA疫苗，它包含真核转录启动子、虹彩病毒主要衣壳蛋白(MCP)的基因、ankyrinrepeats基因和真核转录终止子，还包括用于扩增质粒的复制起始位点和抗性筛选标记(图1)。本发明涉及的DNA疫苗，推荐采用肌肉注射的方法，此外还可以采用口服和浸泡的方式免疫。
文档编号A61P31/20GK103041404SQ201210153708
公开日2013年4月17日 申请日期2012年5月17日 优先权日2012年5月17日
发明者李琦, 滕以刚 申请人:上海七海复泰生物科技有限公司