专利名称：一种基因和疏水药物共负载peg化纳米粒子的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种基因和疏水药物共负载PEG化纳米粒子的制备方法。它结合了基因治疗和化学治疗，属于基因治疗领域新型高效非病毒基因传递体系的制备方法和技术。
背景技术：
癌症(恶性肿瘤)由于缺乏有效治疗手段，已成为影响人类健康的重要疾病，每年直接用于肿瘤治疗的费用数以百亿计。癌症成为科学家尚未攻克的最顽固堡垒之一，也是当代科学研究最具有挑战性的课题之一。化学疗法是恶性肿瘤综合治疗的重要手段之一。但由于其药物用量大，缺乏专一性，使得在抑制癌组织的同时对正常人体细胞也造成严重的毒副作用，患者在治疗期间容易产生多重耐药性。因此，为减少抗癌药对人体正常细胞的毒副作用，寻找安全稳定的药物载体对化学疗法的进一步发展至关重要。基因治疗是将人的健康基因或有治疗作用的基因通过一定方式导入人体细胞，以纠正基因的缺陷或发挥治疗作用，从而治疗疾病的生物医学新技术。其关键是选择合适的基因载体及基因导入方法，使目的基因能够在靶细胞中获得安全、高效、可控且稳定的表达。聚阳离子由于具有制备简单、免疫原性低、载基因容量大等特点，成为基因治疗载体的主要发展方向之一。但这类聚阳离子/DNA组装体在体内容易发生聚集，而被网状内皮系统清除出体内，降低基因传递体系在体内的循环时间并影响基因转染效率。制备聚乙二醇(PEG)化的基因传递体系可有效解决上述问题。已有研究发现，将治疗基因与抗癌药物同时输送到肿瘤细胞中，构建高效安全的基因药物复合载体，达到基因疗法和化学疗法的协同作用，实现基因和抗癌药物的有效传递，有效解决癌细胞的多药耐药性，具有重要的科学和应用价值。因此通过￠-环糊精与二茂铁的主客体作用引入PEG链段，通过￠-环糊精与疏水药物的包结作用负载药物，可制备基因和疏水药物共负载PEG化纳米粒子，为采用化学药物与基因联合治疗恶性肿瘤提供了新的制备方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种基因和疏水药物共负载PEG化纳米粒子的制备方法。基因和疏水药物共负载PEG化纳米粒子的制备方法的步骤如下
1)配置浓度为0.5 4 mg/mL的P -环糊精修饰聚阳离子溶液；
2)配置浓度为0.5 4 mg/mL的二茂铁修饰聚乙二醇溶液；
3)将步骤I)和步骤2)溶液混合，使P-环糊精与二茂铁的摩尔比为4:1 2:1，超声30 min后静直；
4)配置浓度为2mg/mL的疏水药物溶液； 5)将步骤4)制备的疏水药物溶液滴加到步骤3)溶液中，使3-环糊精与疏水药物的摩尔比为1:1 1:4，避光搅拌24 h，透析8 24h，冻干，得到￠-环糊精修饰聚阳离子/二茂铁修饰聚乙二醇/疏水药物包合物粉末；6)配置浓度为0.05 I mg/mL的P -环糊精修饰聚阳离子/ 二茂铁修饰聚乙二醇/疏水药物包合物溶液；
7)配置浓度为75 100l^g/mL的DNA溶液；
8)将步骤6)溶液加入到等体积步骤7)溶液中，漩涡混合并静置30min，获得基因和疏水药物共负载PEG化纳米粒子。所述的0 -环糊精修饰聚阳离子包括P -环糊精修饰聚乙烯亚胺、P -环糊精修饰聚赖氨酸或3-环糊精修饰壳聚糖。所述的疏水药 物包括阿霉素或紫杉醇。本发明通过主客体作用制备基因和疏水药物共负载的PEG化纳米粒子，通过 环糊精与二茂铁的主客体作用引入PEG链段，通过￠-环糊精与疏水药物的包结作用负
载药物，为采用化学药物与基因联合治疗恶性肿瘤提供了新的制备方法。制备方法简单易操作，PEG化的程度、药物及基因的装载量易调节，显著提高了基因和疏水药物共负载纳米粒子在生理盐溶液中的稳定性。
图I为基因和疏水药物共负载PEG化纳米粒子与PEI-g-CD/DOX/ DNA组装体在生理盐溶液中放置不同时间的粒径变化；
图2为基因和疏水药物共负载PEG化纳米粒子在生理盐溶液放置Ih后的透射电镜照
片;
图3为基因和疏水药物共负载PEG化纳米粒子与PEI-g-CD/DNA组装体及PEI-g-CD/DOX/ DNA组装体的(-电位值；
图4为基因和疏水药物共负载PEG化纳米粒子的体外药物释放曲线。
具体实施例方式一种基因和疏水药物共负载PEG化纳米粒子的制备方法的步骤如下
1)配置浓度为0.5 4 mg/mL的P -环糊精修饰聚阳离子溶液；
2)配置浓度为0.5 4 mg/mL的二茂铁修饰聚乙二醇溶液；
3)将步骤I)和步骤2)溶液混合，使P-环糊精与二茂铁的摩尔比为4:1 2:1，超声30 min后静直；
4)配置浓度为2mg/mL的疏水药物溶液；
5)将步骤4)制备的疏水药物溶液滴加到步骤3)溶液中，使3-环糊精与疏水药物的摩尔比为1:1 1:4，避光搅拌24 h，透析8 24h，冻干，得到￠-环糊精修饰聚阳离子/二茂铁修饰聚乙二醇/疏水药物包合物粉末；
6)配置浓度为0.05 I mg/mL的P -环糊精修饰聚阳离子/ 二茂铁修饰聚乙二醇/疏水药物包合物溶液；
7)配置浓度为75 100l^g/mL的DNA溶液；
8)将步骤6)溶液加入到等体积步骤7)溶液中，漩涡混合并静置30min,获得基因和疏水药物共负载PEG化纳米粒子。所述的0 -环糊精修饰聚阳离子包括^ -环糊精修饰聚乙烯亚胺、0 -环糊精修饰聚赖氨酸或3 -环糊精修饰壳聚糖。所述的疏水药物包括阿霉素或紫杉醇。
实施例I :
配置浓度为4 mg/mL的P -环糊精修饰聚乙烯亚胺(PEI-g-⑶)溶液和浓度为4 mg/mL的二茂铁修饰聚乙二醇(PEG - Fe)溶液。将两种溶液按PEI-g-⑶中P -⑶与PEG-Fc的摩尔比为2:1的比例混合，超声30 min后静置待用。将2 mg/mL阿霉素(DOX)二甲基亚砜溶液滴加到上述的混合溶液中，使PEI-g-⑶中⑶与DOX的摩尔比为I: I的比例，避光搅拌24 h，再透析8 h 24 h，冻干，得到PEI-g-CD/PEG-Fc/DOX包合物粉末。按上述制备的PEI-g-CD/PEG-Fc/DOX包合物粉末，采用紫外-可见光分光光度计(UV)测定阿霉素(DOX)的载药量和包封率，测得载药量为9%，包封率为57%，说明3 -环糊精修饰聚乙烯亚胺可以有效包合疏水药物DOX。配置浓度为0. 5 mg/mL 的 PEI-g-CD/PEG-Fc/DOX 溶液和浓度为 75 l^g/mL 的 p53(抗癌基因)溶液。取上述的PEI-g-CD/PEG-Fc/DOX溶液与250ML DNA溶液等体积漩涡混合并静置30 min，制备得基因和疏水药物共负载PEG化纳米粒子。按上述制备的基因和疏水药物共负载PEG化纳米粒子，利用动态光散射(DLS)和透射电镜(TEM)研究共负载纳米粒子 在生理盐浓度下的稳定性，结果见图I、图2。图I为共负载纳米粒子与PEI-g-⑶/DOX/ DNA组装体在生理盐溶液中放置不同时间的粒径的变化情况，图2为共负载PEG化纳米粒子在生理盐溶液放置Ih后的透射电镜照片。实验结果表明共负载PEG化纳米粒子在生理盐溶液中较少聚集，稳定性较好。采用电位分析仪研究上述制备的基因和疏水药物共负载PEG化纳米粒子的表面电位，由于PEG链段的屏蔽作用和体积排斥作用，组装体的;-电位显著降低，见图3。实施例2:
配置浓度为2 mg/mL的P -环糊精修饰聚赖氨酸(PLL-g-⑶)溶液和浓度为2 mg/mL的二茂铁修饰聚乙二醇(PEG - Fe)溶液。将两种溶液按PLL-g-⑶中￠-⑶与PEG-Fc的摩尔比为3:1的比例混合，超声30 min后静置待用。将2 mg/mL紫杉醇(PTX)氯仿溶液滴加到上述的混合溶液中，使PLL-g-⑶中⑶与PTX的摩尔比为1:2的比例，避光搅拌24 h，再透析8 h^24 h，冻干，得到PLL-g-CD/PEG-Fc/PTX包合物粉末。配置浓度为0. 5 mg/mL的PLL-g-CD/PEG-Fc/PTX溶液和浓度为75 l^g/mL的pl6 (多肿瘤抑制因子I基因)溶液。取上述的PLL-g-CD/PEG-Fc/PTX溶液与250 ML DNA溶液等体积漩涡混合并静置30 min，制备得基因和疏水药物共负载PEG化纳米粒子。实施例3
配置浓度为0. 5 mg/mL的P -环糊精修饰壳聚糖(CS-g-⑶)溶液和浓度为I mg/mL的二茂铁修饰聚乙二醇(PEG - Fe)溶液。将两种溶液按CS-g-⑶中P -⑶与PEG-Fc的摩尔比为4:1的比例混合，超声30 min后静置待用。将2 mg/mL紫杉醇(PTX)氯仿溶液滴加到上述的混合溶液中，使CS-g-⑶中⑶与PTX的摩尔比为1:4的比例，避光搅拌24 h，再透析8 h^24 h，冻干，得到CS-g-CD/PEG-Fc/PTX包合物粉末。配置浓度为0. 5 mg/mL的CS-g-CD/PEG-Fc/PTX溶液和浓度为75 l^g/mL的p53溶液。取上述的CS-g-CD/PEG-Fc/PTX溶液与250 MLDNA溶液等体积漩涡混合并静置30 min，制备得基因和疏水药物共负载PEG化纳米粒子。实施例4:
配置浓度为I mg/mL的￠-环糊精修饰聚乙烯亚胺(PEI-g-⑶)溶液和浓度为0.5 mg/mL的二茂铁修饰聚乙二醇(PEG - Fe)溶液。将两种溶液按PEI-g-⑶中P -⑶与PEG-Fc的摩尔比为3:1的比例混合，超声30 min后静置待用。将2 mg/mL阿霉素(DOX)二甲基亚砜溶液滴加到上述的混合溶液中，使PEI-g-⑶中⑶与DOX的摩尔比为1:3的比例，避光搅拌24 h，再透析8 h 24 h，冻干，得到PEI-g-CD/PEG-Fc/DOX包合物粉末。配置浓度为I mg/mL的PEI-g-CD/PEG-Fc/DOX溶液和浓度为100 l^g/mL的pORF_hTRAIL (肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体质粒)溶液。取上述的PEI-g-CD/PEG-Fc/DOX溶液与3. 75 mL DNA溶液等体积漩涡混合并静置30 min,制备得基因和疏水药物共负载PEG化纳米粒子。
按上述制备的基因和疏水药物共负载PEG化纳米粒子，运用紫外-可见光分光光度计(UV)测定阿霉素(DOX)的释放曲线。将5 mL实施例4制备的共负载纳米粒子溶液加入到截留分子量为3500 Da的透析袋中，将透析袋置于10 mL PBS溶液中，然后于37°C恒温水浴、摇床震荡下透析。每隔一段时间，取出I mL透析液，并加入I mL新鲜的PBS溶液。通过检测释放溶液中DOX的紫外吸收值来计算DOX的释放量，结果如图4所示。实施例5:
配置浓度为I mg/mL的￠-环糊精修饰聚乙烯亚胺(PEI-g-⑶)溶液和浓度为2 mg/mL的二茂铁修饰聚乙二醇(PEG - Fe)溶液。将两种溶液按PEI-g-⑶中P -⑶与PEG-Fc的摩尔比为2:1的比例混合，超声30 min后静置待用。将2 mg/mL阿霉素(DOX)二甲基亚砜溶液滴加到上述的混合溶液中，使PEI-g-⑶中⑶与DOX的摩尔比为1:4的比例，避光搅拌24 h，再透析8 h 24 h，冻干，得到PEI-g-CD/PEG-Fc/DOX包合物粉末。按上述制备的PEI-g-CD/PEG-Fc/DOX包合物粉末，采用紫外-可见光分光光度计(UV)测定阿霉素(DOX)的载药量和包封率，测得载药量为5. 6%，包封率为48%。配置浓度为0. 05 mg/mL 的 PEI-g-CD/PEG-Fc/DOX 溶液和浓度为 100 l^g/mL 的含P53 (抗癌基因)的DNA溶液。取上述的PEI-g-CD/PEG-Fc/DOX溶液与24 ML DNA溶液等体积漩涡混合并静置30 min,制备得基因和疏水药物共负载PEG化纳米粒子。配置浓度为0. 05 mg/mL 的 PEI-g-CD/PEG-Fc/DOX 溶液和浓度为 100 l^g/mL 的含PEGFP (绿色荧光蛋白质粒，不含抗癌基因)的DNA溶液。取上述的PEI-g-CD/PEG-Fc/DOX溶液与24 m DNA溶液等体积漩涡混合并静置30 min，制备得基因和疏水药物共负载PEG化纳米粒子。按上述制备的基因和疏水药物共负载PEG化纳米粒子，采用MTT法，利用酶标仪进行细胞毒性动力学实验。将本发明实施例5制备的含两种不同质粒的基因和疏水药物共负载PEG化纳米粒子分别置于人肝癌细胞H印G2细胞中孵育48 h、72 h、96 h、144 h，然后于细胞培养液中加入5 mg/mL四唑盐(MTT)溶液，继续培养4 h，吸去原培养液，每孔加入200U LDMSO溶解结晶，最后于570 nm处用酶标仪测定每孔OD值，并算出不同浓度下的细胞活性。由结果可知，含有p53抗癌基因的共负载PEG化纳米粒子比不含抗癌基因共负载PEG化纳米粒子毒性大，说明P53抗癌基因与阿霉素共同作用，逐渐杀死HepG2细胞。
权利要求
1.一种基因和疏水药物共负载PEG化纳米粒子的制备方法，其特征在于它的步骤如下 1)配置浓度为0.5 4 mg/mL的P -环糊精修饰聚阳离子溶液； 2)配置浓度为0.5 4 mg/mL的二茂铁修饰聚乙二醇溶液； 3)将步骤I)和步骤2)溶液混合，使P-环糊精与二茂铁的摩尔比为4:1 2:1，超声30 min后静直； 4)配置浓度为2mg/mL的疏水药物溶液； 5)将步骤4)制备的疏水药物溶液滴加到步骤3)溶液中，使3-环糊精与疏水药物的摩尔比为1:1 1:4，避光搅拌24 h，透析8 24h，冻干，得到￠-环糊精修饰聚阳离子/二茂铁修饰聚乙二醇/疏水药物包合物粉末； 6)配置浓度为0.05 I mg/mL的P -环糊精修饰聚阳离子/ 二茂铁修饰聚乙二醇/疏水药物包合物溶液； 7)配置浓度为75 100l^g/mL的DNA溶液； 8)将步骤6)溶液加入到等体积步骤7)溶液中，漩涡混合并静置30min，获得基因和疏水药物共负载PEG化纳米粒子。
2.根据权利要求I所述的一种基因和疏水药物共负载PEG化纳米粒子的制备方法，其特征在于所述的P -环糊精修饰聚阳离子包括^ -环糊精修饰聚乙烯亚胺、P -环糊精修饰聚赖氨酸或3-环糊精修饰壳聚糖。
3.根据权利要求I所述的一种基因和疏水药物共负载PEG化纳米粒子的制备方法，其特征在于所述的疏水药物包括阿霉素或紫杉醇。
全文摘要
本发明公开了一种基因和疏水药物共负载PEG化纳米粒子的制备方法。它的步骤如下1)配置β-环糊精修饰聚阳离子溶液；2)配置二茂铁修饰聚乙二醇溶液；3)将步骤1)和步骤2)溶液混合，超声后静置；4)配置疏水药物溶液；5)将步骤4)制备的疏水药物溶液滴加到步骤3)溶液中，避光搅拌，透析，冻干，得到包合物粉末；6)配置包合物溶液；7)配置DNA溶液；8)将步骤6)溶液加入到等体积步骤7)溶液中，漩涡混合并静置，获得基因和疏水药物共负载PEG化纳米粒子。本发明通过主客体作用制备基因和疏水药物共负载的PEG化纳米粒子，制备方法简单易操作，显著提高了基因和疏水药物共负载纳米粒子在生理盐溶液中的稳定性。
文档编号A61K31/337GK102697732SQ20121015349
公开日2012年10月3日 申请日期2012年5月17日 优先权日2012年5月17日
发明者唐三, 李文宇, 王幽香, 陈丽娜 申请人:浙江大学