专利名称：乙型肝炎病毒siRNA表达载体的构建以及抗病毒治疗应用的制作方法
技术领域：
本发明属基因工程技术领域。
背景技术：
目前，乙型肝炎(HBV)抗病毒治疗方案还处于不断探索和实践的过程，已有的核苷类似物和干扰素均不能从根上解决抗病毒问题，因此迫切需要从全新的角度思考抗病毒治疗的措施。近年来基因阻断技术在基因功能研究中有很大进展，临床治疗研究也显示了良好的前景，为我们设计HBV抗病毒治疗方案提供了可借鉴的技术手段。目前通过寻找HBV病毒复制环节中关键的酶或RNA分子并加以阻断(knockdown)，进而达到抑制病毒复制的基因阻断技术，正成为众多学者关注的焦点。
RNA干扰(RNA interference，RNAi)是最近几年来发现和发展起来的新兴基因阻断技术。自RNAi现象报道以来，科学家对其作用机制进行了大量的研究，目前认为涉及包括Rnase III内切酶Dicer等多步骤过程，最终产生有活性的21-23nt小干扰性RNA(shortinterfering RNA，siRNA)，介导与其互补同源mRNA序列的特异性降解。其作用具有高效、特异的特点，比反义寡核苷酸抑制目的基因的效果更好。从目前的研究报道来看，RNAi技术现在主要用于基因功能和抗肿瘤研究，而抗病毒治疗研究才刚刚起步，但已显示了良好的前景和巨大潜力。
国内外有关RNAi抗病毒治疗的相关报道仅抗艾滋病毒(HIV)有4-5篇，从体外实验结果证实抑制作用特异、高效，但运用RNAi阻断技术设计针对HBV基因不同编码区的siRNA序列，进一步构建HBV siRNA表达载体，至今未见国内外相关报道。同时在体外HBV转染的HepG2细胞模型中运用微粒子酶免疫分析方法(MEIA)对HBV siRNA特异抑制病毒蛋白的分泌进行研究；运用Cy-3标记的抗体对转染细胞表达HBcAg和HBsAg进行免疫荧光染色，实现直观、定位观察，至今亦未见报道。因此，本技术的理论意义和实际意义都将是十分重大的。
发明内容
本发明的目的是为了设计针对HBV不同靶基因区siRNA序列，并以pTZU6+1为表达载体，构建一系列HBV siRNA重组体，在体外实验中系统研究其抑制HBV复制、转录的作用，为进一步在体内抗病毒研究打下良好的实验基础。
本发明包括三对HBV siRNA序列(HBV MS、HBV P、HBV C)的设计，序列详见“HBVsiRNA序列的设计和合成”部分。
本发明还包括独特的茎环结构HBV siRNA的设计，即正向和反向重复19nt单链DNA通过中间折叠结构的间隔，同时设计在一条核苷酸链上。
本发明还包括HBV siRNA表达载体pSIHBV MS、pSIHBV P、pSIHBV C的构建。
本发明还包括在体外HBV转染的HepG2细胞模型中运用微粒子酶免疫分析方法(MEIA)对HBV siRNA特异抑制病毒蛋白的分泌进行研究。
本发明还包括运用Cy-3标记的抗体对转染细胞表达HBcAg和HBsAg进行免疫荧光染色，实现直观、定位的观察。
本发明所构建的HBV siRNA表达载体经酶切鉴定、序列测定表明构建成功，在体外转染HBV的细胞模型中，通过免疫荧光和Abbott实验均证实能较为明显地抑制病毒复制和病毒抗原的表达。
图1是含独特茎环结构的HBV siRNA的设计2是pSIHBV表达载体的构建示意3是转染HBV的HepG2细胞中，免疫荧光结果显示HBV siRNA能抑制病毒抗原的表达。
A HepG2细胞HBcAg表达 B HepG2细胞HBsAg表达1 pHBV转染对照2 pHBV与pSIHBV共转染，质粒用量为1∶53 pHBV与pSIHBV共转染，质粒用量为1∶104 pHBV与pSIHBV共转染，质粒用量为1∶20
具体实施例方式本发明的目的可以通过以下措施来达到本发明根据siRNA的设计原则，分别选择HBV包膜蛋白(MS)编码区69nt-87nt，聚合酶(P)编码区708nt-726nt，核心蛋白(C)编码区2052nt-2070nt的核苷酸序列，设计相应的siRNA序列，用BLAST软件进行同源分析证实为HBV高度保守序列后，化学合成单链寡核苷酸，体外经退火形成双链DNA，与真核表达载体pTZU6+1连接，酶切鉴定和序列测定分析表明成功构建了三种靶向乙型肝炎病毒(HBV)基因序列的siRNA表达载体。上述表达载体通过阳离子脂质体介导与HBV真核表达载体pHBV共转染肝癌细胞HepG2后，采用免疫荧光和Abbott实验均证实HBV siRNA具有较强抑制病毒复制和表达的作用。具体
HBV-MS siRNA上游序列5’-TCGAGCTCCAGTTCAGGAACAGTATTCGTACTGTTCCTGAACTGGAGTTTTT-3’下游序列5’-CTAGAAAAACTCCAGTTCAGGAACAGTACGAATACTGTTCCTGAACTGGAGC-3’HBV-C siRNA上游序列5’-TCGAGTCACCATACTGCACTCAGGTTCGCCTGAGTGCAGTATGGTGATTTTT-3’下游序列5’-CTAGAAAAATCACCATACTGCACTCAGGCGAACCTGAGTGCAGTATGGTGAC-3’HBV-P siRNA上游序列5’-TCGAGGCCAAGTCTGTACAGCATCTTCGGATGCTGTACAGACTTGGCTTTTT-3’下游序列5’-CTAGAAAAAGCCAAGTCTGTACAGCATCCGAAGATGCTGTACAGACTTGGCC-3’上述序列用BLAST软件进行同源分析证实为HBV高度保守后，采用化学合成方法合成单链寡核苷酸。
2.DNA片段退火变为双链取等量100mmol/L的DNA合成片段，在退火缓冲液(100mmol/L NaCl)中于95℃保温5min后，缓慢降至室温，然后用DNA纯化试剂盒进行纯化。
3.构建pSIHBV表达载体将纯化的DNA片段分别与Sal I和Xba I双酶切的转录载体pTZU6+1进行连接，转化JM109大肠杆菌，经Amp抗性筛选，用Sal I或Hind III和EcoR I酶切鉴定，分别筛选出含HBV MS、HBV C、HBV P目的基因的阳性克隆，并进行DNA序列分析加以确定。
4.pSIHBV体外对HBV复制的抑制作用将pHBV与三种不同的pSIHBV按照不同的比例共转染HepG2细胞，同时设仅含随机序列的pSI对照。转染后48小时收集细胞，用4％多聚甲醛固定15分钟，采用免疫荧光法对转染细胞表达HBcAg和HBsAg进行观察。结果显示随着pSIHBV比例升高，对病毒复制的抑制作用也随之增加，当两者比例为1∶20时，红色荧光标记的病毒抗原检出最少，siRNA对照组中抗原表达阳性细胞未减少，证明了HBV siRNA对HBV基因有明显的抑制作用，同时也证明了其抑制作用具有高度的序列特异性。
随后用Abbott试剂检测了转染细胞上清中HBsAg和HBeAg的表达水平，每一样品均做3个复孔。实验结果表明转染后48小时pHBV与pSIHBV共转染组HBsAg为2.87±0.05，pSI对照组为12.86±0.10；72小时pHBV与pSIHBV共转染组HBsAg为4.94±1.12，pSI对照组为22.89±1.49，两组比较有显著性差异(p＜0.01)。转染后48小时pHBV与pSIHBV共转染组HBeAg为1.48±0.08，pSI对照组为4.13±0.25；72小时pHBV与pSIHBV共转染组HBeAg为2.44±0.32，pSI对照组为3.72±0.03，两组比较也有显著性差异(p＜0.05)。实验再次证实HBV siRNA对HBV的抑制作用具有高效、特异的特点。
在本发明中，运用分子生物学相关技术，设计了三对HBV siRNA序列并成功构建了pSIHBV表达载体，在进一步的体外实验研究中，运用免疫荧光方法和Abbott实验初步显示了具有较强、特异的抗病毒效应。
本发明的优点在于(1).本发明设计了独特的、具有茎环结构的HBV siRNA，即同一条siRNA序列包含了siRNA折叠体的两条互补链。从5’端开始先为siRNA作用链序列(即对应目的基因序列的互补序列)，长度为19nt，中间以4nt的TTCG间隔形成发夹结构，最后为siRNA作用链的反向重复序列。
(2).本发明采用了pTZU6+1表达载体，该载体含RNA pol III启动子U6，能介导HBVsiRNA在体内的正确转录并根据目的序列的TTTTT末端适时终止，尤其适合靶基因siRNA在体内表达的需要，克服了以往siRNA体外合成耗时、昂贵的缺点，使siRNA的构建更加简捷、快速，也为今后siRNA在功能基因和抗病毒基因治疗上的研究领域更为广阔打下良好的基础。
(3).将上述表达载体与HBV真核表达质粒pHBV共转染HepG2细胞，采用Abbott试剂检测转染细胞上清中HBsAg和HBcAg的表达，通过微粒子酶免疫分析方法(MEIA)对病毒不同靶区siRNA特异抑制病毒蛋白的分泌进行了深入、细致的研究。
(4).在体外实验研究中，采用了新一代的免疫荧光标记物Cy3标记的二抗对转染细胞表达HBcAg和HBsAg进行免疫荧光染色，由于Cy3在荧光显微镜下激发为鲜亮的红色荧光，尤其适合细胞内抗原量较少的检出，信噪比大大增加，实现了对目标抗原的直观、定位观察，显然比普通的DAB法更灵敏、更有说服力。
权利要求
1.构建三种靶向乙型肝炎病毒(HBV)基因序列的siRNA表达载体，其特征在于本发明在构建针对HBV基因的siRNA表达载体时，根据siRNA的设计原则，分别选择HBV包膜蛋白(MS)编码区69nt-87nt，聚合酶(P)编码区708nt-726nt，核心蛋白(C)编码区2052nt-2070nt的核苷酸序列，设计相应的siRNA序列，用BLAST软件进行同源分析证实为HBV高度保守序列后，化学合成单链寡核苷酸，体外经退火形成双链DNA，与真核表达载体pTZU6+1连接，酶切鉴定和序列测定分析表明成功构建了三种靶向乙型肝炎病毒(HBV)基因序列的siRNA表达载体。
2.根据权利要求1所述的HBV siRNA表达载体构建方法，其特征在于设计的三对HBV siRNA序列HBV-MS siRNA上游序列5’-TCGAGCTCCAGTTCAGGAACAGTATTCGTACTGTTCCTGAACTGGAGTTTTT-3’下游序列5’-CTAGAAAAACTCCAGTTCAGGAACAGTACGAATACTGTTCCTGAACTGGAGC-3’HBV-C siRNA上游序列5’-TCGAGTCACCATACTGCACTCAGGTTCGCCTGAGTGCAGTATGGTGATTTTT-3’下游序列5’-CTAGAAAAATCACCATACTGCACTCAGGCGAACCTGAGTGCAGTATGGTGAC-3’HBV-P siRNA上游序列5’-TCGAGGCCAAGTCTGTACAGCATCTTCGGATGCTGTACAGACTTGGCTTTTT-3’下游序列5’-CTAGAAAAAGCCAAGTCTGTACAGCATCCGAAGATGCTGTACAGACTTGGCC-3’
3.根据权利要求1所述的HBV siRNA表达载体构建方法，其特征在于设计的任何一条siRNA序列能形成发夹结构的RNA，即同一条siRNA序列包含了siRNA折叠体的两条互补链。从5’端开始先为siRNA作用链序列(即对应目的基因序列的互补序列)，长度为19nt，中间以4nt的TTCG间隔形成发夹结构，最后为siRNA作用链的反向重复序列。
4.根据权利要求1所述的HBV siRNA表达载体构建方法，其特征在于采用了pTZU6+1表达载体，该载体含RNA pol III启动子U6，能介导HBV siRNA在体内的正确转录并根据目的序列的TTTTT末端适时终止，尤其适合靶基因siRNA在体内表达的需要，克服了以往siRNA体外合成耗时、昂贵的缺点，使siRNA在功能基因和抗病毒基因治疗上的研究领域更为广阔。
5.根据权利要求1所述的HBV siRNA表达载体构建方法，其特征还在于重组质粒与空载体的酶切鉴定方法。因为含HBV siRNA的pTZU6+1载体仅比空质粒多52bp，通过DNA电泳比较分子量大小来筛选重组子显然较为困难。我们根据pTZU6+1带有Sal I与Xba I酶切位点，同时Xho I与Sal I识别的DNA序列相同，Xho I酶切后的粘端与SalI酶切位点匹配的特征，在设计每一条siRNA序列时，分别在5’端加入Xho I、3，端加入Xba I识别序列，并与pTZU6+1的Sal I与Xba I酶切片段连接，含HBV siRNA的重组载体Sal I和Xho I酶切位点均丢失，不能被上述酶酶切，因此通过简单的酶切反应就可以快速筛选重组菌落。
6.上述表达载体与HBV真核表达质粒p-HBV共转染HepG2细胞，采用Abbott试剂检测转染细胞上清中HBsAg和HBcAg的表达，其特征在于通过微粒子酶免疫分析方法(MEIA)对病毒不同靶区siRNA特异抑制病毒蛋白的分泌进行深入、细致的研究。
7.采用Cy3-标记的抗体对HBVV转染细胞表达HBcAg和HBsAg进行免疫荧光观察，并为HBV siRNA体外抑制病毒抗原的合成提供实时、直观的证据。
8.根据目前国外有关siRNA抗HIV的研究报道及我们的体外初步实验结果证实这种HBV siRNA的特征在于能特异地抑制HBV的复制和转录，为进一步进行siRNA抗HBV的体内实验打下了良好的基础，可望作为一种新型抗病毒基因疗法运用到临床治疗中。
全文摘要
乙型肝炎病毒siRNA表达载体的构建以及抗病毒治疗应用，本发明属基因工程技术领域。本发明根据siRNA的设计原则，分别选择HBV包膜蛋白(MS)编码区69nt－87nt，聚合酶(P)编码区708nt－726nt，核心蛋白(C)编码区2052nt－2070nt的核苷酸序列，设计相应的siRNA序列，用BLAST软件进行同源分析证实为HBV高度保守序列后，化学合成单链寡核苷酸，体外经退火形成双链DNA，与真核表达载体pTZU6+1连接，酶切鉴定和序列测定分析表明成功构建了三种靶向乙型肝炎病毒(HBV)基因序列的siRNA表达载体。上述表达载体通过阳离子脂质体介导与HBV真核表达载体pHBV共转染肝癌细胞HepG
文档编号C12N15/86GK1523113SQ03117329
公开日2004年8月25日 申请日期2003年2月20日 优先权日2003年2月20日
发明者黄爱龙, 唐霓, 张秉强, 阎歌 申请人:重庆医科大学