专利名称::蛋白质溶液的铝/铁处理和膜浓缩方法
技术领域:
:本发明涉及一种纯化从蛋白质溶液(例如发酵液)中获得的蛋白质(特别是酶)的方法。
背景技术:
:在蒸发和无定形盐沉淀前,用铝化合物从发酵液中沉淀杂质是已知的(参见WO94/01537和美国专利3795586)。然而,从能量消费观点看,真空蒸发是昂贵的。而且,由于在发酵液中的高盐和低分子量组份水平,仅小的浓缩因子是可能的。用例如硫酸钠或者硫酸铵进行的无定形盐沉淀是高盐消耗的,并且所述方法对蛋白质纯化而言不是有效的单元操作。膜浓缩(例如UF浓缩)广泛地用于蛋白质浓缩,因为该方法通过过滤掉盐和小组份有可能给出比采用真空蒸发所进行的浓缩更有效的浓缩。然而,膜过滤常常具有有限的容量(因此需要大型设备和高的能耗),并且由此具有有限的有效性,使得仅具有有限的浓缩因子。因此,本领域迫切需要开发一种克服上述问题的方法。发明概述已令人惊奇地发现,用可溶性铁和/或铝化合物处理过的发酵液特别适宜于膜浓缩,从而再次产生大的容量。本发明提供了一种纯化从含水蛋白质溶液中获得的蛋白质的方法,该方法包括(a)在pH值4-9之间,用可溶性的铁和/或铝化合物处理所说的蛋白质溶液;(b)用一种或多种絮凝剂处理所说的蛋白质溶液;(c)澄清所说的蛋白质溶液;和(d)膜浓缩所说的蛋白质溶液。附图简要说明用附图更详细的阐明本发明,其中图1表示在三种不同的铝酸盐剂量下超滤一种蛋白酶溶液的效能(■每100千克发酵液中含有0.8千克NaAlO2;+每100千克发酵液中含有1.6千克NaAlO2;*每100千克的发酵液中含有2.4千克NaAlO2),该试验按照实施例1的描述来进行。图2表示在三种不同的铝酸盐剂量下超滤一种淀粉酶溶液的效能(■每100千克发酵液中含有0千克NaAlO2;*每100千克的发酵液中含有4.2千克NaAlO2),该试验按照实施例2的描述来进行。图3表示经过或没有经过硫酸铝预处理的一种蛋白酶溶液的超滤效能(◆每1.54千克的发酵液中含有0.7千克的30%的Al2(SO)3·18H2O);□每1.54千克的发酵液中含有0千克的30%的Al2(SO)3·18H2O),该试验按照实施例3的描述来进行。图4表示经过或没有经过硫酸铁处理的一种蛋白酶溶液的超滤效能(□每1.54千克的发酵液中含有0.177千克的30%的Fe2(SO)3·7H2O);◆每1.54千克的发酵液中含有0千克的30%的Fe2(SO)3·7H2O),该试验按照实施例4的描述来进行。发明详述本发明提供了一种纯化从含水蛋白质溶液中获得的蛋白质的方法,该方法包括(a)在pH值4-9之间,用可溶性的铁和/或铝化合物处理所说的蛋白质溶液;(b)用一种或多种絮凝剂处理所说的蛋白质溶液;(c)澄清所说的蛋白质溶液;和(d)膜浓缩所说的蛋白质溶液。本发明的方法可以用于纯化从含水蛋白质溶液中获得的蛋白质,特别是纯化象来源于发酵液的酶之类的蛋白质。在优选的实施方案中,这种方法可用来纯化蛋白酶、脂酶、淀粉酶、纤维素酶和氧化还原酶。蛋白酶合适的蛋白酶包括动物、植物或微生物来源的那些。微生物来源是优选的。包括化学或遗传学修饰的突变体。所述的蛋白酶可以是一种丝氨酸蛋白酶,优选的是碱性微生物蛋白酶或类胰蛋白酶。碱性蛋白酶的例子是枯草杆菌蛋白酶,特别是来源于芽孢杆菌属的那些,例如枯草杆菌蛋白酶Novo,枯草杆菌蛋白酶Carlberg,枯草杆菌蛋白酶309,枯草杆菌蛋白酶147和枯草杆菌蛋白酶168(在WO89/06279中已描述)。类胰蛋白酶的例子是胰蛋白酶(例如,猪或牛来源的)和WO89/06270中所描述的镰孢属蛋白酶。优选的市售蛋白酶包括由NovoNordiskA/S(丹麦)出售的商品名为A1calse、Savinse、Primase、Durazym和Esperase的那些;由Gist-Brocades出售的商品名为Maxatase、maxacal、Maxapem和properase的那些;由GenencorInternational出售的商品名为Purafect和PurafectOXP的那些;和由SolvayEnzymes出售的商品名为Opticlean和Optimase的那些。脂酶合适的脂酶包括细菌或者真菌来源的脂酶,还包括化学或者遗传学修饰的突变体。有用的脂酶的例子包括HumicolaCanuginosa脂酶(例如,在EP258068和在EP305216中描述的);Rhizomucormiehei脂酶(例如,在EP238023中描述的);假丝酵母属脂酶(例如C.antarictica脂酶,如在EP214716中描述的C.antarictica脂酶A和B);假单胞菌属脂酶(例如产碱假单胞菌和类产破假单胞菌脂酶(如,在EP218272中描述的),葱头假单胞菌脂酶(如,在EP331376中描述的),施氏假单胞菌脂酶(如,在BP1,372,034中描述的),荧光假单胞菌脂酶);芽胞杆菌属脂酶(例如,枯草芽孢杆菌脂酶(Dartois等,(1993),生物化学和生物物理学报,1131,253-260),嗜热脂肪芽孢杆菌脂酶(JP64/744992)和短小芽孢杆菌脂酶(WO91/16422)。而且,大量克隆的脂酶可能是有用的,包括Yamaguchi等(1993,基因103,61-67)描述的沙门柏干酪青霉脂酶,Geotricumcandidum脂酶(Schimada,Y等(1989),生物化学杂志,106,383-388)和各种根霉属脂酶,例如R.delemar脂酶(Hass,M.J等,(1991),基因109,117-113),雪白根霉脂酶(Kugimiya等,(1992),Biosi.Biotech.Biochem.56,716-719)和米根霉脂酶。其它类型的脂解酶(例如角质酶)可以是有用的,例如,在WO88/09367中描述的得自门多萨假单胞菌的角质酶,或者得自腐皮镰孢pisi的角质酶(例如,在WO90/09446中描述的)。特别合适的脂酶是M1LipaseTM、LumafastTM和LipomaxTM(Gist-Brocades),LipolasTM和脂酶UltraTM(novoNordiskA/S)和脂酶PAmano(Amano制药有限公司。)。淀粉酶合适的淀粉酶(α或β)包括细菌或真菌来源的那些。也包括化学或者遗传学修饰突变体。淀粉酶包括,例如,从一种地衣芽孢杆菌菌株中获得的淀粉酶(在英国专利说明书1296839中有详细的描述)。市售的淀粉酶有Duramy1TM、Termamy1TM、Fungamy1TM和BANTM(可从NovoNordiskA/S获得)和RapidaseTM和Maxamy1PTM(可从Gist-Brocades获得)。纤维素酶合适的纤维素酶包括细菌或真菌来源的那些。也包括化学或者遗传学修饰的突变体。合适的纤维素酶在美国4435307中已公开,那些已公开的真菌类纤维素酶由Humicolainsolens产生。特别合适的纤维素酶是那些有益于颜色的纤维素酶。这样的纤维素酶的例子是在1991年9月6日提交的欧洲专利申请91202879.2中所描述的纤维素酶(NovoNordiskA/S)。市售的纤维素酶是由Humicolainsolens的菌株产生的纤维素酶TM(NovoNordiskA/S)和KAC-500(B)TM(kao公司)。氧化还原酶在“酶名称手册1992,学院出版社,Inc.SanDiego中限定和描述了氧化还原酶,它们属于一类催化电子从一种物质转移到另一种物质的酶(氧化-还原)。氧化还原酶包括脱氢酶、还原酶、氧化酶、转脱氢酶、过氧化氢酶、过氧化物酶、和加氧酶。更特殊的例子包括辣根过氧化物酶,木质素酶和其它的过氧化物酶以及氧化酶(如漆酶)。能用来产生合适的氧化还原酶的微生物属的例子是栓菌属、丝核菌属、假单胞菌属、芽胞杆菌属、链霉菌属、蜡伞属、鬼伞属、多孔菌属、假丝酵母属、弯孢属、尾孢属、Mycoliophtora、曲霉属和Scytalidium.。然而,本发明不仅仅限于由上述分类群来源的酶。所有微生物产生的具有与本发明相关的所需性质的氧化还原酶都可以使用。氧化还原酶优选地是漆酶(EC1.10.3.2)、过氧化氢酶(EC1.11.1.6)、过氧化物酶(EC1.11.1.7)或者氧化酶。一种合适的过氧化物酶是可以由微生物(如真菌或细菌)产生的过氧化物酶,在优选的实施方案中,过氧化物酶是从鬼伞属(例如,灰盖鬼伞或长根鬼伞)产生的或从芽胞杆菌属(例如,短小芽孢杆菌)产生的,特别是一种按照国际专利申请WO91/05858的过氧化物酶。所述酶还可以是可以用以下方法产生的,该方法包括在允许酶表达的条件下,在培养基中培养用重组DNA载体转化的宿主细胞,并从培养液中回收所说的酶,所说重组DNA载体携带有编码所述酶的DNA序列以及编码使得编码所述酶的DNA序列可以表达之功能的DNA序列。特别是,一种重组产生的过氧化物酶是按照WO92/16634的来源于Coprinussp(尤其是长根鬼伞或灰盖鬼伞)的过氧化物酶。已知过氧化氢酶来源于动物源(例如,母牛肝脏)和许多不同微生物。JP专利申请2-76579公开了来源于黑曲霉NFAG-2菌株的过氧化氢酶。英国专利2216149公开了来源于青霉属的过氧化氢酶。在本发明的一个优选的实施方案中,所述的过氧化氢酶是从WO92-17571中描述的Scytalidium和腐质霉属的菌株获得的。本发明的方法可以适用于没有处理的发酵液,或者适用于首先经例如pH值调节、温度调节、水稀释和/或经过一种或多种固液分离技术(如,絮凝,离心,过滤或者微过滤)处理的发酵液。按照本发明,已经发现向蛋白质溶液中添加可溶性的铁和/或铝的化合物产生令人惊奇地非常适合膜浓缩的液体,因为流量和蛋白质纯度增加。如果发酵液的pH值在4-9之间,向发酵液中添加可溶性的铁和/或铝化合物就会产生不溶性的沉淀,沉淀主要由氢氧化铁和或氢氧化铝及碳水化合物之类的杂质构成。发酵液的pH值保持在4-9之间是很重要的。通常最有效的沉淀方式是在低pH值条件下进行的。然而,在低的pH值的条件下,许多蛋白质(例如许多酶)显示出低的稳定性。这样,必须选择具有适当有效的过程和适当好的稳定性的折衷的pH值。向发酵液中添加可溶性的铁/铝化合物,随后产生氢氧化物沉淀会改变pH值,但是,在整个沉淀过程中和直到溶液的pH值稳定在4-9的范围内之后的足够的时间内,pH值应再调节到4-9。在某些情况下,为了减少调节pH值所需的酸碱的量,利用酸性的和碱性的铝铁化合物的混合物是有利的,优选地是根本不需要调节pH值。这种酸性盐和碱性盐组合的一个例子是铝酸钠和硫酸铝。如果调节pH值是必需的,任何酸或破都可以使用,但就酸而言,最好是甲酸和乙酸。沉淀不超过可忽略量的杂质所需铝/铁化合物的最小量由杂质的种类和浓度决定,但是,最小量典型地是每升蛋白质溶液0.02摩尔铝和/或铁,优选地是每升蛋白质溶液0.04摩尔铝和/或铁。沉淀不超过可忽略量的杂质所需铝/铁化合物的最大量由由蛋白质的种类和浓度决定,但是,最大量典型地是每升蛋白质溶液1.2摩尔铝和/或铁,优选地是每升蛋白质溶液1.0摩尔铝和/或铁。按照本发明,任何可溶性的铁或铝化合物或者它们的混合物都可以使用,特别是Al2(SO4)3、NaAlO2、K2Al2O4、Al(NO3)3、AlCl3、醋酸铝、甲酸铝、氯化氢氧化铝聚合物(例如可从Boliden获得的EKOFLCK)、硫酸铁、甲酸铁、乙酸铁、甲酸亚铁、乙酸亚铁。在WO94/01537中公开了在优选的实施方案中,包含可溶性铝酸盐的混合物也包含水可混合的溶剂(如酒精)。我们发现通过添加一种或多种絮凝剂有利于产生最理想的沉淀。按照本发明,有用的絮凝剂是盐,例如钙和镁盐,特别是磷酸盐,硫酸盐或氯化物(如氯化钙),以及可以是阳离子的,阴离子的或非离子的无机和/或有机聚合物,特别是阳离子和阴离子聚合物的组合体。在蛋白质溶液(例如发酵液)进行膜浓缩之前,应该用一种或多种澄清方法除去铝/铁沉淀,所述澄清方法典型的是离心、过滤、微过滤或它们的组合。按照实施例1和2所描述的,采用鼓膜过滤(drumfiltration),接着采用压滤机过滤,较易除去铝/铁沉淀。按照本发明,利用任何本领域众所周知的膜设备均能进行膜浓缩,但是,运用超滤技术来完成膜浓缩是优选的,例如空心纤维,螺旋筒或平板和框架系统。膜可以是多种材料制成的,例如多聚砜膜制成的。优选的截止值(cutoffvalue)取决于蛋白质的性质,但是,通常的截止值在1-100KD之间是优选的。按照本发明,采用各种方法例如色谱法、吸咐和/或结晶法都能达到进一步纯化蛋白质的目的。以以下实施例进一步说明本发明,无意于以任何方式限制所要求的本发明的范围。实施例1以下实施例表明,当从发酵液中纯化蛋白质时,在用多聚砜膜进行超滤时,铝酸盐的使用和容量(流量)的改善有着独特的关系。将如美国专利3723250的描述获得的包含迟缓芽孢杆菌蛋白酶(Savinase)的发酵液用于本发明的方法中。在下述方法中,采用三种不同的铝酸盐水平来完成三个试验发酵后,在含有蛋白酶的发酵液中按照表1给出的量加入水和氯化钙。然后,加入浓度为20%W/V的铝酸钠溶液(试验A每100千克发酵液中加入0.8千克;试验B每100千克发酵液中加入1.6千克和试验C每100千克发酵液中加入2.4千克),同时加入甲酸保持溶液的pH值为8。最后,按照表1给出的量加入絮凝剂(SuperflocC521和SuperflocA130)表1此后,采用鼓膜过滤和进一步的在压滤机上过滤处理发酵液。最后,用18平方米DDS35L的平板和具有GR61PP膜的框架系统,在7-15℃条件下超滤。由多聚砜制成的膜的截止值大约为20.000D。在试验A,B和C中,鼓膜过滤的酶浓度为同一水平。图1显示了三种试验的流量特征(■每100千克发酵液中含有0.8千克铝酸钠(试验A);+每100千克发酵液中含有1.6千克铝酸钠(试验B);*每100千克发酵液中含有2.4千克铝酸钠(试验C))。浓缩因子(C.F.)按V起始物/V浓缩物计算。表2显示了相应的流量数据。表2表3显示了浓缩产物(A,B和C)相应的纯度数据。表3表3中的纯度数据清楚地表明,较高剂量的硫酸铝给出较高纯度的酶/克干物质和较低浓度的有色物/活性单位。实施例2以下实施例表明,当从发酵液中纯化蛋白质时,在用空心纤维模块进行超滤时,铝酸盐的使用和容量(流量)的改善有着独特的关系。将包含地衣芽孢杆菌淀粉酶(Termamyl)的发酵液用于本发明的方法中。在下述方法中,采用三种不同的铝酸盐水平来完成三个试验发酵后,在含有淀粉酶的发酵液中按照表4给出的量加入水和氯化钙。然后,加入浓度为20%W/V的铝酸钠溶液(试验A每100千克发酵液中加入0千克;试验B每100千克发酵液中加入1千克和试验C每100千克发酵液中加入4.2千克),同时加入甲酸保持溶液的pH值为8。最后,按照表4给出的量加入絮凝剂(SuperflocC521和SuperflocA130)表4在三种絮状悬液中,调节水的水平来保持相同的酶浓度。在没有额外的自来水稀释的情况下,通过鼓膜过滤把絮状物从澄清液中分离出来。鼓膜过滤以后,产物在压滤机上进一步过滤,给出低于100的NTV值,最后,用一个截止值为5000D的Romicon/Koch的空心纤维模块(PM5,ID1.1mm)上超滤。在TMP值大约为1.2Bar,越过流动速率大约为1m/s的条件下操作模块,操作10小时之后,停止超滤。图2显示了三种不同类型滤液的为浓缩因子函数的流量(■每100千克发酵液中含有0千克铝酸钠(试验A);+每100千克发酵液中含有1千克铝酸钠(试验B);*每100千克发酵液中含有4.2千克铝酸钠(试验C))。表5总结了流量结果。表5表6显示了浓缩产物相应的纯度数据。表6表6所示的纯度数据清楚地表明,较高剂量的铝酸盐给出较低水平的碳水化合物和低浓度的有色物。实施例3以下实施例表明,当从发酵液中纯化蛋白质时,在用多聚砜膜进行超滤时,硫酸铝(中性alunogenite)的使用和容量(流量)的改善有着独特的关系。将如美国专利3723250的描述获得的包含迟缓芽孢杆菌蛋白酶(Savinase)的发酵液用于本发明的方法中。进行了两个试验第一个试验(试验A)不含硫酸铝,第二个试验(试验B)含有14%W/W的18水硫酸铝。pH值均为8.0。发酵后,在含有蛋白酶的发酵液中按照表7给出的量加入水和氯化钙。然后,加入浓度为30%W/V的硫酸铝溶液(试验B),同时加入氢氧化钠保持溶液的pH值为8。最后,按照表7给出的量加入絮凝剂(SuperflocC521和SuperflocA130)表7此后,将如此处理的发酵液进行加压真空吸滤。最后,在10℃3.0Bar下用PM10膜的27cm2Amicon池上超滤试验A和试验B的溶液。所述膜由多聚砜制成,并且截止值大约为10.000D。图3显示了两个试验的流量特征。浓缩因子(C.F.)按V起始物/V浓缩物计算,其中V为体积。产率按NPU终/NPU始·100计算,其中NPU是Novo蛋白酶单位的数量。表8显示了相应的流量数据。蛋白酶的数量按如下描述测定蛋白水解活性可以用酪蛋白做底物测定蛋白水解活性。在标准条件下(即在25℃pH值为9.5的条件下温育30分钟),一个酪蛋白单位可以定义为每分钟释放1mM伯氨基时的酶的数量(同丝氨酸标准比较确定)。表表9中的纯度数据清楚地表明,较高剂量的硫酸铝给出较高纯度的酶/克干物质和较低浓度的有色物/活性单位。实施例4以下实施例表明,当从发酵液中纯化蛋白质时,在用多聚砜膜进行超滤时,硫酸铁的使用和容量(流量)的改善有着独特的关系。将如美国专利3723250的描述获得的包含迟缓芽孢杆菌蛋白酶(Savinase)的发酵液用于本发明的方法中。进行了两个试验,第一个试验(试验A)不含硫酸铁,第二个试验(试验B)含有3.45%W/W的7水硫酸铁。pH值均为8.0。发酵后,在含有蛋白酶的发酵液中按照表10给出的量加入水和氯化钙。然后,加入浓度为30%W/V的硫酸铁溶液(试验B),同时加入氢氧化钠保持溶液的pH值为8。最后,按照表10给出的量加入絮凝剂(SuperflocC521和SuperflocA130)表10</tables>此后,将如此处理的发酵液进行加压真空吸滤。最后,在10℃3.0Bar下用PM10膜的27cm2Amicon池上超滤试验A和试验B的溶液。所述膜由多聚砜制成,并且截止值大约为10.000D。在两个试验中滤液的酶浓度为相同的水平。图4显示了两个试验的流量特征。浓缩因子(C.F.)按V起始物/V浓缩物计算,其中V为体积。产率按NPU终/NPU始·100计算,其中NPU是Novo蛋白酶单位的数量。表8显示了相应的流量数据。表11</tables>表12显示了浓缩产物(A和B)相应的纯度数据。表12</tables>表12中的纯度数据清楚地表明,较高剂量的硫酸铁给出较高纯度的酶/克干物质和较低浓度的有色物/活性单位。权利要求1.一种纯化从含水蛋白质溶液中获得的蛋白质的方法,该方法包括以下步骤(a)在pH值4-9之间,用可溶性的铁和/或铝化合物处理所说的蛋白质溶液;(b)用一种或多种絮凝剂处理所说的蛋白质溶液;(c)澄清所说的蛋白质溶液;和(d)膜浓缩所说的蛋白质溶液。2.按照权利要求1的方法,其中所说的蛋白质溶液是发酵液。3.按照权利要求1的方法,其中所说的铝化合物选自由以下物质组成的组Al2(SO4)3、NaAlO2、K2Al2O4、AlCl3、Al(NO3)3、醋酸铝、甲酸铝和它们的任何混合物。4.按照权利要求1的方法,其中所说的铁化合物选自由以下物质组成的组硫酸铁、甲酸铁、乙酸铁、甲酸亚铁、乙酸亚铁和它们的任何混合物。5.按照以上任一权利要求的方法,其中所说的铝和/或铁化合物以每升蛋白质溶液0.02-1.2摩尔,优选地以每升蛋白质溶液0.04-1.0摩尔的浓度加入。6.按照以上任一权利要求的方法,其中所说的絮凝剂选自由盐类和聚合物组成的组。7.按照权利要求1的方法,其中所说的澄清是通过离心、过滤、微量过滤和它们的组合完成的。8.按照权利要求1的方法,其中所说的膜浓缩是超滤。9.按照权利要求1的方法,其中所说的蛋白质是一种酶。10.按照权利要求8的方法,其中所说的酶是氧化还原酶、蛋白酶、脂酶、纤维素酶或者淀粉酶。全文摘要本发明涉及一种纯化从含水蛋白质溶液中获得的蛋白质的方法,该方法包括:(a)在pH值4—9之间,用可溶性的铁和/或铝化合物处理所说的蛋白质溶液;(b)用一种或多种絮凝剂处理所说的蛋白质溶液;(c)澄清所说的蛋白质溶液;和(d)膜浓缩所说的蛋白质溶液。文档编号C12N9/00GK1186498SQ96194380公开日1998年7月1日申请日期1996年5月31日优先权日1995年6月2日发明者T·K·尼尔森,M·A·拉斯特森,N-V·尼尔森申请人:诺沃挪第克公司被以下专利引用(1),