专利名称：使用糖蛋白g2肽的hsv－2型特异性免疫测试的制作方法
背景技术：
生殖器疱疹，由感染单纯疱疹病毒2型(HSV-2)引起，是人类最常见的性传播疾病。美国成年人中当前HSV-2感染的患病率高于20％(Ashley and Wald，Clin.Microbiol.Rev.121-8，1999)。由于其发病率、复发率及分娩期传播后感染该病毒的新生儿情况下威胁生命的严重性，这种疾病是公共健康的一大忧患。
然而，由于存在HSV-2抗体对单纯疱疹病毒1型(HSV-1)的广泛的交叉反应，HSV-2感染的血清学诊断已经遇到阻碍。HSV的这两种亚型在流行病学和自然史上都有重要差异HSV-1通常引起口唇疾病，而HSV-2几乎总导致生殖器疾病。HSV流行病学及诊断的一般性综述参见Brugha et al.，Int.J.Epidemiol.26698-709，1997；Ashley and Wald，同上。
为了鉴定HSV-2特异性抗体，已发展了多种方法。至今，型特异性检测HSV-2抗体的最可靠方法是免疫印迹测试，特别是Western印迹测试。这一方法的显著缺点是操作劳动强度大，而且要求检测者具有一定水平的技巧以获得明确的结果。在过去十年左右，几种HSV糖蛋白已经被鉴定为包含型特异性表位的病毒蛋白，基于这些糖蛋白已经开发了型特异性确定HSV-2感染的免疫测试。，例如，参见Lee et al.，J.Clin.Microbiol.22641-644(1985)；Eis-Hubinger et al.，J.Clin.Microbiol.371242-1246(1999)；Groen et al.，J.Clin.Mierobiol.36845-847(1998)；Ashley et al.，J.Clin.Microbiol.36294-295(1998)；Hashido et al.，J.Med.Virol.53319-323(1997)；and U.S.Patent No.4,764,459。
虽然这些方法显示出不同程度的灵敏度和特异性，这些基于糖蛋白的免疫测试进行HSV-2抗体型特异性检测存在一个相关的共同问题。全长的糖蛋白可通过分离天然病毒蛋白或重组表达蛋白而获得。这些操作可能成本昂贵并且易受杂质以及相应的交叉反应性影响。
研究证明，对应某些HSV-2病毒蛋白部分序列的肽可用于HSV-2型特异性检测，因为这些肽可以代表一些HSV-2特异性表位。参见，例如Levi et al.，Clin.Diagn.Lab.Immuno1.3265-269(1996)；Ackermann et al.，J.Med.Virol.55281-287(1998)；Marsden et al.，J.Med.Virol.5679-84(1998)；Lijeqvist et al.，J.Gen.Virol.791215-1224(1998)；Grabowska et al.，J.Gen.Virol.801789-1798(1999)；U.S.Patent No.5,919,616和5,965,357。本发明提供HSV-2糖蛋白G2的一种新的肽序列，这一序列可以用于HSV-2型特异性诊断。
本说明书中引用的所有公开文献和专利经引用并入本文。
发明内容
在一方面，本发明涉及一种含肽的组合物，所述肽特异性结合至HSV-2抗体、并最小程度地与HSV-1特异性抗体或任何其它疱疹科病毒的抗体反应。这种肽由SEQ ID NO1中24-36个连续氨基酸组成。在一个优选的实施方案中，这种肽由SEQID NO1中5-32位氨基酸组成。在更优选的实施方案中，这种肽具有由SEQ ID NO1中9-32位氨基酸组成的序列。在一个最优选的实施方案中，这种肽具有SEQ ID NO1的一种氨基酸序列。
一些实施方案中，这种肽被二聚化。这种二聚化可通过二硫键实现。在其它实施方案中，这种肽连接于载体。适合载体的实例是羧化微球，优选羧化乳胶或磁性微球。
一些实施方案中，这种肽通过其N-末端或C-末端的连接子连接于载体。而在另一些实施方案中，这种肽通过在其内部氨基酸残基处的连接子连接于载体。一些情况下，这种连接子是或包括异源肽。另一些情况下，这种连接子是或包括异源蛋白质。在另一些情况下，异源肽和异源蛋白都被使用。在一些其它实施方案中，整个连接子为异源肽。在一种优选的实施方案中，异源蛋白是牛血清白蛋白(BSA)，而另一种优选实施方案中，异源蛋白是钥孔帽贝血蓝蛋白(KLH)。一些实施方案中，异源肽包括一个半胱氨酸残基、一个赖氨酸残基、和至少两个甘氨酸残基。在一些其它实施方案中，连接子包括带分支的氨基酸聚合物，其结构优选如下所示
在一个优选的实施方案中，这种肽具有SEQ ID NO1的氨基酸序列，载体是羧化磁性微球，连接子包括4-马来酰亚胺甲基-1-环己基羰酸(SMCC)和具有GGCK氨基酸序列的异源肽，这种异源肽连接至该肽C-末端处的肽。在另一些优选的实施方案中，连接子还包括直接连接至载体的异源蛋白BSA，SMCC连接至BSA，并通过这种异源肽，连接至该肽。
在另一个优选的实施方案中，此肽具有由SEQ ID NO1第5-32位氨基酸组成的氨基酸序列，载体是羧化磁性微球，连接子包括SMCC和具有GGGGCK氨基酸序列的异源肽，这种异源肽连接至此肽C-末端处的肽。在另一些优选的实施方案中，连接子还包括直接连接至载体的异源蛋白BSA，SMCC连接于BSA并通过这种异源肽连接至此肽。
在另一个优选的实施方案中，此肽含有包括SEQIDNO1第9-32位氨基酸的氨基酸序列，载体是羧化磁性微球，连接子包括SMCC和含有GGGGCK氨基酸序列的异源肽，这种异源肽连接于此肽的C-末端。在其它优选的实施方案中，连接子还包括直接连接至载体的异源蛋白BSA，SMCC连接于BSA，通过这种异源肽；连接于此肽。
在另一个优选的实施方案中，此肽具有由SEQ ID NO1第9-32位氨基酸组成的氨基酸序列，载体是羧化磁性微球，连接子包括SMCC和具有KCGGGG氨基酸序列的异源肽，并且这种异源肽连接至此肽N-末端的肽。在另一些优选的实施方案中，连接子还包括直接连接至载体的异源蛋白BSA，SMCC连接至BSA并通过这种异源肽连接至此肽。
在一个进一步优选的实施方案中，此肽具有由SEQ ID NO1第9-32位氨基酸组成的氨基酸序列，载体是羧化磁性微球，连接子包括具有如下结构的具分支氨基酸聚合物，还包括CK短肽，其通过C残基直接连接至该结构最后的K残基。
在另一方面，本发明涉及型特异性诊断HSV-2感染的方法。这种特异性检测生物样品中HSV-2抗体的方法包括两个步骤。第一步是将生物样品与一种组合物接触，所述组合物包括连接至载体的由SEQ ID NO1的24-36个连续氨基酸组成的肽。第二步是检测在此肽与生物样品的抗体成分之间是否已经发生了抗原抗体结合。在这一步中，检测到抗原抗体结合表明生物样品中存在HSV-2抗体。在一些优选的实施方案中，第二步通过流式细胞术进行。还优选生物样品是全血、血清、血浆、脑脊液、刮拭取样的组织或水泡液(vesicle fluid)。
在一个优选的实施方案中，此肽具有由SEQ ID NO1第5-32位氨基酸组成的氨基酸序列。在一个更优选的实施方案中，此肽具有由SEQ ID NO1第9-32位氨基酸组成的氨基酸序列。在一个最优选的实施方案中，此肽具有SEQ ID NO1的一种氨基酸序列。
在一些实施方案中，这种肽被二聚化。这种二聚化可通过二硫键实现。在其它一些实施方案中，此肽连接于羧化微球，优选的是羧基化乳胶或磁性微球。
在一些实施方案中，这种肽通过其N-末端或C-末端的连接子连接至载体。而在另一些实施方案中，这种肽通过其内部氨基酸残基处的连接子连接至载体。在一些实施方案中，这种连接子包括异源肽。在另外一些实施方案中，这种连接子包括异源蛋白。在一些另外的实施方案中，连接至包括异源肽还包括异源蛋白。在一些其它实施方案中，连接子为异源肽。在一种优选的实施方案中，异源蛋白是BSA，而在另一种优选的实施方案中，异源蛋白是KLH。在一些实施方案中，异源肽包括一个半胱氨酸残基、一个赖氨酸残基和至少两个甘氨酸残基。在一些其它实施方案中，连接子包括具分支的氨基酸聚合物，其结构优选如下所示
在一个优选的实施方案中，这种肽具有SEQID NO1的氨基酸序列，载体是羧化磁性微球，连接子包括SMCC和具有GGCK氨基酸序列的异源肽，这种异源肽连接至此肽C-末端处的肽，并通过流式细胞术检测抗原抗体结合。在另一些优选的实施方案中，连接子还包括直接连接至载体的异源蛋白BSA，SMCC连接至BSA并经这种异源肽连接至此肽。
在另一个优选的实施方案中，此肽具有由SEQ ID NO1第5-32位氨基酸组成的氨基酸序列，载体是羧化磁性微球，连接子包括SMCC和具有GGGGCK氨基酸序列的异源肽，这种异源肽连接至此肽C-末端处的肽，并经流式细胞术检测抗原抗体结合。在另一些优选的实施方案中，连接子还包括直接连接至载体的异源蛋白BSA，SMCC连接至BSA并经这种异源肽连接至此肽。
在另一个优选的实施方案中，此肽具有由SEQ ID NO1第9-32位氨基酸组成的氨基酸序列，载体是羧化磁性微球，连接子包括SMCC和具有GGGGCK氨基酸序列的异源肽，这种异源肽连接至此肽C-末端处的肽，并经流式细胞术检测抗原抗体结合。在另一些优选的实施方案中，连接子还包括直接连接至载体的异源蛋白BSA，SMCC连接至BSA并经这种异源肽连接至此肽。
在另一个优选的实施方案中，此肽具有由SEQ ID NO1第9-32位氨基酸组成的氨基酸序列，载体是羧化磁性微球，连接子包括SMCC和具有KCGGGG氨基酸序列的异源肽，这种异源肽连接至此肽N-末端处的肽。在另一些优选的实施方案中，连接子还包括直接连接至载体的异源蛋白BSA，SMCC连接至BSA并经这种异源肽连接至此肽。
在一个进一步优选的实施方案中，此肽具有由SEQ ID NO1第9-32位氨基酸组成的氨基酸序列，载体是羧化微球，连接子包括具有以下结构的具分支氨基酸聚合物，并进一步包括短肽CK，其经过C残基直接连接至该结构末端的K残基
图1所示为SEQ ID NO1，1PGSPAPPPPEHRGGPEEFEGAGDGEPPEDDDSATGL36图2所示为使用商业HSV-2型特异性酶联免疫测试与使用本发明的方法检测HSV-2特异性抗体的相关性，其中本发明方法使用肽1-SMCC-BSA偶联物，(PGSPAPPPPEHRGGPEEFEGAGDGEPPEDDDSATGLGGCK)-SMCC-BSA，作为HSV-2特异性抗原。
图3所示为使用商业HSV-2型特异性酶联免疫测试与使用本发明的方法检测HSV-2特异性抗体的相关性，其中本发明方法使用肽2-SMCC-BSA偶联物，(APPPPEHRGGPEEFEGAGDGEPPEDDDSGGGGCK)-SMCC-BSA.，作为HSV-2特异性抗原。
图4所示为使用商业HSV-2型特异性酶联免疫测试与使用本发明的方法检测HSV-2特异性抗体的相关性，其中本发明方法使用BSA-SMCC-肽5偶联物，BSA-SMCC-(KCGGGGPEHRGGPEEFEGAGDGEPPEDDDS).，作为HSV-2特异性抗原。
图5所示为使用商业HSV-2型特异性酶联免疫测试与使用本发明的方法检测HSV-2特异性抗体的相关性，其中本发明方法使用肽5，KCGGGGPEHRGGPEEFEGAGDGEPPEDDDS.，作为HSV-2特异性抗原。
具体实施例方式
I.概述本发明涉及由HSV-2糖蛋白G2的部分序列组成并代表HSV-2型特异性表位的肽。实验显示由SEQ ID NO1的24-36个连续氨基酸组成的HSV-2肽与HSV-2抗体以高特异性及灵敏度相结合，而它们与HSV-1抗体的交叉反应最小。因此这些肽可用于型特异性血清学诊断HSV-2感染，特别是用于区分HSV-1感染与HSV-2感染。
也可提供含有本发明肽的组合物用于HSV-2感染的型特异性血清学诊断。在优选的实施方案中，本发明的肽通过连接子连接至载体如羧化乳胶或磁性微球，这些连接子包括异源肽和/或蛋白，如牛血清白蛋白(BSA)和匙孔帽贝血蓝蛋白(KLH)。其它连接子，如具分支的氨基酸聚合物、直链或支链碳连接子、杂环碳连接子(如SMCC)或聚醚连接子，也可用于实施本发明。本发明的HSV-2肽可以在N-或C-末端或通过内部氨基酸残基，偶联于载体。
另外，提供了使用这些肽用于型特异性检测HSV-2抗体的方法。在优选的实施方案中，HSV-2特异性抗体的检测用流式细胞术进行。
II.定义术语“氨基酸”指天然的或合成的氨基酸，及作用方式类似于天然氨基酸的氨基酸类似物或模拟物。天然氨基酸是指由遗传密码编码的氨基酸、以及后来被加工的氨基酸，如羟脯氨酸、γ-羧基谷氨酸、和O-磷酸丝氨酸。术语“氨基酸类似物”指与天然氨基酸有相同的基本化学结构的化合物，即与氢、羧基、氨基和R基结合的α碳，如高丝氨酸、正亮氨酸，甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸甲基锍。这些类似物具有修饰的R基(如正亮氨酸)或修饰的肽骨架，但保留了与天然氨基酸相同的基本化学结构。“氨基酸模拟物”指具有与氨基酸一般化学结构不同的结构、但作用方式类似于天然氨基酸的化合物。
氨基酸在此可使用公知的三字母符号或单字母符号表示，这由IUPAC-IUB生物化学命名委员会推荐。
术语“多肽”、“肽”及“蛋白质”在本文可互换使用，指氨基酸残基的聚合物。该术语应用于这样的氨基酸聚合物，其中其中一个或多个氨基酸残基是相应天然氨基酸的人工化学模拟物，以及天然氨基酸聚合物以及非天然氨基酸聚合物。如本文所用，该术语包括任何长度的氨基酸链，包括氨基酸残基通过共价键连接的全长蛋白。本申请使用的HSV-2肽指具有与HSV-2糖蛋白G2片段对应的序列的肽。
本文所用的“载体”表示天然材料或合成材料的惰性固体支持物，所述天然材料如玻璃和胶原，所述合成材料如丙烯酰胺、纤维素、硝酸纤维素、硅酮橡胶、聚苯乙烯、聚乙烯醋酸乙烯酯、聚丙烯、聚甲基丙烯酸酯、聚乙烯、聚硅酸盐、聚氧乙烯、聚碳酸酯、聚四氟乙烯树脂、特富龙(teflon)、氟碳化合物、尼龙、聚酐、聚乙醇酸、聚乳酸、聚原酸酯、聚丙基富马酸酯、糖胺聚糖、和聚氨基酸。常见的，一些天然存在于载体表面的功能基如羧基(-COOH)、游离氨基(-NH2)和巯基(-SH)可用于肽连接。在没有这样的天然功能基可用时，可在这种固体支持物上连接期望的功能基如羧酸基团、或已知是结合相互作用伴侣的结构(如能结合生物素的亲合素)。本发明优选的载体是羧化乳胶或磁性微球。
本文所用的“连接子”指连接本发明的肽至载体的任何方式。连接子可以位于此肽的N-末端或C-末端。在一些实施方案中，连接可以通过此肽内部氨基酸残基的侧基实现，如不在肽的N-或C-末端的天冬氨酸残基的第二个羧基。连接子可包含与本发明肽异源的肽(如短氨基酸序列GGGGCK或GGCK)或蛋白质(如BSA或KLH)。除了异源性肽以外，连接子还可含有异源蛋白如BSA或KLH。非多肽连接子，如直链或支链碳连接子、杂环碳连接子或聚醚连接子，也可以适用于将本发明的肽连接至载体的目的、或作为多组分连接子的一部分。一种优选的非多肽连接子是SMCC。此外，连接子可以包含具分支的氨基酸聚合物，它能将超过一个本发明肽连接至载体上。异双功能和单双功能连接子都适用于实施本发明。当本发明的肽直接连接于载体时，连接子也可以包含共价键如肽键或二硫键、或非共价键如离子键或氢键。非共价键的实例是抗原-抗体或生物素-亲合素之间的相互作用。
术语“异源的”用于描述作为连接子或连接子组分的肽或蛋白质时，指肽连接子或蛋白质连接子及经连接子连接至载体的本发明肽，被发现彼此之间在本质上没有相同的关系。也就是说，肽连接子和/或蛋白质连接子以及本发明的肽，当它们以本发明的任何具体实施方案偶联时，都不会产生天然存在的氨基酸序列。例如，本发明的肽来源于HSV-2糖蛋白G2，异源肽或蛋白质因此不来源于与从中衍生本发明肽的序列相邻的、HSV-2糖蛋白G2的任何序列。
本文所用“特异性检测”是指这种事实，检测到结合于本发明肽的任何抗体是存在HSV-2抗体的决定性因素，这经常是指在其它抗体和蛋白质的非均一群体中存在HSV-2抗体。特别的，存在HSV-1抗体将不导致可检测量的抗体与此肽结合。因此，术语“特异性检测”特别包括使用本发明的HSV-2肽区分HSV-2感染与HSV-1感染。在规定的免疫测试条件下，可检测信号规定至少是背景信号的两倍，优选超过背景信号10倍，更优选超过100倍。
术语“二聚化”或“二聚体”当用来描述本发明的肽时，指由包含相同肽的两个分子经共价键如二硫键或非共价键而形成的复合物，所述非共价键如经已知标签和标签结合伴侣之间的结合相互作用(如生物素和亲合素)。共价键或非共价键典型地存在于两个含肽分子的连接子部分之间。
术语“内部氨基酸残基”在这里表示不是本发明HSV-2肽中N-端或C-端第一个残基的任何氨基酸残基。
术语“生物样品”指组织如活组织和尸体样品的切片，及用于组织学目的的冰冻切片。这些样品可以包括全血、血清、血浆、脑脊液、唾液、组织、培养细胞如原代培养，外植体、转化细胞，粪便、尿液、水泡液、粘液及其它身体分泌物，或能用刮拭装置取样的组织。生物样品通常取自可能已感染HSV-2的患者。
术语“抗体”是指免疫球蛋白家族的蛋白质，或包括免疫球蛋白片段的多肽，所述片段能非共价、可逆和特异性地结合相应抗原。示例性的抗体结构单元包括四聚体。每个四聚体由两个相同的多肽链对组成，每一对具有一个“轻链”(约25KD)和一个“重链”(约50-70KD)，以一个或多个二硫键相连。已识别的免疫球蛋白基因包括κ、λ、α、γ、δ、ε和μ恒定区基因、和数量巨大的免疫球蛋白可变区基因。轻链分为κ或λ，重链分为γ、μ、α、δ或ε，据此将免疫球蛋白分类为IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。每条链的N末端确定约100-110或更多氨基酸的可变区，该区域主要负责抗原识别。术语“可变轻链(VL)”和“可变重链(VH)”分别指轻链和重链的这些区域。
术语“互补性决定结构域”或“CDR”指VL和VH的超变区。CDR是抗体链的靶蛋白结合位点，具有对该靶蛋白的特异性。在每个人VL和VH中有3个CDR(CDR1-3，从N-末端顺序计数)，构成可变结构域的约15-20％。CDR与靶蛋白的表位在结构上互补，因此直接负责结合特异性。VL和VH的剩余区域，即所谓的框架区，其氨基酸序列显示较少的变异性(Kuby，Immunology，4th ed.，Chapter 4，W.H.Freeman & Co.，New York，2000)。
CDR和骨架区的位置可使用本领域多种公知定义来确定。如Kabat，Chothia，International ImMunoGeneTics database(IMGT)，和AbM(见Johnson et al.，NucleicAcids Res.，29205-206(2001)；Chothia and Lesk，J.Mol.Biol.，196901-917(1987)；Chothia et al.，Nature，342877-883(1989)；Chothia et al.，J.Mol.Biol.，227799-817(1992)；Al-Lazikani et al.，J.Mol.Biol.，273927-748(1997))。抗原结合位点的定义在下列文献中也被描述Ruiz et al.，Nucleic Acids Res.，28219-221(2000)；and Lefranc，M.P.，Nucleic Acids Res.，29207-209(2001)；MacCallum et al.，J.Mol.Biol，262732-745(1996)；and Martin et al，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，869268-9272(1989)；Martin et al.，Methods Enzymol，203121-153(1991)；and Rees et al.，In SternbergM.J.E.(ed.)，Protein Structure Prediction，Oxford University Press，Oxford，141-172(1996)。
术语“抗体轻链”和“抗体重链”分别表示VL和VH。VL由基因区段V(可变区)和J(连接区)编码，VH由V、D(多样性)和J编码。VL或VH每一个都包括CDR和框架区。
抗体以完整的免疫球蛋白存在、或以由多种肽酶消化产生的已经很好表征的多种片段而存在。因此，例如，胃蛋白酶在铰链区二硫键连接以下消化抗体，产生F(ab)’2，F(ab)的二聚体，其是以二硫键连接至VH-CH1的轻链。F(ab)’2可在温和条件下还原从而破坏铰链区的二硫键连接，由此将F(ab)’2二聚体转为F(ab)单体。F(ab)’单体实质上是F(ab)加上部分铰链区(Paul，Fundamental Immunology 3d ed.1993)。尽管多种抗体片段根据完整抗体的消化而定义，技术人员将会知道，这种片段可用化学或重组DNA方法从头合成。因此，本文所用的术语“抗体”也包括通过修饰完整抗体而产生的抗体片段，或用重组DNA方法从头合成的抗体片段(如单链Fv)或用噬菌体展示文库鉴定的片段(参见如McCafferty et al.，Nature，348552-554(1990))。
为了制备单克隆或多克隆抗体，可使用本领域已知的任何技术。(例如，见Kohler& Milstein，Nature，256495-497(1975)；Kozbor et al.，Immunology Today，472(1983)；Cole et al.，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy，pp.77-96.Alan R.Liss，Inc.1985)。单链抗体的生产技术(美国专利No.4,946,778)可以修改用于生产本发明多肽的抗体。转基因小鼠或其它生物如其它哺乳动物也可用来表达人源化抗体。作为替代，噬菌体展示技术可用于鉴定特异性结合选定抗原的抗体、异聚F(ab)片段或scFv片段(例如，见McCafferty et al.，同上；Marks et al.，Biotechnology，10779-783，(1992))。
本申请中所用的“HSV-2抗体”是指特异性与HSV-2抗原反应的抗体，而与任何其它来源的抗原不反应，特别是不与HSV-1反应。
III.肽合成A.化学方法进行肽合成本发明的肽可使用常规肽合成法或本领域公知的其它方法进行化学合成。
可以使用与以下所述相似的操作通过固相肽合成方法合成肽，Merrifield et al.，J.Am.Chem.Soc，852149-2156(1963)；Barany and Merrifield，Solid-Phase PeptideSynthesis，in The PeptidesAnalysis，Synthesis，Biology Gross and Meienhofer(eds.)，Academic Press，N.Y.，vol.2，pp.3-284(1980)；and Stewart et al.，Solid Phase PeptideSynthesis 2nd ed.，Pierce Chem.Co.，Rockford，Ill.(1984)。合成期间，具有保护侧链的N-α-保护氨基酸逐步加入通过其C-末端连接至固相支持物即聚苯乙烯珠的成长中多肽链。通过将N-α-去保护氨基酸的氨基连接至N-α-保护氨基酸的α-羧基，该α-羧基已经通过与试剂如二环己基碳二亚胺反应而被活化，从而合成肽。游离氨基连接至活化羧基导致肽键形成。最常用的N-α-保护基团包括Boc，其是酸不稳定的；和Fmoc，其是碱不稳定的。
适用作固相支持物的材料是本领域技术人员公知的，包括但不限于以下材料卤素甲基树脂如氯甲基树脂或溴甲基树脂；羟甲基树脂；酚树脂，如4-(α-[2，4-二甲氧基苯基]-Fmoc-氨甲基)苯氧基树脂；叔-烷氧基羰基-酰肼化树脂等。这些树脂可商业获得，其制备方法是本领域技术人员已知的。
简单地说，C-末端N-α-保护氨基酸首先连接至固相支持物。然后除去N-α-保护基。去保护的α-氨基偶联至下一个N-α-保护氨基酸的活化α-羧基。重复此过程直至合成期望的肽。然后从不溶性聚合物支持物上切除所得的肽，并去保护氨基酸侧链。更长的肽可通过受保护肽段的缩合而得。适当的化学、树脂、保护基、保护氨基酸和试剂的细节是本领域公知的，因此在此不再详细讨论(参见Atherton et al.，SolidPhase Peptide SynthesisA Practical Approach，IRL Press(1989)，and Bodanszky，Peptide Chemistry，A Practical Textbook，2nd Ed.，Springer-Verlag(1993))。
B重组方法生产肽正如本领域技术人员所知，本发明的肽也能通过重组方法生成。虽然经常优选按照上述方法化学合成此肽，某些情况下获得重组肽有一些优点。例如，当本发明的HSV-2肽要与异源肽或异源蛋白连接时，编码该HSV-2肽的核酸可被导入合适的表达载体，随后按正确读码框与编码异源肽和/或异源蛋白的序列融合，使得在转染或转化适当的宿主细胞系时，HSV-2肽与异源肽/蛋白的融合多肽可以产生并被纯化。本领域公知的大量表达载体和宿主细胞可用于此目的。
C肽纯化合成肽的纯化可使用多种层析方法完成，如反相HPLC、凝胶渗透、离子交换、体积排阻、亲合、分配、或逆流分配。选择适合的基质及缓冲液是本领域公知的。
将重组产生的肽纯化至实质性纯度可以用标准技术完成，包括使用如硫酸铵等物质选择性沉淀、柱层析、免疫纯化法和其它方法。例如，见Scopes，ProteinPurificationPrinciples and Practice(1982)；U.S.Patent No.4,673,641；Ausubel et al.，Current Protocols in Molecular Biology(1994)；and Sambrook and Russell，MolecularCloningA Laboratory Manual 3d Ed.(2001)。特别的，当重组多肽包含融合至具有已知分子粘附性质的异源蛋白的HSV-2肽时，通过使之流过固定有适当结合伴侣的柱子，可比较容易地纯化至相对高纯度。
D肽序列确认制备用于HSV-2特异性检测的肽的氨基酸序列可用多种成熟方法确认。例如，Edman降解的常规方法可用来确定肽的氨基酸序列。基于Edman降解的几种变化形式的测序方法，包括微序列测定，和基于质谱的方法也经常用于此目的。
E肽修饰本发明的肽可被修饰而得到更期望的性质。设计抗蛋白水解酶降解或具有提高的溶解性或结合能力的化学修饰肽及肽模拟物是公知的。
用于HSV-2特异性检测的肽的修饰氨基酸或化学衍生物可含有修饰氨基酸的另外化学结构，其通常不是糖蛋白G2的一部分。该肽的共价修饰在本发明范围内。可通过使该肽的目标氨基酸残基与能和选定侧链或末端残基反应的有机衍生剂反应而进行这种修饰。
设计抗蛋白水解酶降解的肽模拟物是本领域技术人员公知的。例如，见Sawyer，Structure-Based Drug Design，P.Verapandia，Ed.，N.Y.(1997)；U.S.Patent Nos.5,552,534 and 5,550,251。肽骨架和侧链的修饰均可用于设计模拟二级结构。可能的修饰包括D-氨基酸、Nα-Me-氨基酸、Ca-Me-氨基酸及脱氢氨基酸(dehydroamino acid)的替换。至今，多种二级结构模拟物已经设计出来并掺入肽或肽模拟物中。
其它修饰包括用非天然羟基化氨基酸替换天然氨基酸，用腈衍生物替换酸性氨基酸中的羧基，用烷基替换碱性氨基酸中的羟基，或用甲硫氨酸亚砜替换甲硫氨酸。此外，用于HSV-2型特异性检测的肽的氨基酸可以用相同但相反手性的氨基酸替换，即天然存在的L-氨基酸可用其D-构型替换。
还可修饰本发明的肽以提高其与HSV-2抗体特异性结合的能力。例如，连接子，可以包含异源肽、异源蛋白、和/或本性非肽的化合物，可引入本发明肽的任一末端，以辅助将要求保护的肽固定至载体，以及更好地呈递该肽给HSV-2抗体。作为另一个例子，本发明的肽可以二聚化以实现与HSV-2抗体更高水平的特异性结合。可通过多种手段进行二聚化，最常用的方法是通过二硫键。由于该肽不含天然半胱氨酸残基，半胱氨酸残基可以包括作为连接子的一部分。向本发明的肽加入连接子的过程将在下节详细讨论。
VI.将肽固定至载体用于HSV-2型特异性检测的本发明公开的肽优选固定于固相支持物或载体。载体经常是合成的聚合物材料，但也可以是天然材料。载体材料的实例是丙烯酰胺、纤维素、硝酸纤维素、玻璃、聚苯乙烯、聚乙烯醋酸乙烯酯、聚丙烯、聚甲基丙烯酸酯、聚乙烯、聚硅酸盐、聚乙烯氧化物、聚碳酸酯、特富龙、氟碳化合物、尼龙、硅橡胶、胶原、聚酐、聚乙醇酸、聚乳酸、聚原酸酯、聚丙基富马酸酯、糖胺聚糖、和聚氨基酸。载体可以是多种可用形式的一种，包括薄膜、珠、瓶、盘、纤维、织造纤维、成型聚合物、颗粒、和微粒如微球。支持物的优选形式是板和珠。最优选的珠形式是磁珠或乳胶珠。
A.连接至连接子本发明的肽可通过多种连接子连接至载体。连接子可连接至肽的N-或C-末端。在肽与载体之间间接连接时，连接子可由与本发明肽异源的另一个肽组成，或除了异源肽以外，还包含本发明肽的异源蛋白。具分支氨基酸聚合物也可用作连接子，可利用在氨基酸残基上有多个功能基的优点，如在赖氨酸残基上有两个氨基。其它合适的连接子是本领域技术人员公知的，包括但不限于支链或直链碳连接子、杂环碳连接子(如SMCC)或聚醚连接子。除了异源肽和/或蛋白以外还可以使用这些连接子，或用这些连接子代替异源肽和/或蛋白。
直接连接时，连接子可以是肽与载体间的共价键(如二硫键)或非共价键(如离子键)。
1.间接连接当通过合成方式获得本发明的肽时，作为连接子的异源肽可在肽合成时包括进去。例如，由一个半胱氨酸残基、一个赖氨酸残基及至少两个甘氨酸残基组成的连接子可作为待合成的肽序列的一部分，其可在N-或C-末端。其它连接子如直链或支链碳连接子、杂环碳连接子或聚醚连接子也可用于单独或与异源肽和/或蛋白结合连接本发明的肽。当连接子中除异源肽之外还使用异源蛋白如BSA和KLH时，可以在肽合成和纯化之后用化学手段将其连接至肽，而异源肽已经在合成中被加入此肽中。这种偶联可以如下实现通过末端氨基酸残基的α碳氨基和羧基连接此肽和异源蛋白，如通过肽键；或通过其侧基连接此肽与异源蛋白的氨基酸残基，如通过二硫键。连接子如异源肽和/或蛋白也可以通过HSV-2肽内部氨基酸残基的功能基(如天冬氨酸残基的第二个羧基)连接至本发明的HSV-2肽。
本发明的肽由重组方式获得时，编码异源肽或蛋白的核苷酸序列可在亚克隆期间包括进去，所得重组多肽因此将已经连接了适当连接子。
本领域技术人员将会知道，具有适当功能基的多种其它连接子如碳连接子或聚醚连接子也可用来实现本发明。这些连接子可通过其侧基连接至肽的组成氨基酸(例如，通过二硫键连接至半胱氨酸)。连接子还可以连接至肽末端氨基酸的α-碳氨基或羧基。
2.直接连接本发明的肽可以直接固定于不溶性载体上。连接肽的策略与将肽或蛋白质连接子连接至载体的一些方法相似，其详细讨论在下节提供，其中肽通常含有多种功能基如羧酸(-COOH)、游离氨基(-NH2)或巯基(-SH)等，这些基团可用于与载体上适当的功能基反应而形成连接。
B.连接至载体1.共价键用于HSV-2型特异性检测的肽，有或无连接子，可通过共价键连接至载体上。通常载体有一些功能基，如胺、羧酸和巯基，肽或连接子的功能基可以容易地与之反应而形成连接肽和载体的共价键。连接本发明肽和载体的共价键可以存在于载体和此肽的末端氨基酸残基之间，或存在于载体和此肽的内部氨基酸残基之间。在载体中没有适合这一目的的天然功能基时，可以在偶联之前将载体衍生化以暴露或连接另外的活性功能基。衍生化可能涉及连接多种分子的任一种，如那些可由Pierce ChemicalCompany，Rockford，Illinois获得的分子。
2.非共价键作为替代，可通过标签和标签结合伴侣的已知相互作用将肽连接至载体。该结合相互作用的伴侣之一，如标签，可作为连接子连接至此肽，而另一配体，如标签结合伴侣，可连接至载体。基于文献中详述的已知分子相互作用，很多标签与标签结合伴侣可以使用。例如，当标签有天然结合伴侣时，如生物素，可用来结合适合的标签结合伴侣(亲合素、链亲和素、neutravidin等)。受体-配体相互作用作为标签和标签结合伴侣对也是适当的。例如，细胞膜受体的激动剂和拮抗剂(例如，细胞受体-配体相互作用如转铁蛋白、c-kit、病毒受体配体、细胞因子受体、趋化因子受体、白细胞介素受体、钙粘蛋白家族、整合素家族、选择素家族等等；例如见Pigott & Power，The Adhesion Molecule Facts Book I(1993)。类似的，毒素和毒液(venoms)、病毒表位、激素(如阿片、类固醇等)、细胞内受体(如介导多种小配体的作用，包括类固醇、甲状腺激素、维生素A类和维生素D；肽)、药物、凝集素、糖、核酸(线形和环形聚合物构型)、寡糖、蛋白质、磷脂和抗体都可与多种细胞受体相互作用。另外，一些合成聚合物，如聚氨酯、聚酯、聚碳酸酯、聚脲和聚酰胺、聚乙烯亚胺、聚亚芳基硫化物(polyarylene sulfides)、聚硅氧烷、聚亚酰胺、和聚乙酸酯类也可形成适合的标签或标签结合伴侣。
含有标签的连接子可通过上述多种方式连接至载体。另一方面，标签结合伴侣可使用当前可用的多种方法的任一种固定于固相基质(即载体)。通常可通过将基质全部或部分暴露于固定化学基团至其表面的化学试剂，将固相基质衍生化或功能化，这种化学基团转而可与标签结合伴侣的一部分反应。例如，适于连接至较长链部分的基团包括胺基、羟基、巯基和羧基。氨烷基硅烷和羟烷基硅烷可用来功能化多种表面，如玻璃表面。构建这种固相生物聚合物阵列在文献中有详细描述，见Merrifield，J.Am.Chem.Soc.852149-2154(1963)(描述固相合成，如肽)；Geysen et al.，J.Immun.Meth.102259-274(1987)(描述在针(pin)上合成固相组分)；Frank & Doting，Tetrahedron446031-6040(1988)(描述在纤维素盘片上合成多种肽序列)；Fodor et al.，Science，251767-777(1991)；Sheldon et al.，Clinical Chemistry 39(4)718-719(1993)；andKozal et al.，Nature Medicine 2(7)753759(1996)(都固定于固相基质的生物聚合物阵列)。固定标签结合伴侣至基质的非化学方法包括其它常见方法，如热、紫外辐射交联等。
V.HSV-2抗体特异性检测分析A.用本发明的肽检测HSV-2抗体为了使本发明的肽可用于HGV-2型特异性检测，首先它们必需能特异性结合HSV-2抗体。为了测试这种特异性结合，可进行多种公知的免疫结合测试。例如，见U.S.Patent Nos.4,366,241；4,376,110；4,517,288；and 4,837,168。免疫测试方法的一般性综述也可见Asai，Methods in Cell Biology，Volume 37Antibodies in Cell Biology，Academic Press，Inc.NY(1993)。
典型的，本发明的肽可被固定并用作所谓的HSV-2抗体的“捕获剂”。已知含HSV-2抗体而不含HSV-1抗体的样品可用于结合测试，以筛选能特异性结合HSV-2抗体的肽。适当的结合条件是本领域公知的，且进行这些结合测试的一般性指导在许多科学出版物中可以发现。例如，见Harlow and Lane，AntibodiesA LaboratoryManual，Cold Spring Harbor Laboratory(1988)。抗体-肽复合物形成时，使用标记试剂指示这种复合物的存在。本文中，有多种方法使用标记试剂达到这个目的。例如，标记试剂可以是识别抗体-肽复合物并携带标记的第二抗体。作为替代，第二抗体本身可能缺乏标签，但依次可以被标记的第三抗体结合，所述第三抗体特异性针对第二抗体来源物种的抗体。第二抗体也可用可检测结构进行修饰，如生物素，第三个标记分子能特异性结合于该检测结构，如带标签的链亲和素。此外，能特异性结合免疫球蛋白恒定区的其它蛋白质，如蛋白A或蛋白G也可用作标记试剂。这些蛋白质是链球菌细胞壁的正常组分，并显示对多种物种的免疫球蛋白恒定区的强烈的非免疫原性反应活性。一般地，见Kronval et al.，J.Immunol，1111401-1406(1973)；andAkerstrom et al.，J.Immunol，1352589-2592(1985)。
整个测试期间，每次试剂组合之后可能需要孵育和/或清洗步骤。孵育时间可从约5秒至数小时之间变化，优选从约5分钟至约24小时。孵育时间将根据动测试形式、特定肽、溶液体积、浓度等变化。测试通常在室温进行，虽然其可在一定温度范围中进行，如从约10℃度至约40℃。
不同方式的标记可用于抗体-肽复合物的检测。标记结构可以是，如荧光分子(如荧光素、罗丹明、德克萨斯红和藻红蛋白)或酶分子(如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶和β-半乳糖苷酶)，它们结合至二抗或三抗，允许基于发荧光或酶催化的化学反应产物进行检测。放射性标记包括多种同位素，如3H、125I、35S、14C或32P，也可结合至适当的分子，因此抗体-肽复合物的检测可使用记录放射活性的任何适当方法，如放射自显影。例如，见Tijssen，″Practice and Theory of Enzyme Immunoassays，″Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology.Burdon and vanKnippenberg Eds.，Elsevier(1985)，pp.9-20。对标记、标记方法及标记检测的介绍也可参见Polak and Van Noorden，Introduction to Immunocytochemistry，2d Ed.，Springer Verlag，NY(1997)；and in Haugland，Handbook of Fluorescent Probes andResearch Chemicals，a combined handbook and catalogue published by MolecularProbes，Inc.(1996)。
B.流式细胞术流式细胞术是检测HSV-2型特异性抗体存在的优选方法之一，其中本发明的肽偶联至适合的颗粒，HSV-2抗体的特异性结合通过标记如荧光素的第三分子结合而检测。流式细胞术的仪器操作方法是本领域公知的，可用于实施本发明。一般地说，流式细胞术是这样的微粒悬液流经激光束，用光电倍增管检测从每个颗粒发射的荧光。流式细胞术仪器操作和方法的详细描述可在文献中发现。实例是McHugh，″FlowMicrosphere Immunoassay for the Quantitative and Simultaneous Detection ofMultiple Soluble Analytes，″Methods in Cell Biology 42，Part B(Academic Press，1994)；McHugh et ah，″Microsphere-Based Fluorescence Immunoassays Using FlowCytometry Instrumentation，″Clinical Flow Cytometry，Bauer，K.D.，et al，eds.(Baltimore，Maryland，USAWilliams and Williams，1993)，pp.535-544；Lindmo et al，″Immunometric Assay Using Mixtures of Two Particle Types of Different Affinity，″J.Immunol.Meth.126183-189(1990)；McHugh，″Flow Cytometry and the Applicationof Microsphere-Based Fluorescence Immunoassays，″Immunochemica 5116(1991)；Horan et al.，″Fluid Phase Particle Fluorescence AnalysisRheumatoid FactorSpecificity Evaluated by Laser Flow Cytophotometry，″Immunoassays in the ClinicalLaboratory，185-189(Liss 1979)；Wilson et al.，″A New Microsphere-BasedImmunofluorescence Assay Using Flow Cytometry，″J.Immunol.Meth.107225-230(1988)；Fulwyler et al.，″Flow Microsphere Immunoassay for the Quantitative andSimultaneous Detection of Multiple Soluble Analytes，″Meth.Cell Biol.33613-629(1990)；Coulter Electronics Inc.，United Kingdom Patent No.1,561,042(publishedFebruary 13，1980)；and Steinkamp et al，Review of Scientific Instruments 44(9)1301-1310(1973)。
用于实施本发明的颗粒优选是微观大小并由聚合物材料形成。可用作微粒的聚合物是相对于生物样品组分和测试试剂为化学惰性的，但对于结合成员涂层(coatings)则可固定于微球表面。适合的微粒材料也将具有最小的自发荧光，将是固体且不溶于样品中和测试使用的任何缓冲液、溶剂、载体、稀释剂或悬浮剂，并能固定至适当的涂层材料，优选通过共价键合。适合聚合物的实例是聚酯、聚醚、聚烯烃、聚亚烷基氧化物、聚酰胺、聚氨酯、多糖、纤维素、和聚异戊二烯。交联可用于很多聚合物中以使微粒具有结构完整性和硬度。微粒的大小范围可以变化，具体大小范围对本发明不是关键性的。多数情况下，微粒的直径范围在约0.5微米至约100微米，优选约0.3微米至约40微米。
为了便于测试的颗粒回收和洗涤步骤，颗粒优选含有磁反应性材料，即任何对磁场有反应的材料。或者孵育或者洗涤之后的固相和液相的分离然后可以如此实现将磁场施加于含孵育悬液的反应容器上，使颗粒贴附于容器壁上，从而可以通过倾倒或抽吸去除液体。本发明中感兴趣的磁反应性材料包括顺磁性材料、铁磁性材料、亚铁磁性材料和变磁性(metamagnetic)材料。顺磁性材料是优选的。实例是铁、镍和钴，以及金属氧化物材料如Fe3O4、BaFe12O19、CoO、NiO、Mn2O3、Cr2O3和CoMnP。
磁反应性材料可分布于整个聚合物，作为聚合物表面的涂层或作为其表面的两或更多涂层之一来施加，或使该材料进入颗粒的任何其它方式掺入或固定。颗粒中磁反应性材料的量不是关键的，可在宽范围中变化。其量可影响颗粒密度，然而，其量和颗粒大小都可影响维持微粒在悬液中的容易程度，其目的是实现液相和固相之间的最大接触和有助于流式细胞术。微粒中过量的磁反应性材料会产生非常高的自发荧光，足以干扰测试结果。因此，优选磁反应性材料的浓度应足够低，以使从材料产生的任何自发荧光最小。出于以上考虑，根据本发明的颗粒中的磁反应性材料优选占颗粒总重量的范围是约0.05％至约75％。更优选的重量百分范围是从约2％至约25％，甚至更优选的重量百分范围是从约2％至约8％。
用适当的测试试剂包被颗粒表面可通过静电吸引、特异性亲和相互作用、疏水作用或共价键合实现。共价键合为优选。聚合物可用功能基衍生化从而经常规方式共价结合测试试剂，特别是使用含功能基的单体，这些单体作为唯一的单体或共聚单体。合适的功能基的实例是胺基(-NH2)、铵基(-NH3+或-NR3+)、羟基(-OH)、羧基(-COOH)和异氰基(-NCO)。可用于将羧酸基引入聚烯烃的单体，例如是丙烯酸和甲基丙烯酸。
连接子可用作提高颗粒表面抗体可识别表位的密度以及降低空间阻碍的手段。这将增加测试的范围和灵敏度。如果需要固定本发明的特定包被材料，连接子也可用作在固态表面添加特定类型反应基团的手段。适合的有用功能基的实例是聚赖氨酸、聚天冬氨酸、聚谷氨酸和聚精氨酸。
一般而言，应小心避免使用具有高自发荧光的颗粒。从广泛的起始单体通过常规乳液聚合技术形成的颗粒一般是适合的，因为它们大多表现低水平的自发荧光。相反地，已经被修饰以增加其多孔性从而增加其表面积的颗粒，即文献中被称为“大孔”颗粒的那些颗粒，则较不理想，因为其倾向于表现为高自发荧光。
标记结合成员中使用的标记可以是任何能发出可检测信号的标记物。优选的这种标记是荧光基团。大量荧光基团已经在文献中被报道，因此是本领域技术人员公知的，许多可以容易地从生物技术产业的商业供应者处获得。荧光基团的文献来源包括Cardullo et al，Proc.Natl.Acad.Sci USA 858790-8794(1988)；Dexter，D.L.，J.ofChemical Physics 21836-850(1953)；Hochstrasser et al，Biophysical Chemistry 45133-141(1992)；Selvin，P.，Methods in Enzymology 246300-334(1995)；Steinberg，I.Ann.Rev.Biochem.，4083-114(1971)；Stryer，L.Ann.Rev.Biochem.，47819-846(1978)；Wang et al.，Tetrahedron Letters 316493-6496(1990)；Wang et al，Anal Chem.671197-1203(1995)。
下面是荧光基团实例的列表。
4-乙酰胺基-4’-异硫氰酸芪-2，2’二磺酸吖啶吖啶异硫氰酸5-(2’-氨乙基)氨基萘-1-磺酸(EDANS)4-氨基-N-[3-乙烯磺基)苯基]萘亚酰胺-3，5-二磺酸盐N-(4-苯胺基-1-萘基)马来酰亚胺邻氨基苯甲酰胺BODIPY亮黄香豆素7-氨基-4-甲基香豆素(AMC，香豆素120)7-氨基-4-三氟甲基香豆素(香豆素151)花青染料cyanosine4，6-diaminidino-2-苯吲哚(DAPI)5’，5”-二溴焦棓酚-磺酸萘(5’，5”-dibromopyrogallol-sulfonaphthalein)(溴焦棓酚红)7-二乙胺-3-(4’-异硫氰酸基苯基)-4-甲基香豆素二亚乙基三胺五乙酸盐4，4’-二异硫氰酸基二羟基-芪-2，2”-二磺酸4，4’-二异硫氰酸基芪-2，2’-二磺酸
5-[二甲基氨基]萘-1-磺酰氯(DNS，丹磺酰氯)4-(4’-二甲基氨基苯基偶氮)苯甲酸(DABCYL)4-二甲基氨基苯基偶氮苯基-4’-异硫氰酸(DABITC)伊红伊红异硫氰酸酯藻红B藻红异硫氰酸乙啶5-羧基荧光素(FAM)5-(4，6-二氯三氮烯-2-基)氨基荧光素(DTAF)2’，7’-二甲氧基-4’，5’-二氯-6-羧酸荧光素(JOE)荧光素荧光素异硫氰酸酯荧光胺IR144IR1446异硫氰酸孔雀石绿4-甲基伞形酮正甲酚酞硝基酪氨酸副品红酚红藻胆蛋白(B-藻红蛋白，R-藻红蛋白，等)o-酞二醛(o-phthaldialdehyde)芘芘丁酸琥珀酰亚胺基1-芘丁酸量子点活性红4(CibacronTM亮红3B-A)6-羧基-X-罗丹明(ROX)6-羧基罗丹明(R6G)丽丝胺罗丹明B磺酰氯罗丹明(Rhod)罗丹明B罗丹明123异硫氰酸罗丹明X磺基罗丹明B磺基罗丹明101磺基罗丹明101的磺酰氯衍生物(得克萨斯红)N，N，N，’N’-四甲基-6-羧基罗丹明(TAMRA)四甲基罗丹明三甲基罗丹明异硫氰酸(TRITC)核黄素玫红酸镧系螯合物衍生物用荧光团和结合成员上的适当功能基通过常规共价键合，将任何的这些荧光团连接至上述结合分子从而形成用于实施本发明的测试试剂。识别这些基团和形成连接的反应对本领域技术人员是显而易见的。
类似的，作为自动化测试的一部分，施加和去除磁场的仪器操作方法是本领域技术人员已知的并在文献中有报道。这些文献报道的实例是Forrest et al.，UnitedStates Patent No.4,141,687(Technicon Instruments Corporation，February 27，1979)；Ithakissios，United States Patent No.4,115,534(Minnesota Mining and ManufacturingCompany，September19，1978)；Vlieger，A.M.，et al.，Analytical Biochemistry 2051-7(1992)；Dudley，Journal of Clinical Immunoassay 1477-82(1991)；and Smart，Journalof Clinical Immunoassay 15246-251(1992)。所有在此及以前段落的引用都经引用并入本文。
C.本发明的肽对HSV-1的非反应性用于HSV-2型特异性检测的肽的必要特征的另一同等重要方面是，它们必须不以可检测的特异性结合HSV-1抗体，特别是在用于HSV-2抗体检测的测定形式中。一旦肽显示出与HSV-2抗体特异性反应，它们将被进一步检测对HSV-1抗体及其它病毒如疱疹病毒科的抗体的任何可能的交叉反应。为了测试这些肽不与HSV-1抗体反应，它们被固定并用作免疫分析中的“捕获试剂”，除了已确认样品含有HSV-1抗体(而非HSV-2抗体)，免疫测试实际上与上节描述相同。
提供以下实施例用于举例说明而非限制。
实施例I.肽合成表1列出的肽使用N-α-保护基Boc或Fmoc作为单体合成。
表1.合成的gG-2肽
II.二聚化任选的肽二聚化步骤如下进行单体肽溶于去离子水或0.1M碳酸氢钠中，4℃搅拌过夜。产生的氧化、二聚化的肽用C18柱用制备型HPLC纯化。
III.单体肽-BSA偶联物的制备向牛血清白蛋白(BSA)的0.1 mM硼酸缓冲液中(pH8.0)(10mg/ml)中，加入154μlSMCC、溶于二甲亚砜(DMSO)的N-羟基琥珀酰亚胺(10mg/ml)。混合物在室温保温2小时，加载到用10mM磷酸盐(PBS，pH7.4)预平衡的Sephadex G-25柱(30ml)上，并用PBS洗脱。收集第一个峰，蛋白浓度用280nm吸光度估计。
单体肽(1mg)与1mg修饰的BSA混合，4℃保存过夜。通过体积排阻层析纯化肽-BSA偶联物。
IV.二聚体肽-BSA偶联物的制备二聚体肽-BSA偶联物可按照以下描述制备。
1.SMCC-肽二聚体50μl溶于DMSO(10mg/ml)的SMCC加入溶于100mM磷酸盐(pH8.0)的1ml肽二聚体溶液(5mg/ml)中。孵育2小时后，修饰的肽用HPLC色谱纯化。2.2-巯基乙酰-BSA50μl溶于DMSO的N-琥珀酰亚胺基S-乙酰硫代乙酸酯(SATA)(10mg/ml)加入100mM磷酸盐(pH8.0)的1ml BSA(10mg/ml)中。孵育2小时后，加入100μl含10mM EDTA的200mM N-乙基马来酰亚胺。反应混合物在室温孵育1小时，然后加到Sephadex G-25柱上。用10mM PBS将修饰的BSA从柱上洗脱。
3.肽二聚体-BSA偶联物4mg修饰的BSA与4mg修饰的肽在2-8℃混合，并孵育过夜。用体积排阻色谱纯化偶联的肽。
V.肽或肽-BSA包被磁珠的制备。
向用25mM 2-[N-吗啉代]乙磺酸(MES)(pH6.1)洗涤两次的6mg磁珠中，加入588μl去离子水、80μl 0.5M MES(pH6.1)、92μl 100mg/ml N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和溶于去离子水的40μl 50mg/ml 1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亚胺(EDC)，混合物在室温旋转振荡30分钟。活化的珠子用25mM MES(pH6.1)洗涤两次。然后，加入100μl 0.5M MES(pH6.1)、720μl去离子水、和180μl肽(1mg/ml)或肽-BSA偶联物(1mg/ml)，并旋转振荡混合物。混合物在旋转器上进一步室温孵育2小时，7000rpm离心2分钟。弃去上清后加入1ml溶于含20mM Tris碱的PBS的1％BSA，在旋转器上室温混合2小时，离心去除上清。珠子用溶于10mM PBS的1％BSA洗涤两次，储存于1ml 1％BSA中。流程图1显示一个示例性过程，经已经连接于其C-末端的异源肽将HSV-2肽连接至SMCC上，再经BSA连接至微球。
VI.流式细胞免疫测试(FCIA)肽或肽-BSA偶联物，如表1所示，被偶联至预先确定的磁珠(每个肽或肽-BSA偶联物被偶联至磁珠，其具有特定区域染料成分的特征性荧光。并以每个区域磁珠相似的磁珠数一起混合。混合的磁珠用溶于含0.1％Tween 20的PBS中的1％BSA稀释至每ml含1000拷贝的各区域磁珠。
向微量滴定管中加入100μl样品稀释液、5μl患者样品及100μl珠混合物，并在37℃摇床孵育20分钟。磁性分离后，磁珠用洗涤缓冲液(含0.1％Tween 20的10mM PBS)洗涤2次。加入50μl抗人IgG(Fc特异性)-B-藻红蛋白偶联物。在37℃摇床孵育10分钟之后，再次用洗涤缓冲液洗涤磁珠2次，并重悬于50μl洗涤缓冲液。用Luminex 100仪器计数并分析磁珠。结合于磁珠的抗体量(IgG)用偶联藻红蛋白的抗人IgG测定。
VII.与商品测试系统比较用137个临床确诊患者样品的研究已经证明，使用本发明的肽-BSA偶联物的测试系统效果好于基于gG2的HSV-2型特异性IgG商品测试系统，并与Western印迹验证测定结果100％一致(表2)。
表2.基于肽的HSV-2型特异性测试
VIII.对HSV-1的非反应性本发明的HSV-2型特异性免疫测试系统经测试，缺少对疱疹科其它病毒尤其是HSV-1的抗体的交叉反应。通过两种商品化HSV-2型特异性测试系统和Western印迹证实，表3证明缺少对HSV-1 IgG的交叉反应。
表3.与HSV-1抗体阳性样品的非反应性
表3.与HSV-1抗体阳性样品的非反应性
权利要求
1.一种组合物，包含由SEQ ID NO1的24-36个连续氨基酸组成的HSV-2肽。
2.权利要求1的组合物，其中所述肽具有由SEQ ID NO1第5-32位氨基酸组成的序列。
3.权利要求1的组合物，其中所述肽具有由SEQ ID NO1第9-32位氨基酸组成的序列。
4.权利要求1的组合物，其中所述肽具有SEQ ID NO1的序列。
5.权利要求1的组合物，其中所述肽被二聚化。
6.权利要求5的组合物，其中所述肽通过二硫键被二聚化。
7.权利要求1的组合物，其中所述肽被连接至载体。
8.权利要求7的组合物，其中所述载体是羧化微球。
9.权利要求8的组合物，其中所述载体是羧化乳胶或磁性微球。
10.权利要求7的组合物，其中所述肽经其N-末端或C-末端处的连接子连接至载体。
11.权利要求7的组合物，其中所述肽经其内部氨基酸残基处的连接子连接至载体。
12.权利要求10的组合物，其中所述连接子包含异源肽。
13.权利要求10的组合物，其中所述连接子由异源蛋白质组成。
14.权利要求12的组合物，其中所述连接子还包含异源蛋白质。
15.权利要求14的组合物，其中所述异源蛋白质是牛血清白蛋白(BSA)。
16.权利要求14的组合物，其中所述异源蛋白质是钥孔帽贝血蓝蛋白(KLH)。
17.权利要求12中的组合物，其中所述连接子由异源肽组成。
18.权利要求12中的组合物，其中所述异源肽包含一个半胱氨酸残基、一个赖氨酸残基和至少2个甘氨酸残基。
19.权利要求10的组合物，其中所述连接子包含具分支的氨基酸聚合物。
20.权利要求19的组合物，其中所述具分支的氨基酸聚合物包括如下结构
21.权利要求12的组合物，其中(1)所述肽具有SEQ ID NO1的氨基酸序列；(2)所述载体是羧化磁性微球；(3)所述连接子包含4-(马来酰亚胺甲基)-1-环己基羧酸(SMCC)和具有GGCK氨基酸序列的异源肽；和(4)所述异源肽在所述肽的C末端处连接至所述肽。
22.权利要求21的组合物，其中所述连接子还包含异源蛋白质BSA，其直接连接至载体，并且其中SMCC连接至BSA并经异源肽连接至所述肽。
23.权利要求12的组合物，其中(1)所述肽具有由SEQ ID NO1的第5-32位氨基酸组成的氨基酸序列；(2)所述载体是羧化磁性微球；(3)所述连接子包含SMCC和具有GGGGCK氨基酸序列的异源肽；和(4)所述异源肽在所述肽的C末端处连接至所述肽。
24.权利要求23的组合物，其中所述连接子还包含异源蛋白质BSA，其直接连接至载体，并且其中SMCC连接至BSA并经异源肽连接至所述肽。
25.权利要求12的组合物，其中(1)所述肽具有由SEQ ID NO1的第9-32位氨基酸组成的氨基酸序列；(2)所述载体是一个羧基化磁化微球；(3)所述连接子包含SMCC和具有GGGGCK氨基酸序列的异源肽；和(4)所述异源肽在所述肽的C末端处连接至所述肽。
26.权利要求25的组合物，其中所述连接子还包含异源蛋白质BSA，其直接连接至载体，并且其中SMCC连接至BSA并经异源肽连接至所述肽。
27.权利要求12的组合物，其中(1)所述肽具有由SEQ ID NO1的第9-32位氨基酸组成的氨基酸序列；(2)所述载体是羧化磁性微球；(3)所述连接子包含SMCC和具有KCGGGG氨基酸序列的异源肽；和(4)所述异源肽在所述肽的N末端处连接至所述肽。
28.权利要求27的组合物，其中所述连接子还包含异源蛋白质BSA，其直接连接至载体，并且其中SMCC连接至BSA并经所述异源肽连接至所述肽。
29.权利要求20的组合物，其中(1)所述肽具有由SEQ ID NO1的第9-32位氨基酸组成的氨基酸序列；(2)所述载体是羧化微球；和(3)所述具分支的氨基酸聚合物还包含CK短肽，其中所述短肽经其C残基直接连接至所述具分支的氨基酸聚合物的最后的K残基。
30.一种特异性检测生物样品中HSV-2抗体的方法，包括以下步骤(a)将生物样品与包含由SEQ ID NO1的24-36个连续氨基酸组成的肽的组合物接触，其中所述肽连接至载体；和(b)检测在所述肽与生物样品的抗体组分之间是否已经发生抗原抗体结合，其中检测到抗原抗体结合指示生物样品中存在HSV-2抗体。
31.权利要求30的方法，其中步骤(b)由流式细胞术进行。
32.权利要求30的方法，其中生物样品是全血、血清、血浆、脑脊液、小泡液或粘液。
33.权利要求30的方法，其中所述肽具有由SEQ ID NO1的第5-32位氨基酸组成的氨基酸序列。
34.权利要求30的方法，其中所述肽具有由SEQ ID NO1的第9-32位氨基酸组成的氨基酸序列。
35.权利要求30的方法，其中所述肽具有SEQ ID NO1的氨基酸序列。
36.权利要求30的方法，其中所述载体是羧化微球。
37.权利要求36的方法，其中所述载体是羧化乳胶或磁性微球。
38.权利要求30的方法，其中所述肽被二聚化。
39.权利要求38的方法，其中所述肽通过二硫键被二聚化。
40.权利要求30的方法，其中所述肽通过所述肽N-末端或C-末端处的连接子连接至载体。
41.权利要求30的方法，其中所述肽通过所述肽内部氨基酸残基处的连接子连接至载体。
42.权利要求40的组合物，其中所述连接子包含异源肽。
43.权利要求40的组合物，其中所述连接子由异源蛋白质组成。
44.权利要求42的组合物，其中所述连接子还包含异源蛋白质。
45.权利要求44的组合物，其中所述异源蛋白质是牛血清白蛋白(BSA)。
46.权利要求44的组合物，其中所述异源蛋白质是钥孔帽贝血蓝蛋白(KLH)。
47.权利要求42的组合物，其中所述连接子由异源肽组成。
48.权利要求42的组合物，其中所述异源肽包含一个半胱氨酸残基、一个赖氨酸残基和至少2个甘氨酸残基。
49.权利要求40的组合物，其中所述连接子包含具分支的氨基酸聚合物。
50.权利要求49的组合物，其中所述连接子包含如下结构
51.权利要求42的方法，其中(1)所述肽具有SEQ ID NO1的氨基酸序列；(2)所述载体是羧化磁性微球；(3)所述连接子包含SMCC和具有GGCK氨基酸序列的异源肽；(4)所述异源肽在所述肽C末端处连接至所述肽；和(5)步骤(b)经流式细胞术进行。
52.权利要求51的方法，其中所述连接子还包含异源蛋白质BSA，其直接连接至载体，并且其中SMCC连接至BSA并经异源肽连接至所述肽。
53.权利要求42的方法，其中(1)所述肽具有由SEQ ID NO1的第5-32位氨基酸组成的氨基酸序列；(2)所述载体是羧化磁性微球；(3)所述连接子包含SMCC和具有GGGGCK氨基酸序列的异源肽；和(4)所述异源肽在所述肽C末端处连接至所述肽；和(5)步骤(b)经流式细胞术进行。
54.权利要求53的方法，其中所述连接子还包含异源蛋白质BSA，其直接连接至载体，并且其中SMCC连接至BSA并经异源肽连接至所述肽。
55.权利要求42的方法，其中(1)所述肽具有由SEQ ID NO1的9-32个氨基酸组成的氨基酸序列；(2)所述载体是羧化磁性微球；(3)所述连接子包含SMCC和具有GGGGCK氨基酸序列的异源肽；和(4)所述异源肽在所述肽的C末端处连接至所述肽；和(5)步骤(b)经流式细胞术进行。
56.权利要求55的方法，其中所述连接子还包含异源蛋白质BSA，其直接连接至载体，并且其中SMCC连接至BSA并经异源肽连接至所述肽。
57.权利要求42的方法，其中(1)所述肽具有由SEQ ID NO1的第9-32位氨基酸组成的氨基酸序列；(2)所述载体是羧化磁性微球；(3)所述连接子包含SMCC和具有KCGGGG氨基酸序列的异源肽；(4)所述异源肽在所述肽的N末端处连接至所述肽；和(5)步骤(b)经流式细胞术进行。
58.权利要求57的方法，其中所述连接子还包含异源蛋白质BSA，其直接连接至载体，并且其中SMCC连接至BSA并经异源肽连接至所述肽。
59.权利要求50的方法，其中(1)所述肽具有由SEQ ID NO1的第9-32位氨基酸组成的氨基酸序列；(2)所述载体是羧化微球；(3)所述具分支的氨基酸聚合物还包含CK短肽，其中所述短肽通过其C残基直接连接至所述具分支的氨基酸聚合物的最后的K残基；和(4)步骤(b)经流式细胞术进行。
全文摘要
本发明涉及来源于HSV－2糖蛋白G2并代表HSV－2型特异性表位的肽。本发明也提供包含这些肽的组合物，用于型特异性血清学诊断HSV－2感染。还提供使用这些肽用于型特异性检测HSV－2抗体、和区分HSV－2病毒感染与HSV－1和其它疱疹病毒家族感染的方法。
文档编号G01N33/569GK101023187SQ200480042300
公开日2007年8月22日 申请日期2004年3月5日 优先权日2004年3月5日
发明者陈佩林, 苏宗得, 余浩, 拉里·布勒克卡, 帕特里克·F·科尔曼 申请人:伯乐实验室有限公司