植物启动子及使用所说的启动子用于基因表达的方法

专利名称：植物启动子及使用所说的启动子用于基因表达的方法
技术领域：
本发明的领域本发明涉及对于采用基因重组技术和诸如功能性修饰等的植物工程建立新植物品种有用的以及对于诸如生产有用代谢产物的植物培养细胞进行功能修饰的植物细胞工程有用的植物启动子，以能表达有用的基因的状态将有用的基因连接到该启动子上形成的DNA片段，以及含有该DNA片段的载体。而且，本发明还涉及用该DNA片段或含该DNA片段的载体转化的植物或植物细胞或涉及由该植物细胞再生的转基因植物。另外，本发明还涉及克隆植物启动子的方法。
背景技术：
最近在实践上已使用利用基因工程技术来改进植物〔科学，244，1293-1299(1989)〕。特别是在转化系统中利用包含于土壤细菌，根癌土壤杆菌和发根病土壤杆菌中的Ti质粒和Ri质粒已取得了显著的进展，其中该系统不仅可用于迄今已转化的烟草，Arabidopsis和矮牵牛属植物，而且还可用于诸如azuki bean的双子叶植物〔NIHONSHOKUBUTU SOSHIKIBAIYOU GAKKAI(日本植物组织培养协会)会议论文摘要，p.124(1990)〕和诸如水稻的单子叶植物〔植物杂志，6，271-282(1994)〕。而且，对于单子叶植物，其代表性的例子是水稻，在实践上已使用的方法包括制备原生质体，然后以电穿孔将基因转移进其中〔自然，338，274-276(1989)〕。另外，有许多例子使用粒子枪方法将基因直接转移进植物〔植物杂志，2，275-281(1992)〕。
至于诱导有用的物质或酶的组织特异性表达的启动子，目前已分离了在各自的种子组织〔SHOKUBUTU SAIBOU KOUGAKU(植物细胞技术)，3，568-576(1991)〕，各自的叶和花组织〔科学，250，931-936(1990)〕，块茎〔SHOKUBUTU SAIBOU KOUGAKU(植物细胞技术)，3，577-587(1991)〕，块根和根瘤〔科学，250，948-954(1990)〕中特异性表达的基因并在转基因植物中分析了这些启动子的表达。
然而，迄今用于这些载体系统的大多数启动子是来自包含于根癌土壤杆菌的Ti质粒的启动子以及来自于花椰菜花叶病毒(GaMV)基因的启动子。这些启动子组成型地在不期望的转基因植物的生长阶段和组织进行表达，且它是不可控制的。另外，表达水平较低。而且，在含有诱导组织特异性表达的表达调节区的启动子中，没有一个启动子在重建植物细胞壁木葡聚糖(xyloglucan)所需的位点和时间特异性地诱导表达。
而且，在植物细胞工程领域，即使当人们试图在植物细胞中生产有用的次级代谢产物以便用于植物组织培养时，已知的许多情况下，在代谢物的生物合成系统中酶基因的表达由于存在为细胞生长所必需的植物激素而受到抑制，从而抑制了代谢物的生产〔植物生理学，80，329-387(1990)〕。因此，在为细胞生长所必需的植物激素存在的条件下增大由细胞进行的次级代谢物的生物合成是极端困难的。因此，需要采用两个阶段的培养方法，其中，在不同的条件下进行细胞的生长和次级代谢物的生物合成〔Nippon NOUGEIKAGAKU KAISHI(日本农业化学协会杂志)，60，849-854(1986)〕。
可认为这类抑制由抑制表达的植物激素和类似物的信号对于生物合成系统中酶基因的启动子的调节引起。
因此，认为经过将上述启动子被在细胞生长期间充分诱导有用物质或酶表达的启动子取代形成的嵌合基因转移进细胞在细胞生长条件下可便利次级代谢物的生物合成。然而，在本领域尚不知道特别在细胞生长期间充分诱导有用物质或酶表达的任何启动子。因此，如果可以获得特别是在细胞生长期间充分诱导有用物质或酶表达的这样一种启动子，那么可以随细胞生长实现次级代谢物的生物合成且可期望明显提高有用次级代谢物的产率。
因此，在植物工程和植物细胞工程中期望能诱导组织特异性表达或能以植物激素和类似物进行控制表达的启动子。
本发明的目的本发明的目的是提供特别是在重建植物细胞壁木葡聚糖所需的位点和时期能诱导组织特异性表达以及以植物激素和类似物进行控制表达的植物启动子。含有该启动子的DNA片段，含有该DNA片段的载体，用该DNA片段或载体转化的植物或植物细胞，从该植物细胞再生的转基因植物，以及克隆该植物启动子的方法。
本发明的概述本发明人注意到的事实是来自植物的木葡聚糖内部转移酶(endoxyloglucan transferase)(EXT)基因和其家族基因的表达具有组织特异性并且期望获得能控制该表达的启动子及其载体。本发明人进一步期望该启动子能用于改进植物细胞和植物。因此，本发明人尝试克隆了含有假定位于植物EXT基因上游的启动子的区域。然而，用已知的噬斑杂交方法难以克隆EXT基因的启动子，因为存在包括假基因的许多家族基因且经过制备具有含位于EXT基因和其家族基因上游区域片段的噬菌体并用它感染宿主获得的噬菌体的噬斑形成能力减小。
因此，本发明人进行了深入的研究。结果，本发明人成功地克隆了EXT基因的启动子并分析了启动子部分以确定其核苷酸序列。将该启动子部分裂解下来并连接到来自大肠杆菌的β-葡糖苷酸酶(GUS)基因，将所得的嵌合基因转移进植物细胞。
已证实在转移进了基因的细胞中强烈表达GUS基因。根据该相同的方法，当EXT基因的家族基因启动子部分的核苷酸序列被确定并连接到来自大肠杆菌的GUS基因上，将所得的嵌合基因转移进植物细胞时，也证实了GUS基因的强烈表达。
而且，以Northern杂交已证实含该启动子的EXT基因以组织特异性方式特别是在为重建植物细胞壁木葡聚糖所需的位点和时期进行表达且存在在细胞培养的对数生长期或静止期表达的含该启动子的各EXT基因和其家族基因。从而完成了本发明。
这就是简单地说，本发明的第一个方面涉及诱导组织特异性表达的植物启动子，其特征在于该植物启动子能控制编码具有进行植物细胞壁木葡聚糖重建之功能的酶的基因的表达，特别是，它具有在重建植物细胞壁木葡聚糖所需的位点的启动子活性或具有在重建植物细胞壁木葡聚糖所需的时期的启动子活性。
本发明的第二个方面涉及本发明第一方面的植物启动子，其特征在于它包含于选自序列表中SEQ ID NO 1、2、3、4、5、6、7和8的任意核苷酸序列中。
本发明的第三个方面涉及本发明第一方面的植物启动子，其特征在于它可与第二个方面的核苷酸序列杂交且在植物或植物细胞中或在植物细胞再生的转基因植物中具有启动子活性。
本发明的第四个方面涉及含有第一、第二或第三方面的植物启动子的DNA片段，其特征在于它以能表达有用基因的状态连接到植物启动子上。
本发明的第五个方面涉及载体，其特征在于它含有第一、第二或第三方面的植物启动子或第四方面的DNA片段。
本发明的第六个方面涉及用第四方面的DNA片段或第五方面的载体转化的植物或植物细胞或涉及从该植物细胞再生的转基因植物。
本发明的第七个方面涉及生产蛋白质的方法，其特征在于使用至少一种第六个方面的转化的植物和植物细胞以及从该植物细胞再生的转基因植物。
本发明的第八个方面涉及控制植物形态的方法，其特征在于使用第四方面的DNA片段或第五方面的载体。
本发明的第九个方面涉及克隆植物启动子的方法，其特征在于使用编码具有进行植物细胞壁木葡聚糖重建之功能的酶的基因，特别是编码木葡聚糖内部转移酶的基因或其功能等价物。
本发明的详细解释本文使用的“启动子”含有位于转录起始位点(+1)上游20至30个碱基对处且负责以RNA聚合酶从精确位置起始转录的TATA盒区或TATA-盒样区域。然而不必局限于在这些区域之前和之后且可以含有除上述区域之外的用于调节表达的与非RNA聚合酶的蛋白质相联所需的任何其它区域。
而且有时在本说明书中使用术语“启动子区域”，它指含有本说明书所述的启动子的区域。
本文使用的“启动子活性”指当为了表达将有用的基因连接到启动子下游的某一位点上然后将所得基因转移进宿主时，在宿主(植物，植物细胞或从植物细胞再生的转基因植物)外或内生产有用基因的基因产物的能力和功能。
一般来说，经过将编码能容易测定的蛋白质的基因(报告基因)连接到启动子下游的某一位点以进行表达，将所得的启动子转移进宿主，然后测量该蛋白质的表达水平将启动子活性表示为阳性或阴性，或强或弱。因此，当有用的基因连接到启动子下游的某一位点以进行表达，然后将所得的基因转移进宿主，证实有用的基因的基因产物在宿主外或内表达时，表明该启动子在转移的宿主中具有启动子活性。
本文使用的术语“编码具有进行植物细胞壁木葡聚糖重建之功能的酶的基因”指编码特别是在植物细胞壁木葡聚糖重建中表达的酶的基因。具体地说，是指编码木葡聚糖内部转移酶(EXT)的基因和EXT基因的家族基因。EXT基因的家族基因的例子包括BRU1基因〔植物生理学，104，161-170(1994)〕，meri-5基因〔植物细胞，3，359-370(1991)〕，和在本发明中获得的XRP基因。
本文使用的术语“用于植物细胞壁木葡聚糖重建所需的位点”指编码具有进行植物细胞壁木葡聚糖重建之功能的酶的基因特异性地表达的位点，至于编码具有进行植物细胞壁木葡聚糖重建之功能的酶的基因的特异性的表达，发生表达的位点包含于本文所述的植物细胞壁木葡聚糖重建所需的位点中。
例如，有时，作为编码具有进行植物细胞壁木葡聚糖重建之功能的酶的基因之一的EXT基因的特异性表达位点与即使是相同植物中的EXT基因的家族基因的那些位点不同。然而，它们全部包括在本说明书所述的重建植物细胞壁木葡聚糖所需的位点中。
本文使用的“重建植物细胞壁木葡聚糖的植物生长时期”指编码具有进行植物细胞壁木葡聚糖重建之功能的酶的基因特异性地表达的时期，至于编码具有进行植物细胞壁木葡聚糖重建之功能的酶的基因的特异性的表达，发生表达的时期包含于本文所述的植物细胞壁木葡聚糖重建所需的时期中。
例如，有时，作为编码具有进行植物细胞壁木葡聚糖重建之功能的酶的基因之一的EXT基因的表达的特异性时期与即使是相同植物中EXT基因的家族基因的时期不同，然而，所有这些时期包括在本说明书所述的重建植物细胞壁木葡聚糖所需的时期中。
例如，在培养细胞中，在对数生长期有丝分裂细胞丰富并进行活跃的细胞壁合成和重建。在静止期，细胞主动延伸，从而需要细胞壁的重建。因此，在两个时期都需要细胞壁的重建。如下文实施例10所述，来自烟草的EXT基因在培养细胞中的表达时期与来自烟草EXT基因的一个家族基因XRT基因完全不同。换句话说，来自烟草的EXT基因在对数期特异性地强烈表达，而在静止期该表达减少到大约1/20。相反，来自烟草的EXT基因的家族基因XRT基因在静止期特异性地强烈表达。因此，经过编码该酶的基因的启动子可控制表现出相同酶活性的酶的特异性表达时期。本文所述的重建植物细胞壁木葡聚糖的时期的例子也包括在这类情况下的对数期和静止期。
本文使用的术语“功能上等价”意义如下除了编码该蛋白质的基因的多态性和突变外，经受了在活体中发生和在纯化过程中对形成的蛋白质进行修饰来对其氨基酸序列上进行诸如氨基酸的缺失、插入、添加、和取代的各种突变天然存在的蛋白质。然而，已知存在与未突变的蛋白质表现出基本上等价的生理学和生物学活性的分子。这种具有不同结构但具有基本上等价的功能的分子定义的为功能等价物。
如果上述突变是人工导入蛋白质的氨基酸序列，那么同样适用。如果它们表现出与未突变的蛋白质基本上等价的生物学活性，那么在这些情况下制备的各种突变体可解释为功能等价物。
例如，据说大肠杆菌表达的蛋白质N末端存在的甲硫氨酸残基在许多情况下由甲硫氨酸氨肽酶的作用而去掉。然而，有时，根据蛋白质的特定类型形成具有或不具有甲硫氨酸残基的两种蛋白质。尽管如此，在许多情况下甲硫氨酸残基的存在或不存在不影响该蛋白质的活性。而且，已知用丝氨酸残基取代白细胞介素-2(IL-2)的某些半胱氨酸残基获得的多肽保持白细胞介素-2的活性〔科学，224，1431-1433〕。
而且，在以基因工程进行的蛋白质生产中，蛋白质常作为融合蛋白被表达。例如，为了提高目的蛋白的表达水平，将来自另一蛋白质的N端肽添加到目的蛋白质的N端。而且，为了便于使用与表达后添加的肽链具有亲和性的载体纯化目的蛋白质而将合适的肽链添加到目的蛋白质的N端或C端。
而且，已知对于基团中的每个氨基酸，有1至6个密码子(3核苷酸组)限定一个具体的氨基酸。因此，有许多基因可编码一个具体的氨基酸序列，尽管基因的数目取决于氨基酸序列。在自然界中基因并不总是稳定存在，在其核苷酸上常发生突变。如果在基因上出现的突变不引起所编码的氨基酸序列有任何改变(称为沉默突变)，在这种情况下，可以说形成了编码相同氨基酸顺序的不同基因。因此，即使是分离了编码某个限定的氨基酸序列的基因，也不能否定在含该基因的活生物体传代中形成编码相同氨基酸序列的许多类基因的可能性。
而且，采用各种基因工程技术人工制备编码相同氨基酸序列的许多类基因并不困难。
例如，在以基因工程进行的蛋白质生产中，当用于编码目的蛋白的固有基因中的某个密码子在所使用的宿主中不常使用时，有时会出现低表达水平。在这种情况下，已尝试经过将所说的密码子人工替换成在宿主中更普遍的另一密码子而不影响所编码的氨基酸序列可增强目的蛋白的表达。不用说，以这种方式很可能人工制备各种编码某一氨基酸序列的一些基因。因此，在本发明中甚至包含这些人工制备的不同基因，只要它们编码可从本发明公开的核苷酸序列推导的氨基酸序列。
而且，经过在目的蛋白质的氨基酸序列中缺失、插入、添加和取代一个或多个氨基酸进行了至少一种修饰的许多多肽具有与目的蛋白功能上相当的活性。编码这些多肽的基因也包括在本发明的功能等价物中，不论它们是从自然分离的还是人工制备的。
一般来说，在许多情况下，编码功能等价物的基因具有同源性。因此，能与在本发明中使用的EXT基因杂交的且编码具有相同功能的多肽基因也包含在本发明的功能等价物中。
本文所述的“有用基因”的例子包括编码在植物或植物细胞或植物细胞再生的转基因植物中可表达的蛋白质的基因，来自植物或植物细胞或植物细胞再生的转基因植物中的基因的反义RNA、编码来自植物或植物细胞或植物细胞再生的转基因植物的转录因子结合蛋白的基因或具有转录因子结合位点的序列或类似序列的假目标(decoy)和裂解来自植物或植物细胞或植物细胞再生的转基因植物的mRNA的核酶。
编码在植物或植物细胞或植物细胞再生的转基因植物中可表达的蛋白质的基因的例子有来自植物的基因，但它们不限于在本发明中所涉及的基因，以及来自诸如细菌、酵母、放线菌、真菌、子囊菌、担子菌等的微生物的基因和来自诸如动物等的活生物体的基因，只要它们能在植物或植物细胞或植物细胞再生的转基因植物中表达。
本文所述的“假目标”指编码来自植物或植物细胞或植物再生的转基因植物的转录因子的结合蛋白的DNA基因或具有转录因子结合位点的序列或类似序列的DNA，当“假目标”转移进细胞时，它抑制转录因子的作用。
本文所述的“核酶”指裂解限定蛋白质的mRNA以抑制这些限定蛋白质翻译的分子。核酶可从编码限定蛋白质的基因序列设计。本文所述的核酶的例子包括能裂解限定蛋白质的mRNA以抑制这些限定蛋白质翻译的任何核酶，而不论其类型，如锤头型核酶、发夹型核酶、δ-型核酶等。
至于含有具有进行植物细胞壁木葡聚糖重建功能的酶的植物，在本发明中可使用任何植物。植物的例子包括双子叶植物，如，azukibean、大豆、Arabidopsis、西红柿、马铃薯、白菜、向日葵、棉花、烟草等和单子叶植物，如小麦、水稻、玉米、甘蔗等，其中特别采用具有以组织特异性方式表达的EXT酶和EXT类似物酶的植物。
EXT基因是植物中的管家基因，因此存在很多家族基因。至于含有这些家族基因启动子区的DNA片段，用常规噬斑杂交方法克隆EXT基因的启动子并不容易，因为存在包括假基因的许多家族基因且当制备具有EXT基因或其家族基因的上游区的片段的噬菌体并感染宿主时获得的噬斑的噬斑形成能力减少。然而，为了克服这两个困难，经过采用EXT基因和其家族基因的cDNA作探针，基因组DNA作为靶可将杂交应用于包括双子叶植物和单子叶植物的任何植物，经过详细考察PCR方法也可能进行分离。
至于探针，可使用不同于靶物种的植物的EXT基因和其家族基因的cDNA。然而，为了更有效地杂交，优选来自与靶相同物种的植物的cDNA作为探针。本发明从，azuki bean(Vigna angularis)、大豆(Glycinemax)、Arabidopsis(Arabidopsis thaliana)、西红柿(Lycopersiconesculentum)、小麦(Triticum aestivum)、烟草(Nicotinianatabacum)、水稻(Oryza sativa)、玉米(zea mays)中分离了EXT基因的cDNA。在这些cDNA分子中，azuki bean、大豆、Arabidopsis、西红柿和小麦的全长或部分核苷酸序列以及水稻的限制性图谱和玉米的限制性图谱在EP-0562836 A1(1993)中描述，烟草的部分核苷酸序列已在JP 7-79778A中描述。另外，水稻和玉米的部分核苷酸序列在序列表的SEQ ID NO 9和SEQ ID NO 10中显示。
使用EXT基因的全长或部分cDNA作探针可分离家族基因的cDNA。例如，经过使用在所有上述EXT基因cDNA与Tropaeolum majus木葡聚糖酶基因之间保守的序列作探针可从许多种植物中分离家族基因的cDNA〔植物杂志，3，701-711(1993)〕。另外，经过根据保守区域合成引物并然后进行PCR可从许多种植物中分离家族基因的cDNA〔共有PCR；分子和细胞生物学，13，4745-4752(1993)〕。
下文中，本发明作为举例详细解释了azuki bean。
使用azuki bean(WATANABE SHUSHI Co.，Ltd.)种子以EP-0562836 A1(1993)所述的方法制备的cDNA文库可用于寻找用EXT基因的家族基因转化的克隆。例如，经过从azuki bean制备RNA，接着使用 Oligotex-dT30(NIHON Roche Co.，Ltd.)纯化poly(A)+RNA，然后，例如经过用poly(A)+RNA和Oligo-dT引物以逆转录酶处理以制备cDNA可制备出cDNA文库。经过使用cDNA合成试剂盒系统阳性(Amersham)可从cDNA制备cDNA文库。这些cDNA文库可用于使用EXT基因的cDNA作探针进行噬菌斑杂交以获得。例如选自5×104个噬斑的96个阳性噬斑。以平板裂解方法扩增这些噬斑(TManiatis等，分子克隆，实验手册，第二版，第2章，p 60-66，冷泉港实验室出版社1989年出版)，接着经斑点杂交根据信号强度分类噬斑。
从表现出信号强度不同于azuki bean的EXT基因的两个噬斑中分离噬菌体并提取插入其中的DNA。用限制性酶EcoR I(TAKARASHUZO Co. Ltd.)裂解这些DNA并经琼脂糖凝胶电泳鉴定DNA片段的长度。纯化鉴定的大约730bp、430bp和1090bp的DNA片段并在pUC18的EcoR I位点亚克隆(TAKARA SHUZO Co.，Ltd.)所得的质粒分别命名为pVX44-1，pVX44-2和pVX45-1。使用BcaBESTTM双脱氧测序试剂盒(TAKARA SHUZO Co.，Ltd.)根据Sanger的方法将这些质粒用于测定DNA片段的核苷酸序列，表明克隆了与EXT基因(azuki bean EXT)具有高度同源性的两个基因。其部分核苷酸序列在序列表的SEQ ID NO 11和SEQ ID NO 12中显示(azuki bean EXT2和azuki bean EXT3)。
使用一个上述保守序列(SEQ ID NO 13)作探针将上述cDNA文库用于噬斑杂交以便获得，例如从8×103个噬斑中选择的8个阳性噬斑。提取插入噬斑噬菌体载体中的DNA，例如可获得与EXT基因及与其家族基因，BRU1基因〔植物生理学，104，161-170(1994)〕和meri-5基因〔植物细胞，3，359-270(1991)〕具有高度同源性的DNA片段(大约1.2kbp)。在序列表中以SEQ ID NO 14显示了部分该DNA的核苷酸序列(azuki bean XRP1)。
而且，使用上述保守序列和oligo-dT引物可将上述cDNA文库用于例如PCR。结果可获得不同于例如azuki bean EXT，azuki beanEXT2，azuki bean EXT3，和azuki bean XRP1的家族基因的DNA片段。部分该DNA核苷酸序列在序列表的SEQ ID NO 15中显示(azuki bean XRP2)。
在非azuki bean的植物中，使用一个上述保守序列(SEQ IDNO 13)作探针的噬斑杂交可用于获得家族基因的cDNA。例如，使用一个上述保守序列(SEQ ID NO13)作探针可将商业上可获得的烟草cDNA文库用于噬斑杂交以获得从大约3×104个噬斑中检到的30个阳性噬斑。提取插入所得噬斑的噬菌体载体中的DNA，可获得例如与EXT基因及BRU1基因〔植物生理学，104，161-170(1994)〕和meri-5基因〔植物细胞，3，359-270(1991)〕高度同源的DNA片段(大约1.2kbp)。部分该DNA的核苷酸序列在序列表SEQ ID NO16中显示(烟草XRP1)。
接着，例如，经过用常规方法从azuki bean叶制备基因组DNA，使用限制酶Sau3A I对其进行部分消化，使用λGEM-11 Xho I半位点臂克隆系统(Promega Biotec)将部分消化产物连接到例如载体λGEM-11上，接着用体外包装试剂盒(Stratagene)包装，然后将所得的片段感染进宿主可获得azuki bean的基因组DNA文库。该文库可用于例如使用EP-0562836 A1(1993)所述的EXT基因的cDNA作探针进行的杂交以搜寻具有含该基因启动子区的DNA片段的噬菌体。例如，从大约1×105个噬斑获得10个阳性噬斑，提取插入噬斑噬菌体载体中的DNA以获得大约15kbp平均长度的DNA片段。这些DNA片段用于使用含EXT基因cDNA的DNA片段作探针进行的Southern杂交，接着将目的片段亚克隆进质粒载体以分析部分核苷酸序列。结果，例如，可证实插入所有噬斑中噬菌体载体的DNA片段具有类似于EXT基因的序列。
这些研究表明，易于进行含EXT基因和其家族基因的启动子的区域的克隆。然而，事实上，引起了下列2个问题，且以常规噬斑杂交克隆EXT基因的任何启动子都失败了。
第一个问题是存在包括假基因的许多家族基因，不易用常规杂交鉴定。因此，为了进行确实是目标cDNA克隆的对应物的基因组DNA克隆的克隆，必须在粗筛可能是对应物的基因组DNA克隆后分析和测定各基因组DNA的所有核苷酸序列。另外，必须经过从cDNA分析许多家族基因，然后使用其核苷酸序列特异性的寡聚探针(SSOP)进行杂交以限定基因组DNA克隆来弄清能区分家族基因中各基因的核苷酸序列。
第二个问题涉及含EXT基因和其家族基因的启动子区的DNA片段转移引起的强抑制作用以及在宿主细菌(大肠杆菌)中噬菌体感染时出现的噬斑形成能力的减少。事实上，难以发现上面限定的含EXT基因启动子区的噬菌体，因为与正常噬菌体相比形成的噬斑极小。这一问题首先在重复实验过程中出现，以及错误地分离目标启动子基因，直到克隆实际完成时，都是相当不可预料的。
然后，本发明人为解决上述问题进行了深入的研究，经过使用包括改进的PCR方法的各种基因工程技术逐一可靠地解决了这些问题后结果首先成功地克隆了含有EXT基因启动子的区域。
下文中，EXT基因和其家族基因在下面说明中一并称为EXT-家族基因。
启动子的克隆如果存在上述噬斑形成活性抑制的影响，即使从整个基因组DNA文库重复筛选后，也不可能克隆出EXT基因的启动子区。那么，可想象出制备对抑制不敏感的短基因组片段然后在抑制影响最小的条件下进行克隆。为达到该目的，需要首先用各种限制性酶完全消化基因组DNA，接着进行基因组Southern杂交。然后推断何种大小的具有何种限制性酶末端位点的DNA片段含有EXT基因的目的启动子区。
经过用由此限定的限制性酶完全消化基因组DNA并从琼脂糖凝胶中回收具有平均限定的DNA片段大小的外周DNA片段可制备由此限定的DNA大小的部分基因组DNA文库。
结果，可获得与原始完整基因组DNA文库相比浓缩了大约10倍以上的部分基因组DNA文库。例如，用常规方法从azuki bean叶制备的基因组DNA用例如限制性酶BamH I、EcoR I和Hind III(均来自TAKARA SHUZO Co.，Ltd.)进行消化，接着进行基因组Southern杂交以显示形成2或3条带，其中以BamH I消化鉴定最强的带为超过15kbp，以EcoR I消化的为大约8.5kbp，以Hind III消化鉴定的为大约8.5kbp，以EcoR I-Hind III双消化的鉴定为大约5.5kbp。
在这些带中，从琼脂糖凝胶中回收经EcoR I-Hind III双消化鉴定为大约5.5kbp的带被连接到λEXlox(Novagen)的EcoR I和Hind III位点上，接着经体外包装试剂盒(Stratagene)包装并感染宿主细菌，从而能够获得具有平均大约为5.5kbp大小的DNA片段的部分基因组DNA文库，在该DNA片段两端具有EcoR I和Hind III位点，且获得的文库与完整基因组DNA文库相比更浓缩。如上所述，使用EXT基因的cDNA作探针对该浓缩的文库进行杂交以选择具有含该基因启动子区的DNA片段的噬菌体。例如，以1.3×105个噬斑选出的8个阳性噬斑使用根据与非EXT基因的家族基因cDNA同源性较低的5′非编码区合成的寡核苷酸VAN-U7(SEQ ID NO17)作探针进行杂交，从而证实，例如8个噬菌斑中有4个是含有EXT基因cDNA的DNA片段。λEXlox可自动进行亚克隆，因为该DNA片段感染进具有PlCre基因的宿主细菌后亚克隆的区域在宿主中经自动亚克隆自动转变成pUC型质粒。
使用插入了DNA片段的质粒进行DNA序列分析，接着比较DNA片段与EXT基因的cDNA序列，鉴定该DNA片段是否含有EXT基因的启动子。
由此鉴定的片段的部分DNA核苷酸序列在序列表的SEQ ID NO18(EXT编码区上游)和SEQ ID NO19(DNA片段下游)中显示。
下文为了方便将EcoR I位点5′上游称为“启动子上游区”，3′-下游称为“启动子下游区”。
用该片段整合的质粒命名为pVXG303，而用pVXG303转化的大肠杆菌JM 109菌株命名和表示为大肠杆菌JM 109/pVXG303并按布达佩斯条约以保藏号FERM EP-5390于1995年3月15日(原始保存日)保存于国家生物科学和人类技术研究所工业科学技术代理部，工业贸易和工业部(1-3，Higashi 1-Chome，Tsukuba-Shi，Ibaragi-Kem，305，日本)。
经过克隆按上面所述鉴定的大约8.5kbp的Hind III片段可获得启动子上游区。为达到该目的，用限制性酶Hind III完全消化azuki bean的基因组DNA，然后以上面所述相同的方式经0.7％琼脂糖凝胶电泳分离回收DNA片段。另外，用限制性酶Spe I(TAKARA SHUZO Co.Ltd.)完全消化λZAP II(Stratagene)，接着在dCTP和dTTP存在下进行补平反应，形成半补平的位点。如上面所述在dATP和dGTP存在下对Hind III片段(平均大约8.5kbp)进行补平反应，接着连接到λZAP II半补平位点上，使能够进行制备基因组DNA文库试验。
然而，对于包装来说该λDNA的大小是勉强合格的，从而预期其文库的滴度不会很高。事实上，该文库的滴度低到能有效地进行筛选。其大小也很小，以至于不能使用诸如λDASH II(Stratagene)的取代型噬菌体载体。事实上，经过将回收的Hind III片段(平均大约8.5kbp)连接到λDASH II的Hind III位点获得的文库滴度很低，以致于能有效地进行筛选。
另外，使用EXT基因的cDNA作探针从使用λGEM 11(PromegaBiotec)的完整基因组DNA文库进行筛选是唯一的方法。然而，预期不能获得含有EXT基因目的启动子的任何片段。因为受噬斑形成抑制的影响且存在如上所述的许多家族基因。
于是，预期使用新克隆的基因组片段作探针与使用cDNA相比会导致与含目标启动子的片段更强烈地进行杂交。因此，需要使用该基因组DNA片段作探针进行噬斑杂交，然后筛选尽可能多的噬斑。
该筛选的结果是，例如，从2×105个噬斑中获得了20个阳性信号，进一步筛选能分离阳性克隆。然而，基于插入有含目标启动子的片段的噬菌体载体而获得的噬斑的大小很小，以致于其它噬斑的微弱污染会导致噬菌体DNA提取时专一形成来自污染的噬菌体的DNA，这是无论在平板溶胞产物方法中或培养肉汤方法中以更快的增殖速率优先增殖污染的噬菌体的结果。
事实上，在进行筛选前根本未期望出现这些问题。因此，相应于该信号的噬斑可经过重复的第二次筛选来获得，其中原代噬菌体的稀释溶液较薄地进行喷洒，或进一步进行第三次筛选。令人惊奇的是在第三次筛选中，仔细检查平板可在相应于第一次粗筛未鉴定的信号位置检查到一个噬斑，它比阴性噬斑要小得多。为了仅增殖来自该噬斑的噬菌体，小心操作由此获得的非常小的噬斑以防止其它噬斑的污染。插入噬菌体载体的DNA片段的提取能够提供，例如，大约11kbp长的DNA片段。
另外，经过使用根据与非EXT基因的家族基因的cDNA同源性较低的5′非编码区合成的寡核苷酸VAN-U7(SEQ ID NO17)作探针进行共同杂交可在二次筛选中有效地筛选出含目标EXT基因的克隆。
用例如，限制性酶Hind III(TAKARA SHUZO Co.Ltd.)消化DNA片段，接着使用上述azuki bean的EXT基因的基因组DNA作探针进行基因组的Southern杂交，能限定含该基因启动子区的更短的DNA片段。该片段插入质粒的限制性位点，将插入有该片段的质粒转移进合适的宿主。另外，使用插入有所说DNA片段的质粒进行DNA测序分析，接着用比较DNA片段与EXT基因的cDNA序列，能够判断该DNA片段是否含有EXT基因的启动子。而且，该片段能作为含目标启动子上游区的片段用于进行亚克隆。由此获得的在两端具有Hind III和EcoR I的亚克隆的DNA片段整合进pUC118(TAKARA SHUZO Co.Ltd.)的Hind III和EcoR I位点以允许测定核苷酸序列。

图1显示了该片段的限制性图谱。该核苷酸序列在序列表的SEQ ID NO20中表示。
用含目标启动子上游区的片段整合进pUC118的Hind III和EcoR I位点的质粒命名为pVXP 101，而用pVXP 101转化的大肠杆菌JM 109菌株命名并表示为大肠杆菌JM 109/pVXP 101且根据布达佩斯条约以保藏号FERM BP-5389于1995年2月23日(原始保存日)保存于国家生物科学和人类技术研究所，工业科学和技术代理，工业贸易和工业部(1-3，Higashi 1-Chome，Tsukuba-Shi，Ibaragi-Ken，305，日本)。
上述程序并不总能应用于含有目标启动子区的DNA片段的克隆。例如，在该片段对宿主细菌是致命的或有生长抑制作用的情况下。事实上，含EXT基因启动子的上述噬菌体形成的噬斑很小，不能找到并应用于筛选。
如此，可想象得到PCR方法作为克隆含EXT基因启动子区的DNA片段的另一方法。
扩增该未知序列的PCR方法包括反向PCR〔植物杂志，7，157-164(1995)〕和使用序列盒的PCR〔TANPAKUSHITU KAKUSANKOUSO(蛋白质，核酸和酶)，35，3157-3163(1990)〕。
然而，当高等动物或植物的基因组DNA用作模板时，常规反向PCR仅对扩增长度达到大约1kbp的DNA链有效。另外，使用序列盒的PCR同样仅对长度达到大约1kbp的片段的扩增有效。
另外，在反向PCR中用于自我连接的限制性酶的选择受到限制，其中使用识别4bp的限制性酶对获得扩增的片段是关键的。在使用序列盒的PCR中，需要试验具有各种识别6bp的限制性酶位点的许多序列盒，从而需要付出较大的劳动。而且，对于含象启动子区的AT富集偏好性序列的DNA片段，不用说识别6bp的限制性酶位点，即使识别4bp的限制性酶位点的存在的可能性也较低，因此在反向PCR和使用序列盒的PCR中都需要扩增长的靶DNA。于是，本发明人发现了可改进能仅扩增短DNA链的常规方法以便能经过优化自我连接条件和使用TaKaRa LAPCR试剂盒(TAKARA SHUZO Co.Ltd.)在反向PCR中有效地扩增长度超过大约2kbp的DNA。
另外，本发明人发现了2个阶段的PCR程序，其中，第一次PCR的反应溶液稀释后用作第二次PCR的模板以便有效地扩增目的DNA片段，从而得以解决上述问题。
例如，将从azuki bean叶制备的基因组DNA使用限制性酶Hind III进行完全消化，接着用T4 DNA连接酶(TAKARA SHUZO Co.Ltd.)进行自我连接。由于自我连接反应的效率极大地取决于该反应系统的体积，优选调节反应系统的体积以便使DNA浓度不超过4μg/ml。
使用由此获得的环状基因组DNA作模板进行PCR。使用的引物的例子包括诸如引物VAN-UH1(SEQ ID NO21)，引物VAN-L(SEQ ID NO22)，引物VAN-UH2(SEQ ID NO23)，引物VAN-L 16(SEQ ID NO24)，引物VAN-UH3(SEQ IDNO25)和引物VAN-L3(SEQ ID NO26)的序列，它们根据上述pVXG303的EXT基因的基因组DNA序列(SEQ ID NO18和SEQ ID NO19)合成。
为了有效地扩增目的DNA片段，两阶段的PCR方法是有效的。例如，使用上述引物VAN-UH1(SEQ ID NO21)和引物VAN-L(SEQ ID NO22)作引物进行第一次PCR可扩增大约1.8kbp的DNA片段，然后利用所得的反应产物作模板，使用引物VAN-UH2(SEQ ID NO23)和引物VAN-L3(SEQ ID NO26)进行第二次PCR。
然而，如果以与上面所述相同的方式进行第一次PCR，然后使用引物VAN-UH2(SEQ ID NO23)和引物VAN-L16(SEQ IDNO24)或引物VAN-UH3(SEQ ID NO25)和引物VAN-L3(SEQ ID NO26)作引物进行第二次PCR，扩增并不有效。换句话说，扩增的效率取决于引物的选择。因此，优选从一些制备的组合中发现最合适的引物组合。
应以下面的TaKaRa LA PCR试剂盒(TAKARA SHUZO Co.Ltd.)的方案进行PCR反应，除了反应温度和循环条件不同外。因此，第一次PCR使用50μl反应溶液在94℃(0.5分钟)，55℃(1.0分钟)和72℃(2分钟)进行30次循环，然后在相同条件下进行第二次PCR。于是，需要制备第一次PCR反应的一些稀释的溶液以发现在第二次PCR中所加的最佳量。
大约1.8kbp的扩增产物可亚克隆进(例如)pUC 119(TAKARASHUZO Co.Ltd.)的Hinc II位点。比较该片段的两端的核苷酸序列与以前部分克隆的上述EXT基因的基因组DNA的序列(SEQ ID NO18和SEQ ID NO19)，揭示所说的片段是否是含有与前面序列连续的EXT基因启动子的DNA片段。图2显示了该片段的限制性图谱。该片段的核苷酸序列在序列表的SEQ ID NO27中显示。用该PCR产物整合的质粒命名为pVXP-H3，而用pVXP-H3转化的大肠杆菌JM 109菌株命名和表示为大肠杆菌JM 109/pVXP-H3并按布达佩斯条约以保藏号FERM BP-5388于1995年2月17日(原始保存日)保存于国家生物科学和人类技术研究所，工业科学和技术代理，工业贸易和工业部(1-3，Higashi 1-Chome，Tsukuba-Shi，Ibaragi-Ken，305，日本)。
序列表中SEQ ID NO1和SEQ ID NO2显示了编码由序列表中SEQ ID NO18和SEQ ID NO19与SEQ ID NO27组成的EXT N端氨基酸序列的基因上游的核苷酸序列。
作为核苷酸序列分析和比较序列表中SEQ ID NO1与SEQ IDNO2的结果，揭示了两个序列是完全相同的，在全部区域中仅除了在SEQ ID NO1第782位残基A的下游和SEQ ID NO2残基A的下游有2处区别。这两个区别包括在SEQ ID NO1中第829位残基基A的下游与SEQ ID NO2中第921位残基A的下游连续A残基的数目不同(SEQ ID NO1为16个碱基，在SEQ ID NO2中有14个碱基)以及SEQ ID NO1的第947位残基T和SEQ ID NO2的第1037位残基C之间不同。这一观察结果揭示了这一共同序列具有在为植物细胞壁木葡聚糖重建所需的位点和时期调节特异性表达的区域。
经过以克隆含EXT基因启动子区的DNA片段的方法相同的方式解决问题可克隆含家族基因启动子区的DNA片段。而且，经过比较所得的克隆片段与确实在为植物细胞壁木葡聚糖重建所需的位点和时期特异性表达的一些该家族基因可鉴定在植物中组织特异性表达所必需的区域。另外，以相同的可鉴定培养细胞中在对数生长期特别强烈表达所必需的区域。
表达位点和表达时期的测量-Northern杂交为了分析以启动子进行的表达，例如，可使用azuki bean的基因cDNA作探针经过Northern杂交测量azuki bean植物中的表达位点和表达时期。另外，例如，可使用烟草EXT基因cDNA作探针经Northern杂交测量烟草培养细胞中的表达时期。
以例如在EP-0562836 A1(1993)和JP7-79778A中所述的方法可克隆azuki bean的EXT基因cDNA和烟草EXT基因cDNA。
例如，以硫氰酸胍方法或酚-SDS方法可进行从azuki bean植物和诸如烟草培养细胞的植物组织提取RNA。例如，由此提取的总RNA可进行琼脂糖凝胶电泳分析，接着转移到膜上，然后使用该膜进行杂交。例如，经过比较在琼脂糖凝胶电泳上的rRNA水平可在相同水平上制备总RNA水平，从而得以正确比较表达的EXT基因mRNA的水平。
例如，使用播种后生长40天的azuki bean植物，对经硫氰酸胍方法从茎、芽和叶提取的总RNA进行琼脂糖凝胶电泳，接着使用具有对不同于其它家族基因cDNA的EXT基因cDNA特异性的序列的DNA作探针进行Northern杂交。杂交后获得的滤膜在强化条件下洗涤，上述具有对EXT基因cDNA特异性的序列的探针仅能与靶EXT基因mRNA配对而不能与其它家族基因mRNA配对，从而得以仅检测到目的EXT基因的表达。以mRNA的大小也能证实该表达。比较在各植物组织中EXT基因mRNA的水平能揭示EXT基因mRNA在所有位点都表达且特别是在植物细胞壁木葡聚糖重建活跃的茎中强烈表达。而且，使用azuki bean幼苗，从每1cm长的上胚轴切块中提取的总RNA进行琼脂糖凝胶电泳分析，接着使用EXT基因cDNA作探针进行Northern杂交。以这种方式可揭示在上胚轴生长最快的位点，即在植物细胞壁木葡聚糖重建活跃的位点表达最强。
以上面所述相同的方式，使用对各自家族基因特异性的探针经Northern杂交可清楚地限定各家族基因的表达位点。
培养1、4、6、8和10天的各烟草BY2培养细胞〔当天发酵技术，p689，NIHON HAKKOU KOUGAKUKAI(日本发酵技术协会)出版，1972〕经抽吸过滤收集，使用液氮立即进行迅速冷冻，然后保存于-80℃直至进行RNA提取操作。经酚-SDS方法从这些细胞提取的总RNA可经琼脂糖凝胶电泳进行分析，接着使用具有对烟草EXT基因cDNA特异性的序列的DNA作探针进行Northern杂交。比较表达能揭示出在任何时间发生的表达且在对数生长期(4天)时表达特别强烈。也可揭示出，与此相反，一个家族基因，烟草XRP1基因在静止期强烈表达，在对数期不会如此强烈地表达。
以RT-PCT鉴定表达位点和表达时期另外，RT(逆转录酶)-PCR方法可用于简单地分析由这些EXT基因的家族基因启动子控制的表达。
例如，分别收集接种后生长40天的azuki bean植物的各茎、芽和叶，立即使用液氮进行迅速冷冻，然后在-80℃保存直至进行RNA提取操作。例如，以硫氰酸胍方法从这些组织提取总RNA。使用TaKaRaRNA PCR试剂盒(TAKARA SHUZO Co.Ltd.)可将各总RNA用作RT-PCR的模板以鉴定表达位点。在这种情况下，被各家族基因启动子控制的表达位点的特异性可使用对各自家族基因特异性的序列作引物来鉴定。
例如，使用播种后在黑暗中生长5天的azuki bean植物，分别收集上胚轴的各1cm长的切块，立即使用液氮进行迅速冷冻，然后在-80℃保存直至进行RNA提取操作。例如以硫氰酸胍方法从这些组织提取的各总RNA可使用TaKaRa RNA PCR试剂盒(TAKARA SHUZOCo.Ltd.)用作RT-PCR的模板更详细地鉴定表达位点和时期的特异性。
例如，经抽吸过滤收集培养0、1、2、4、6、8和10天的各烟草BY2培养细胞，立即使用液氮进行迅速冷冻，然后在-80℃下保存直至进行RNA提取操作。以酚-SDS方法从这些细胞提取的各总RNA可使用TaKaRa RNA PCR试剂盒(TAKARA SHUZO Co.Ltd.)用作RT-PCR的模板以鉴定表达时期。在这种情况下以各家族基因启动子控制的表达时期的特异性经过使用对各烟草EXT基因和其家族基因特异性的序列作引物可进行鉴定。
基因直接转移和GUS-活性测量-瞬时试验切下全长或部分含上述启动子的序列并连接到各种报道基因上以制备嵌合基因。经过将该嵌合基因直接转移进植物细胞可测量启动子的活性。
报道基因指连接在目的基因启动子区的下游以检测该基因启动子活性或其它顺式元件的作用的基因。大肠杆菌来源的酶基因的编码区原则上用作报道基因，因为将用该嵌合基因转化的细胞不应具有相同或相似的酶活性。
植物中该报道基因的例子包括大肠杆菌来源的GUS基因，氯霉素乙酰转移酶(CAT)，β-半乳糖苷酶(lacZ)，新霉素磷酸转移酶(NPTII)，荧光素酶等，其中，大肠杆菌来源的GUS最近已特别被广泛使用。
经过使用4-methylunbelliferylglucuronide(4-MUG，WAKO纯化学药品工业有限公司)作底物并测量以其产物4-甲基伞形酮(4-MU，macalai tesque)发射的特异性荧光测定GUS活性。4-MU的测量易于进行，因为它高度稳定且背景荧光低。另外，当5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-葡糖苷酸(X-Glu，分子探针)用作底物时，产物是一种不溶性靛兰色素。称为靛蓝蛋白(indigotin)，从而利用其特性，可容易地检查细胞或组织中GUS活性的位置。
经过使用，例如，包含于pBI 121(Clontech)和pBI 221(Clontech)中的花椰菜花叶病毒35S启动子可比较启动子活性。
经过将转录终止序列连接到报道基因下游可有效地终止转录。转录终止序列可来自EXT基因或来自其它基因。另外，经过将poly-A添加序列连接到插入序列的下游可增强转录效率。poly-A添加序列可来自EXT基因或来自另一基因，例如土壤杆菌属章鱼碱合成酶〔TheEMBO Journal.，3，835-846(1984)〕和土壤胭脂氢酸合成酶〔分子和应用遗传学杂志，1，561-573(1982)〕。该嵌合基因盒可插入到合适的载体中并在大肠杆菌中以质粒扩增以便直接转移进活生物体中。
将含该嵌合基因的载体导入活生物体的方法是，例如显微注射〔分子和普通遗传学，202，179-185(1986)〕，聚乙二醇方法〔自然，296，72-74(1982)〕，粒子枪方法〔自然，327，70-73(1987)〕，与含DNA盒或RNA的小细胞、细胞、溶酶体等的原生质体融合法〔美国科学院学报，79，1859-1863(1982)〕，电穿孔方法〔美国科学院学报，82，5824-5828(1985)〕，等。
如此转移的基因在细胞中瞬时转录表达在最初几天后可用于瞬时试验以分析转移后培养1到2天后细胞提取物中的表达产物。
可在大肠杆菌中扩增的质粒载体有，例如，花椰菜花叶病毒35S启动子，大肠杆菌来源的GUS基因和具有来自胭脂氨酸合成酶转录终止序列盒的pBI 121(Clontech)。为了去掉质粒中的花椰菜花叶病毒35S启动子区，可用限制性酶Hind III和Xba I(TAKARA SHUZO Co.Ltd.)消化该质粒，接着进行琼脂糖凝胶电泳以去掉非35S启动子区的目的片段。含EXT基因启动子区的DNA片段可转移至该纯化位点。
经过使用，例如，电穿孔方法可将由此制备的含EXT基因的启动子区的DNA片段和含GUS基因嵌合基因的载体转移进烟草BY2培养细胞。
为了使用电穿孔方法转移进烟草BY2培养细胞，可经过用例如，含1％纤维素酶-ONOZUKA(Yakult Honsha Co.，Ltd.)，0.1％果胶酶Y23(SEISHIN Corpolation)和0.4M甘露醇的酶溶液30℃处理2小时将烟草BY2培养细胞转变成无细胞壁的原生质体。在电穿孔缓冲溶液(70mM KCl，1.5mM MES和0.3M甘露醇)中的获得的2×106个烟草BY2培养细胞原生质体的悬液与3pmol的载体DNA和10％PEG 6000/电穿孔缓冲溶液混合。使用，例如，基因脉冲II(Bio-Rad实验室)对所得的混合物进行电脉冲(300V，125μF)以便将DNA转移进植物细胞。然后，细胞在转移后在含0.2mg/l 2，4-D作植物生长素，1％蔗糖和0.4M甘露醇的Linsmaier-Skoog培养基〔PhysiologiaPlantarum，18，100(1965)〕中26℃培养1-2天。提取细胞，提取物中的表达产物GUS可经荧光分析测量。这就是说，对放于Eppendorf管中的在200μl提取缓冲溶液〔50mM磷酸缓冲液(pH7.0)、10mM EDTA，0.1％Triton X-100，0.1％ Sarkosyl和10mM 2-巯基乙醇〕中的回收细胞混合物进行超声处理，离心分离的上清液用于GUS活性试验和测定GUS比活的蛋白质定量试验。
经过测量例如当4-MUG用作底物时由产物4-MU发射的特异性荧光(激发波长365nm；荧光波长455nm)来试验GUS的活性。这就是说，加入45μl提取缓冲溶液和25μl 4mM 4-MUG与放于96孔微量滴度平板的各30μl提取物反应。5，35和95分钟后，经过加入50μl的反应终止溶液(1M Na2CO3)终止反应。然后，当4-MUG用作底物时，用荧光板读数器测量由4-MU发射的特异性荧光(激发波长365nm；荧光波长455nm)以测定产物4-MU。
而且，经过下面举例的程序测定蛋白质的量。因此，将2、5、10、15、20和30μl 1/5稀释的提取物溶液或800μg/ml BSA标准溶液(20μl提取物缓冲液与80μl 1mg/ml BSA混合)放入96孔微滴度平板，向其中分别加入158，155，150，145，140和130μl蒸馏水和40μl在Bio-Rad蛋白质测定试剂盒(Bio-Rad实验室)中的测定试剂使各总体积为200μl。缓慢搅拌后，室温下静置20分钟，以平板阅读器在60分钟内测量混合物(波长590nm)以测定蛋白质的量。在进行上述试验的同时，测量4-MU标准溶液的荧光强度，结果以4-MU量(pmol)为X轴，荧光强度为Y轴制成布点图。从斜率获得每1个荧光单位的4-MU量。而且，以时间(分)为X轴，荧光强度为Y轴将样品的结果制成布点图以获得荧光强度的增长率，然后获得相当于GUS活性的4-MUG分解率。另外，从蛋白质总量可获得GUS的比活。
以这种方式可证实含EXT基因启动子区的DNA片段表现出比据说在植物中强烈表达的花椰菜花叶病毒35S启动子更强的活性。
转化的植物由此获得的含EXT基因启动子区的DNA片段和含插入的GUS基因嵌合基因的载体可转移进植物或植物细胞以制备转化子。
插入了嵌合基因的载体优选含有选择性标记基因以便于选择转化的植物或植物细胞。例如，提供抗生素抗性特征的基因(抗生素抗性基因)可用作选择性标记基因。该基因有，例如，提供抗G 418、潮霉素、博莱霉素、卡那霉素、庆大霉素和氯霉素抗性的基因。如果抗生素抗性基因整合进载体中，那么转化的植物或植物细胞，即转移进了该表达盒的植物和植物细胞经过挑出生长于含抗生素的培养基中的植物或植物细胞可易于选择。
将含插入的嵌合基因的载体直接导入植物的方法举例为显微注射法、聚乙二醇法、粒子枪法与含载体的小细胞、细胞、溶酶体等进行原生质体融合的方法，电穿孔法等。
而且，经过利用植物病毒作载体可将嵌合基因转移进植物。例如，花椰菜花叶病毒可用作植物病毒。这就是说，病毒基因组首先插入大肠杆菌来源的载体中以制备重组体，然后将表达盒插入病毒基因组中。经过使用限制性酶从所说的重组体切下由此修饰的病毒基因组，然后经过将基因组接种进植物可将该表达盒插入植物中(植物肿瘤分子生物学，pp549-560，学术出版社1932年出版，和美国专利号4 407 956)。
而且，经过采用土壤杆菌属细菌在感染植物时将其部分质粒DNA转移进植物基因组的特征可将表达盒转移进植物。
在土壤杆菌属的细菌中，根瘤土壤杆菌感染植物诱导根癌，发根病土壤杆菌感染植物诱导发根，它们由当细菌感染植物时，在称为Ti质粒或Ri质粒的细菌质粒中称为转移DNA区域的区域转移进植物并整合到植物基因组中引起。另外，在Ti质粒或Ri质粒中有另一个称为Vir-区的区域，它对于T-DNA区域转移进植物，然后整合进植物是必须的。Vir-区域本身并不转移进植物且该Vir-区域也能对不含T-DNA区域的质粒发挥功能〔自然，303，179-189(1983)〕。
如果将要整合进植物基因组的目的DNA已插入到Ti质粒或Ri质粒的T-DNA区域，那么当土壤杆菌属的细菌感染植物时，目的DNA能整合进植物基因组。于是，去掉Ti质粒或Ri质粒T-DNA区引起根癌或发根的部分不破坏目的转移功能，且所得的质粒能用作载体。各种这类载体可用于本发明。例如，使用称为双载体的pBI 121(Clontech)，用含EXT基因启动子区的DNA片段和具有GUS基因的嵌合基因取代pBI 121中连接到花椰菜花叶病毒35S启动子上的GUS基因位点以便用于将所说的嵌合基因转移进植物。在这种情况下，同时使用作为阴性对照的具有无启动子GUS基因(pBI 101，Clontech)的载体，pBI 121(Clontech)等能够与花椰菜花叶病毒35S启动子的表达方式进行比较。由于该载体不具有Vir-区，需要土壤杆菌属细菌含有另一具有Vir-区域的质粒。
而且，该载体可不仅在土壤杆菌属细菌而且在大肠杆菌中扩增。因此，可使用大肠杆菌进行Ti质粒的重组操作。另外，该载体包括一个抗生素抗性基因，因此当转化大肠杆菌，土壤杆菌属的细菌和植物时，容易选择转化子。
转化可应用于任何种类的植物，只要该植物能被土壤杆菌属的细菌感染并形成再生系统。大多数双子叶植物可使用土壤杆菌属细菌进行转化，具体地说，在自然界中作为土壤杆菌属细菌宿主的所有植物都能进行体外转化。尽管包括谷类植物的单子叶植物在自然界中不是土壤杆菌属细菌的宿主，但是也能体外转化例如黑麦植物〔自然，325，274-276(1987)〕，玉米植物〔科学，240，204-207(1988)〕，水稻植物〔自然，338，274-276(1989)〕等。
转化可(1)经过使用原生质体和(2)经过使用一块组织或未处理的细胞进行。对于使用方法(1)需要预先建立从转化的原生质体再生植物的系统。对于使用方法(2)，需要使用土壤杆菌属细菌转化一块组织或未处理的细胞，然后建立将它们再生成植物的系统。转化的植物可经过在含有能作为上述转化标记的试剂的培养基中生长来选择。
从植物细胞再生植物的方法，尽管在植物种类中有区别，但一般包含从(1)的转化原生质体悬液中或从(2)的组织块或在平板上转化的未处理的细胞愈伤组织，然后形成苗。另外，用于再生的培养基除各种氨基酸外可含有诸如植物生长素或细胞分裂素的激素。
目的表达盒是否插入转化植物的基因组可经过Southern杂交或类似方法来证实，而报道基因mRNA是否在植物中形成可经过Northern杂交或类似方法来证实。
利用插入了按上面所述制备的嵌合基因的植物，可经过交配将嵌合基因传递给植物的下一代。
例如，含有含EXT基因启动子区的DNA片段和以本发明获得的与GUS基因的嵌合基因的质粒可在pBI 121(Clontech)中构建。然后，由此构建的质粒可用于转化诸如根癌土壤杆菌LBA 4404菌株〔自然，303，179-180(1983)；可从Clontech获得〕的土壤杆菌属中的合适的菌株，接着将转化子感染进目的植物以转化该植物。
例如，Arabidopsis种子(可从Notlingham Arabidopsis StockCenterNASC)按常规方法在MSO平板〔MURASHIGE-Skoog无机盐混合物(WAKO纯化学药品工业有限公司)，与2％蔗糖，3mg/l盐酸硫胺素，5mg/l尼克酸，0.5mg/l盐酸吡哆醇混合，调至pH6.3，进一步与0.2％ gellan gum混合，高压灭菌并涂板〕上无菌培养，然后切下部分根用作在CIM平板(向MSO平板中加入0.5mg/l 2，4-二氯苯氧乙酸和0.05mg/l激动素)上的愈伤组织培养。
分别培养以含上述嵌合基因的质粒转化的土壤杆菌和以pBI 121和pBI 101转化的土壤杆菌并将稀释的混合物分配到管中。然后，将形成愈伤组织的根切块浸泡在其中并在CIM平板上共同培养几天。当各细胞菌株充分生长至可见时，用细菌特异性抗生素杀死它们，并将根切块在SIMC平板〔向MSO平板加入终浓度为5μg//ml的2-ip〔N6-(2-异戊烯)腺嘌呤(WAKO纯化学药品工业有限公司)〕，终浓度为0.15μg/ml的IAA(3-吲哚乙酸，WAKO纯化学药品工业有限公司)，终浓度为500μg/ml的Claforan(Hoechst)〕上再培养几天。所得的切块在SIMCS平板(含卡那霉素的SIMC平板)上最后培养并每周重复植移到新平板上。转化的切块不断生长并形成膨大的团块，而未转化的切块变成褐色。培养转化子直至形成丛生叶，用解剖刀切下转化子的底端以便不含愈伤组织部分，并转移进RIM平板(向MSO平板各以0.5μg/ml的终浓度加入IAA)。8至10天后，在浸泡于无机盐培养基〔Hyponecks(Hyponecks，日本)用水稀释1000倍〕的石纤维小盒(NITTOBOUSEKI Co.，Ltd.)中继续培养。开花和结荚后，将植物移植进用无机培养基浸泡的土壤中以获得种子。种子进行灭菌，然后在MSK平板(向MSC平板以500mg/l的终浓度加入卡那霉素)上播种和发芽以获得转化子。
经过以常规方法从这些转化子提取DNA，用限制性酶Hind III和EcoR I裂解DNA，并使用以限制性酶Hind III和EcoR I消化pVXP-H3制备的启动子区作探针进行Southern杂交可鉴定是否发生转化。这就是说，当对(1)未进行转化的WS菌株，(2)转移了嵌合基因的转化子和(3)仅转移了载体pBI 121实施上述程序时，除了在(1)至(3)中共同的内源性信号外，在用限制性酶Hind III和EcoR I消化的(2)的样品中观察到大约1.8kbp的特异性信号，从而鉴定了含EXT基因启动子的DNA整合进(2)中。
如果使用X-Gluc作底物测定由此获得的转化子的GUS活性，经过利用一种不溶性靛兰色素，称作靛蓝的产物的特性可易于测量在细胞或组织中GUS活性的位置。这就是说，经过在MSK平板(向MSO平板以终浓度50mg/l加入卡那霉素)上播种无菌种子，随后发芽获得的植物幼苗放入含2mM DTT的水中，减压抽气后转移进GUS反应溶液〔1mM X-Gluc，50mM磷酸盐缓冲液(pH7.0)，和20％的甲醇〕在37℃进行反应0.5到4小时。
反应完成后，加入乙醇终止反应并去掉诸如叶绿素的色素，用乙醇洗涤植物2至3次，静置3小时至过夜，然后转移进充满水的培养皿中。植物放在载玻片上，加入1至2滴70％的含水甘油固定后，接着再加入甘油，用盖玻片盖住使得以在显微镜下观察。当对(1)未进行转化的WS菌株，(2)转移了嵌合基因的转化子和(3)仅转移了载体pBI 121的转化子进行上述程序时，可观察到在(2)中延长生长的组织部分被染兰，而在(1)中组织根本未被染色，在(3)中全部组织被染色，尽管不均匀。
下面举例的方法可用于获得可与本发明的植物启动子杂交并在植物，植物细胞和从植物细胞再生的转基因植物中至少一种中也具有启动子活性的启动子的程序中。
首先，从目的基因来源获得的染色体DNA根据常规方法经过连接到质粒或噬菌体载体上转移进宿主以制备文库。文库在平板上培养，将生长的菌落或噬斑转移到硝酸纤维素或尼龙膜上，经变性将DNA固定于其上。该膜在含探针的溶液中保温，该探针预先用32P将标记，(该探针举例有在序列表中SEQ ID NO1、2、3、4、5、6、7和8所述的核苷酸序列及其一些基因)，以便在膜上的DNA与探针杂交，例如，固定于膜上的DNA在含6×SSC，1％十二烷基磺酸钠，100μg/ml鱼精DNA和5×Denhardt’s溶液(含浓度各为1％的牛血清白蛋白，聚乙烯吡咯烷酮和Ficoll)的溶液中在65℃下与探针进行杂交20小时。杂交后，洗去非特异性吸附并以放射自显影或类似方法鉴定与探针杂交的克隆。重复该方法直至获得单个杂交克隆。目的植物启动子插入了由此获得的克隆中。
例如，以下列方法测定所得基因的核苷酸序列以证实该基因是目的植物启动子。
在以杂交获得的克隆进行核苷酸测序的情况下，大肠杆菌当作重组体时，在试管或类似物中培养且以常规方法提取质粒。用限制性酶裂解后，取出插入的片段并进行亚克隆进M13噬菌体载体，接着以双脱氧法进行核苷酸测序。如果重组体是噬菌体，可用基本上相同的步骤进行核苷酸测序。用于核苷酸测序的该培养的基本实验方法在“分子克隆，实验手册”(T.Maniatis等，冷泉港实验室1989年出版)等中描述。
为了证实获得的基因是目的植物启动子，将测定的核苷酸序列与本发明的植物启动子序列和与序列表SEQ ID NO1、2、3、4、5、6、7和8所述的核苷酸序列进行比较以推断该基因的结构。
当获得的基因不含完整植物启动子区时，根据获得的基因制备合成的DNA引物，然后，与本发明的启动子杂交的完整植物启动子区的核苷酸序列可经过PCR扩增缺失区并进一步使用获得的基因片段作探针筛选DNA文库来测定。
而且，根据本发明的植物启动子的核苷酸序列，以含该核苷酸序列的基因的定点诱变诱导的取代，插入和缺失中至少一种修饰的一部分核苷酸序列能改变本发明的植物启动子的功能，从而获得与本发明的植物启动子相似的植物启动子。用于该定点诱变的已知方法的例子包括缺口复制的方法〔酶学方法，154，350-367(1987)〕，含尿嘧啶的DNA方法〔酶学方法，154，367-382(1987)〕，亚硝酸盐方法〔美国科学院学报，79，7258-7262(1982)〕，和进一步的表达盒诱变方法〔基因，34，315-323(1985)〕。
而且，根据本发明的植物启动子的核苷酸序列，经过用已知植物启动子或类似物的基因或该基因的部分连接或取代含有该核苷酸序列的基因或该基因的部分构建嵌合启动子〔美国科学院学报，88，7266-7270(1991)〕，从而获得与本发明的启动子一样在重建植物细胞壁木葡聚糖所需的位点和时期具有启动子活性的植物启动子。
由此获得的植物启动子以可操作的状态在其下游连接有用的基因，接着以与用于本发明的启动子相似的方法测定启动子活性能证实植物启动子是否在植物、植物细胞和由植物细胞再生的转基因植物中至少一种中发挥功能。另外，可鉴定植物启动子控制的表达位点特异性。
如果本发明获得的植物启动子导入植物、植物细胞和从植物细胞再生的转基因植物的任一种中，导入的启动子可以是滞留在染色体外的载体形式或是整合进染色体内的载体形式。该染色体外滞留的载体和染色体内整合的载体是本领域已知的，且用例如显微注射法，聚乙二醇法，粒子枪方法，与含载体的小细胞、细胞、溶酶体等的原生质体融合法，电穿孔法等可将它导入植物和从植物细胞再生的转基因植物中。而且，该载体可转变成嵌合基因，其中，在植物启动子下游的编码具有重建植物细胞壁木葡聚糖功能的酶N端一些氨基酸的基因以可操作的状态连接到有用基因的上游。
使用本发明获得的EXT基因或EXT家族基因的启动子或具有可与该启动子杂交的序列或其部分序列的多核苷酸，将有用的基因以可操作的状态连接到其下游，接着导入植物和植物细胞中，能象本发明的启动子一样以特异性方式在重建植物细胞壁木葡聚糖所需的位点和时期诱导该基因的表达，从而控制植物的形态。例如，经过将编码反义RNA的基因，假目标等或能发挥功能的核酶连接到本发明启动子的下游，接着导入植物、植物细胞和植物细胞再生的转基因植物中来进行控制。经过控制植物形态可生产矮小植物，而经过控制花粉管的延长可制备雄性不育植物。而且，对于延长/生长的茎，即重建植物细胞壁木葡聚糖所需的位点用作食品的植物可改进食品或食用的质量。而且，在培养细胞的对数生长期或静止期诱导特异性基因表达能例如，控制细胞增生和提高有用次级代谢物的产率。
而且，根据本发明，在重建植物细胞壁木葡聚糖所需的位点和时期具有启动子活性的植物启动子可经过利用编码具有进行植物细胞壁木葡聚糖重建之功能的酶的基因，特别是编码EXT或其功能性等价物的基因来克隆。
下面的实施例进一步更详细地说明本发明但不构成对本发明范围的限制。
实施例1木葡聚糖内部转移酶(EXT)家族基因(Azuki Bean EXT2和Azuki Bean EXT3)的分离(1)poly(A+)RNAVigna angularis ohwi et Ohashi的种子W.Takara(WATANABE SHUSHI Co.，Ltd.)按Physiologia Plantarum，82，490-497(1991)所述的方法发芽。
发芽一周后，切下地面部分的茎和叶以获得大约2g的植物组织。将它们立即在液氮中冷冻并在液氮存在下在研钵中研磨以制备粉末，将粉末悬浮于20ml的变性溶液〔7M硫氰酸胍，25mM柠檬酸钠(pH7.0)。01M巯基乙醇，2％十二烷基肌氨酸钠〕中。所得的悬液用Polytron压榨，与10ml的变性溶液和30ml的酚/氯仿溶液〔水饱和的酸性酚和氯仿/异戊醇(49∶1)的1∶1的混合物〕边剧烈搅拌边混合，离心分离含水层，与异丙醇，1/10体积的3M乙酸钠和1/300体积的乙酸混合，然后离心获得大约4mg的RNA沉淀。
该沉淀溶于2ml吸附缓冲液〔20mM Tris-HCl(pH7.5)，2mM EDTA，1M NaCl和0.5％SDS〕中，并在oligo(dT)-纤维素型-7柱(Pharmacia)上吸附，用洗脱缓冲液〔10mM Tris-HCl(pH7.5)和1mM EDTA〕洗脱以回收大约25μg的poly(A+)RNA。
(2)cDNA文库的构建和筛选经过使用cDNA合成试剂盒System-Plus(Amersham)根据在基因，25，263-269(1983)中所述的方法使用λgt10(Stratagene)作载体从实施例1-(1)中获得的poly(A+)RNA构建cDNA文库。使用随机引物标记试剂盒(TAKARA SHUZO Co.，Ltd)用〔α-32P〕dCTP标记azuki bean EXT基因cDNA〔EP-0562836 A1(1993)〕以制备杂交探针。该探针的比活是7.5×108cpm/μg。使用该探针对上面构建的cDNA文库进行噬斑杂交方法。这就是说，噬斑以每平板1×104个噬斑形成并转移到膜上。经过变性，中和和固定后，将膜在预杂交缓冲液(6×SSC，0.1％SDS，5×Demhardt’s溶液，和10μg/ml鱼精DNA)中50℃进行预杂交2小时。然后，加入杂交缓冲液以制备2×105到106/ml的探针并在50℃进行杂交15小时。完成杂交后，用含6×SSC和0.1％SDS的洗涤溶液在室温下洗涤膜20分钟。将膜在-80℃暴露于盒中过夜，盒中放有敏感的X射线相纸(Kodak)以制备放射自显影照片。结果在5×104个噬斑中选择，获得了96个阳性噬斑。对各噬斑进行第二次筛选并用于下面实验。
(3)噬斑的分类和Azuki bean EXT2 cDNA及Azuki BeanEXT3 cDNA，EXT基因家族基因的分离。
将平板裂解方法(T.Maniatis等，“分子克隆，实验手册”，第二版，第2章，p60-66，冷泉港实验室出版社1989年出版)应用于上述噬斑以制备大量噬菌体颗粒，将它应用于使用实施例1-(2)中所用的azuki bean EXT基因cDNA作探针的斑点杂交中。以上面所述相同的方式进行杂交步骤后，在50℃的6×SSC，4×SSC，2×SSC及0.1SSC及随后的65℃0.1SSC的梯度强度条件下洗涤滤膜，使根据信号强度进行分类。结果，噬斑分成6个类型的组。在这些组中，显示出信号强度不同于azuki bean EXT基因的两类噬斑从用0.1SSC 50℃洗涤后有可检测的信号但用0.1×SSC 65℃洗涤后检测不到的组中获得。从这些噬斑中分离噬菌体且提取插入的DNA。经过用限制性酶EcoR I裂解所说的DNA，接着以琼脂糖凝胶电泳来鉴定该DNA片段的长度。结果，从一类噬斑中检测出大约730bp和大约430bp的片段，从另一类噬斑中检测出大约109bp的片段。对各DNA片段进行纯化，接着在pUC18(TAKARA SHUZO Co.，Ltd.)的EcoR I位点进行亚克隆，所得的质粒分别命名为pVX-44-1，pVX-44-2和pVX-45-1。当根据上述Sanger方法〔科学，214，1205-1210(1981)〕使用BCaBESTTM双脱氧测序试剂盒(TAKARA SHUZO Co.，Ltd)对这些质粒进行DNA片段的核苷酸测序时，从pVX-44-1和pVX-44-2克隆与azuki bean EXT基因具有高度同源性的基因(azuki beanEXT2)，从pVX-45-1克隆与azuki bean EXT基因具有高度同源性的另一类基因(azuki bean EXT3)。其部分核苷酸序列在序列表的SEQ ID NO11和SEQ ID NO12中显示。
实施例2Azuki Bean XRP1 cDNA，EXT基因的家族基因的分离使用cDNA合成试剂盒(TAKARA SHUZO Co.，Ltd.)根据在〔基因，25，263-269(1983)〕中所述的方法使用λZAP II(Stratagene)作载体从实施例1-(1)中获得的poly(A+)RNA构建cDNA文库。为了制备探针，使用DNA 5′-末端标记试剂盒MEGALABELTM(TAKARA SHUZO Co.，Ltd.)用〔γ-32P〕APT标记相应于DEIDFEFLG的氨基酸序列(SEQ ID NO28)的混合的合成寡核苷酸(27聚体，SEQ ID NO13)，该氨基酸序列对于作用于木葡聚糖的蛋白质通常是保守的。该探针的比活是大约1×108cpm/μg。以与实施例1相同的方式使用该探针对上面构建的cDNA文库进行噬斑杂交方法，其中杂交在50℃进行15小时。然后用28SSC在50℃洗涤膜2次共20分钟并进行放射自显影。在10×14cm平板上以每平板大约2万噬斑形成噬菌斑，对大约10万个噬斑选择的结果是检测不到阳性信号。当用azuki bean EXT cDNA整合的噬菌体颗粒以每平板大约50个噬斑形成噬菌斑接着在相同条件下杂交来同时进行阳性对照时，检测到相应于各噬斑的明显的阳性信号。
相反，当cDNA文库的噬菌体溶液(含大约1万噬斑)与阳性对照中的噬菌体溶液混合以形成每方板大约50个其噬斑时，奇怪的是检测不到阳性信号。如果使用长度超过100个碱基的cDNA片段进行噬斑不出现该事故，因此明显当使用大约20至30个碱基长的寡聚体时发生问题。可以预料即使在阳性克隆存在的条件下，来自大量其它共存噬菌体的噬斑的某种相互作用抑制了阳性信号的形成。
由于以每平板500至1000个噬斑形成的噬斑密度不足以避免该问题，接着对大约8×103个噬斑的选择获得了8个阳性噬斑。经过与M13辅助噬菌体双重感染且利用F′菌株的宿主细菌，λZAP II可进行自动亚克隆，其中，在宿主中克隆的区域自动转变酸成pBluescript SK(-)(Stratagene)。
以这种方式从上述8个噬斑制备质粒，并用限制性酶EcoR I(TAKARA SHUZO Co.，Ltd.)进行裂解，接着进行琼脂糖凝胶电泳以鉴定DNA片段的长度。在这些片段中，一个大约1.2kbp的任选的DNA片段整合进分别命名为pVM 104，pVM 106和pVM 109的3类质粒中。
当根据上述Sanger方法使用BcaBESTTM双脱氧测序试剂盒(TAKARA SHUZO Co.，Ltd.)对这些质粒进行DNA片段的核苷酸测序时，克隆了与azuki bean EXT基因及与BRU1基因〔植物生理学，104，161-170(1994)〕且有高度同源性的两类基因和meri-5基因〔植物细胞，3，359-370(1991)〕(pVM 106和pVM 109是相同的基因)。一个这类基因pVM 106(azuki bean XRP1)的部分核苷酸序列在序列表的SEQ ID NO14中显示。
实施例3以PCR分离Azuki Bean XRP2 cDNA EXT基因的家族基因以与实施例2相同的方式从azuki bean的地下部分制备的大约10000 pfu(噬斑形成单位)的λ噬菌体溶液(33μl)用酚/氯仿溶液提取2次，接着经乙醇沉淀以获得简单纯化的λ噬菌体DNA。以该总DNA用作模板，使用混合的合成寡核苷酸(序列ID NO13)作有意义引物，dTTT与18个碱基结合的寡聚(dT)18引物作反义引物，使用PCR扩增试剂盒(TAKARA SHUZO Co.，Ltd.)进行PCR反应。反应在94℃(1分钟)，55℃(1分钟)和72℃(1分钟)重复循环25次进行，所得的反应溶液在72℃维持7分钟。然后，取1μl该反应溶液用作模板，经过使用混合的合成寡核苷酸(SEQ ID NO13)作有意义引物，寡聚(dT)18引物作反义引物重复上述循环25次进行第二次PCR。完成该反应后，以3％琼脂糖凝胶电泳分析该反应混合物以证实以特异性方式扩增了大约260bp，350bp，450bp，500bp，600bp，750bp，800bp和1300bp的DNA片段。回收这些片段并使用DNA钝端化试剂盒(TAKARA SHUZO Co.，Ltd.)使末端钝化。另外，使用MEGALABELTM(TAKARA SHUZO Co.，Ltd.)将PCR产物的5′端磷酸化，所得的产物在pUC产119(TAKARA SHUZO Co.，Ltd.)的Hinc II位点亚克隆。当根据Sanger方法使用BcaBESTTM双脱氧测序试剂盒(TAKARA SHUZO Co.，Ltd.)对这些质粒进行DNA片段的核苷酸测序时，克隆与azuki bean EXT基因是同源性的2类基因，其中一个与实施例2的pVM 106和pVM 109相同。另一基因(azuki beanXRP2)的部分核苷酸序列在序列表的SEQ ID NO15中显示。
实施例4分离烟草XRP1 cDNA，EXT基因的家族基因利用以λZAP作载体的cDNA文库(Stratagene)以制备探针，使用DNA 5′-末端标记的试剂盒MEGALABELTM(TAKARA SHUZOCo.，Ltd.)用〔γ-32P〕ATP标记相应于DEIDFEFLG的氨基酸序列(SEQ ID NO28)的混合的合成寡核苷酸(27聚体，SEQ IDNO13)，该氨基酸序列在作用于木葡聚糖的蛋白质上保守。以与实施例2相同的方式对上述cDNA文库使用该探针进行噬斑杂交。对大约3×104个噬斑进行选择的结果是获得了30个阳性噬斑。
当用M13辅助噬菌体进行双重感染并使用F′菌株的宿主细菌时λZAP(Stratagene)可进行自主克隆，其中在宿主中克隆的区域自动转变成pBluescript SK(-)(Stratagene)。以这种方式以上述30个噬斑制备质粒且用限制性酶EcoR I进行裂解，接着以琼脂糖凝胶电泳鉴定DNA片段的长度。在这些片段中，含大约1.5kbp和大约0.9kbp的DNA片段的2类质粒分别命名为pTM3D和pTM11D。
当根据Sanger方法使用BcaBESTTM双脱氧测序试剂盒(TAKARASHUZO Co.，Ltd.)对这些质粒进行核苷酸测序时，克隆与azuki beanEXT基因及上述BRU1基因和meri-5基因具有同源性的2类基因。一个该类型(烟草XRP1)的pTM11D的部分核苷酸序列在序列表的SEQID NO16中显示。
实施例5分离EXT基因家族基因的基因组DNA克隆(1)从Azuki Bean叶制备基因组DNAVigna angularis ohwi et Ohashi的种子c v. Takara(WATANABE SHUSHI Co.，Ltd)根据Physiologia Plantarum，82，490-497(1991)所述的方法发芽以获得大约10g叶。这些叶(大约10g)在液氮存在下在研钵中研碎以制备白色粉末。大约2.5g叶粉末立即放于50ml聚苯乙烯管中并用与25％SDS混合的10ml尿素-酚DNA提取缓冲液〔0.05M Tris-HCl(pH7.6)，0.02M EDTA，5％酚，8M尿素，0.35M NaCl和2％肌氨酸钠〕在65℃下提取1小时。提取物与2倍体积的酚-氯仿-异戊醇(25∶24∶1)混合物混合，轻轻搅拌大约15分钟，然后以2000rpm离心15分钟。离心后，上清转移进新管中，再与2倍体积的酚-氯仿-异戊醇(25∶24∶1)混合物混合，轻轻搅拌大约15分钟，然后以2000rpm离心15分钟。离心后上清转移进新管中，与2倍体积的乙醇混合并轻轻搅拌。然后沉淀，使用巴斯德吸管缠绕白色的基因组DNA并转移进新管中。向该管中加入1.5ml TE缓冲液〔10mM Tris-HCl(pH 8.0)和1mM EDTA〕，所得的混合物在55℃静置过夜以溶解该DNA。以0.4％琼脂糖凝胶电泳分析将该DNA溶液稀释10倍制备的1μl样品揭示该溶液含浓度大约100ng/μl的高分子DNA。换句话说，从大约2.5g叶获得了150μg的基因组DNA。
(2)基因组DNA文库的构建检查条件以便用限制性酶Sau3A I对上面获得的基因组DNA进行部分消化。这就是说，用稀释缓冲液稀释10U/μl的Sau3A I(TAKARASHUZO Co.，Ltd.)以将50μl反应溶液(1μg DNA)中的其浓度调成1至0.035U/μg DNA，在37℃下反应30分钟并与1μl 0.5M EDTA混合以终止反应。反应后，以0.4％琼脂糖凝胶电泳分析20μl样品表明在0.1U/μg DNA的条件下形成的15至20kbp大小的分子最丰富。在该条件下扩大反应，且向在该条件下部分消化的10μg DNA中加入5μl10×补齐缓冲液〔0.5M Tris-HCl(pH7.2)，0.1M硫酸镁，1mMDTT，500μg/ml乙酰化BSA，10mM dATP和10mM dGTP〕和10UKlenow片段。用加蒸馏水使总体积为50μl后，37℃下进行反应30分钟。反应完成后，反应溶液与50μl酚-氯仿-异戊醇(25∶24∶1)混合物混合，轻轻搅拌，以12000rpm离心5分钟。上清转移进新管中并用乙醇沉淀。沉淀溶于20μl TE缓冲液〔10mM Tris-HCl(pH8.0)和1mM EDTA〕中。然后，0.5μg和1.5μg各所得的部分补齐，部分Sau3A I-消化的基因组DNA使用TakaRa连接试剂盒Version 1(TAKARA SHUZO Co.，Ltd.)用10μgλGEM11臂(PromegaBiotech)连接。换句话说，0.5μg和1.5μg各部分补齐，部分Sau3A I-消化的基因组DNA与含1.0μg λGEM 11臂(Promega Biotech)的溶液混合，蒸发干燥后，混合物溶于5μl连接缓冲液中，与TaKaRa连接试剂盒Version 1中的5μl溶液B混合且在26℃下进行连接10分钟。对连接样品进行2次酚提取，接着用乙醇沉淀。然后，经过使用体外包装试剂盒(Stratagene)对总量进行包装，接着感染宿主细菌大肠杆菌LE392以获得azuki bean的基因组DNA文库。测量该文库的滴度为2.1×105pfu/ml。
(3)筛选文库和分离基因利用该文库，使用BcaBESTTM标记试剂盒(TAKARA SHUZOCo.，Ltd.)以〔α-32P〕dCTP标记大约1.1kbp的azuki bean EXT基因cDNA〔EP-0562836 A1(1993)〕以制备用于噬斑杂交的探针。换句话说，25ng上述DNA片段和2μl的随机引物放入管中，用蒸馏水稀释至5μl，在95℃加热3分钟，接着迅速在冰上冷却。向其中加入2.5μl10倍浓缩的缓冲液，2.5μl dNTP的混合溶液，5μl的标记dCTP，加蒸馏水至24μl，并加入1μl BcaBESTTMDNA聚合酶(TAKARASHUZO Co.，Ltd.)，所得的溶液在52℃培养10分钟。经过在95℃加热3分钟，接着在冰上迅速冷却进行热变性灭活酶。总量用于杂交。该探针的比活为7.2×108cpm/μg。
以与实施例1相同的方式进行噬斑杂交，除了在65℃进行预杂交和杂交。
杂交后，用含2×SSC和0.1％SDS的洗涤溶液在室温下洗涤膜一次20分钟并用含0.1×SSC和1％SDS的洗涤溶液在50℃再次洗涤20分钟。将噬斑接种到10个方板上以形成每平板1×104个噬斑的噬菌斑。结果对总共10个平板上获得1×105个噬菌体进行筛选获得10个阳性噬斑。接着，各噬斑用于第二次筛选。以平板溶解方法从第二次筛选获得的各噬斑提取噬菌体DNA。该噬菌体DNA用限制性SacI、EcoRI、HindIII、BamHI和PstI(均来自TAKARA SHUZO Co.，Ltd.)进行消化，接着使用上述相同的探针进行Southern杂交。
根据在“分子克隆，实验手册”第二版，第9章，pp.9.31-9.58(T.Maniatis等，冷泉港实验室出版社1989年发行)中所述的方法进行Southern杂交。
这就是说，对各DNA样品进行1％琼脂糖凝胶电泳，接着碱变性并在尼龙膜(Hybond-N，Amersham)上Southern印迹过夜。经过用紫外透射器(254nm)照射5分钟固定DNA后，将膜在5ml预杂交缓冲液(5×Denbardt’s溶液，6×SSC，0.1％SDS和10μg/ml鱼精DNA)中65℃进行预杂交2小时。然后，加入探针并在65℃进行杂交过夜。杂交后，用含2×SSC和0.1％SDS的洗涤溶液在室温下洗涤膜2次10分钟，然后用相同的洗涤溶液在50℃洗涤2次30分钟。干燥后，将膜于-80℃的盒中曝光过夜，盒中放有X-射线胶片(Kodak)以制备放射自显影照片。
从获得的放射自显影照片的图像，将10个噬菌体分成3类。在插入这3类噬菌体载体的DNA片段中，azuki bean EXT基因用作探针时检测的DNA片段进行亚克隆到质粒载体中以分析部分核苷酸序列。结果表明插入所有噬斑的噬菌体载体中的DNA片段含有相似于EXT基因的基因即家族基因。然而，其中不包含EXT基因。
实施例6从Azuki Bean部分基因组DNA文库克隆含Azuki Bean EXT基因“启动子下游”区的DNA片段以与实施例5相同的方式从azuki bean叶提取的基因组DNA用EcoR I和Hind III限制性酶进行消化，用EcoR I-Hind III进行双重消化，0.7％琼脂糖凝胶电泳，接着转移到尼龙膜上并使用以与实施例5-(3)相同的方式制备的azuki bean EXT基因cDNA作探针进行Southern杂交。
根据实施例5-(3)所述的方法进行Southern杂交，除了杂交后用含2×SSC和0.1％SDS的洗涤溶液在室温下洗涤膜3次20分钟，用相同洗涤溶液在50℃下洗涤2次20分钟，然后用含0.1×SSC和0.1％SDS的洗涤溶液50℃洗涤2次20分钟。
结果揭示在各泳道上检测出大约3条带，对于EcoR I消化最强的带出现在大约8.5kbp处，对Hind III出现在大约8.5kbp处，对EcoR I-Hind III双重消化出现在大约5.5kbp处。然后，用EcoR I-Hind III完全双重消化的30μg DNA进行0.7％琼脂糖凝胶电泳，从琼脂糖凝胶上回收大约5.5 kbp的带，连接到λEXlox(Novagene)的EcoR I-Hind III位点，使用体外包装试剂盒(Stratagene)包装，接着感染宿主细菌大肠杆菌ER 1647，获得两端具有EcoR I-Hind III位点的大小集中在大约5.5kbp的DNA片段的部分azuki bean基因组DNA文库。该文库的滴度为1.9×106pfu/ml。
接着，按与实施例5相同的方式使用azuki bean EXT基因cDNA作探针进行噬斑杂交。从1.3×105个噬斑获得10个阳性噬斑。将这些噬斑悬浮于SM缓冲液中，且各噬斑进行第二次筛选。在第二次筛选中，上述azuki bean EXT基因cDNA以及根据与azuki bean EXT基因cDNA同功酶具有低同源性的5。非编码区合成的寡核苷酸VAN-U7(序列ID NO 17)分别用作探针。如果azuki bean EXT基因cDNA用作探针，按与上面所述相同的方式进行噬斑杂交和洗涤。如果使用合成的寡核苷酸VAN-U7，经过使用5′端标记试剂盒MEGALABELTM(TAKARA SHUZO Co.，Ltd.)在5′端用〔γ-32P〕ATP标记制备杂交探针。该探针的比活为大约2×108cpm/μg。按与实施例2相同的方式使用该探针进行噬斑杂交，除了预杂交和杂交在47℃下进行。杂交后，用含6×SSC和0.1％SDS的洗涤溶液在室温下洗涤膜2次，然后用相同的洗涤溶液在47℃下洗涤2次共20分钟。结果显示，在10个阳性噬斑中，4个噬斑是含EXT基因cDNA的DNA片段。经过感染具有PlCrep基因的宿主细菌大肠杆菌BM 25.8对插入了这些片段的噬菌体进行自动亚克隆，其中在宿主中自动亚克隆的区域转变成pUC型质粒。由此制备的质粒命名为VXG303。
用pVXG303转化的大肠杆菌JM109菌株(TAKARA SHUZO Co.，Ltd.)命名并标记为大肠杆菌JM 109/pVX303，且按布达佩期条约以保藏号FERM BP-5390于1995年3月15日(原始保存日)保存于国家生物科学和人类技术研究部，工业科学和技术代理，工业贸易和工业部(1-3，Higashi 1-Chome，Tsukuba-Shi，Ibaragi-Ken，305，日本)。按Sanger方法使用BcaBESTTM双脱氧测序试剂盒(TAKARA SHUZO Co.，Ltd.)对该质粒进行DNA片段的核苷酸测序。其部分核苷酸序列在序列表的SEQ ID NO18和SEQ ID NO19中显示。比较这些序列与azuki bean EXT基因cDNA的序列揭示所说的片段含azuki bean EXT基因的启动子。
实施例7以反向PCR克隆含Azuki Bean EXT基因启动子区的DNA片段(1)检查自我连接效率实施例6中的pVXG303是具有来自含azuki bean EXT基因启动子区的5.5kbp基因组DNA的EcoR I/Hind III片段的大约9.5kbp的质粒。
作为自我连接和反向PCR的对照，用限制性酶Hind III消化该质粒，然后分别以10ng/μl，3.3ng/μl，2ng/μl和1ng/μl的DNA浓度进行自我连接。连接后，将5μl各样品转化进大肠杆菌JM 109并以许多形成的菌落获得自我连接的效率。结果表明自我连接效率随稀释的DNA浓度而增加。然而，如果以这些连接溶液用作模板经过使用引物VAN-UH1(SEQ ID NO21)作有意义引物且引物VAN-L(SEQ ID NO22)作反义引物进行聚合酶链式反应(PCR)，当在反应系统中加入更大体积的连接溶液以增大模板量时诱导抑制且当进行乙醇沉淀以减少反应系统中的模板量时回收率随DNA浓度的稀释而减小。这些结果揭示了当连接中的DNA浓度和反应体积分别调为3.3ng/μl和300μl时可有效获得目的环状DNA。
(2)Azuki Bean DNA的Hind III片段用作模板的反向PCR
按与实施例5相同的方式从azuki bean叶制备的1μg基因组DNA用限制性酶Hind III完全消化，用酚/氯仿溶液提取1次以灭活酶，然后进行乙醇沉淀。乙醇沉淀的DNA与268μl蒸馏水，30μl 10×连接缓冲液和2μl T4 DNA连接酶(TAKARA SHUZO Co.，Ltd.)混合，然后在16℃反应过夜进行自我连接。以0.1μg获得的环状基因组DNA用作模板，经过使用引物VAN-UH1(SEQ ID NO21)作有义引物且引物VAN-L(SEQ ID NO22)作反义引物使用TaKaRa LAPCR试剂盒(TAKARA SHUZO Co.，Ltd.)进行PCR。经过重复94℃(0.5分钟)，55℃(1分钟)和72℃(2分钟)的循环30次进行反应。然而，在该反应中未观察到任何扩增。然后，以1μl该反应溶液用作模板，使用下列引物以相同的方式重复上述循环30次进行PCR1)引物VAN-UH2(SEQ ID NO23)作有义引物且引物VAN-L16(SEQ ID NO24)作反义引物，2)引物VAN-UH3(SEQ ID NO25)作有义引物且引物VAN-L3(SEQ ID NO26)作反义引物，3)引物VAN-UH2(SEQ ID NO23)作有义引物且引物VAN-L3(SEQ ID NO26)作反义引物，4)引物VAN-UH3(SEQ ID NO25)作有义引物且引物VAN-L16(SEQ ID NO24)作反义引物。
以1％琼脂糖凝胶电泳分析反应后的反应溶液揭示了大约1.8kbp的DNA片段在组合3)中特异性扩增。在其它组合中难以鉴定目的片段，因为有许多非特异性的DNA片段扩增。
从凝胶中回收在引物组合3)中获得的DNA片段并使用DNA钝端化试剂盒MEGALABELTM(TAKARA SHUZO Co.，Ltd.)在5′端将PCR产物磷酸化，然后在pUC 119(TAKARA SHUZO Co.，Ltd.)的Hinc II位点亚克隆。从其中选择3个质粒，并根据Sanger的方法使用BcaBESTTM双脱氧测序试剂盒(TAKARA SHUZO Co.，Ltd.)进行DNA片段的核苷酸测序。由于部分核苷酸测序表明所有质粒的核苷酸序列是相同的，经过使用一个该序列测定总核苷酸序列。
其部分核苷酸序列在序列表的SEQ ID NO27中显示。另外，所说的DNA片段的限制性图谱在图2中显示。含所说的DNA片段的该质粒命名为pVXP-H3，而用所说的pVXP-H3转化的大肠杆菌JM109菌株使并表示为大肠杆菌JM 109/pVXP-H3且按照布达佩斯条约以保存号FERM-BP-5388于1995年2月17日(原始保存日)保存于国家生物科学和人类技术研究所，工业科学和技术代理，工业贸易和工业部(1-3，Higashi，1-Chome，Tsukuba-Shi，Ibaragi-Ken，305，日本)。
实施例8从Azuki Bean基因组DNA文库克隆含azukibean EXT基因启动子上游区的DNA片段(1)基因组DNA文库的构建为了用限制性酶Sau3A I部分消化实施例5获得的基因组DNA而检测其条件。这就是说，用稀释缓冲液稀释10U/μl的Sau3A I(TAKARASHUZO Co.，Ltd.)以便在50μl反应溶液(1μg DNA)中将其浓度为从1调节到0.035U/μg DNA，在37℃下反应30分钟，然后与1μl0.5M EDTA混合以终止反应。反应后，以0.4％琼脂糖凝胶电泳分析20μl样品，表明在0.1U/μg DNA的条件下形成的15至20kbp大小的分子最丰富。在该条件下扩大反应。
接着，在该条件下部分消化的160μg DNA用于经过进行NaCl密度梯度离心尝试分离15-20kbp大小的分子。这就是说，在与HITACHIRPS40-T离心机配套的离心管中制备1.25至5M NaCl的密度梯度，缓慢放入200μl各DNA(大约160μg)，使用HITACHI SCP70H超速离心机以35000rpm进行超速离心3小时。离心后，样品以各250μl分配进Eppendorf管中。经0.4％琼脂糖凝胶电泳从每3管取20μl等分试样进行分析表明馏分号18至21似乎含有合适大小的DNA分子。因此，来自馏分号20的各0.3μg，0.6μg和1.2μg DNA与1.0μg的λGEM 11臂(Promega Biotech)溶液混合以制备8μl溶液，加入TaKaRa连接试剂盒Version 2(TAKARA SHUZO Co.，Ltd.)的8μl溶液II和16μl溶液I后在26℃进行连接10分钟。用酚提取连接后的各样品2次并乙醇沉淀。然后使用体外包装试剂盒(Stratagene)对总量进行包装，接着感染宿主细菌大肠杆菌LE 392以获得azuki bean基因组DNA文库。该文库的滴度为1.1×105pfu/ml。
(2)文库的筛选使用BcaBESTTM标记试剂盒(TAKARA SHUZO Co.，Ltd.)以〔α-32P〕dCTP标记实施例6中获得的基因组DNA片段以制备杂交探针。以与实施例5相同的方式在上面制备的基因组DNA文库中使用该探针进行噬斑杂交。杂交后，用含2×SSC和0.1％SDS的洗涤溶液在室温下洗涤膜3次共20分钟，再用含1SSC和0.1％SDS的洗涤溶液在50℃洗涤一次20分钟。噬菌体接种到20个方板上以每平板1×104个噬斑形成噬菌斑。结果对从总共20个平板获得的2×105个噬菌斑进行筛选，获得21个阳性噬斑。接着，对各噬斑进行第二次筛选以分别分离其阳性克隆。
经过接种噬菌体溶液进行第二次筛选，该溶液取自第一次筛选获得的21个阳性噬斑中的一个，且溶液尽可能稀薄以便每方板形成大约300个噬斑，接着进行噬斑杂交。在第二次筛选中，以第一次筛选相同的方式在实施例6中获得的基因组DNA片段以及根据与在azuki beanEXT基因cDNA序列中诸如其它同功酶(azuki bean EXT2和azukibean EXT3)的家族基因具有较低同源性的5′-非编码区合成的寡核苷酸VAN-U7(SEQ ID NO17)分别用作探针。如果基因组DNA片段用作探针，以与第一次筛选相同的方式进行噬斑杂交和洗涤。如果利用合成的寡核苷酸VAN-U7，应用与实施例6相同的方法。
在第二次筛选获得的显示出阳性信号的10个噬斑中，选择具有强信号的一个噬斑进行第三次筛选。然而，具有强信号的这类噬斑在大约1000个噬斑，即使在第二次筛选中只有一个。而且，这唯一的噬斑非常小。为了纯化增殖的该噬斑，经过接种到6个圆板(90mmφ)上进行第三次筛选以便形成每平板100至200个噬斑。它们用于杂交并以与第二次筛选相同的方式洗涤。结果，在不相应于首次浏览的信号识别的噬斑但在相应于非常仔细地观察平板时信号的位置检测到极小的针尖大小的噬斑。使用该噬斑经仔细应用平板溶解方法提取噬菌体DNA。提取插入所说的噬斑的噬菌体载体中的DNA片段，然后获得大约长11kbp的DNA片段。
经过用EcoR I-Hind III对该DNA片段进行双重消化，使用实施例6中获得的azuki bean EXT基因基因组DNA片段作探针进行Southern杂交，可鉴定含该基因启动子区的更短的DNA片段。使用插入了该DNA片段的质粒进行核苷酸测序并比较所说的片段与azuki bean EXT基因cDNA的序列揭示该DNA片段是否含有azuki bean EXT基因启动子。图1显示了所说片段的限制性图谱。另外，所说片段的部分核苷酸序列在序列表的SEQ ID NO20中显示。将该片段整合进pUC 118(TAKARA SHUZO Co.，Ltd)的EcoR I和Hind III位点的质粒命名为pVXP 101，而用pVXP101转化的大肠杆菌JM 109菌株命名并表示为大肠杆菌JM 109/pVXP 101并且按布达佩斯条约以保存号FERM BP-5389于1995年2月23日(原始保存日)保存于国家生物科学和人类技术研究所，工业科学和技术代理，工业贸易和工业部(1-3，Higshi，1-Chome，Tsukuba-Shi，Ibaragi-Ken，305，日本)。
实施例9使用Azuki Bean幼苗进行Northern杂交(1)总RNA的制备从播种后5日龄和40日龄azuki bean植物的茎、芽、子叶和叶取组织在液氮中集中冷冻并在-80℃下保存至进行RNA提取操作。以硫氰酸胍/酚方法从各冷冻组织提取总RNA。这就是说，将1g冷冻的细胞放入含2.5ml硫氰酸胍溶液〔经过将100g硫氰酸胍和1.47g 2水柠檬酸钠溶于水中制备的200ml溶液在4℃保存，用前每1ml中加入7μl巯基乙醇和5mg十二烷基肌氨酸钠〕的管中，用Polytron压榨进行提取，与2.5ml酚-氯仿-异戊醇(25∶24∶1)混合物混合，轻轻搅拌15分钟，然后在3000rpm离心10分钟。然后，随剧烈搅拌将分离的水层与2.5ml酚-氯仿-异戊醇(25∶24∶1)混合物混合，离心所得的悬液以分离水层。重复该程序2次。随后，随剧烈搅拌将所得的水层与2.0ml酚-氯仿-异戊醇(25∶24∶1)混合物混合，离心所得的悬液以分离水层，将水层与3M乙酸钠和乙醇混合，然后离心获得RNA沉淀。该沉淀完全溶于2ml Tris-SDS溶液〔50mM Tris-HCl(pH 9.0)和1％SDS〕中并放入含2ml水饱和酚的试管中摇匀。离心所得的悬液以分离水层，伴随着剧烈的搅拌连续向其中加入2ml水饱和的酚和2ml氯仿-异戊醇(49∶1)混合物，离心所得的悬液以分离水层。接着，伴随剧烈的搅拌将所得的水层与2ml氯仿-异戊醇(49∶1)混合物混合，离心所得的悬液以分离水层，将它与3M乙酸钠和乙醇混合，然后离心获得RNA沉淀。该沉淀完全溶于0.5ml无菌水中并经过测量吸光率将浓度调成1mg/ml。边搅拌边将所得的溶液与1/4体积的10M氯化锂混合，4℃静置2小时。然后离心获得沉淀。该沉淀完全溶于1ml无菌水中，与3M乙酸钠和乙醇混合，然后离心获得大约0.6mg的RNA沉淀。
(2)Northern杂交使用BcaBESTTM标记试剂盒(TAKARA SHUZO Co.，Ltd.)以〔α-32P〕dCTP标记azuki bean EXT基因cDNA的片段〔EP-0562836A1(1993)〕以制备用于Northern杂交的探针。
根据“分子克隆，实验手册”第二版，第7章pp.7.39-7.52(T.Maniatis等，冷泉港实验室出版社1989年出版)所述的方法以下列方式进行Northern杂交。这就是说，对提取的总RNA以甲醛泳动的琼脂糖凝胶(1％)进行电泳，接着以乙酸铵溶液进行中和，在尼龙膜(Hybond-N)上进行Northern印迹过夜。经过用紫外透射(254nm)照射5分钟固定RNA后，将膜在20ml预杂交缓冲液〔50％甲醛，0.65MNaCl，0.1M Na-PIPES(pH6.8)，5×Denhardt’s溶液，0.1％SDS，5mM EDTA和100μg/ml鱼精DNA〕中42℃进行预杂交3小时。然后，以上述方法制备的32P-标记的探针加入到20ml预杂交缓冲液〔50％甲醛，0.65M NaCl，0.1M Na-PIPES(pH 6.8)，5×Denhardt’s溶液，0.1％SDS，5mM EDTA和10％硫酸葡聚糖〕中。向该探针溶液中加入预杂交得到的膜，在42℃下进行杂交过夜。
杂交后，用含2×SSC和0.1％SDS的洗涤溶液在50℃下洗涤膜3次共20分钟。干燥后，膜在盒中-80℃曝光过夜，盒中放有X-射线胶片(Kodak)以制备放射自显影照片。
结果揭示了在茎中观察到EXT基因的特异性表达，且特别在延长生长的部分表达该基因。
实施例10使用烟草培养的细胞进行Northern杂交(1)制备总RNA经抽吸过滤在Buchner过滤漏斗上分别收集培养1、4、6、8和10天的烟草BY2培养细胞。在漏斗上滤掉培养基后再抽吸10到30秒以完全去液体培养基。排去培养基后，经称重迅速回收大约1g细胞，立即在液氮中冷冻，然后在-80℃保存直至进行RNA提取操作。冷冻细胞放入含2ml提取溶液〔200mM Tris-HCl(pH9.0)，100mMNaCl，10mM EDTA，0.5％SDS和14mM 2-巯基乙醇〕和2ml水饱和酚的试管中，用Polytron压榨5分钟以完成提取，与2ml氯仿-异戊醇(49∶1)混合物混合，用Polytron剧烈搅拌。离心所得的悬液以分离水层。接着，将所得的水层与2ml水饱和酚和2ml氯仿-异戊醇(49∶1)混合物连续混合并伴随着进行剧烈搅拌，离心所得的悬液以分离水层。重复该程序2次。所得的水层与2ml氯仿-异戊醇(49∶1)混合物混合并伴随剧烈搅拌，离心所得悬液以分离水层，将水层与2M乙酸钠和乙醇混合，然后离心以获得大约0.7mg RNA沉淀。
(2)Northern杂交使用BcaBESTTM标记试剂盒(TAKARA SHUZO Co.，Ltd.)以〔α-32P〕dCTP分别标记烟草EXT基因cDNA(JP-7-789778A)和实施例4中所述的家族基因烟草XRP1的cDNA片段(SEQ ID NO16)以制备Northern杂交的探针。
以与实施例9-(2)所述的方法相同的方式进行Northern杂交。结果在图3中显示。这就是说，图3说明了EXT和XRP的表达，其中，烟草EXT mRNA的表达在上排显示，烟草XRP mRNA的表达在中排显示，rRNA是在下排显示。
正如可从图3中看到，揭示了在培养的第一天观察到烟草EXT基因的表达，在第4天达到高峰。相反，在实施例4中显示的EXT基因家族基因，烟草XRP1基因在培养的第1天和第6天后强烈表达。
同时，经过测量细胞数和堆积细胞的体积(PCV)也绘出了烟草BY2培养细胞的生长曲线。经过用含1％纤维素酶-ONOZUKA(YakultHonsha Co.，Ltd.)，0.1％果胶酶Y23(SEISHIN Corporation)和0.4M甘露醇的酶溶液(pH5.5)30℃下处理烟草BY2培养细胞2小时使转变成无细胞壁原生质体，接着用血细计数器计数原生质体的数目获得细胞数。而且，经过使用旋转离心机以2000rpm离心放于15ml刻度离心管中的烟草BY2培养细胞的细胞悬液(10ml)，接着测量细胞沉淀的体积获得PCV。由此，将平均值(n5)的布点图在图4中显示。这就是说，图4显示了在烟草BY2细胞培养物中的生长，其中，纵轴代表PCV(％)和细胞数，横轴代表时间(天)。
图3和4显示的结果表明烟草EXT基因在任何时间表达，且在对数生长期的早期表达特别强烈。
还表明在实施例4显示的EXT基因家族基因的烟草XRP1基因在诱导期和静止期强烈表达。
实施例11
使用烟草培养细胞的瞬时试验(1)转移质粒的构建使用具有花椰菜花叶病毒35S启动子，大肠杆菌来源的GUS基因和来自胭脂氢酸合成酶的转录终止序列表达盒的pBI 121(Clontech)，经过用限制性酶EcoR I完全消化后使用DNA钝端化试剂盒(TAKARASHUZO Co.，Ltd.)使所说的质粒钝端化首先去掉该质粒的EcoR I位点，自我连接后转化进大肠杆菌JM 109菌株。获得的质粒的命名为pB1221EL且用pB 1221EL转化的大肠杆菌JM 109菌株命名为大肠杆菌JM109/pB 1221EL。为了去掉该质粒中的花椰菜花叶病毒35S启动子区，用限制性酶Hind III和Xba I消化该质粒，然后以琼脂糖凝胶电泳随后切下来纯化非35S启动子区的目的片段。
接着，以实施例6中制备的pVXG303用作模板，经过使用引物VAN-UHE(SEQ ID NO29)作有义引物且引物VAN-LX(SEQ IDNO30)作反义引物进行PCR。经过重复94℃(1分钟)， 55℃(2分钟)和72℃(3分钟)的循环10次进行反应。经过用2.5％的琼脂糖凝胶电泳分离回收所得的片段，连接进上述pB 1221EL的Hind III和XbaI位点，转化进大肠杆菌JM 109菌株，该质粒命名为pEXTΔEGUS，且用pEXTΔEGUS转化的大肠杆菌JM 109菌株命名为大肠杆菌JM109/pEXTΔEGUS。
接着，以限制性酶Hind III完全消化后使用DNA钝化试剂盒(TAKARA SHUZO Co.，Ltd.)对pEXTΔEGUS进行钝端化。用限制性酶EcoR I完全消化所得的DNA片段，以BAP处理进行末端脱磷酸化并经琼脂糖凝胶电泳纯化。
另一方面，在实施例7中制备的pVXP-H3在用限制性酶Xba I(TAKARA SHUZO Co.，Ltd.)完全消化后进行钝端化，接着用限制性酶EcoR I完全消化。
含azuki bean EXT基因Xba I位点到EcoR I位点的启动子区的大约960 bp DNA片段用琼脂糖凝胶电泳进行纯化，用上述pEXTΔEGUS DNA片段进行连接，转化进大肠杆菌JM 109菌株。该质粒命名为pEXTΔXGUS，且用pEXTΔXGUS转化的大肠杆菌JM 109菌株命名为大肠杆菌JM 109/pEXTΔXGUS。
用限制性酶Hind III和EcoR I完全消化pEXTΔEGUS，与用限制性酶Hind III和EcoR I完全消化实施例7制备的pVXP-H3获得的含启动子的DNA片段连接。然后转化进大肠杆菌JM 109菌株。该质粒命名为pEXTGUS，且用pEXTGUS转化的大肠杆菌JM 109菌株命名为大肠杆菌JM 109/pEXTGUS。
(2)以电穿孔进行基因转移应用电穿孔方法将按上述制备的各pEXTΔEGUS，pEXTΔXGUS和pEXTGUS转移进烟草BY2培养细胞，使用仅具有GUS基因表达盒的无启动子pBI 101(Clontech，在图5中命名为pGUS)及具有花椰菜花叶病毒35S启动子和GUS基因的pBI 221(Clontech)作对照。
首先，用含1％纤维素酶ONOZUKA(Yakult Honsha Co.，Ltd.)，0.1％果胶酶Y23(SEISHIN Corporation)和0.4M甘露醇的酶溶液(pH5.5)30℃处理烟草BY2培养细胞2小时以转变成无细胞壁原生质体。在电穿孔缓冲液(70mM KCl，5mM MES和0.3M甘露醇，pH5.8)中的烟草BY2培养细胞的2×106个原生质体的悬液与3 pmol各质粒DNA和10％PEG 6000/电穿孔缓冲液混合并搅拌。对所得的混合物使用基因脉冲仪II(生物放射实验室)进行电脉冲(300V，125μF)以便将DNA转移进植物细胞。
转移后在含0.2mg/l 2，4-D作植物生长素，1％蔗糖和0.4M甘露醇的Linsmaier-Skoog培养基〔Physiologia Plantarum，18，100(1965)〕中26℃培养细胞40小时。经提取回收细胞，对放于Eppendorf管中的200μl提取缓冲液〔50mM磷酸缓冲液(pH7.0)，10mMEDTA，0.1％Triton X-100，0.1％Sarkosyl和10mM 2-巯基乙醇〕中的回收的细胞混合物使用安装输出控制为1.5，26循环为50％的超声仪W-225(热系统-超声仪)在冰上进行超声处理30秒。然后，经离心分离的上清用于测定GUS活性和测定蛋白质量。
(3)测量启动子活性经过向放于96孔微滴度平板的各30μl提取物中加入45μl提取缓冲液和25μl 4mM 4-MUG底物进行反应以产生荧光。5、35和95分钟后，经过加入50μl反应终止溶液(1M Na2CO3)终止反应。然后，用荧光板阅读器〔Fluoroscan II(Labosystems)〕测量在激发波长为365nm，荧光波长为455nm下由反应产物4-MU发射的特异性荧光。
而且，以如下所述的方法测量蛋白质的量。因此，将2、5、10、15、20和30μl 1/5稀释的提取物溶液或800μg/ml BSA标准溶液(20μl的提取缓冲液与80μl 1mg/ml BSA混合)放入96孔微滴度平板中且向其中分别加入158、155、150、145、140和130μl蒸馏水和40μl Bio-Rad蛋白质测定试剂盒(Bio-Rad Laboratories)中的测定试剂。缓慢搅拌后在室温下静置20分钟，在60分钟内以平板阅读器(波长590nm)测量混合物以测定蛋白质的量。
以下面方式测量GUS活性。在进行上述测定的同时测量4-MU标准溶液的荧光强度且以4-MU量(pmol)作X轴，荧光强度作Y轴将结果绘成布点图。然后从斜率获得每一个荧光单位的4-MU量，而且，以时间(分)为X轴，荧光强度作Y轴将样品的结果绘成布点图以获得荧光强度的增强率。然后获得相当于GUS活性的4-MUG的分解率。另外，从蛋白量获得GUS比活。结果在图5中显示。换句话说，图5说明了使用转化的烟草BY2培养细胞测量EXT启动子活性，其中图中的棒形图显示各质粒转移的GUS比活(pmol 4 MU/分/mg蛋白质)，各质粒的启动子区的限制性图谱说明如下。
如图5所示，可证实含EXT基因启动子区的DNA片段表现出比所说在植物中强烈表达的花椰菜花叶病毒35S启动子更强的活性。
实施例12使用转化的Arabidopsis检测组织特异性(1)构建转移质粒为了获得图6和7所示的转移质粒，用限制性酶Hind III和SnaB I(TAKARA SHUZO Co.，Ltd.)分别消化具有来自胭脂氨酸合成酶的转录终止序列表达盒的双重载体pBI-HI-35SIG〕〔植物和细胞生理学，31，805-813(1990)〕和标记基因的抗潮霉素(HPT)和卡那霉素(NPTII)的基因以及含大肠杆菌来源的内含子的GUS基因和花椰菜花叶病毒35S启动子，然后经过切下琼脂糖凝胶电泳的非35S启动子区的目的片段进行纯化。然后，用限制性酶Hind III和SnaB I消化实施例11制备的pEXTGUS和上述pEXTΔXGUS，经过切下琼脂糖凝胶电泳的含azuki bean EXT启动子区的片段进行纯化。将这些片段分别连接到上述pBI-HI-35SIG的Hind III和SnaB I位点，然后转化进大肠杆菌JM 109菌株。转移的这些质粒分别命名为pBVEG 101和pBVEG 121，用这些质粒转化的大肠杆菌JM 109菌株分别命名为大肠杆菌JM 109/pBVEG 101和大肠杆菌JM 109/pBVEG 121。
而且，如图8和9所示，仅具有GUS基因表达盒的无启动子pBI 101(Clontech)的Hind III和SnaB I片段和具有花椰菜花叶病毒35S启动子的pBI 121(Clontech)按上述相同的方法在pBI-HI-35SIG的Hind III和SnaB I位点进行亚克隆以获得用于对照实验的质粒。由此获得的质粒分别命名为pBI-H-101和pBI-H-121，用这些质粒转化的大肠杆菌JM 109菌株分别命名为大肠杆菌JM 109/pBI-H-101和大肠杆菌JM 109/pBI-H-121。
(2)转化土壤杆菌用于感染将上述各质粒与使用基因脉冲仪II(生物放射实验室)以电脉冲(2.5KV，25μF，200Ω)发射的根癌土壤杆菌EHA 101感受态细胞〔SHOKUBUTU SAIBOU KOUGAKU(植物细胞技术)4(3)，193-203(1992)〕混合，并在30℃培养2天以便将质粒转移进土壤杆菌菌株。用这些质粒转化的土壤杆菌菌株分别命名为根癌土壤杆菌EHA 101/pBVEG 101，根癌土壤杆菌EHA 101/pBVEG 121，根癌土壤杆菌EHA 101/pBI-H-101和根癌土壤杆菌EHA 101/pBI-H-121。
(3)转基因植物的生产Arabidopsis Chaliana的生态型，WS种子(可从NotliaghamArabidopsis Stock CenterNASC获得)用20％次氯酸盐进行表面消毒，然后播种在MSO平板〕MURASHIGE0-Skoog无机盐混合物(WAKO纯化学药品工业有限公司)与2％蔗糖，3mg/l盐酸硫胺素，5mg/l尼克酸和0.5mg/l盐酸吡哆醇混合，调成pH6.3，进一步与0.2％的胶化树胶混合，高压灭菌并涂板〕上，4℃低温处理2天，然后在3000勒克司光连续照射下22℃培养。在播种1周和2周后分别转移到新MSO平板上，在第2周转移2天后，捆住3至4条根并切成大约1cm长的根切块。将根切块并排放在CIM平板(0.5mg/l 2，4-二氯苯氧乙酸和0.05mg/l激动素加入MSO平板)上，在3000勒克司光连续照射下22℃培养2天。然后，将培养2天的根切片在经过在30℃培养(2)中获得的各土壤杆菌菌株2天，接着用MS溶液稀释5倍制备的溶液中浸泡30秒，浸泡去掉剩余的水后，并排放在新CIM平板上，然后培养2天。2天后，感染的切块转移到SIMC平板〔向MSO平板上加入5mg/l N6-(2-异戊烯)腺嘌呤，0.15mg/l吲哚乙酸，0.3g/l羧苄青霉素〕上，培养2天，然后移植到SIMCS平板(向SIMS平板上加入50mg/l卡那霉素和20mg/l潮霉素)上。植物每周一次或2次重复移植到新SIMCS平板上。
当观察幼苗的再生且再生的植物具有大约5mm的完整丛生叶时，从愈伤组织切下植物部分并轻轻插到RIM平板(向MSO平板上加入0.5mg/l吲哚乙酸)上。各有根的植物最终移植到石棉上并在液体〔Hyponecks(Hyponecks日本)用水稀释1000倍〕中培养以获得T2种子。
(4)检测组织特异性在(3)中获得的种子播种到MSKH平板(向MSO平板上加入50mg/l卡那霉素和20mg/l潮霉素)上以选择抗性原种。抗性原种最终移植到石棉上并在液体〔Hyponecks(Hyponecks日本)用水稀释1000倍〕中培养。
播种大约30天后，经过切下开花并开始形成长角果的植物的地下部分收集样品。将切下的植物切块浸泡在固定液(20％多聚甲醛，0.1M磷酸盐缓冲液，1mM EDTA，pH7.0)中室温下1小时，用0.1M磷酸盐缓冲液洗涤2次，然后浸泡在底物溶液〔2mM X-Gluc，50mM磷酸盐缓冲液(pH7.0)，0.5％Triton X-100，和20％甲醛〕中。为利于底物溶液穿透而抽气25分钟后，反应在37℃进行1-3天。反应后，用70％乙醇洗涤样品，然后经过浸泡进40％甘油中观察并保存。
反应结果表明，在野生型植物及在用pBI-H-101转移的植物中未观察到GUS-特异性菌株，而在用pBI-H-121(花椰菜花叶病毒35S启动子)转移的所有植物组织中检测到该菌株。
另一方面，在用含azuki bean EXT基因启动子的pBCEG 101和pBVEG 121转移的植物中，在基的延长部分，叶和长角果的尖端和在雌蕊顶端观察到GUS菌株，表明这些部分具有有效的启动子活性。在这些结果中，野生型，pBI-H-121和pBVEG 101的结果在图10中显示。
实施例13以Azuki Bean基因组DNA的Hind III，Nsp V和Xba I片段用作模板经反向PCR分离Azuki Bean EXT2基因启动子放入分离的试管中的以与实施例5相同的方式从azuki bean叶制备的1μg基因组DNA分别用各限制性酶Hind III，Nsp V和Xba I完全消化，用酚/氯仿溶液提取1次以灭活酶，然后进行乙醇沉淀。乙醇沉淀的DNA与268μl蒸馏水，30μl 10×连接缓冲液和2μl T4 DNA连接酶(TAKARA SHUZO Co.，Ltd.)混合，经过在16℃反应过夜进行自我连接。以0.1μg获得的环形基因组DNA用作模板，使用引物IP44-3(SEQ ID NO31)作有义引物，引物IP44-5(SEQ ID NO32)作反义引物使用TaKaRa LA PCR试剂盒(TAKARA SHUZOCo.，Ltd.)进行PCR。经过重复94℃(1分钟)，98℃(20秒)和67℃(10分钟)的循环30次接着72℃(10分钟)进行反应。反应后，5μl的反应溶液进行1％琼脂糖凝胶电泳，表明仅在用限制性酶Hind III消化的样品中观察到大约6.0kbp的带。对于其它样品，在该反应中未观察到任何扩增。然后，用限制性酶Hind III消化的样品的100倍稀释液和其它未稀释的反应溶液各取1μl用作PCR的模板，该PCR使用引物IP44-2(SEQ ID NO33)作有义引物，引物IP 44-5(SEQ ID NO32)作反义引物以相同的方式进行。反应后，以1％琼脂糖凝胶电泳分析5μl反应溶液证实大约6.0kbp的带非常强，因此在用限制性酶Hind III消化的样品中被特异性扩增。在用限制性酶Nsp V消化的样品中，大量扩增似乎是非特异性的DNA片段，大约1.2kbp的带很可能是主带。在用限制性酶Xba I消化的样品中，扩增了大量似乎是非特异性的DNA片段，因此难以鉴定目的片段。然后，从用限制性酶Hind III消化的样品中，从凝胶中回收第一次PCR获得的DNA片段且使用DNA钝端化试剂盒(TAKARA SHUZO Co.，Ltd.)使其末端钝化，使用5′端标记试剂盒MEGALABELTM(TAKARA SHUZO Co.，Ltd.)在5′端使PCR产物磷酸化，然后转移进pUC 118的Hinc II位点。所得的质粒转化进大肠杆菌JM 109，但未获得菌落。
然后，计划制备大约6.0kbp PCR片段的限制性图谱以限定启动子区，然后分离并亚克隆一些片段。
首先，经过将该PCR片段钝端化接着用限制性酶Hind III消化分离大约3.1kbp带和大约2.9kbp带。将这些DNA片段与pUC118的Hind III-Hinc II位点连接并转化进大肠杆菌JM109，但仅获得了含大约2.9kbpDNA插入片段的质粒，未获得大约3.1kbp的DNA。另外，使用引物IP44-2(SEQ ID NO33)和M13引物M4(TAKARA SHUZOCo.，Ltd.)的PCR以及使用引物IP 44-6(SEQ ID NO34)和M13引物M4(TAKARA SHUZO Co.，Ltd.)的PCR的结果表明仅对引物IP 44-6(SEQ ID NO34)和M13引物M4出现扩增，2.9kbp的插入片段含azuki bean EXT2基因的3′-下游区而3.1kbp片段含启动子区。
图11显示了用引物IP 44-3和IP 44-5扩增的大约6.0kbp PCR片段的限制性图谱。在图中，限制性图谱的上部分相应于引物IP 44-5的核苷酸序列，下部分相应于引物IP 44-3的核苷酸序列。
接着，由于在该大约6.0kbp片段上存在两个EcoR I位点，对PCR片段进行末端钝化，接着用限制型酶Hind III和EcoR I消化以分离大约0.4kbp带，大约0.5kbp带和大约2.55kbp带。由于限制性图谱(图11)显示在大约0.5kbp和2.55kbp的片段上存在启动子区域，将各带连接到pUC 118的EcoR I-Hinc II位点和EcoR I-Hind III位点上，接着转化进大肠杆菌JM 109。
在由此获得的菌落中，经过使用引物IP 44-2(SEQ ID NO33)和M13引物M4(TAKARA SHUZO Co.，Ltd.)的PCR筛选连接在EcoR I-Hinc II位点的16个菌落，显示7个菌落为阳性。在这些阳性菌落中，从3个菌落中提取质粒且分别命名为pVX2P501，pVX2P503和pVX2P505。
根据Sanger方法使用M13引物M4(TAKARA SHUZO Co.，Ltd.)和M13引物RV(TAKARA SHUZO Co.，Ltd.)对pVX2P501、pVX2P503和pVX2P505的各自插入片段部分进行序列分析测定pVX2P501、pVX2P503和pVX2P505中包含的插入片段的核苷酸序列，接着合理解释这些结果。比较这些序列与原始azuki bean EXT2cDNA的序列(SEQ ID NO11)揭示重迭部分相同，且3类克隆也具有完全相同的序列。
以使用引物IP 44-2(SEQ ID NO33)和M13引物M4(TAKARA SHUZO Co.，Ltd.)的PCR筛选在EcoR I-Hind III位点连接的46个菌落，揭示27个菌落含有大约2.6kbp的插入片段。
接着，当用限制性酶AccI(TAKARA SHUZO Co.，Ltd.)消化该大约2.6kbp片段时，从3个菌落中出现大约600bp的片段，从12个菌落中出现大约500bp片段。由于上述限制性图谱(图11)表明从含启动子区的克隆出现大约600bp片段，从3个阳性菌落提取质粒，且分别命名为pEXT2pro(F)f1、pEXT2pro(F)f2和pEXT2pro(F)f3。
根据Sanger方法使用M13引物M4(TAKARA SHUZO Co.，Ltd.)和M13引物RV(TAKARA SHUZO Co.，Ltd.)对pEXT2pro(F)f1、pEXT2pro(F)f2和pEXT2pro(F)f3进行部分序列分析揭示这3类克隆具有完全相同的序列。接着，为了测序大约2.6kbp插入片段的完整区域，将经过使用合成寡聚体E/Psite(1)(SEQ ID NO35)和合成寡聚体E/Psite(2)(SEQ ID NO36)制备的PstI位点衔接头转移进pEXT2pro(F)f3的EcoR I位点。该转移允许仅在pEXT2pro(F)f3的EcoRI位点相反侧转移PstI位点。
另外，用限制性酶PstI和EcoRI完全消化该质粒，利用4序列缺失试剂盒(TAKARA SHUZO Co.，Ltd.)以获得在EcoRI位点和插入片段侧之间缺失的克隆。
根据Sangerp方法使用M13引物M4(TAKARA SHUZO Co.，Ltd.)和M13引物RV(TAKARA SHUZO Co.，Ltd.)对一些合适长度的选定的缺失克隆进行各自插入片段部分的序列分析测定pEXT2pro(F)f3中包含的插入片段的核苷酸序列，接着合理解释其结果。
经过PCR和其边界区域的直接测序证实包含于pEXT2pro(F)f3中的插入片段的核苷酸序列在基因组中连续这一事实。序列表中的SEQ IDNO3显示azuki bean EXT2 N端氨基酸序列上游启动子区的大约3.0kbp的序列。
实施例14用azuki bean基因组DNA的HindIII，NspV和XbaI片段作模板以反向PCR分离azuki bean EXT3基因启动子以与实施例13所述相同的方式用限制性酶HindIII，NspV和XbaI完全消化azuki bean基因组DNA，接着自我连接制备的0.1μg环状基因组DNA用作模板，使用引物IP 45-3(SEQ ID NO37)作有义引物且引物IP 45-5(SEQ ID NO38)作反义引物，使用TaKaRaLA PCR试剂盒(TAKARA SHUZO Co.，Ltd.)进行PCR。经过重复94℃(1分钟)，98℃(20秒)，67℃(10分钟)的循环30次最后72℃(10分钟)进行反应。反应后，5μl反应溶液进行1％琼脂糖凝胶电泳，表明仅在用限制性酶Nsp V消化的样品中观察到大约4.5kbp的带。对于其它样品，在反应中未观察到任何扩增。然后，用限制性酶Nsp V消化的样品的100倍稀释液和未稀释的其它反应液各1μl用作PCR模板，该PCR使用引物IP45-2(SEQ ID NO39)作有义引物且引物IP 45-6(SEQ ID NO40)作反义引物以相同的方式进行。反应后，以1％琼脂糖凝胶电泳分析5μl反应溶液证实大约4.5kbp的带非常强。因此在用限制性酶Nsp V消化的样品中被特异性扩增。在用限制性酶HindIII消化的样品中，扩增了大量似乎非特异性的DNA片段，因此难以鉴定目的片段。而且，在用限制性酶XbaI消化的样品中，鉴定了大约4.5kbp和大约3.5kbp的2条主带。
然后，从用限制性酶NspV消化的样品中，从凝胶中回收首次PCR获得的大约4.5kbp的DNA片段，使用DNA钝端化试剂盒(TAKARASHUZO Co.，Ltd.)进行末端钝化，使用5′端标记试剂盒MEGALABELTM(TAKARA SHUZO Co.，Ltd.)在5′端使PCR产物磷酸化，然后转移进pUC 118的HincII位点。所得的质粒转化进大肠杆菌JM 109。
在获得的菌落中，使用引物IP 45-2(SEQ ID NO39)和M13引物M4(TAKARA SHUZO Co.，Ltd.)经PCR筛选46个菌落，显示3个菌落为阳性。在这些阳性菌落中，从3个菌落提取质粒，分别命名为pVX3P206，pVX3P234和pVX3P237。
根据Sangerp方法使用M13引物M4(TAKARA SHUZO Co.，Ltd.)和M13引物RV(TAKARA SHUZO Co.，Ltd.)对pVX3P206，pVX3P234和pVX3P237的插入片段两端部分进行序列分析。结果表明这些序列含有用于PCR的引物，比较这些序列与原始azuki bean EXT3cDNA的序列(SEQ ID NO12)揭示重叠部分相同。另外在分析的区域3类克隆具有完全相同的序列。
当用限制性酶Nsp V完全消化这些片段时，大约4.0kbp的带分成大约0.5kbp和大约3.5kbp的两条带。然后，使用PCR方法鉴定大约0.5kbp和大约3.5kbp的两条带中那一条含启动子区。结果显示大约0.5kbp的带是含启动子区的DNA片段。
然后，计划将用限制性酶Xba I消化的样品中经第二次PCR获得的大约4.5kbp和大约3.5kbp的两条主带用于克隆所说启动子区的5′上游。
当用限制性酶Nsp V完全消化这些DNA片段时，大约4.5kbp的带分成大约0.5kbp和大约4.0kbp的两条带。另一方面，限制性酶Nsp V不消化大约3.5kbp的带。因此，认为大约4.5kbp的带含有启动子区，
然后，经过用限制性酶Nsp V和Xba I消化大约4.5kbp的DNA片段，接着用限制性酶Nsp V-Xba I双重消化制备大约4.5kbp的DNA片段的限制性图谱。
图12显示了用引物IP 45-3和IP 45-5扩增的大约4.5kbp片段的限制性图谱。在图中，限制性图谱的上面部分相应于引物IP 45-5的核苷酸序列，下面部分相应于引物IP 45-3的核苷酸序列。
结果，揭示了大约3.0kbp的Nsp V-Xba I DNA片段是启动子区的5′上游。
从凝胶中回收以限制性酶Nsp V-Xba I双重消化大约4.5kbpDNA片段形成的3.0kbp的DNA片段并转移进pBluescript SK(-)(Stratagene)的Xba I-Acc I位点。所得的质粒转移进大肠杆菌JM109。
在获得的菌落中，使用M13引物M4(TAKARA SHUZO Co.，Ltd.)和M13引物RV(TAKARA SHUZO Co.，Ltd.)经PCR筛选7个菌落，显示6个菌落含有大约3.0kbp的插入片段。从这6个菌落中提取质粒且分别命名为pVX3P101、pVX3P103、pVX3P104、pVX3P105、pVX3P106和pVX3P107。
在这些质粒中，根据Sanger方法使用M13引物M4(TAKARASHUZO Co.，Ltd.)和M13引物RV(TAKARA SHUZO Co.，Ltd.)对pVX3P101、pVX3P103、pVX3P104和pVX3P107各自的插入片段部分的核苷酸序列进行部分序列分析表明4类克隆具有完全相同的序列。接着，为了测序大约3.0kbp插入片段的完整序列，用限制性酶Kpn I(TAKARA SHUZO Co.，Ltd.)和Xho I(TAKARA SHUZOCo.，Ltd.)完全消化pVX3P107后，利用千序列缺失试剂盒(TAKARASHUZO Co.，Ltd.)获得的Xho I位点和插入片段侧之间缺失的克隆。经过对合适长度的一些选择的缺失克隆根据Sanger方法使用M13引物M4(TAKARA SHUZO Co.，Ltd.)和M13引物RV(TAKARASHUZO Co.，Ltd.)进行各自插入片段的序列分析测定包含于pVX3P107中的插入片段的核苷酸序列，接着合理解释这些结果。以PCR和其边界区的直接测序证实pVX3P206、pVX3P234和pVX3P237中包含的插入片段的核苷酸序列与pVX3P107中包含的插入片段的核苷酸序列在基因组中连续这一事实。序列表中SEQ ID NO4显示出由此获得的azuki bean EXT3 N-端氨基酸序列上游启动子区的大约3.4kbp的序列。
实施例15使用azuki bean基因组DNA的Hind III和Xba I片段作模板以反向PCR分离Azuki Bean XRP1基因启动子。
以与实施例13所述相同的方式用限制性酶Hind III、Nsp V和Xba I完全消化azuki bean基因组DNA接着自我连接制备的0.1μg环状基因组DNA用作模板，使用引物IPM6-3(SEQ ID NO41)作有义引物且引物IPM6-4(SEQ ID NO42)作反义引物使用TaKaRaLA PCR试剂盒(TAKARA SHUZO Co.，Ltd.)进行PCR。
经过重复94℃(1分钟)，98℃(20秒)和67℃(10分钟)的循环30次，接着72℃(10分钟)进行反应。反应后，5μl反应溶液进行1％琼脂糖凝胶电泳，表明未观察到任何扩增。
然后，1μl反应溶液用作PCR模板，以相同的方式经过使用引物IPM6-2(SEQ ID NO43)作有义引物且引物IPM6-5(SEQ IDNO44)作反义引物进行PCR。反应后，以1％琼脂糖凝胶电泳分析5μl反应溶液，证实在用限制性酶Hind III和Nsp V消化的样品中扩增了大量似乎非特异性的DNA片段，因此难以鉴定目的片段。而且，在用限制性酶Xba I消化的样品中，鉴定了大约2.5kbp和大约0.6kbp的2条主要带。
然后，从用限制性酶Xba I消化的样品中，从凝胶中回收在第二次PCR获得的大约2.5kbp和大约0.6kbp的2个DNA片段并使用DNA钝端化试剂盒(TAKARA SHUZO Co.，Ltd.)进行末端钝化，使用5′端将PCR产物磷酸化，然后转移进pUC 118的Hinc II位点。所得的质粒转化进大肠杆菌JM 109。
在获得的各组菌落中，使用M13引物M4(TAKARA SHUZO Co.，Ltd.)和M13引物RV(TAKARA SHUZO Co.，Ltd.)经PCR分别筛选6个菌落，显示5个菌落在大约2.5kbp带为阳性，而3个菌落在大约0.6kbp带在为阳性。从这些阳性菌落提取质粒。来自大约2.5kbp带的质粒分别命名为pXRG301、pXRG302、pXRG303、pXRG304和pXRG305。另外，来自大约0.6kbp带的质粒分别命名为pXRG403、pXRG404、pXRG406。
用限制性酶EcoR I和Sph I(TAKARA SHUZO Co.，Ltd.)完全消化pXRG301、pXRG302、pXRG303、pXRG304和pXRG305揭示仅pXRG302、pXRG303和pXRG304的3个质粒具有大约2.5kbp的插入片段。而且，用限制性酶Xba I完全消化pXRG301、pXRG302、pXRG303、pXRG304、pXRG305、pXRG403、pXRG404、pXRG406导致在插入片段的一个位点而不是载体的一个位点进行裂解以形成大约1.1kbp的带，而pXRG403和pXRG404和pXRG406仅在载体中存在的位点进行裂解。这些结果表明pXRG301、pXRG302、pXRG303、pXRG304和pXRG305含有目的azuki bean XRP1启动子区。
根据Sanger方法使用M13引物M4(TAKARA SHUZO Co.，Ltd.)和M13引物RV(TAKARA SHUZO Co.，Ltd.)对pXRG301、pXRG302和pXRG303和pXRG304的各插入片段的两端部分进行序列分析。结果表明pXRG302和pXRG303的序列含有用于PCR的引物，比较这些序列与原始azuki bean XRP1 cDNA的序列)SEQID NO14揭示了重叠部分是相同的。另外，2类克隆具有完全相同的序列。
图13表明了用引物IPM6-2和IPM6-5扩增的大约2.5kbp片段的限制性图谱。在图中，限制性图谱的上面部分相应于引物IPM6-5的核苷酸序列，下面部分相应于引物IPM6-2的核苷酸序列。
根据Sanger方法使用M13引物M4(TAKARA SHUZO Co.，Ltd.)和M13引物RV(TAKARA SHUZO Co.，Ltd.)经过对各自插入片段进行序列分析测定pXRG302中包含的插入片段的大约1.1kbp的azuki bean XRP1启动子区的核苷酸序列，接着进一步分析根据插入的片段的序列合成的引物并合理解释这些结果。序列表中SEQ ID NO5显示了该azuki bean XRP1 N-端氨基酸序列上游启动子区的大约1.1kbp的序列。
实施例16以西红柿基因组DNA的EcoR I，Hind III、Nsp V和Xba I片段作模板经反向PCR分离西红柿基因启动子。
使Lycopersion esculentum cv.Ponterosa的种子(TAKII SEEDCo.，Ltd.)发芽，然后培养大约1个月以获得大约10g叶和茎。在液氮存在的条件下在研钵中研碎大约2.5g这些叶和茎以制备白色粉末。所得的叶和茎粉末立即放入50ml聚苯乙烯管中，用与25％SDS混合的10ml尿素-酚DNA提取缓冲液〔0.05M Tris-HCl(pH7.6)，0.02MEDTA，5％酚，8M尿素，0.35M NaCl和2％十二烷基肌氨酸钠〕65℃提取1小时。提取物与2倍体积的酚-氯仿-异戊醇(25∶24∶1)混合物混合，轻轻搅拌大约15分钟，然后以2000rpm离心15分钟。离心后，上清转移进新管中，再与2倍体积的酚-氯仿-异戊醇(25∶24∶1)混合物混合，轻轻搅拌大约15分钟，以2000rpm离心15分钟。离心后上清转移进新管中，与2倍体积的乙醇混合，轻轻搅拌。然后沉淀，使用巴斯德吸管缠绕白色的基因组DNA并转移进新试管中。向该试管中加入1.5ml TE缓冲液〔10mM Tris-HCl(pH8.0)和1mMEDTA〕所得的混合物在55℃保存过夜以溶解该DNA。以0.4％琼脂糖凝胶电泳分析1μ经过稀释该DNA溶液10倍后制备的样品揭示了该溶液含有浓度为大约100ng/μl的高分子DNA。换句话说，从大约2.5g植物部分中获得了大约150μg的基因组DNA。
将1μg该基因组DNA放入分离的试管中并使用限制性酶EcoR I、Hind III、Nsp V和Xba I分别进行完全消化，接着以实施例13所述相同的方式进行自我连接。用0.1μg由此制备的环状基因组DNA作模板，使用TaKaRa LA PCR试剂盒(TAKARA SHUZO Co.，Ltd.)经使用引物IPLE-3(SEQ ID NO45)作有义引物且引物IPLE-4(SEQ ID NO46)作反义引物进行PCR。经过重复94℃(1分钟)，98℃(20秒)和67℃(10分钟)的循环30次，最后接着72℃(10分钟)进行反应。反应后，5μl反应溶液进行1％琼脂糖凝胶电泳，表明在用限制性酶Hind III和Xba I消化的样品中观察到大约6.6kbp的带。对于其它样品，在该反应中未观察到任何扩增。然后，用限制性酶Xba I消化的样品中获得的1μl反应液作模板，经过使用引物IPLE-2(SEQID NO47)作有义引物且引物IPLE-5(SEQ ID NO48)作反义引物使用TakaRa LA PCR试剂盒(TAKARA SHUZO Co.，Ltd.)进行第二次PCR。在与上面所述相同的条件下经过重复循环10次进行反应。反应后，从凝胶中回收获得的DNA片段并然后转移进pT7BlueT-载体(Noragen)。所得的质粒转移进大肠杆菌JM 109。
在获得的菌落中，经过使用TaKaRa LA PCR试剂盒(TAKARASHUZO Co.，Ltd.)使用引物IPLE-1(SEQ ID NO49)和引物IPLE-6(SEQ ID NO50)进行PCR筛选12个菌落，表明6个菌落为阳性。从这些6个菌落中提取质粒并分别命名为pLXG 101、pLXG 102、pLXG 103、pLXG 106、pLXG 109和pLXG 110。
根据Sanger方法，使用M13引物M4(TAKARA SHUZO Co.，Ltd.)和M13引物RV(TAKARA SHUZO Co.，Ltd.)对pLXG 101、pLXG 102和pLXG 106的各插入片段进行序列分析。
比较这些序列与原始的西红柿EXT cDNA的序列〔EP-0562836A1(1993)〕揭示了重叠部分是相同的。然而，在测序范围内检测到2至3个碱基取代。可预料到该取代包含由聚合酶反应中嵌套式PCR诱导的错误。因此，测序6个质粒中的一个的启动子区后，合成引物，也测序其它克隆，从而推断该序列在实际基因组中。
图14说明了用引物IPLE-2和IPLE-5扩增的大约6.6kbp插入片段的限制性图谱。在该图中，限制性图谱的上面部分相应于引物IPLE-5的核苷酸序列，下面部分相应于引物IPLE-2的核苷酸序列。
而且，用限制性酶Xba I完全消化p LXG 101、pLXG 102、pLXG 103、pLXG 106、pLXG 109和pLXG 110，接着进行琼脂糖电泳，显示pLXG 101、pLXG 102、pLXG 103和pLXG 110在大约4.9kbp周围形成2条带，pLXG 106和pLXG 109在大约8.1kbp和大约1.7kbp处形成两条带。这一观察表明对于pLXG 101、pLXG 102、pLXG 103这三个质粒以反向插入PCR扩增的DNA片段。另外，使用TaKaRa LAPCR试剂盒(TAKARA SHUZO Co.，Ltd.)，以这些质粒用作模板，使用M13引物M4(TAKARA SHUZO Co.，Ltd.)和引物IPLE-1(SEQ ID NO49)进行PCR的结果表明在从用限制性酶Xba I完全消化的插入片段分离的大约4.9kbp和大约1.7kbp的DNA片段中大约4.9kbp的DNA片段含有西红柿EXT基因启动子区。
然后，用限制性酶Xba I对pLXG 106进行完全消化，接着乙醇沉淀。将乙醇沉淀的DNA与268μl蒸馏水，30μl 10×连接缓冲液和3μl T4DNA连接酶(TAKARA SHUZO Co.，Ltd.)混合，然后在16℃反应过夜进行自我连接。将所得的质粒转化进大肠杆菌JM 109。
在获得的菌落中，从4个菌落提取质粒，且分别命名为pLXG601、pLXG602、pLXG603和pLXG604。用限制性酶EcoR I-Pst I双重消化这些pLXG601、pLXG602、pLXG603和pLXG604。接着琼脂糖电泳，表明在所有这些质粒中存在大约4.9kbp的插入片段。
而且，由于上述限制性图谱(图4)表明在大约4.9kbp插入片段中存在一个Hind III位点，用限制性酶Hind III完全消化pLXG 106，接着向乙醇沉淀的DNA中加入268μl蒸馏水，30μl 10×连接缓冲液和3μlT4 DNA连接酶(TAKARA SHUZO Co.，Ltd.)，然后经过16℃反应过夜进行自我连接。所得的质粒转化进大肠杆菌JM 109中。
在获得的菌落中，从6个菌落提取质粒且分别命名为pLXP 101、pLXP 102、pLXP 103、pLXP 106、pLXL 109、pLXP 111。用限制性酶EcoR I-Pst I双重消化pLXP 101、pLXP 102、pLXP 103、pLXP106、pLXL 109、pLXP 111，接着进行琼脂糖电泳，显示在所有这些质粒中存在大约1.4kbp的插入片段。
根据Sanger方法使用M13引物M4(TAKARA SHUZO Co.，Ltd.)和M13引物RV(TAKARA SHUZO Co.，Ltd.)对pLXP 101的插入片段部分的核苷酸序列进行序列分析。
接着，为了测序pLXP 101大约1.4kbp插入片段的完整区域，用限制性酶Kpn I和BamH I完全消化pLXP 101后，使用干序列缺失试剂盒(TAKARA SHUZO Co.，Ltd.)获得在BamH I位点和插入片段侧之间缺失的克隆。根据Sanger方法使用M13引物M4(TAKARA SHUZOCo.，Ltd.)和M13引物RV(TAKARA SHUZO Co.，Ltd.)对合适长度的选定缺失克隆的各插入片段部分进行序列分析测定在pLXP 101中含有的插入片段的核苷酸序列，接着合理解释这些结果。另外，使用根据pLXP 101插入片段的核苷酸序列合成的引物测序并比较在pLXG102和pLXG103中的大约1.4kbp的启动子区，从而推断大约1.4kbp启动子区的序列在西红柿EXT基因N-末端氨基酸序列的上游。这一序列在序列表的SEQ ID NO6中显示。
实施例17用烟草基因DNA的EcoR I、Hind III、Nsp V和Xba I片段作模板以反向PCR分离烟草EXT基因启动子。
大约150mg烟草BY2培养细胞(愈伤组织)在研钵中研磨成粉末，将它与0.5ml提取溶液〔15％蔗糖，50mM Tris-HCl(pH8.0)，和50mM EDTA〕混合，转移进Eppendorf管中，以500rpm离心1分钟。沉淀溶于300μl 2T-1E〔20mM Tris-HCl(pH8.0)和10mMEDTA〕中，与40μl 10％SDS混合，缓慢摇动，然后在70℃处理15分钟。所得的溶液与225μl 5M乙酸铵混合，搅拌，放于冰上30分钟，在15000rpm下离心15分钟。离心后，上清转移进新管中，与0.7ml异丙醇混合，搅拌，室温静置15分钟，以15000rpm离心15分钟。去掉上清后，残留物与冰冷的80％乙醇混合并以15000rpm离心15分钟。沉淀干燥并与100μl TE缓冲液〔10mM Tris-HCl(pH8.0)和1mMEDTA〕混合，所得混合物4℃静置过夜以溶解该DNA。以0.4％琼脂糖凝胶电泳分析5μl DNA溶液揭示了该溶液含浓度为大约100ng/μl的高分子DNA。换句话说，从大约150mg愈伤组织获得了大约10μg基因组DNA。
取1μg该基因组DNA放入分离的试管中并分别使用限制性酶EcoR I、Hind III、Nsp V和Xba I进行完全消化，接着以实施例13所述的相同方式进行自我连接。以0.1μg由此制备的环状基因组DNA作模板，使用TaKaRa LA PCR试剂盒(TAKARA SHUZO Co.，Ltd.)经使用引物IPTE-3(SEQ ID NO51)作有义引物且引物IPTE-4(SEQ ID NO52)作反义引物进行PCR。经过重复94℃(1分钟)，98℃(20秒)和67℃(10分钟)的循环30次，最后接着72℃(10分钟)进行反应。反应后，对5μl反应溶液进行1％琼脂糖凝胶电泳，表明在用限制性酶Xba I消化的样品中观察到大约1.2kbp的带。对于其它样品，在该反应中未观察到任何扩增。然后从用限制性酶Xba I消化的样品中获得的1μl上述反应溶液用作模板，使用TaKaRa LAPCR试剂盒(TAKARA SHUZO Co.，Ltd.)经过使用引物IPTE-2(SEQ ID NO53)作有义引物且引物IPTE-5(SEQ ID NO54)作反义引物进行第二次PCR。在与上述相同的条件下进行反应。结果，扩增了大约1.1kbp的DNA片段。从凝胶中回收第二次PCR获得的DNA片段，然后转移进pT7Blue T-载体(Novagen)中。所得的质粒转化进Nova Blue感受态细胞(Novagene)。
在获得的菌落中，使用引物IPTE-1(SEQ ID NO55)和引物IPTE-6(SEQ ID NO56)经PCR筛选12个菌落，表明所有12个菌落都是阳性。其中，从6个菌落提取质粒且分别命名为pNXG101、pNXG 102、pNXG 103、pNXG 104、pNXG 105和pNXG 106。
根据Sanger方法使用M13引物M4(TAKARA SHUZO Co.，Ltd.)和M13引物RV(TAKARA SHUZO Co.，Ltd.)对pNXG102、pNXG 103和pNXG 104的各插入片段进行序列分析。比较这些序列与原始烟草EXT cDNA的序列(JP7-79778A)揭示了重叠部分完全相同。
图15显示了用引物IPTE-2和IPTE-5扩增的大约1.1kbp插入片段的限制性图谱。在图中，限制性图谱的上部分相应于引物IPTE-5的核苷酸序列，下部相应于引物IPTE-2的核苷酸序列。
而且，用限制性酶Xba I完全消化pNXG 101、pNXG 102、pNXG103、pNXG 104、pNXG 105和pNXG 106接着进行琼脂糖电泳，揭示对于pNXG 101形成大约3.1kbp和大约0.9kbp的2条带，对于pNXG102、pNXG 103、pNXG 104、pNXG 105和pNXG 106形成大约3.8kbp和大约0.2kbp的两条带。这一观察结果表明对于pNXG 101和对于pNXG102、pNXG103、pNXG104、pNXG105和pNXG 106 EXT以相反的相向插入。另外，从以这些质粒用作模板使用M13引物M4(TAKARASHUZO Co.，Ltd.)和引物IPTE-1(SEQ ID NO55)或引物IPTE-6(SEQ ID NO56)进行的PCR结果揭示出在用限制性酶Xba I完全消化插入片段分离的大约0.9kbp和大约0.2kbp的DNA片段中，大约0.9kbp DNA片段含烟草EXT基因启动子区。
然后，用限制性酶Hind III对pNXG 103进行完全消化，接着乙醇沉淀，将乙醇沉淀的DNA与268μl蒸馏水，30μl 10×连接缓冲液和3μlT4 DNA连接酶(TAKARA SHUZO Co.，Ltd.)混合，然后在16℃下进行自我连接反应过夜。所得的质粒转化进大肠杆菌JM 109。从3个菌落中提取质粒并分别命名为pT-EXT-4、pT-EXT-5和pT-EXT-6，接着进行琼脂糖凝胶电泳，揭示了在所有这些质粒中存在大约0.4kbp的插入片段。根据Sanger方法使用M13引物M4(TAKARASHUZO Co.，Ltd.)和T7启动子引物(Novagen)对pT-EXT-4、pT-EXT-5和pT-EXT-6的插入片段部分的核苷酸序列进行序列分析。
而且，用限制性酶Hind III和Xba I完全消化pNXG 102，经琼脂糖凝胶电泳切下大约0.5kbp的带进行纯化。
接着，将该DNA片段连接到用限制性酶Hind III-Xba I双重消化pUC 18(TAKARA SHUZO Co.，Ltd.)获得的分子上。所得的质粒转化进大肠杆菌JM 109。
在获得的菌落中，从3个菌落提取质粒且分别命名为pT-EXT-1、pT-EXT-2和pT-EXT-3。用限制性酶Hind III-EcoR I双重消化这些pT-EXT-1、pT-EXT-2和pT-EXT-3，接着进行琼脂糖电泳，揭示了在所有这些质粒中存在大约0.5kbp的插入片段。
根据Sanger方法使用M13引物M4(TAKARA SHUZO Co.，Ltd.)和M13引物RV(TAKARA SHUZO Co.，Ltd.)对pT-EXT-1、pT-EXT-2和pT-EXT-3的插入片段部分进行核苷酸序列分析。
根据对这些结果的合理解释，测定从该烟草EXT N-未端氨基酸序列上游的启动子区的全部核苷酸序列。这些序列在序列表中以SEQID NO7表示。
实施例18用小麦基因组DNA的EcoR I、Hind III、Nsp V和Xba I片段作模板经反向PCR分离小麦基因启动子。
在独立的试管中放入1μg小麦基因组DNA(Clontech)并分别使用限制性酶EcoR I、Hind III、Nsp V和Xba I进行完全消化并以实施例13所述相同的方式进行自我连接。以0.1μg由此制备的环状基因组DNA作模板，使用TaKaRa LA PCR试剂盒(TAKARA SHUZOCo.，Ltd.)经过以引物KOM-1(SEQ ID NO57)作有义引物且引物KOM-4(SEQ ID NO58)作反义引物在总体积为50μl的反应系统中进行PCR。经过重复94℃(1分钟)，98℃(20秒)和67℃(10分钟)的循环30次，最后接着72℃(10分钟)进行反应。反应后，对5μl的反应溶液进行1％琼脂糖凝胶电泳，表明在用限制性酶Hind III消化的样品中观察到大约4.3kbp的带和大约3.5kbp的带。另外，在用限制性酶Nsp V消化的样品中观察到大约5.0kbp的带。对于其它样品，在该反应中未观察到任何扩增。
然后，用以限制性酶Hind III消化的样品获得的1μl初次PCR反应溶液作为模板，经过使用引物KOM-2(SEQ ID NO59)作有义引物且引物KOM-5(SEQ ID NO60)作反义引物，使用TaKaRaLA PCR试剂盒(TAKARA SHUZO Co.，Ltd.)在总体积50μl的反应系统中，进行嵌套式PCR。经过重复94℃(1分钟)，98℃(20秒)，67℃(10分钟)的循环30次，最后接着72℃(10分钟)进行反应。反应后，5μl的反应溶液进行1％琼脂糖凝胶电泳，表明仅观察到一条大约3.3kbp的带。然后，从凝胶中回收所得的DNA片段并使用DNA钝化试剂盒(TAKARA SHUZO Co.，Ltd.)进行末端钝化，使用5′端标记试剂盒MEGALABELTM(TAKARA SHUZO Co.，Ltd.)在5′端将PCR产物磷酸化，然后转移进pUC 119(TAKARA SHUZOCo.，Ltd.)的Hinc II位点。所得的质粒转化进大肠杆菌JM 109。
在获得的菌落中，经过使用M13引物M4(TAKARA SHUZO Co.，Ltd.)和M13引物RV(TAKARA SHUZO Co.，Ltd.)进行集落挑选PCR筛选15个菌落中含合适长度插入片段的质粒表明15个菌落中有8个为阳性。其中，从这6个菌落中提取质粒并分别命名为pKOM-1、pKOM-2、pKOM-3、pKOM-4、pKOM-5和pKOM-6。
根据Sanger方法使用M13引物M4(TAKARA SHUZO Co.，Ltd.)和M13引物RV(TAKARA SHUZO Co.，Ltd.)对pKOM-1、pKOM-2、pKOM-3、pKOM-4、pKOM-5和pKOM-6的各插入片段的两端进行序列分析。比较这些序列与原始小麦EXT cDNA的序列〔EP-0562836 A1(1993)〕揭示了重叠部分是完全相同的。然而，在测序范围内检测到2至3个碱基取代。可预料在西红柿中该取代涉及在聚合酶反应中由嵌套式PCR引起的错误。
图16说明了以引物KOM-2和KOM-5扩增的大约3.3kbp插入片段的限制性图谱。在图中，限制性图谱的上部分相应于引物KOM-5的核苷酸序列，下部分相应于引物KOM-2的核苷酸序列。
用限制性酶Hind III完全消化pKOM-1、pKOM-2、pKOM-3、pKOM-4、pKOM-5和pKOM-6，接着进行琼脂糖电泳，揭示对pKOM-1、pKOM-3和pKOM-5形成大约4.2 kbp和大约2.0kbp的两条带，而对于pKOM-2、pKOM-4和pKOM-6形成大约4.9kbp和大约1.3kbp的两条带。这一观察结果表明对于pKOM-1、pKOM-3和pKOM-5的3条带和pKOM-2、pKOM-4及pKOM-6的3条带而言，EXT以相反的方向插入。另外，从以这些质粒作模板，使用引物KOM-2(SEQ ID NO59)和MI 3引物M4(TAKARA SHUZO Co.，Ltd.)或M13引物RV(TAKARASHUZO Co.，Ltd.)进行PCR的结果揭示在用限制性酶Hind III完全消化插入片段分离的大约2.0kbp和大约1.3kbp的DNA片段中，大约1.3kbp的DNA片段含有小麦EXT基因启动子区。
然后，用限制性酶Hind III完全消化pKOM-1，经琼脂糖电泳对大约1.3kbp的DNA片段，即含小麦EXT基因启动子区的DNA片段进行纯化，接着使用TaKaRa DNA连接试剂盒(TAKARA SHUZO Co.，Ltd.)进行自我连接。所得的质粒转移进大肠杆菌JM 109中。
在获得的菌落中，经PCR检查6个菌落中插入片段的大小以检测大约1.3kbp的DNA片段。然后，从3个菌落中提取质粒并分别命名为pKEP-1、pKEP-2和pKEP-3。用限制性酶EcoR I、Sac I、Kpn I、Sma I、BamH I、Xba I、Pst I和Hind III完全消化pKEP-1、pKEP-2和pKEP-3，接着进行琼脂糖电泳以制备其限制性图谱。其中，pKEP-1的限制性图谱在图17中显示。
接着，用限制性酶Sac I完全消化KEP-1、KEP-2和KEP-3并经琼脂糖电泳对大约3.8kbp的带进行纯化，接着使用TaKaRa DNA连接试剂盒(TAKARA SHUZO Co.，Ltd.)进行自我连接。所得的质粒命名为pKEPS-1、pKEPS-2和pKEPS-3。
而且，用限制性酶EcoR I-Pst I对pKEPS-1、pKEPS-2和pKEPS-3分别进行双重消化并以琼脂糖电泳纯化大约1.1kbp的带。然后，将该DNA片段连接到以限制性EcoR I-Pst I双重消化pUC 19(TAKARA SHUZO Co.，Ltd.)获得的分子上。所得的质粒转化进大肠杆菌JM 109。
在获得的菌落中，以使用M13引物M4(TAKARA SHUZO Co.，Ltd.)和M13引物RV(TAKARA SHUZO Co.，Ltd.)的PCR筛选5个菌落中大约1.1kbp大小的插入片段。从阳性菌落中提取质粒并分别命名为pKEPEP-1、KEPPEP-2和KEPPEP-3。
根据Sanger方法使用M13引物M4(TAKARA SHUZO Co.，Ltd.)和M13引物RV(TAKARA SHUZO Co.，Ltd.)对pKEP-1、pKEP-2、pKEP-3、pKEPS-1、pKEPS-2、pKEPS-3、pKEPEP-1、KEPPEP-2和KEPPEP-3的各插入片段部分的核苷酸序列进行序列分析。
根据对这些结果的合理解释，测定在pKEP-1中含有的在小麦EXTN-末端氨基酸序列上游的启动子区的完整核苷酸序列。该序列在序列表的SEQ ID NO8中显示。
实施例19分析西红柿EXT基因的表达模式(1)制备总RNA从西红柿植物Arisa craig的叶、茎(延长期间和延长后)和果实〔成熟的绿色果实(其表面为绿色且在内面形成胶状物质)和成熟的红色果实〕各收集5g组织冷冻并在液氮中使用研钵研碎。研碎的组织与5ml提取溶液〔0.2M Tris-HCl(pH9.0)，0.1M NaCl，10mMEDTA，0.5％SDS和14mM 2-巯基乙醇〕和5ml酚-氯仿-异戊醇(50∶49∶1)混合物混合并剧烈搅拌。离心所得的悬液以分离水层。重复该方法2次。将分离的水层与1/10体积的3M乙酸钠混合，用冰冷却20分钟并离心。回收上清，与乙醇混合，然后离心以获得沉淀。该沉淀溶解于2ml TE/HPRI溶液〔10mM Tris-HCl，1mM EDTA，5U/ml RNA酶抑制剂(TAKARA SHUZO Co.，Ltd.)和1mM二硫苏糖醇(DTT)〕，与1/4体积的10M氯化锂混合，用冰冷却2小时，然后离心。获得的沉淀溶于0.5ml TE/HPRI溶液，与3M乙酸钠和乙醇混合，然后离心以获得RNA沉淀。
(2)Northern杂交使用BcaBESTTM标记试剂盒(TAKARA SHUZO Co.，Ltd.)用〔α-32P〕dCTP标记西红柿EXT cDNA的片段〔EP-0562836 A1(1993)〕和西红柿果实多聚半有乳糖醛酸酶(西红柿PG)的CDNA片段〔分子和普通遗传学，208，30-36(1987)〕以分别制备Northern杂交的探针。根据对“分子克隆，实验手册”，第二版，第7章，第7.39-7.52页(T.Maniatis等，冷泉港实验室出版社1989年出版)所述方法的修改以下述方式进行Northern杂交。这就是说，用移动甲醛的琼脂糖凝胶(1％)对2μg提取的RNA进行电泳，接着对尼龙膜(Hybond-N+)进行Northern印迹过夜。用紫外线透射仪(254nm)照射3分钟固定RNA，将膜在25ml预杂交缓冲液(6×SSC，0.1％SDS，5×Denhardt’s溶液和100μg/ml鱼精DNA)中65℃进行预杂交2小时。
以上述方法制备的32P-标记的探针加入25ml预杂交缓冲液(6×SSC，0.1％SDS，5×Denhardt氏溶液)中。向该探针溶液中加入预杂交获得的膜并在65℃进行杂交过夜。
杂交后，用含2×SSC和0.1％SDS的洗涤溶液65℃洗涤膜20分钟。干燥后，将膜在-80℃的盒中曝光过夜，盒中放有X-射线胶片(Kodak)以制备放射自显影照片。
结果在图18中显示。这就是说，图18说明了使用西红柿组织的Northern杂交，其中，西红柿EXT mRNA的表达在上排显示，西红柿PG mRNA的表达在中排显示，rRNA水平在下排显示。另外，在图中，泳道1显示成熟的红色果实，泳道2是成熟的绿色果实(其中表面为绿色，内面形成胶状物质)，泳道3是正在伸长的茎，泳道4是伸长后的茎，泳道5是叶。
从图18中可见，经过比较各植物组织之间西红柿EXT mRNA的表达水平揭示了特别是在成熟的绿色果实和在正在伸长的茎中观察到强烈表达。相反，西红柿PG mRNA用作对照，经过比较各植物组织间的表达水平，发现在成熟的红色果实中强烈表达。
(3)使用西红柿果实的RT-PCR根据实施例19(1)中所示的程序，以西红柿植物Arisa craig未成熟的绿色果实(其表面为绿色但在内部未形成凝胶物质)到成熟红色果实的不同成熟时期的10类果实制备总RNA。使用TaKaRa RNAPCR试剂盒AMV Version 2(TAKARA SHUZO Co.，Ltd.)以下列方式将1μg各总RNA用与RT-PCR以分析西红柿EXT mRNA和西红柿PG mRNA的表达。
经过使用试剂盒中所附的随机引物(9聚体)在30℃(1分钟)，55℃(15分钟)，99℃(5分钟)和5℃(5分钟)进行逆转录反应。然后，以总反应溶液作模板，使用下列组合进行PCR反应1)根据西红柿EXT cDNA片段〔EP-0562836 A1(1993)〕合成的引物TOM-1(SEQ ID NO6I)和引物TOM-2(SEQ IDNO62)，2)根据西红柿PG cDNA片段〔分子和普通遗传学，208，30-36(1987)〕合成的引物PG-SP3(SEQ ID NO63)和引物PG-AP2(SEQ ID NO64)。经过重复94℃(0.5分钟)，55℃(1分钟)和72℃(1分钟)的循环25次进行反应。反应后，反应溶液的等分试样进行1％琼脂糖凝胶电泳。结果在图19中显示。这就是说，图19说明了使用西红柿组织的RT-PCR，其中在各成熟阶段的西红柿EXT的表达以上述1)所述的引物扩增，在上排中显示，在各成熟阶段的以上述2)所述引物扩增的西红柿PG的表达(扩增产物)在下排显示。另外，在图中，数目增加的各泳道表示果实的成熟时期增加。换句话说，泳道1和2相应于未成熟的绿色果实(其中表面是绿色但内部未形成胶状物质)。泳道3和4是成熟的绿色果实(其中表面是绿色，内部形成胶状物质)，泳道5和6为转变中的果实(10至30％的果实表面变红)，泳道7和8为粉红色果实(30至60％的果实表面变红)，泳道9和泳道10为成熟的红色果实(100％的果实表面变红)。
从图19可看出，经过比较各成熟时期西红柿EXT的表达揭示了在未成熟绿色变成成熟绿色的时期诱导强烈的西红柿EXT表达，因为在相应于这段时期的泳道1到泳道4检测到扩增产物(大约913bp)。另一方面，揭示了用作对照的西红柿PG mRNA在相应于泳道5至9的转变成粉红的时期强烈表达，在这些泳道中检测到其扩增产物(大约561bp)。
这些结果揭示了西红柿EXT启动子是特别在生长的茎和变大的果实(未成熟至成熟绿色)中诱导强烈的基因表达的启动子。这就是说，揭示了在重建植物细胞壁木葡聚糖所需的位点和在重建植物细胞壁木葡聚糖所需的时期的各种情况下诱导该基因的表达。
实施例20使用烟草培养细胞的瞬时试验(1)构建转移质粒首先，为了使用电穿孔方法将含启动子区和GUS基因的嵌合基因的质粒转移进烟草BY2培养细胞的原生质体而进行各转移质粒的构建，1.制备含azuki bean EXT2基因启动子区及GUS基因(转录融合物)的DNA片段的嵌合基因的质粒。
按图20所示构建含azuki bean EXT2基因启动子区和GUS基因的DNA片段的嵌合基因的质粒。这就是说，利用具有花椰菜花叶病毒35S启动子，大肠杆菌来源的GUS基因，和来自胭指氨酸合成酶的转录终止序列表达盒的pBI221(Clontech)。
首先，为了去掉pBI221中的花椰菜花叶病毒35S启动子区，用限制性酶HindIII和SmaI(TAKARA SHUZO Co.，Ltd.)消化该质粒，然后经琼脂糖凝胶电泳纯化非35S启动子区的目的片段，接着切下。接着用限制性酶EcoRI和HincII完全消化实施例13中制备的pVX2P501，然后以琼脂糖凝胶电泳纯化大约0.5kbp的插入片段，接着切下。另外，用限制性酶HindIII和EcoRI完全消化实施例13中制备的pEXT2pro(F)f2，然后用琼脂糖凝胶电泳纯化大约2.55kbp的插入片段，接着切下。将这些DNA片段连接起来，然后转化进大肠杆菌JM 109菌株。该质粒使为pVAEXT2GUS，用pVAEXT2GUS转化的大肠杆菌JM 109菌株使为大肠杆菌JM 109/pVAEXT2GUS。用限制性酶Hind III和SnaB I消化，接着进行琼脂糖凝胶电泳时，该pVAEXTGUS形成大约3.4kbp的带，从而表明该质粒含全长大约3.0kbp的azuki bean EXT2基因启动子区。
2.制备含Azuki bean EXT3基因启动子区和GUS基因(转录融合)的DNA片段的嵌合基因的质粒。
按图21所示构建含azuki bean EXT3基因启动子区和GUS基因的DNA片段的嵌合基因的载体。这就是说，利用具有花椰菜花叶病毒35S启动子，大肠杆菌来源的GUS基因和来自胭脂氨酸合成酶的转录终止序列表达盒的pBI221(Clontech)。
首先，为了去掉pBI221中的花椰菜花叶病毒35S启动子区，用限制性酶HindIII和XbaI消化该质粒，然后以琼脂糖凝胶电泳纯化非35S启动子区的目的片段并切下。接着用大约0.3μg实施例14制备的pVX3P206作模板，经过使用位于pVX3P206 azuki bean EXT3基因启动子区Nsp V下游区域的引物VX3UH(SEQ ID NO65)和在翻译起点之前的序列的引物VX3LX(SEQ ID NO66)进行PCR。合成引物VX3UH(SEQ ID NO65)和引物VX3LX(SEQ ID NO66)使Xba I位点和Hind III位点分别转移进PCR产物的两端。经过重复94℃(1分钟)，55℃(1分钟)和72℃(2分钟)的循环10次进行反应。反应后，对5μl反应溶液进行1％琼脂糖凝胶电泳以检测除模板质粒带外的大约0.4kbp的带。由于XbaI位点和HindIII位点分别转移进了引物VX3UH(SEQ ID NO65)和引物VX3LX(SEQ ID NO66)，以琼脂糖凝胶电泳纯化这条大约0.4kbp的DNA片段，用限制性酶HindIII和Xba I消化，与前面纯化的pBI221 HindIII-XbaI DNA片段连接，然后转化进大肠杆菌JM 109菌株。该质粒命名为pVAEXT3GUS，用pVAEXT3GUS转化的大肠杆菌JM 109菌株命名为大肠杆菌JM 109/pVAEXT3GUS。
用限制性酶HindIII和XbaI消化，接着进行琼脂糖凝胶电泳时，这一pVAEXT3GUS形成大约0.4kbp的带，从而揭示该质粒含全长大约0.4kbp的azuki bean EXT3基因启动子区。
3.制备含Azuki Bean XRP1基因启动子区和GUS基因(翻译融合)的DNA片段的嵌合基因的质粒。
按图22所示构建含azuki bean XRP1基因启动子区和GUS基因的DNA片段的翻译融合嵌合基因的载体。这就是说，利用具有花椰菜花叶病毒35S启动子，大肠杆菌来源的GUS基因和来自胭脂氨酸合成酶的转录终止序列盒的pBI221(Clontech)。
首先，用限制性酶XbaI和SmaI消化pBI221，然后经琼脂糖凝胶电泳纯化目的DNA片段，接着切下。然后，用限制性酶XbaI-HincII双重消化实施例15制备的pXRG302，以琼脂糖凝胶电泳纯化大约1.1kbp的插入片段，然后切下。将该DNA片段连接到前面纯化的pBI221 DNA片段上，然后转化进大肠杆菌JM 109菌株。
从获得的菌落制备质粒。接着，为了去掉该质粒中的花椰菜花叶病毒35S启动子区，用限制性酶HindIII和XbaI消化该质粒，自我连接，然后转化进大肠杆菌JM 109菌株。该质粒命名为pVAXRPltlGUS，用pVAXRPltlGUS转化的大肠杆菌JM 109命名为大肠杆菌JM 109/pVAXRPltlGUS。以pVAXRPltlGUS作模板，使用M13引物M4(TAKARA SHUZO Co.，Ltd.)和M13引物RV(TAKARASHUZO Co.，Ltd.)进行PCR，接着进行琼脂糖凝胶电泳，导致形成大约3.0kbp的带，从而揭示了该质粒含大约1.1kbp azuki beanXRP1基因启动子区的全长。
而且，当测定从pVAXRPltlGUS中GUS基因到启动子区的上游部分核苷酸序列时，证实来自pBI221的基因(SEQ ID NO68)以能表达GUS的方式整合到编码azuki bean XRP1 N-末端氨基酸序列的基因之后以例该pVAXRPltlGUS形成具有azuki bean XRP1 N-末端氨基酸序列的GUS翻译融合蛋白。
4.制备含西红柿EXT基因启动子区和GUS基因(转录融合)的DNA片段的嵌合基因的质粒。
按图23所示构建含西红柿EXT基因启动子区(大约1.4kbp)和GUS基因的嵌合基因DNA片段的载体。这就是说，利用具有花椰菜花叶病毒35S启动子，大肠杆菌来源的GUS基因和来自胭脂氨酸合成酶的转录终止序列盒的pBI221(Clontech)。
首先，为了去掉pBI221中的花椰菜花叶病毒35S启动子区，用限制性酶HindIII-XbaI双重消化该质粒，然后用琼脂糖凝胶电泳纯化非35S启动子区的目的片段，接着切下。然后，用大约0.3μg的pLXG 103作模板，使用位于实施例16制备的pLXG 103中西红柿EXT基因启动子区Hind III位点下游区域的引物LXUH1(SEQ ID NO69)和翻译起点之前的序列引物LXLX(SEQ ID NO70)进行PCR。合成这些引物LXUH1(SEQ ID NO69)和引物LXLX(SEQ ID NO70)以便加入Hind III位点和Xba I位点并分别转移进PCR产物的末端。经过重复94℃(1分钟)，55℃(1分钟)和72℃(2分钟)的循环10次进行反应。反应后，对5μl反应溶液进行1％琼脂糖凝胶电泳以检测除模板质粒带外的大约1.4kbp的带。由于HindIII位点和XbaI位点已分别转移进引物LXUH1(SEQ ID NO69)和引物LXLX(SEQ IDNO70)，以琼脂糖凝胶电泳纯化大约1.4 kbp的DNA片段，用限制性酶HindIII和XbaI消化，与前面纯化的pBI221 DNA片段连接，然后转化进大肠杆菌JM 109菌株。该质粒命名为pLEEXT1.4GUS，用pLEEXT1.4GUS转化的大肠杆菌JM 109菌株命名为大肠杆菌JM 109/pLEEXT1.4GUS。
用限制性酶HindIII和XbaI消化接着进行琼脂糖凝胶电泳时pLEEXT1.4GUS形成大约1.4kbp的带，从而揭示了该质粒含大约1.4kbp西红柿EXT3基因的启动子区。
而且，如图24所示，使用仅与烟草EXT基因启动子区具有同源性的区域制备具有GUS基因的融合基因(转录融合)的质粒。
以实施例16中制备的大约0.3μg pLXG 103作模板，经过使用位于与pLXG 103中烟草EXT基因启动子区和西红柿EXT基因启动子区同源的区域5′下游的引物LXUH2(SEQ ID NO71)和在翻译起点之前的序列的引物(SEQ ID NO70)进行PCR。合成引物LCUH2(SEQID NO71)和引物LXLX(SEQ ID NO70)以便加入HindIII位点和XbaI位点并分别转移进PCR产物的两端。经过重复94℃(1分钟)，55℃(1分钟)和72℃(2分钟)的循环10次进行反应。反应后，对5μl反应溶液进行1％琼脂糖凝胶电泳以检测除模板质粒带外的大约0.7kbp的带。由于Hind III位点和XbaI位点分别转移进了引物LXUH2(SEQ ID NO71)和引物LXLX(SEQ ID NO70)，经琼脂糖凝胶电泳对大约0.7kbp的DNA片段进行纯化，用限制性酶HindIII和XbaI消化，与前面纯化的pBI221 DNA片段连接，然后转化进大肠杆菌JM 109菌株。这一质粒命名为pLEEXT0.7GUS，用pLEEXT0.7GUS转化的大肠杆菌JM 109菌株命名为大肠杆菌JM 109/pLEEXT0.7GUS。
用限制性酶HindIII和XbaI消化接着进行琼脂糖凝胶电泳时，该pLEEXT0.7GUS形成大约0.7kbp的带，从而揭示了该质粒含有大约0.7kbp的西红柿EXT基因启动子区域。
5.制备含西红柿XRP基因启动子区和GUS基因嵌合基因DNA片段(转录融合)的质粒。
如图25所示构建含编码的西红柿EXT N-端氨基酸序列的基因(SEQ ID NO72)和具有GUS基因的大约4.9kbp的DNA片段的翻译融合区的载体。这就是说，利用具有花椰菜花叶病毒35S启动子，大肠杆菌来源的GUS基因和来自胭脂氨酸合成酶的转录终止序列盒的pBI221(Clontech)。
首先，为了去掉pBI221中的花椰菜花叶病毒35S启动子区，用限制性酶PstI和BamHI消化该质粒，然后经琼脂糖凝胶电泳纯化非35S启动子区的目的DNA片段，接着切下。然后，用限制性酶PstI和BamHI消化实施例16中制备的pLXG601，然后经琼脂糖凝胶电泳纯化大约4.9kbp的插入片段，接着切下。该DNA片段连接到前面纯化的pBI221DNA片段上，然后转化进大肠杆菌JM 109菌株。该质粒命名为pLEEXTtl 4.9GUS且用pLEEXTtl 4.9GUS转化的大肠杆菌JM 109菌株命名为大肠杆菌JM 109/pLEEXTtl 4.9GUS。用限制性酶Pst I和BamH I完全消化pLEEXTtl 4.9GUS，接着琼脂糖凝胶电泳，导致形成大约4.9kbp的带，从而揭示了该质粒含大约4.9kbp的西红柿EXT基因启动子区。
而且，当测序pLEEXTtl 4.9GUS中从GUS基因到启动子区的上游部分的核苷酸序列时，证实来自pBI221的基因(SEQID NO73)以能表达GUS的方式整合到编码西红柿EXT N-端氨基酸序列的基因之后以便由pLEEXTtl 4.9GUS形成具有西红柿EXT N-端氨基酸序列的GUS翻译融合蛋白。
接着，按图26所示构建含编码西红柿EXT N-端氨基酸序列的基因(SEQ ID NO72)和启动子区与GUS基因的大约1.4kbp DNA片段的翻译融合区的载体。这就是说，利用具有花椰菜花叶病毒35S启动子，大肠杆菌来源的GUS基因和来自胭脂氨酸合成酶的转录终止序列盒的pBI221(Clontech)。
首先，为了去掉pBI221中的花椰菜花叶病毒35S启动子区，用限制性酶HindIII和BamHI消化该质粒，然后经琼脂糖凝胶电泳纯化非35S启动子区的目的DNA片段，接着切下。然后，用限制性酶HindIII和BamHI消化实施例16中制备的pLXP101，然后经琼脂糖凝胶电泳纯化大约1.4kbp的插入片段，接着切下。该DNA片段连接到前面纯化的pBI221DNA片段上，然后转化进大肠杆菌JM 109菌株。该质粒命名为pLEEXTtl 1.4GUS，且用pLEEXTtl 1.4GUS转化的大肠杆菌JM 109菌株命名为大肠杆菌JM 109/pLEEXTtl 1.4GUS。
用限制性酶HindIII和BamHI完全消化pLEEXTtl 1.4GUS，接着琼脂糖凝胶电泳，导致形成大约1.4kbp的带，从而揭示了该质粒含大约1.4kbp的西红柿EXT基因启动子区。
而且，当测序pLEEXTtl 1.4GUS中从GUS基因到启动子区的上游部分的核苷酸序列时，证实来自pBI221的基因(SEQ ID NO73)以能表达GUS的方式整合到编码西红柿EXT N-端氨基酸序列的基因之后以便pLEEXTtl 1.4GUS形成具有西红柿EXT N-端氨基酸序列的GUS翻译融合蛋白。
6.制备含烟草EXT基因启动子区和GUS基因(转录融合)的嵌合基因DNA片段的质粒按图27所示构建含烟草EXT基因启动子区和GUS基因的嵌合基因DNA片段的载体。这就是说，利用具有花椰菜花叶病毒35S启动子，大肠杆菌来源的GUS基因和来自胭脂氨酸合成酶的转录终止序列的pBI221(Clontech)。
首先，为了去掉pBI221中的花椰菜花叶病毒35S启动子区，用限制性酶PstI和XbaI消化该质粒，然后以琼脂糖凝胶电泳纯化非35S启动子区的目的片段，接着切下。然后，以实施例17中制备的大约0.3μg的pNXG 102作模板，以位于pNXG 102烟草EXT基因启动子区HindIII位点下游的区域的引物NXUP(SEQ ID NO74)和在转录起始点之前的序列的引物NXLX(SEQ ID NO75)进行PCR。合成引物NXUP(SEQ ID NO74)和引物NXLX(SEQ ID NO75)以便加入PstI位点和XbaI位点并分别转移到PCR产物的两端。经过重复94℃(1分钟)。55℃(1分钟)和72℃(2分钟)的循环10次进行反应。反应后，对5μl反应溶液进行1％琼脂糖凝胶电泳以检测除模板质粒带外的大约0.8kbp的带。由于PstI位点和XbaI位点已分别转移进引物NXUP(SEQ ID NO74)和引物NXLX(SEQ ID NO75)，经琼脂糖凝胶电泳纯化大约0.8kbp的DNA片段，用限制性酶PstI和XbaI消化，与前面纯化的pBI221 DNA片段连接，然后转化进大肠杆菌JM 109菌株。该质粒命名为pLEEXT 0.8GUS用pLEEXT 0.8GUS转化的大肠杆菌JM 109菌株命名为大肠杆菌JM 109/pLEEXT 0.8GUS。
以限制性酶PstI和XbaI消化，接着进行琼脂糖凝胶电泳时，pLEEXT 0.8GUS形成大约0.8kbp的带，从而揭示了该质粒含有大约0.8kbp烟草EXT基因启动子区。
7.制备含小麦EXT基因启动子区和GUS基因(转录融合)的嵌合基因DNA片段的质粒按图28所示构建含小麦EXT基因启动子区和GUS基因的嵌合基因的载体。这就是说，利用具有花椰菜花叶病毒35S启动子，大肠杆菌来源的GUS基因和来自胭脂氨酸合成酶的转录终止序列盒的pBI 221(Clontech)。
首先，为了去掉pBI221中的花椰菜花叶病毒35S启动子区，用限制性酶HindIII和SmaI消化该质粒，然后用琼脂糖凝胶电泳纯化非35S启动子区的目的DNA片段，接着切下。然后用限制酶HindIII和NaeI完全消化实施例18中制备的大约2μg的pKEP-1，以琼脂糖凝胶电泳并随后切下纯化大约0.6kbp和大约0.5kbp的DNA片段。
大约0.6kbp和大约0.5kbp的两个DNA片段连接到前面纯化的pBI221 DNA片段上，然后转化进大肠杆菌JM 109菌株。这个质粒命名为pTAEXT 1.1GUS，用该质粒转化的大肠杆菌JM 109菌株命名为大肠杆菌JM 109/pTAEXT1.1GUS。
用限制性酶HindIII和EcoRI消化pTAEXT1.1GUS，接着进行琼脂糖凝胶电泳，导致形成大约3.3kbp的带，从而揭示了该质粒含大约1.1kbp的小麦EXT基因启动子区。
(2)以电穿孔进行基因转移为了以电穿孔方法将上述实施例20-1至20-7制备的各质粒转移进烟草BY2培养细胞，用含1％纤维素酶-ONOZUKA(YakultHonsha Co.，Ltd.)，1％果胶酶Y23(SEISHIN Corporation)和0.4M甘露醇的酶溶液(pH5.5)30℃处理烟草BY2培养细胞2小时使转变成无细胞壁原生质体。在电穿孔缓冲液(70mM KCl，5mMMES和0.3M甘露醇，pH5.8)中的2×106个烟草BY2培养细胞原生质体的悬液与上述1至7段制备的质粒各3pmol和10％PEG 6000/电穿孔缓冲液边搅拌边混合，使用基因脉冲仪II(Bio-Rad实验室)对所得的混合物进行电脉冲(300V，125μF)以便将DNA转移进植物细胞。
转移后在含0.2mg/l 2，4-D作植物生长素，1％蔗糖和0.4M甘露醇的Linsmaier-Skoog培养基〔Physiologia Plantarum，18，100(1965)〕中26℃培养细胞40小时。回收细胞，并将放于Eppendorff管中的在200μl提取缓冲液〔50mM磷酸缓冲液(pH7.0)，10mMEDTA，0.1％Triton X-100，0.1％Sarkosyl和10mM 2-巯基乙醇〕中的回收细胞混合物在冰上使用调整输出对照在1.5且功循环为50％的超声仪W-225(热系统超声公司)进行超声处理30秒。然后，离心分离的上清用于GUS活性测定和蛋白质总量测定。
(3)测量启动子活性经过向放于96孔微滴度平板上的各30μl上述提取物中加入45μl提取缓冲液和25μl 4mM 4-MUG底物进行反应以产生荧光。在5、35和95分钟后，经过加入5μl反应终止溶液(1M Na2CO3)终止反应。然后，用荧光平板阅读器〔Fluoroscan II(实验系统)〕测量在激发波长为365nm，荧光波长为455nm下由反应产物4-MU发射的特异性荧光。
而且，以如下举例的程序测定蛋白质的量。因此，将2、5、10、15、20和30μl 1/5稀释的提取物溶液或800μg/ml BSA标准溶液(20μl提取缓冲液与80μl 1mg/ml BSA混合)放入96孔微量滴度平板上并向其中分别加入158、155、150、145、140和130μl蒸馏水和40μl Bio-Rad蛋白测定试剂盒(Bio-Rad Laboratories)中的测定试剂。缓慢搅拌后，在室温下静置20分钟，在60分钟内以平板阅读器(波长590nm)测量混合物以分析蛋白质的量。
以下面方式测量GUS活性。进行上述测定的同时，测量4-MU标准溶液的荧光强度，结果以4-MU量(pmol)作X-轴，荧光强度为Y轴绘成布点图。然后，从斜率获得每1个荧光单位的4-MU量，另外，以时间(分)为横轴，荧光强度为纵轴将样品的结果绘成布点图以获得荧光强度的增长率，然后获得相当于GUS活性的4-MUG的分解率。另外，从蛋白质的量获得GUS比活。结果在图29中显示。换句话说，图29显示了转化的烟草BY2培养细胞的GUS比活的比较，其中对于转移各质粒获得的GUS比活，取转移pLEEXT 1.4GUS的比活值为100，在图中对各启动子活性绘制布点图，从而比较总共进行7次的转移实验。
在图中，将转移各质粒的GUS比活值表示为横轴，取转移pLEEXT1.4GUS的比活值为100，用于实验的质粒表示为纵轴，n数值为2至7。
从这些结果，证实含这些EXT基因启动子区的DNA片段表现出比据说在植物中强烈表达的花椰菜花叶病毒35S启动子更强的活性。从该图中可看出，揭示了特别是azuki bean XRP1和西红柿EXT启动子的活性极高，从西红柿EXT启动子的比较揭示翻译融合的效率更好。
如上文所述，本发明提供了在重建植物细胞壁木葡聚糖所需的位点和时期以特异性方式表达的编码木葡聚糖内部转移酶(EXT)的基因和其家族基因的启动子。而且，本发明提供了克隆EXT基因及其家族基因的启动子的方法，含EXT基因及其家族基因的启动子的植物转化载体以及制备它们的方法，调节EXT基因及其家族基因的启动子表达的方法，和使用EXT基因和其家族基因启动子控制植物形态学和植物的方法。
附图的简要描述图1是pVXP101中插入片段的限制性图谱。
图2是pVXP-H3中插入片段的限制性图谱。
图3是显示实施例10中培养细胞Norrhern杂交的迁移方式的照片。
图4是显示实施例10中培养细胞生长的图。
图5显示了实施例11中瞬时试验的结果。
图6是pBCEG101的构建示意图。
图7是pBCEG 121的构建示意图。
图8是pBI-H-101的构建示意图。
图9是pBI-H-121的构建示意图。
图10是显示实施例12中转基因Arabidopsis植物GUS染色的结果的照片。
图11是实施例13中PCR扩增的大约6.0kbp的DNA片段的限制性图谱。
图12是实施例14中PCR扩增的大约4.5kbp的DNA片段的限制性图谱。
图13是pXRG302中插入片段的限制性。
图14是pLXG101中插入片段的限制性。
图15是pNXG102中插入片段的限制性。
图16是pKOM-1中插入片段的限制性。
图17是pKEP-1的限制性图谱。
图18显示了实施例19中植物Northern杂交的电泳迁移方式。
图19显示了实施例19中植物经RT-PCR后的电泳迁移方式。
图20是pVAEXT2GUS的构建图。
图21是pVAEXT3GUS的构建图。
图22是pVAXRPltlGUS的构建图。
图23是pLEEXT1.4GUS的构建图。
图24是pLEEXT0.7GUS的构建图。
图25是pLEEXTt4.9GUS的构建图。
图26是pLEEXTtl1.4GUS的构建图。
图27是pNTEXT0.8GUS的构建图。
图28是pTAEXT1.1GUS的构建图。
图29显示了实施例11和实施例20中转化的烟草培养细胞的GUS比活的比较。
序列表SEQ ID NO1序列长度1875序列类型核酸链型双链拓扑线型分子类型基因组DNA原始来源生物Vigna angularis序列描述AAGCTTTTTG CACATATTTG CAGCAGTAGA CAATGCCACT CGCTGAAAAA TATGATCTCC60CAGAATTTTG GCACAAAAAA TATATCCTAA CTAATATTTG ACTCTATCTA AGATACCACC 120TGACATCAAA TGTTTCAATT TTATAGTCTT TAGCACGAGA AGATGTATAT TAGATATAAA 180CCTTATCTTA TTTAATTAAT TTAGTAAGAT TGAATTAGAG GTAAATTTTA TTACTTAATA 240TAATTAGACT ACTCATAAAT ATATAAATTT AAATTTTAAG TGTTCATTCC AATATATGAA 300ATCTATTGAA AATATCACGT CAACTAATAA TATAACAAAA CTATAATATA AAAATAAGTA 360TAAATTTTAT ATTTATAAAC AATTTTGACA TTAAATTAAA CTTAAATTTA TCTCTATTAA 420TAATAATATT ATAAGACAAA TTACTCTGCT AAAATACAGA AAACAATATA TTTTTTTGAA 480ACTTTGAAAT ATTATATTGT TGGATGATGT TGGATAATTA GAAAGGACAT ATTATATATA 540TGTCACGTTG AGATGAGTGG CCCATTGCAC TGAAAATGAC TGACAAATGG TACTCTCAAT 600CCCATCTTAT TCTCTGTTCA ATTTTTTTCA CTTGAAAACT GTTTTTCCCT ATGGAAAATA 660GCAATAACTA CAATATCCTC GTTTCTTCTT GTTAGCTCTT GGCTACAACT GTGTTCATCT 720TCTCCACTTT CATCAATACA ATTCCAAACA GAATATACTT AGACCCTTCT GCTATTTCAA 780GAAAGTAGCT TGCAAATTTG CTTTGTTTCC GACATACACT TCAATATGAA AAAAAAAAAA 840AAAACACTTT GAGAACTTTT TAAAAAGTAT TAAGTAGGAT TTGACGGCAG AATTTTGTTT 900CCATATTTAG TTGAAAATAC ATACAAAACG TATTTGAAAG TTATATTCGA TTGAATTTGG 960TTTTAACATA GAAAAAATTC AACCAAATTA AGTCCATACT TAAGCATTAA TATAAATATT 1020TCAGTTATTC GACTTCGGTT TCACGTCTTG CCATTGTTTT ACATGTGTAA TACTTCAATT 1080AATTTTTTAT GTTTTCATGT CTCTTTATCC ACTCCCTTTA TTTTTACATT ATAATACCAC 1140ATTCCTCCAA TACTATAATT CTTAAGATAT ATGTGAACAT TAATATCTAA TGATACATAA 1200GGTAAGTTGT AAATATTCAT AGAAAAAATA AAATGACTTT TCAAGAAAAC CAACAACTAA 1260ATATAAAATA TAGAAAAGTT ATTTACAATT TTGTCCGTTA ACATGTCCAG ATATTACACT 1320CTCAAAAGAA AAAGTGTTAG AAAAATCATA TAAAATAGAG TTCAAATTCT TTGTTAGATT 1380TTTTTTACTG AACATTTAAA ATATATATTG ATATTGATTA TTCATTTTTA TAAATATATT 1440TTAAAATTAA CATTCAATAT ATATATTTTA AAATTAACAT TCAATATATA TATTTTAAAG 1500ACACAGAAGA AACAACAAAT TCCATAAAAT TGTGAGATAA TATTTAACCC TAACTTTCTT 1560ATGAACTGAG AGATTTTACA TTTATGAGAA ATGATTGTCC TGTGTTAATT ATCCATGTCA 1620GCTACCTAAT CACTAGAAAA GCTAATCAGA ATTCTGTGAT CTAGTCCTAC TATTCAAACA 1680CTTTTAGGCC AAAGAAAATT GAAACACAAA ATACCAGTTC TCAAATACAA TGAACATTAT 1740TAATTATAAT TCAGTTAAAA GTCATTGATC AGAACAGCAG TGAAGGTTAG CTATAAGCGC 1800GTTATAGGTG CAGGCAGAGT GTCGTGCCTA TATATACCCT TTGGAATGCA CAAGTTGAAA 1860CACAAAAGAA AAATG1875SEQ ID NO2序列长度1965序列类型核酸链型双链拓扑线型分子类型基因组DNA原始来源生物Vigna angularis序列描述AAGCTTCAAG TAAGTCTCTG TGATATGTAT GCAAGGGTTC GAAATGAGAA GAAGGCCCTT60CAAATTCTAG GTGTACTGGA ATCTAGGAAG GATGAATTAG GAAAAGCTGA TTTTGAGAGA 120ATTATAAGTG GCCTTATTGA TGGTGGGTTT CGGCAAGATG CCCAACGAAT ATGTGGGATC 180ATGGAGGCGC AGGATTTCGA TGCATCAAAG GTTAAGGTCA ACCTTATGAA GCCTGTCTCT 240AGAGGACCTC GTATGAGATA GTTTAGTGGT CATGAATTGG GACATTTTAG TCTTTCTCTG 300CAAGTGAGTT ACAAATGTAT TACCTTATAT AGGAAGCAAT GTCTGCATGA TTTATCATAC 360CATGTAACAA ATAAGAATGA ATTTGTTTAT GGATTTTTCC ATTGCTCAGA TTCTGAATTT 420ACGCAATTTT TTTTTTCTTT TGAACTTTAG TTGTTTGTAT ATACAAATGT CTTCTGTGGC 480ATGTTCATGG AATTTTCATT TCCAATTATT CAATATTCTT GTGGTGTGAT CATCACTTTT 540GTTAGGCAAA TCTGACAGCA CTGATGCCCC CTATCAGGAT TTTTAAACTT GTATGCGGTA 600TACTATACTG ATCACAAGAT ACAAACTAAT ATAAATGGAT AGGAAATGCA GATGGGATGG 660TTCAAGCTAG TCTTTAATAT TGAGATAGTA CAGAAAATGC AATGCCCAAA GTAAACAACG 720CTGATATTTC AAAATCACAT ATTAAAGCTA AAGTTGGTAG CAACTAGCGT GAGAGCATCC 780TAGTCTAGAC TGTGAATGCA GTATTTATAC ACTACAATGA TCTAAATAAG ATGCTACTAA 840TGCAATCATG CTTAATGTAA TATGAATTGA TCTAAAGTAG CTTGCAAATT TGCTTTGTTT 900CCGACATACA CTTCAATATG AAAAAAAAAA AAAACACTTT GAGAACTTTT TAAAAAGTAT 960TAAGTAGGAT TTGACGGCAG AATTTTGTTT CCATATTTAG TTGAAAATAC ATACAAAACG 1020TATTTGAAAG TTATATCCGA TTGAATTTGG TTTTAACATA GAAAAAATTC AACCAAATTA 1080AGTCCATACT TAAGCATTAA TATAAATATT TCAGTTATTC GACTTCGGTT TCACGTCTTG 1140CCATTGTTTT ACATGTGTAA TACTTCAATT AATTTTTTAT GTTTTCATGT CTCTTTATCC 1200ACTCCCTTTA TTTTTACATT ATAATACCAC ATTCCTCCAA TACTATAATT CTTAAGATAT 1260ATGTGAACAT TAATATCTAA TGATACATAA GGTAAGTTGT AAATATTCAT AGAAAAAATA 1320AAATGACTTT TCAAGAAAAC CAACAACTAA ATATAAAATA TAGAAAAGTT ATTTACAATT 1380TTGTCCGTTA ACATGTCCAG ATATTACACT CTCAAAAGAA AAAGTGTTAG AAAAATCATA 1440TAAAATAGAG TTCAAATTCT TTGTTAGATT TTTTTTACTG AACATTTAAA ATATATATTG 1500ATATTGATTA TTCATTTTTA TAAATATATT TTAAAATTAA CATTCAATAT ATATATTTTA 1560AAATTAACAT TCAATATATA TATTTTAAAG ACACAGAAGA AACAACAAAT TCCATAAAAT 1620TGTGAGATAA TATTTAACCC TAACTTTCTT ATGAACTGAG AGATTTTACA TTTATGAGAA 1680ATGATTGTCC TGTGTTAATT ATCCATGTCA GCTACCTAAT CACTAGAAAA GCTAATCAGA 1740ATTCTGTGAT CTAGTCCTAC TATTCAAACA CTTTTAGGCC AAAGAAAATT GAAACACAAA 1800ATACCAGTTC TCAAATACAA TGAACATTAT TAATTATAAT TCAGTTAAAA GTCATTGATC 1860AGAACAGCAG TGAAGGTTAG CTATAAGCGC GTTATAGGTG CAGGCAGAGT GTCGTGCCTA 1920TATATACCCT TTGGAATGCA CAAGTTGAAA CACAAAAGAA AAATG 1965SEQ ID NO3序列长度2960序列类型核酸链型双链拓扑线型分子类型基因组DNA原始来源生物Vigna angularis序列描述AAGCTTGATA GATACAATTT GTATGTACCA ACTTGAGAGG AGTGTTAAAT ATATTATTTT60TATTTTATAT TTATCTTTTA TTTTTAGTTA GTTTGTTATT ATTTATTATT TGTATTTTGG 120GCTTAGTACA TATTTCTTCT ATTATAAATA AAAGACTCTA CGTGTATATT CAACATAAAG 180GAGATTAATC TTATACATAA TTTTCACTAT ATTCAACAAC TATCATAAAA AACATGTAAA 240AAGAGGCAAT TACCATTGCA TCTTTAACAA CAATTGTGAC TTTAAACTAT CGTTATTACT 300AGTAACAAAA TCCTATTTTT ATACATGTAA ATATTTAGGA TGAAAATTAT CTCTTTCCAT 360TGAATAATAA TAAACTTTGG ATAAATAAAA TTTGATCCTG TATTATTAAT TTTATTTTTG 420AAAAGAATGA AAATTTTAAT TTAATTTTTC ATTACATACA AATTTTCAAA TTCATTAGTA 480ATTATAAAAT AGTTTCATGT TTTTGTTAAA TTAGTTGTCA AAACATATTT TTAATAAAAT 540ATCTCGAAAA AAATGTTAAC AATAAAAAAT AGGACCTTTT GACACTCCAT AAAAAAACAT 600GTTTTTTTAA TCAGAAAAAC ATGTTATAAT AATCGATAAT ACTATTCTTC ATATATCAAT 660GTATACATGT TAGAAATACT ATATATGTTA CTCAAACTAA TATAATATAT ACTTATATTT 720CAAAAATAAA AGAAGATAAA ATTATCCTAC ATATTGTTTC TTTAAATTTA CATATAAAGT 780CATATTATCG TTTTGAGTAC TCACTTAAAT AATCAAACAT GGTATATCAT ACAACATATA 840CATATATTAG TTTACAGATA AAATTATAAC AAAATCTATC TAATTCACTT TTTAAGAACA 900CAAATATTTA ATTACATTTC AATATTCAAA GTAATTTGTT ATTGATATAT TTAGAGGATT 960CATATTAAAC ACATGTAACA AGGAAAATAT ATAGAAAATA TCGTCTTATT TCAAAGTTAG 1020ATAATTCATT TAACATAAGT CTTTTCTATT CTTGTCACCT AATATCTTAA TGCTTATAAT 1080CTATAACCCC CCCAACAATA TATCATATTT ACATAATGAT TTATACTATC AATAATATCA 1140TGACTCTTGA GACATAATAT CATCTCTCAC CATACACTCC CAAAATAACA ATATCATATA 1200TAACATCATA AAAGTATCCA CATGAAATAT ACATCATCAT AATACCACAC ATTTTCATCA 1260TAAACATACA CATATTACAT ACATGAATAC TAATCTTTCA ACACAATACC GTCACATGGG 1320AGAACTTAAT TTGCCTCTCG TCCCAAAGGA GAAAACCTAA AATAACAAAC AAATTTTTTT 1380TTTTGTGTTA GTAAACATAC ACACTTTTTT AACACTCATA CAATTCACAT ATCTAAAATA 1440ATATTTAATG AAATAAATGT AAGTTAATTA AGTGCCAGTT ATCTAAAAGT GATATGCCTA 1500CTAGTCAATG GATTTAGAAC ACCAAATATC CCAATTAAGT TATTAAAACA CCTTAGTTTA 1560AACCTTTATA TCATTAGCAC CATTATAATA AGAAAATTTG AATAACAGGA AATTAAACAA 1620TTACATTTGA TCAATAATAT ATTTAAACTG CCTTGATATT TTTACCTGCT ATCTCTTTGC 1680ATAAAATATA TATTTGATTG TAATTTTAGA TTTTATATAT TATAAAAAAA TTAGTTTTAG 1740TTCTTAATTT TTTTTATTTA AATTTGACTT CTTTAATTTT TAATCATTCG TAACTTTAAT 1800CTTTGAATTT CTTGAATAAT TACTAAAGTT TTAATTATAT GCAACTTTAT TCAATTTTCA 1860ATTTTGAAAT TATACTGAAG CACTATTTTA TTACATTTAC ATTAAAGTCC TGCATTCTAT 1920TCTTCTCAAT TTTCTAAAAG ACCACGCACA TTATATACTT TACCCAATCT TATTATATTA 1980TGTTTAATGT AACCCAAATT ATAGATAATT GATCTTAAAA TTGAACAACA TTATGATCGT 2040TAAAAACTAA AATATACAAA TTGGGTAAAA GAAAATCCAC AGACCCAAAT AATGAATATT 2100ATAAAATGAG GGACTAAAAA CTACATAAAA TAATATGGAC CCAAAAAAAT ACATATTTTA 2160TAAAATATAA ATTCCAGAAT TACAATTAAG TAAAAAGATA TTAAAAGATA AGATAATAAA 2220TTATTTATCA AATATTTTTA ATTTAATTAT AAAATTTGTT ATTTAAATTT TATTTTTCTA 2280AAATTTAAAA AAAAAACTTA TAATTAATAA GTTTAGCATA CAGGTGAGCA TGTCAGTATT 2340ATATAAATTA AATATGTCAA TAGTCCATTT AGTATTAGGT GTATTGTCAT ATATCAACAT 2400GAAAGCAACA TGATTTAAAG AATAATAAAC TAATACATGA TTAAAACCGT TTAAATTTAG 2460AAATTAAGAA ACCAAGCGTA CAGAATTTAA AAGTAAATAA AAATCACATT GGAAATTTTA 2520AGAGGATAAA AAATACAATT AAATCTAAAT GGTTTCTAGT TAATATGTTT TCATACACAT 2580AAATATCAAG AAGCAATTCA TTTTACTTGT TTATAGAATT CGGTTCTTAT CCAAATTAAA 2640AAGAAAATTT CTTAGGCATA CTAAATTATA TATTTGATTG AATTTAACAT TCATTTAAAA 2700ATCATGTCTA TTAGGTACAA AATGATTGCT AATTAGCGAG CCCCAAGGTG TAATAAACGC 2760GTAATATCAT GATGACACCT GTTACTTCTA GCTTTCGAAG ATCATAATCA TGAACAGAAA 2820TATACCTAAT GAACAGAAAG AAAACTCCTG TGGCAGAGAT GAACGAAGAA GCAAACTTCC 2880AAAGCACGGT GATGTGTCTA TATATATATT CCCATTAGCC TCAAAGACTT TCACAACACT 2940TTCATCTTTC CCTTGTTAAC 2960SEQ ID NO4序列长度3300序列类型核酸链型双链拓扑线型分子类型基因组DNA原始来源生物Vigna angularis序列描述CCACCGCGGT GGCGGCCGCT CTAGACATAA TGATCTCTTT CAATGATCAC CATTAAATAT60AGACACAAAA TAGATTTGAA CTTAAGATTT ATCAAATTAA GTTTAACAAC TAAAATCCAA 120CCAGAGAACC ATGATCTCTA TCCACAAGTT ATTTTAGAAT GATTTGAGAA TGAAATTCTA 180CTAATTAAGT CATAAAAGTA TAACAAAAAA CATGAACATA TAGAAATGAT AATGAAATGC 240ATTTTTTTAA CTATTCTTGC AGGATAGAAA ACATACTGCA AAGATTCCAG AGAAAGTTTT 300TCTCTTTACT CTTCAACCTT TTAGCTCATA TTCTTCCATG TCTAGGTATC GTTCCAAGCG 360AGAAGAAGTG TGTTTGTAAA AGACACTATG ACGCTCAAGT AAGGAGTGTG CCTTTGATGA 420TAATAAATAT TTTAATAATG AACACATAAT TAATTACCTC GTGAACAAGA CTATTTATAT 480TAGGTTTATG GGTCCTTACC TGTTGGGCTT GGATTACATA GATAATCATC ATGGTTAATT 540TGTTTAGTGA TCTTGCTAAT ACTTTTAACT CTTAACCTTT ACTGATCCTT ACTATTACAA 600TGTGATCTTA AACATTACAA AATGAAATAA TGTTAGGTAG GTGTTCATGA ATATTTAAAA 660TGATTCTTGA TCGGTATGAG CCAAAATCAT CTCTGGTACA TATAAATAGA GATGAGTTTA 720GTCATTACAT ACCCACATAA TGTTAAGTAG ATGTTTACAT ATGATTGATA AGATAACCTC 780TCGTATATAG GTTGAAATGG TCTTTGATAC ATGTAATAAC ATTAGATGTT AATAGTTAAA 840AATTGATTAA AATAAAATTA CATATAATAA TTTATTTTGA TACATATTGC CAGACCTCAT 900TTAAAACGCA CCCAAAAACC TTCTGAACGG ACGTCAGGTG TCAAGCGAAG AGGATCCGGA 960AATCAGATAG TGGAAGGCAG GTGTCGGCAG ATGAGCGGAC GCTCGTTTTG ACGTGGGAAG 1020CAAAACTTGA TTTTTCAGAA AATTCACGTC ACACTCTCTG CATGCACCTT CTTCCCCAAA 1080CTCTGAAAAT TTTATTTCTC CTCCTTCTCA CTAAAAACTC TCCCTTCTCT CTATAAAATA 1140TCATCATTTG TTGATAATTT TGATGTTCGT TTTGAAGTTT TTTTATTATT ATTTAATTAT 1200AGTAATATCT CCTTCTTAAA TTCCTTAAAT AATATCTATT TATTCATGTT TTCGTTATTG 1260TCGATATATT CTAACTACAA AACTATCTTA AATACTTAAT AATGTAAAGT TAAGGTAAGA 1320TAGCGAAAGC AAAGGTAAAT GTAAATCTAA AAATAAAACA AACTTTGTAT TTAGACATTA 1380ATAATATATA TAAAAAATAC CCTTATATAT AATGGATTCT ACGTTTTAAG GTTAAGGGTA 1440TTTTAATAAT TTTCATTCTC AAAACTAAAA AAAAAAAAAA AAAAAACCTC ATTTTCAAAA 1500CTAAAAAAAA AAAAAAACCT CCAAACCCTT AGTTACCTCT CTCATTCCTC TCAACCCTTT 1560CTCTCTCATC TCTCCCACTC CAACCTTTTC TCTGTCATCC CTACTGTAGT CCCAATTGAA 1620AAAATCAGAA ACTCTAGCCC CAATTGAAAA AATCAGAAAC ACTTGCCGTT AAATTGCCTT 1680TGTAAAGAGT TGAGTCATTG ACATATTCAC CTTCAGGAAA AGGTTCACTC AAGATCTCTT 1740CAATTTCACC ATCTTCATTA ACCTCTCTAA TTTCATCATC TACATGTGTT GAATCATCAT 1800CTCTAAAAAA TTATAAAATG AAAAGTCATT ATAAAATCAT TTTTTGTAAG AAATTGTTTA 1860ACGAGTGTCT CTGATTTTTT CCACGCCAAT TACCAATTCC TTTGATGTTA TTATGCTTGT 1920GAAAATTAGA TAAAATTAGA TAAAATTAGA TAAGACAAAA ATTATAAAAT GAAAACTCAT 1980TATAAAATCA TTTTTTGTAA GAAATTGTTT AACAGCGAGT ATTTCTGATT TTTTCCAGGT 2040CAATTACCAA TTCCTTTATA CTTGTGAAAA TTGGATAAAA TTAGATAAGA CAAAAATTAT 2100AAAATGAAAA CTCATTATGA AATCATTTTT GTAAGATTGT TTAACGACAC ATGTTTCTGA 2160TTTTTTGAAT TAGGGCTATA GTAGGGATGA TAGAGAAAAA GTTGGAGTGA GAGAGATGAA 2220AGAGTGAGGA TTGAGAGAAA TGAGAGAGGT GAATAAGAGT TTGGGTGTTT TTTTTTAGTT 2280TTGAGAATGG AAATTATTAA AATACCCTTA ACCTTAAATT TAGAATCTAT GATATATAAG 2340GGTATTTTTG TCTACTAAAA TCTGATACAT ATTACTCAAA TGTACCAACT AAAAAGAGAC 2400GTACACGCGT TACCCAACCC CATATATATA TATATATTAG CCTCCCAAAC TATCTTAAAT 2460AAGGTAAAGT TAAGGTAAGA CAGCGAAAGC CATAAGTAAA TGTAAATCTA AAAGTAAAAC 2520CAATTTAGTT TTTAGACATT ACGAGTATTC AGGCATTCAT AATTATGGTA CAACTTTTTA 2580ATAAAGAAAT AAAAAGAACA ATTCATTATA TACACAAAAA AAGTTACATA CACTGAACTT 2640ATCACTTATT TCGTACACAC AAAAATTATT TATATTTTTA CATAAATCCT ATCTAGTCAG 2700TTTTCTCCAT TAAAATATTA TATAAAAATA TATAAATATA ATAATAAAAT TTAAAATACA 2760CCTCTTTGAT TTGCAACGAG CCACCAGAAG GAGAGATTGT TAATTTAAAC GGAGTAAATA 2820ATCATCAAGT GCCACGAAAT AGTTACATAA TCACGAAGTT ATCTACAAAA AATAGCCTAA 2880AATGCATTCG AAAATTTATC ATTATTGCAA ACAACAATAC TCTAATCTGA AAGAGATTGA 2940TGATTACAAA GATTAGCTAG CAGTCAATTT AAATAAACGC GTAATAGTCT CTCTATTAGT 3000TGTTTCCAAC ACAAAATCCT AACTAAAGCA AATGCATGAT TCTTTGTCTT CATCTCTCTC 3060TCATCTGACA TAAAACAAAT CTTAAATATA TATCATTAAT CATTATAACA AGCATAAACT 3120TGATCGTTTT TGTTAAATGA TGAAGCATGT ATTATTGAAT TAAATATAAA TTTATGTTGA 3180ATATTTAAAA AGATAGAAAG TAGAGGGAAA GAGAGAGGAA GAAGGGTATT GGGCTAGGTG 3240CAGTGCTTAT ATATACCCTT TTCTTAGCCA TTAGCTTCCA CAAACAGATA AACACAGAAA 3300
SEQ ID NO5序列长度1127序列类型核酸链型双链拓扑线型分子类型基因组DNA原始来源生物Vigna angularis序列描述TCTAGATGGT TTCACCCAAC TACATGTTTT GTTCTGTTTT GCTTTGGTTT CAAACTTGTG60ATAAAAGCAA CGCGTTGAGT CTGTTTGTCA ATTTTGTTCG ATTTCAGATT CTCTGTGGAT 120GGAACTCCAA TAAGGGAGTT CAAGAACATG GAGTCAAAGG GTGTTCCATT CCCCAAAAAC 180CAAGGCAATG AGGATATACT CAAGCCTTTG GAATGCAGAT GATTGGGCCA CAAGGGGAGG 240GCTTGTTAAA ACCGATTGGA GCCAAGCTCC ATTCACGGCT TCATACAGAA ACTTCAATGC 300CAATGCTTGC ACTGTGTCCT CTGGAACTTC TTCTTGTTCA AACTCTGTCT CTTCTCCCAA 360TGCTTGGCTC TCGGAAGAAT TGGACTCTAC TAACCAGGAG AGACTGAAGT GGGTACAGAA 420GAATTACAAT GATCTACAAC TATTGCACCG ACGCCAAAAG ATTTCCACAG GGCCTTCCTA 480CAGAGTGCAA CACTGCCTAA TTTTTCTTAT CAATCCTTTC CATGCTCCAC TTTCTTTTTT 540ATTTCTTCTG TTGTACTTTC CATCATGATC AATTCTTTTA TTCATTGTAA AACATTGCTA 600TCATGATAAG TTTTCTTAAA TATTTGCATA AGAAACTTGC CGTATAAATC GTCTATAAGC 660AGGAAACTAA AATAGTCCAG GAAATCGAGA ATCGAGAAAC GAGAATTTCC AGGTCACCAA 720CCTGTGAAAA TTGTTTTTGA TCTTCGATAA AAGTATTAGT TAATTAAAAA AACACAAGAT 780TGTTGAAAAT ATTAAATAAT AGAAACCATG TACTGTGTAT GGCGGTGTCT CCTTATATAA 840ATTTCATGCA GAAACGCGTG AAATGATTGG TGTGGGCGTC CATTTACAAC AACAAAACTT 900ACTACTTTTT CATTCTTCAC CAGCTGTCTA CAACTAATTC AAAAGTTCAC AACCTACCTT 960TTTCTCACTT TCCTCTTATC TACCAATCTC TCTTTTTTTC TCCTATAAAT ACCATCCTTT 1020GCAGTATCAA CCAACATTCT CACAAATAAC CAAAAACAAT TTCACTCAGT TTCACACAAA 1080ACAATTCTGC ATGGCATTTT CAAGACTTTT ACTGTTAACA TGCATTG1127
SEQ ID NO6序列长度1406序列类型核酸链型双链拓扑线型分子类型基因组DNA原始来源生物Lycopersicon esculentum序列描述AAGCTTGTTA AACTGATTTA AAAGTTCGTT TTTTAATATA TCAGAGTGTT TGATAATTAT60GAAAGTAACT TATTTTAAAT TAAATATGAT TTATTTTTAG CCAAAAGCTA AAAGTAAGGT 120AAAGAGTGTT TTTTTTTCTA ACTTGAAAGT TATTTTATGT TGACCAAATA TACAAGTATC 180TTTTTGCCTT AATTCTTTTA TTTTTTGTTT TTTATTTTTT ATTATTATAA GTTGCGCATA 240TAAAATTAAC TTAAGTAATT AATTTATATA TTTGTCTTAT GAATAATTTG TGATGATAAA 300GAAATATATG AATGATCAAA AATACTATTA CTTATTGATT AAAATATAAA TTAATTTGTT 360CTAACTCTTT TAAGTATAAA AAACTTAAAA TTAAACAAAT TTTTTTCATG TTAACCAATT 420TAAAGGTATT TCAAATATTT TTATTTTAAA AAGAAGGTGT TTCCCCGCAT TTATTTGCAA 480AACACATCAA GAATCTTTTT TCAACTTCGA CACTTTTATT CAAACATATG AATAATTATT 540TCAAATATAA TTTTTAGCAC TTTAAAAATC TTTTTTTAAT TCAATCTAAA TAGGCTCTTA 600ATAATTTTTT AAATTAATTA GACTTATTTT TAAATTTAAT AATTATTTAT AAAAAAATCG 660TATAAAATCG AAAAAAACAA AAGCACGCGC TATTAGGTCG AGTGAGATGG ATGGGGTCAT 720AAAATTTTGC TCCTCGGTCT GAGGGTGACA AGCCTTTTCT CTGATACGGG CATGTGCATG 780TCCCCGTTAA TTACTCCCCC AATGTGCAAT TACCCACTAA CTCTAACCCC TCTTTTGGAC 840AATTATTTGA AAGGCTTTAA TTTAATTATT TTTTTGTTTT TCATTCCATC TATACTTATA 900TTAAAGTTGA ATCAAATTTA GAATTACACT TGTATTTAGC ACTAAAGTGC TATATAATAA 960AAAATGACTA TGTACTCAAG AAAAATTAAA TTTGAAATCA ACAGAAGAGT CATAATTTTT 1020AATAAAGAAA TTTAAAATTT ATAAAAATAA ACACAAAAAA TGTCTCAAAG GAGATTAGAT 1080ATCTATTAGA ATATTATTGT AATAAAATAT AAATAATATA ATTTTGCATA TTCGAAGTTT 1140CTGATTAAGG ACGAAAGAAT AATCGTGGCT GCACAATAAC CTTTGTTGGT GAAAGGACAA 1200ATTTCAACCA CCCAAAATCT GAAAAATCTA ACTTTGTTTC AACTTTCAAC CACAAGTCCA 1260ACTCAGTCCC TTTTACACCT ATAAATAACC AGTCACTACA CTTCCATTTT CCTCACCCCC 1320ATTGGGCCAT ATTCATCATT CTCTAAAAAA AGAAAAAAAG AAAAATACAC AAACACTGGT 1380CTCTGATTGG ATTTGTTTTT CTCACC 1406SEQ ID NO7序列长度800序列类型核酸链型双链拓扑线型分子类型基因组DNA原始来源生物烟草序列描述TCTAGAGTTA GATCCCGAAT AATTATCTTA CACCTATCCT ATCAAAACTC TATTTTCTCT 60CATTGATAAC CTTCTTTGCT TATTCCTTGT TTCGATAATC ACTAGTCAAT AGATTTAGAT 120TCGTAGTTAA TTTTAGTATT AATCATATAA ATCTCAACTG TTGATCCTCT TGGATAGCAA 180TCAAGGTAGA AACTACGAGA ATACTGTTTA AATCCAATCC TTGTGGATAC GATATTATAC 240TATATTATCT TTGATTATTG AGCATAATTA AGTGTGTGTT TTGCGTTCGT TACAAAAGTC 300AAGTTTTCTT GAAAATAAAA ATTTCAAATT ATGTTATACT ATTTTATAAT AGTACTTTAC 360TATAGCAGTC AAAAAATATT TGGAACAAAA TGAAATTGTT ATAGAGGGGT TTAGACATTT 420TAAGCGATAA TTAAAAGTGA AAAGCACGCG CTATTAGGTC GAGTGAAATG AATGGGGTCA 480TATAACTTTC CTCCTCGGTC TGAGAGTGAC AAAGCTTTTC TCTGACGCGG GCATGTGCAT 540GTCTCCGTTA ATTGCTCCCT CAACGTGTAT TACCCAATAG ACACCTCCCA ATTATTTAAA 600AGGCCAAACA CAACCACCGA AAATCTCACT TTGTTTCAAC CCTGTGTTGA CGACCACAAG 660TGATTCCTGT TCCTGCCCCT TTACACCTAT AAATAATCAG CCATTTCCCT TCCATTTTCC 720TCACCCCCAT TGGGCCATAA TCCATTCCCA AACAAAGATA CATAGTTGTT TCTGATTGGC 780TTAGCTTTAG AACTTTCACC 800
SEQ ID NO8序列长度1138序列类型核酸链型双链拓扑线型分子类型基因组DNA原始来源生物小麦序列描述GCTTGACTTT AATCAAACCG GTATATATAA ACTAAAAAAA CGAAGGGAGT ACTACATACT60AGCTTTATAA TACTAGTACT GGATAAAATC TGCCACAGAA AGATTTTAGC GGGGAGAAGG 120AGCATCATAG ACTGACTGAA TGATAGAAGT GTTTTCACCG GCGGTGCATT GCTTTCAATC 180AATCCATTGA AATGGAGTCC AGCTGCTTAC CCTAATCTAA TCACAGGATG AGCCCATGGA 240TCTAGCTGCA GTACCTCGAC TCCACCGGAA AGGAGCGGGC CCGTGTCGGT AGCGTTGCTC 300CGGCTGGGTC CAGCACGACC CGACCGCGGC ACGCGTGGCG TTGGATTTGG AGATTCGGGC 360TCCTGATTGT GATGCGAGTC TGCAACATGC ACAGCCATGT GACCTGCATT GATTCCTGCC 420AGCCACTGTG CTGTGTGTGA GACCTGACCT GCACAAGAAC GGATCAAAGC TGGGGCCGGC 480CCTTCGCGGC ATCATCAACC TCTCAAAAAC TCGTGTAAAA ACAGGTTCAC AAAATAACTC 540ATCTGAAACA ACTCCTCAAA ATCTGACGCA GAAATGAGCC TTCTATAGAG TAGAAGAAAC 600AGCAAATGCT GCAAAAGGCG AAAAGGCTGG TCCGTCGAAT GAAATTCTGA TACTATTGCC 660TCGATTCAAC ATATATATAC TTATAATCCA AACAAGAAAT CGTACTGTAC TCCGATCCGA 720TGGCAAATAA ATCAGTGGCA ATGGCAGCAA GTTGCGAGGT GTGCATGATC CGTGGATCAA 780TCAACAATGC TTGATTTGCT CGCACTGGGC CAACCTGACA CGCACAAGAC AAGCATTGCA 840CCTCGCAAGC ACCTCACTCC ACAGCGTCCC CATGCACTGG ATGCAGCTGG CTCACTCATC 900ACTCGATTGC CATCGCTCGA TCCATCATGT TCATTTAGTG CCACGTCAAA ACAGATTATT 960TTTATTTCGC CAAGCAACCA ATAATGTACT CCAAGAACCT ACGTACAGTG AGCTCACACT 1020AGCTATAAAT ACACACAGGC TTCTTCGTCT TCGCATCCAC CACTCGCCCA TTGTTTGTAG 1080TACCAACCAG CCAAGCCAAG AAGTAACAGA GAAGGAGGAA GAGAGGCCGG CCGGCGAA1138
SEQ ID NO9序列长度173序列类型核酸链型双链拓扑线型分子类型基因组DNA原始来源生物稻序列描述CTTCAGCATG CACATCAAGC TCGTCGCCGG CGACTCCGCC GGCACCGTCA CCGCCTTCTA 60CCTGTCGTCG CAGAACTCGG AGCACGACGA GATCGACTTC GAGTTCCTGG GGAACAGGAC 120GGGGGAGCCG TACATCCTGC AGACGAACGT CTTCTCCGGC GGGAAGGGGG ACC 173SEQ ID NO10序列长度98序列类型核酸链型双链拓扑线型分子类型基因组DNA原始来源生物玉蜀黍序列描述TGAAGCTCGT CGGCGGCGAC TCCGCGGGCA CCGTCACGGC CTTCTACCTG TCGTCGCAGA 60ACTCGGAGCA CGACGAGATC GACTTCGAGT TCCTGGCA 98SEQ ID NO11序列长度1130序列类型核酸链型单链拓扑线型分子类型mRNA的cDNA原始来源
生物Vigna angularis序列描述GGTTTCCCTT GTTAACATGG CTTCTCCTTT GTTGATTTTG TGTCTTGTTC TGGTTTCGCT60AGCCTCTGCT GCACTCTGTG CGGCCCCACG GAGACCAGTG GATGTTCCAT TTGGCAGAAA 120CTACATTCCC ACATGGGCTT TCGATCACAT CAAATACTTC AATGGGGGTT CTGAGATTCA 180ACTTCATCTT GACAAGTACA CTGGCACTGG TTTCCAAACA AAAGGGTCCT ATCTGTTTGG 240TCACTTCAGC ATGAACATAA AGATGGTTCC TGGTGATTCA GCTGGCACAG TCACTGCTTT 300TTATTTATCA TCTCAAAACG CGGAGCACGA TGAGATAGAC TTTGATTTCT TGGGGAACAG 360AACAGGACAA CCTTACATTT TACAGACAAA TGTGTTCACT GGAGGGAAGG GTGACAGAGA 420GCAAAGAATC TATCTTTGGT TTGATCCCAC AAAAGCGTAT CACAGATATT CTGTACTATG 480GAACATGTAT CAAATTGTAT TCCTAGTGGA TAACATCCCA ATCAGGGTGT TCAAGAACCT 540GAAGGAGTTG GGAGTGAAGT TTCCCTTTAA CCAACCGATG AAGGTTTACA ACAGTTTATG 600GAATGCTGAT GATTGGGCCA CAAGGGGTGG TTTGGAGAAA ACAGATTGGT CAAAAGCTCC 660ATTCGTAGCA GAGTACAAGG GGTTTCATGT TGATGGGTGT GAGGCTTCAG TGAATTCAAG 720GTTCTGTGCC ACACAGGGTA AGAGATGGTG GGATCAAACA GAGTTTCGTG ATCTTGATTC 780CTTTCAGTGG CGAAGACTCA AATGGGTGCG TCAGAAATTC ACCATCTACA ACTACTGCAC 840TGACAGAACC CGCTACCCTC AACTTCCACC AGAATGCAGA AGAAACCGTG ACATTTAAAT 900TTTCATCTGC TGTTTTTATC ACTTATTTCT GTGTTCTACA ACAACTTTCT CACTGCATTC 960ATCATTTACC AGTTACCATA CTTTATTCCT ACCATTATTT ATTACCATTG TATTGTTTGG 1020AATGTGTAAT TAAGGCCTTG GGGTCTGAAT ACAGAGGAAA CTCTATAATA AAACTACGTA 1080TGTTATGTAA TTCTATTCTT ATACTTGGGC ACCACCAATA ATGTAATATT 1130SEQ ID NO12序列长度1068序列类型核酸链型单链拓扑线型分子类型mRNA的cDNA原始来源
生物Vigna angularis序列描述CAGAAAATGG TTTCTTCTTT GTGGACCGTG TCTCTGATAT TGGCATCGCT GGCCTCTGCA 60GCAGTTTGTG CCAACCCGAG GAGGCCAGTG GATGTACAAT TCGGTAGAAA CTACGTTCCT 120ACATGGGCTT TTGATCACAT CAAATACTTC AATGGTGGTT CTGAGATTCA ACTTCATCTT 180GACAAGTACA CTGGTACTGG CTTTCAGTCC AAAGGGTCAT ACTTGTTTGG CCATTTCAGC 240ATGTACATAA AGATGGTTCC TGGAGATTCA GCTGGCACAG TCACTGCCTT CTATTTATCT 300TCTCAAAACG CGGAGCACGA TGAGATAGAC TTTGAGTTCT TGGGGAACAG AACAGGACAA 360CCTTACATTT TGCAAACAAA TGTGTTCACC GGAGGAAAGG GTGACAGAGA GCAAAGAATC 420TATCTCTGGT TTGACCCCAC CAAAGCATAT CACAGATACT CTATTCTCTG GAACTTGTAT 480CAGATTGTGT TCTTTGTTGA CGATGTGCCG ATCAGAGTGT TCAAGAACAG CAAGGACTTG 540AGAGTGAAGT TTCCATTCGA CCAACCTATG AAGCTATACA ACAGTTTGTG GAATGCTGAT 600GACTGGGCAA CAAGGGGTGG TTTGGAGAAA ACAGATTGGT CGAAAGCTCC TTTCGTAGCA 660GGGTACAAGG GGTTCCACAT CGATGGGTGC GAGGCCTCTG TGACCGCTAA GTTCTGCGAC 720ACACAGGGCA AGAGATGGTG GGACCAACCA GAGTTTCGTG ACCTTGACGC CGCTCAATGG 780CAAAGACTCA AATGGGTGCG TCAGAAATTC ACCATCTACA ACTACTGCAC TGACAGAAAA 840CGCTACCCTC AACTTTCCCC TGAATGCAGT AGAGACCGCG ACATTTAAAT TTTCACATAC 900TTCTGTTACC ATTTACTTTT ACCAGATTGT TGTCACTTTC ATGTACAATT TTATATCACG 960TCAAATCTAT CCATTGCCAC TTTATTTATG AATTGAAATT TGCTTCAGAT AAAAAAATTA 1020TAAATAAACA CAGTTTTTCT TAGAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAA 1068SEQ ID NO13序列长度27序列类型核酸链型单链拓扑线型分子类型其它核酸(合成的DNA)序列描述GATGAGATAG ACTTYGAGTT CTTGGGR 27
SEQ ID NO14序列长度1017序列类型核酸链型单链拓扑线型分子类型mRNA的cDNA原始来源生物Vigna angularis序列描述GAAACAATTT CACTCAGTTT CACACAAAAC AATTCTGCAT GGCATTTTCA AGACTTTTAC 60TGTTAACATG CATTGTTGGG TATTTTCTGA TTGCCTCTGC ATCCAATTTC TATCAAGATT 120TTGAAATAAC CTGGGGAGAT GGTCGTGCCA AGACACTAAA CAATGGCGAC CTTCTTACTT 180TGTCTCTTGA CAAAGCCTCT GGCTCCGGCT TTCAGTCAAA GAATGAATAC CTTTTTGGCA 240AAATTGACAT GCAACTCAAA CTAGTCCCCG GCAACTCTGC TGGCACCGTC ACTGCCTACT 300ATCTGTCTTC AAAAGGAGCA ACGTGGGATG AGATTGACTT TGAATTCTTG GGGAATTTGA 360GCGGTGATCC TTACATTCTC CACACCAACG TGTTTAGCCA AGGCAAGGGT AATAGGGAGC 420AACAATTCTA CCTCTGGTTT GACCCAACTG CTGATTTTCA CACCTATTCC ATCCTCTGGA 480ACCCTCAACG TATTGTATTC TCTGTGGATG GAACTCCAAT AAGGGAGTTC AAGAACATGG 540AGTCAAAGGG TGTTCCATTC CCCAAAAACC AAGCAATGAG GATATACTCA AGCCTTTGGA 600ATGCAGATGA TTGGGCCACA AGGGGAGGGC TTGTTAAAAC CGATTGGAGC CAAGCTCCAT 660TCACGGCTTC ATACAGAAAC TTCAATGCCA ATGCTTGCAC TGTGTCCTCT GGAACTTCTT 720CTTGTTCAAA CTCTGTCTCT TCTCCCAATG CTTGGCTCTC GGAAGAATTG GACTCTACTA 780ACCAGGAGAG ACTGAAGTGG GTACAGAAGA ATTACATGAT CTACAACTAT TGCACCGACG 840CCAAAAGATT TCCACAGGGC CTTCCTACAG AGTGCAACAC TGCCTAATTT TTCTTATCAA 900TCCTTTCCAT GCTCCACTTT CTTTTTTATT TCTTCTGTTG TACTTTCCAT CATGATCAAT 960TCTTTTATTC ATTGTAAAAC ATTGCTATCA TGATAAGTTT TCTTAAATAT TTCATAA1017SEQ ID NO15序列长度588
序列类型核酸链型单链拓扑线型分子类型mRNA的cDNA原始来源生物Vigna angularis序列描述GATGAGATTG ATTTTGAGTT CTTGGGGAAC CGTAGTGGTC AGCCTTACAC AGTTCAGACA60AATATCTACG CTCATGGAAA AGGGGATAGA GAGCAAAGGG TGAACCTCTG GTTTGATCCT 120TCCGCGGATT TTCACACCTA CACTATCATG TGGAATCATC ACCATATTGT GTTCTACGTT 180GATGATTTTC CCATTAGAGT GTACAAGAAC AATGAAGCGA AGGGAATCGC ATACCCAAAG 240ATGCAGGCTA TGGGAGTGTA TTCGACGTTG TGGGAAGCTG ATAACTGGGC AACAAGAGGG 300GGATTGGAGA AAATCGATTG GAGTAAGGCA CCATTTTATG CATATTACAA GGACTTTGAC 360ATTGAAGGGT GCCCAAGTCC AGGACCTGCT AACTGTGCCT CTAATCAAAG TAATTGGTGG 420GAAGGAGCTA CATACCAAGC TCTTAATGCC ATGGAAGCTC GAAGGTACAG GTGGGCTCGT 480CTTAACCATA TGATCTATGA TTACTGCCAA GATAAGCCAA GGTACACGGT CATCCCACCA 540GAGTGCCTTG CCGGCATTTA AACCCAAGAA CTCAAAATCA ATCTCATC588SEQ ID NO16序列长度854序列类型核酸链型单链拓扑线型分子类型mRNA的cDNA原始来源生物烟草序列描述CTGTCTTTGG ACAAAGTTTC TGGCTCTGGT TTTCAATCTA AGAAAGAGTA TCTCTTTGGG 60AGAATTGATA TGCAAATCAA ACTTGTTGCT GGAAATTCTG CTGGAACTGT CACTACATAC 120TATTTATCTT CTCAGGGACC CACACATGAT GAAATTGACT TTGAATTCTT GGGAAATGTT 180ACTGGTGAAC CTTATATTCT CCACACAAAC ATTTATGCCC AAGGCAAAGG AAACAAAGAG 240CAGCAATTTT ACCTTTGGTT TGATCCTACC AAGAACTTCC ACACCTACTC AATCATATGG 300AAACCCCAAC ATATCATTTT TTTGGTCGAC AACACACCAA TAAGAGTTTA CAAGAATGCT 360GAATCCATTG GTGTGCCATT TCCCAAGAAC CAGCCCATGA GAATTTACTC TAGCCTTTGG 420AATGCTGATG ATTGGGCAAC AAGAGGAGGC CTAGTGAAAA CTGATTGGTC TAAAGCACCA 480TTTACAGCCT ACTATAGAAA TTTCAATTCT CAAACTTTTA GCAGTTCACA ATTTTCAAAT 540GAAAAATGGC AAAATCAAGA ACTTGATGCC AATGGCAGAA GAAGACTCAG ATGGGTGCAG 600AGGAATTTCA TGATTTATAA TTATTGTACT GATTTTAAGA GGTTTCCTCA GGGTTTTCCT 660CCAGAATGCA AAAGATTTTG AGTGATATTA GTTGGTTTTT GTGTAATTCT TTGATGTGTT 720TGTGGTTTTA TTTTGTTAGA TTATAGCAAC CAAAATAAAT GTATTTTTCT CGTTTTATTT 780TGTATCTTTT TCGAAGCTTG TAGTTCATCT TGTATCTAAT TTGTTTGATA TCCTTTATGA 840TAAAAAAAAA AAAA854SEQ ID NO17序列长度20序列类型核酸链型单链拓扑线型分子类型其它核酸(合成的DNA)序列描述ACACAAAATA CCAGTTCTCA 20SEQ ID NO18序列长度227序列类型核酸链型双链拓扑线型分子类型基因组DNA原始来源生物Vigna angularis序列描述GAATTCTGTG ATCTAGTCCT ACTATTCAAA CACTTTTAGG CCAAAGAAAA TTGAAACACA 60AAATACCAGT TCTCAAATAC AATGAACATT ATTAATTATA ATTCAGTTAA AAGTCATTGA 120TCAGAACAGC AGTGAAGGTT AGCTATAAGC GCGTTATAGG TGCAGGCAGA GTGTCGTGCC 180TATATATACC CTTTGGAATG CACAAGTTGA AACACAAAAG AAAAATG227SEQ ID NO19序列长度290序列类型核酸链型双链拓扑线型分子类型基因组DNA原始来源生物Vigna angularis序列描述ACTCTTTGTA ATTTTATCGA AGAGTTAGTG TGCAATAGAA ATTTAACATT GAGTATTTAC 60AATTGTTAAA ACTATACATT CACTTCATTT TCATGCATTT ATAAACATTT CAATTTCAAT 120TTCATGTTAA AATCAACTCA AAGTAATACT CAAATCTTAT TCCTAGTGAC TTTAATATAT 180TGTTAACTTA TCAAGTTTCA ATTCCTTCAA TCATCAACAA GCAATCAAGA ATTAAGTTCA 240AGAGTCTTAA GATTACTAAT AAATCATGTT CTATCCCTAG ATATAAGCTT 290SEQ ID NO20序列长度1654序列类型核酸链型双链拓扑线型分子类型基因组DNA原始来源生物Vigna angularis
序列描述AAGCTTTTTG CACATATTTG CAGCAGTAGA CAATGCCACT CGCTGAAAAA TATGATCTCC60CAGAATTTTG GCACAAAAAA TATATCCTAA CTAATATTTG ACTCTATCTA AGATACCACC 120TGACATCAAA TGTTTCAATT TTATAGTCTT TAGCACGAGA AGATGTATAT TAGATATAAA 180CCTTATCTTA TTTAATTAAT TTAGTAAGAT TGAATTAGAG GTAAATTTTA TTACTTAATA 240TAATTAGACT ACTCATAAAT ATATAAATTT AAATTTTAAG TGTTCATTCC AATATATGAA 300ATCTATTGAA AATATCACGT CAACTAATAA TATAACAAAA CTATAATATA AAAATAAGTA 360TAAATTTTAT ATTTATAAAC AATTTTGACA TTAAATTAAA CTTAAATTTA TCTCTATTAA 420TAATAATATT ATAAGACAAA TTACTCTGCT AAAATACAGA AAACAATATA TTTTTTTGAA 480ACTTTGAAAT ATTATATTGT TGGATGATGT TGGATAATTA GAAAGGACAT ATTATATATA 540TGTCACGTTG AGATGAGTGG CCCATTGCAC TGAAAATGAC TGACAAATGG TACTCTCAAT 600CCCATCTTAT TCTCTGTTCA ATTTTTTTCA CTTGAAAACT CTTTTTCCCT ATGGAAAATA 660GCAATAACTA CAATATCCTC GTTTCTTCTT GTTAGCTCTT GGCTACAACT GTGTTCATCT 720TCTCCACTTT CATCAATACA ATTCCAAACA GAATATACTT AGACCCTTCT GCTATTTCAA 780GAAAGTAGCT TGCAAATTTG CTTTGTTTCC GACATACACT TCAATATGAA AAAAAAAAAA 840AAAACACTTT GAGAACTTTT TAAAAAGTAT TAAGTAGGAT TTGACGGCAG AATTTTGTTT 900CCATATTTAG TTGAAAATAC ATACAAAACG TATTTGAAAG TTATATTCGA TTGAATTTGG 960TTTTAACATA GAAAAAATTC AACCAAATTA AGTCCATACT TAAGCATTAA TATAAATATT 1020TCAGTTATTC GACTTCGGTT TCACGTCTTG CCATTGTTTT ACATGTGTAA TACTTCAATT 1080AATTTTTTAT GTTTTCATGT CTCTTTATCC ACTCCCTTTA TTTTTACATT ATAATACCAC 1140ATTCCTCCAA TACTATAATT CTTAAGATAT ATGTGAACAT TAATATCTAA TGATACATAA 1200GGTAAGTTGT AAATATTCAT AGAAAAAATA AAATGACTTT TCAAGAAAAC CAACAACTAA 1260ATATAAAATA TAGAAAAGTT ATTTACAATT TTGTCCGTTA ACATGTCCAG ATATTACACT 1320CTCAAAAGAA AAAGTGTTAG AAAAATCATA TAAAATAGAG TTCAAATTCT TTGTTAGATT 1380TTTTTTACTG AACATTTAAA ATATATATTG ATATTGATTA TTCATTTTTA TAAATATATT 1440TTAAAATTAA CATTCAATAT ATATATTTTA AAATTAACAT TCAATATATA TATTTTAAAG 1500ACACAGAAGA AACAACAAAT TCCATAAAAT TGTGAGATAA TATTTAACCC TAACTTTCTT 1560ATGAACTGAG AGATTTTACA TTTATGAGAA ATGATTGTCC TGTGTTAATT ATCCATGTCA 1620GCTACCTAAT CACTAGAAAA GCTAATCAGA ATTC 1654
SEQ ID NO21序列长度29序列类型核酸链型单链拓扑线型分子类型其它核酸(合成的DNA)序列描述GAAGTAATAC TCAAATCTTA TTCCTAGTG 29SEQ ID NO22序列长度30序列类型核酸链型单链拓扑线型分子类型其它核酸(合成的DNA)序列描述CCCATTTTTC TTTTGTGTTT CAACTTGTGC 30SEQ ID NO23序列长度30序列类型核酸链型单链拓扑线型分子类型其它核酸(合成的DNA)序列描述ACAAGCAATC AAGAATTAAG TTCAAGAGTC 30SEQ ID NO24序列长度30序列类型核酸链型单链拓扑线型分子类型其它核酸(合成的DNA)序列描述TAATAATGTT CATTGTATTT GAGAACTGGT 30SEQ ID NO25序列长度30序列类型核酸链型单链拓扑线型分子类型其它核酸(合成的DNA)序列描述GATTACTAAT AAATCATGTT CTATCCCTAG 30SEQ ID NO26序列长度30序列类型核酸链型单链拓扑线型分子类型其它核酸(合成的DNA)序列描述AAAGTGTTTG AATAGTAGGA CTAGATCACA 30SEQ ID NO27序列长度1744序列类型核酸链型双链拓扑线型分子类型基因组DNA原始来源生物Vigna angularis序列描述AAGCTTCAAG TAAGTCTCTG TGATATGTAT GCAAGGGTTC GAAATGAGAA GAAGGCCCTT 60CAAATTCTAG GTGTACTGGA ATCTAGGAAG GATGAATTAG GAAAAGCTGA TTTTGAGAGA 120ATTATAAGTG GCCTTATTGA TGGTGGGTTT CGGCAAGATG CCCAACGAAT ATGTGGGATC 180ATGGAGGCGC AGGATTTCGA TGCATCAAAG GTTAAGGTCA ACCTTATGAA GCCTGTCTCT 240AGAGGACCTC GTATGAGATA GTTTAGTGGT CATGAATTGG GACATTTTAG TCTTTCTCTG 300CAAGTGAGTT ACAAATGTAT TACCTTATAT AGGAAGCAAT GTCTGCATGA TTTATCATAC 360CATGTAACAA ATAAGAATGA ATTTGTTTAT GGATTTTTCC ATTGCTCAGA TTCTGAATTT 420ACGCAATTTT TTTTTTCTTT TGAACTTTAG TTGTTTGTAT ATACAAATGT CTTCTGTGGC 480ATGTTCATGG AATTTTCATT TCCAATTATT CAATATTCTT GTGGTGTGAT CATCACTTTT 540GTTAGGCAAA TCTGACAGCA CTGATGCCCC CTATCAGGAT TTTTAAACTT GTATGCGGTA 600TACTATACTG ATCACAAGAT ACAAACTAAT ATAAATGGAT AGGAAATGCA GATGGGATGG 660TTCAAGCTAG TCTTTAATAT TGAGATAGTA CAGAAAATGC AATGCCCAAA GTAAACAACG 720CTGATATTTC AAAATCACAT ATTAAAGCTA AAGTTGGTAG CAACTAGCGT GAGAGCATCC 780TAGTCTAGAC TGTGAATGCA GTATTTATAC ACTACAATGA TCTAAATAAG ATGCTACTAA 840TGCAATCATG CTTAATGTAA TATGAATTGA TCTAAAGTAG CTTGCAAATT TGCTTTGTTT 900CCGACATACA CTTCAATATG AAAAAAAAAA AAAACACTTT GAGAACTTTT TAAAAAGTAT 960TAAGTAGGAT TTGACGGCAG AATTTTGTTT CCATATTTAG TTGAAAATAC ATACAAAACG 1020TATTTGAAAG TTATATCCGA TTGAATTTGG TTTTAACATA GAAAAAATTC AACCAAATTA 1080AGTCCATACT TAAGCATTAA TATAAATATT TCAGTTATTC GACTTCGGTT TCACGTCTTG 1140CCATTGTTTT ACATGTGTAA TACTTCAATT AATTTTTTAT GTTTTCATGT CTCTTTATCC 1200ACTCCCTTTA TTTTTACATT ATAATACCAC ATTCCTCCAA TACTATAATT CTTAAGATAT 1260ATGTGAACAT TAATATCTAA TGATACATAA GGTAAGTTGT AAATATTCAT AGAAAAAATA 1320AAATGACTTT TCAAGAAAAC CAACAACTAA ATATAAAATA TAGAAAAGTT ATTTACAATT 1380TTGTCCGTTA ACATGTCCAG ATATTACACT CTCAAAAGAA AAAGTGTTAG AAAAATCATA 1440TAAAATAGAG TTCAAATTCT TTGTTAGATT TTTTTTACTG AACATTTAAA ATATATATTG 1500ATATTGATTA TTCATTTTTA TAAATATATT TTAAAATTAA CATTCAATAT ATATATTTTA 1560AAATTAACAT TCAATATATA TATTTTAAAG ACACAGAAGA AACAACAAAT TCCATAAAAT 1620TGTGAGATAA TATTTAACCC TAACTTTCTT ATGAACTGAG AGATTTTACA TTTATGAGAA 1680ATGATTGTCC TGTGTTAATT ATCCATGTCA GCTACCTAAT CACTAGAAAA GCTAATCAGA 1740ATTC 1744SEQ ID NO28序列长度8序列类型氨基酸链型单链拓扑线型分子类型肽序列描述Asp Glu Ile Asp Phe Glu Leu Gly1 5SEQ ID NO29序列长度29序列类型核酸链型单链拓扑线型分子类型其它核酸(合成的DNA)序列描述GGAAGCTTGA ATTCTGTGAT CTAGTCCTA 29SEQ ID NO30序列长度29序列类型核酸链型单链拓扑线型分子类型其它核酸(合成的DNA)序列描述GGTCTAGATC CAAAGGGTAT ATATAGGCA 29SEQ ID NO31序列长度30序列类型核酸链型单链拓扑线型分子类型其它核酸(合成的DNA)序列描述ATCCACTGGT CTCCGTGGGG CNGCACAGAG 30SEQ ID NO32序列长度30序列类型核酸链型单链拓扑线型分子类型其它核酸(合成的DNA)序列描述AACTTTCTCA CTGCATTCAT CATTTACCAG 30SEQ ID NO33序列长度30序列类型核酸链型单链拓扑线型分子类型其它核酸(合成的DNA)序列描述AGGCTAGCGA AACCAGAACA AGACACAAAA 30SEQ ID NO34序列长度30序列类型核酸链型单链拓扑线型分子类型其它核酸(合成的DNA)序列描述CATACTTAT TCCTACCATT ATTTATTACC 30SEQ ID NO35序列长度31序列类型核酸链型单链拓扑线型分子类型其它核酸(合成的DNA)序列描述AATTTGGTCT CAACTGCAGT TCGTCAACCC G 31SEQ ID NO36序列长度31序列类型核酸链型单链拓扑线型分子类型其它核酸(合成的DNA)序列描述AATTCGGGTT GACGAACTGC AGTTGAGACC A 31SEQ ID NO37序列长度30序列类型核酸链型单链拓扑线型分子类型其它核酸(合成的DNA)序列描述ATCCACTGGC CTCCTCGGGT TGGCACAAAC 30SEQ ID NO38序列长度30序列类型核酸链型单链拓扑线型分子类型其它核酸(合成的DNA)序列描述CTTTTACCAG ATTGTTGTCA CTTTCATGTA 30SEQ ID NO39序列长度30序列类型核酸链型单链拓扑线型分子类型其它核酸(合成的DNA)序列描述CTGCAGAGGC CAGCGATGCC AATATCAGAG 30SEQ ID NO40序列长度30序列类型核酸链型单链拓扑线型分子类型其它核酸(合成的DNA)序列描述TCTATCCATT GCCACTTTAT TTATGAATTG 30SEQ ID NO41序列长度30序列类型核酸链型单链拓扑线型分子类型其它核酸(合成的DNA)序列描述ATTGGATGCA GAGGCAATCA GAAAATACCC 30SEQ ID NO42序列长度30序列类型核酸链型单链拓扑线型分子类型其它核酸(合成的DNA)序列描述CTACAGAGTG CAACACTGCC TAATTTTTCT 30SEQ ID NO43序列长度30序列类型核酸链型单链拓扑线型分子类型其它核酸(合成的DNA)序列描述CAATGCATGT TAACAGTAAA AGTCTTGAAA 30SEQ ID NO44序列长度30序列类型核酸链型单链拓扑线型分子类型其它核酸(合成的DNA)序列描述CTCCACTTTC TTTTTTATTT CTTCTGTTGT 30SEQ ID NO45序列长度30序列类型核酸链型单链拓扑线型分子类型其它核酸(合成的DNA)序列描述GGATACCCAC AAATACAAC AAGTGACAAA 30SEQ ID NO46序列长度30序列类型核酸链型单链拓扑线型分子类型其它核酸(合成的DNA)序列描述CAAAGTGCTT TTAATTGAGC TGTATTTCCC 30SEQ ID NO47序列长度30序列类型核酸链型单链拓扑线型分子类型其它核酸(合成的DNA)序列描述AAAACTCCTT TTATGATACC CATGGTGAGA 30SEQ ID NO48序列长度30序列类型核酸链型单链拓扑线型分子类型其它核酸(合成的DNA)序列描述TTTTTGAGTG TATCATTATT GGTGGAGTCA 30SEQ ID NO49序列长度30序列类型核酸链型单链拓扑线型分子类型其它核酸(合成的DNA)序列描述ATCTGAGACC AGTGTTTGTG TATTTTTCGC30SEQ ID NO50序列长度30序列类型核酸链型单链拓扑线型分子类型其它核酸(合成的DNA)序列描述GATATTATGT ATCTCATGCC AGGCCTTTCA 30SEQ ID NO51序列长度30序列类型核酸链型单链拓扑线型分子类型其它核酸(合成的DNA)序列描述AGGTACTTGA TGTGGTGACT AGCCCCAACTG30SEQ ID NO52序列长度30序列类型核酸链型单链拓扑线型分子类型其它核酸(合成的DNA)序列描述GGTCTTCATG ACTCAGCGTG TAACGAGTGA 30SEQ ID NO53序列长度30序列类型核酸链型单链拓扑线型分子类型其它核酸(合成的DNA)序列描述CTCATAGTTT TTCCAAAAGG GTACATCCAC 30SEQ ID NO54序列长度35序列类型核酸链型单链拓扑线型分子类型其它核酸(合成的DNA)序列描述TATTGTAATT TATTGCACTA TTTGTTTTCT CTGAA 35SEQ ID NO55序列长度30序列类型核酸链型单链拓扑线型分子类型其它核酸(合成的DNA)序列描述GGGATACCCA CAAAGTCCTA GTAATGACAA 30SEQ ID NO56序列长度35序列类型核酸链型单链拓扑线型分子类型其它核酸(合成的DNA)序列描述AACCAATACT TATGAGTGTA GCACTATTGA ACAAC 35SEQ ID NO57序列长度30序列类型核酸链型单链拓扑线型分子类型其它核酸(合成的DNA)序列描述ATGTGCATGC TGAAGTGGCC GAAGAGGTAG 30SEQ ID NO58序列长度30序列类型核酸链型单链拓扑线型分子类型其它核酸(合成的DNA)序列描述ACTACCACTA GTTGTTGTTG TGCCGCTGGT 30SEQ ID NO59序列长度30序列类型核酸链型单链拓扑线型分子类型其它核酸(合成的DNA)序列描述ACGTAGTTCT TGTCGAACGG CACGTCCACC 30SEQ ID NO60序列长度30序列类型核酸链型单链拓扑线型分子类型其它核酸(合成的DNA)序列描述CGCTGAGACC TAGTAGTACG AGGAATTTGT 30SEQ ID NO61序列长度30序列类型核酸链型单链拓扑线型分子类型其它核酸(合成的DNA)序列描述TTTTCTAGAC CATGGGTATC ATAAAAGGAG 30SEQ ID NO62序列长度30序列类型核酸链型单链拓扑线型分子类型其它核酸(合成的DNA)序列描述TTGGAGCTCA TTTTAAATAT CTCTGTCCTT 30SEQ ID NO63序列长度20序列类型核酸链型单链拓扑线型分子类型其它核酸(合成的DNA)序列描述CCTGTTCAAT TTGTGGTTCC20SEQ ID NO64序列长度20序列类型核酸链型单链拓扑线型分子类型其它核酸(合成的DNA)序列描述TTGTGGTCCA GGTCATGGTA20SEQ ID NO65序列长度30序列类型核酸链型单链拓扑线型分子类型其它核酸(合成的DNA)序列描述GGAAGCTTTT CGAAAATTTA TCATTATTGC 30SEQ ID NO66序列长度31序列类型核酸链型单链拓扑线型分子类型其它核酸(合成的DNA)序列描述GGTCTAGATT TCTGTGTTTA TCTGTTTGTG G 31SEQ ID NO67序列长度26序列类型核酸链型单链拓扑线型分子类型其它核酸(合成的DNA)序列描述ATGGCATTTT CAAGACTTTT ACTGTT 26SEQ ID NO68序列长度16序列类型核酸链型双链拓扑线型分子类型基因组DNA序列描述GGGTGGTCAG TCCCTT 16SEQ ID NO69序列长度26序列类型核酸链型单链拓扑线型分子类型其它核酸(合成的DNA)序列描述GGAAGCTTGT TAAACTGATT TAAAAG 26SEQ ID NO70序列长度29序列类型核酸链型单链拓扑线型分子类型其它核酸(合成的DNA)序列描述GGTCTAGAGG TGAGAAAAAC AAATCCAAT 29SEQ ID NO71序列长度30序列类型核酸链型单链拓扑线型分子类型其它核酸(合成的DNA)序列描述GGAAGCTTTA TTAGGTCGAG TGAGATGGAT30SEQ ID NO72序列长度23序列类型核酸链型双链拓扑线型分子类型基因组DNA序列描述ATGGGTATCA TAAAAGGAGT TTT 23SEQ ID NO73序列长度28序列类型核酸链型双链拓扑线型分子类型基因组DNA序列描述AATCGGATCC CCGGGTGGTC AGTCCCTT 28SEQ ID NO74序列长度33序列类型核酸链型单链拓扑线型分子类型其它核酸(合成的DNA)序列描述GGCTGCAGGT TAGATCCCGA ATAATTATCT TAC 33SEQ ID NO75序列长度30序列类型核酸链型单链拓扑线型分子类型其它核酸(合成的DNA)序列描述GGTCTAGAGG TGAAAGTTCT AAAGCTAAGC 30
权利要求
1.一种控制编码具有进行植物细胞壁木葡聚糖重建之功能的酶的基因的表达的植物启动子。
2.权利要求1的植物启动子，其特征在于，该启动子在重建植物细胞壁木葡聚糖所需的位点具有活性。
3.权利要求1的植物启动子，其特征在于，该启动子在重建植物细胞壁木葡聚糖所需的时期具有活性。
4.权利要求1的植物启动子，其特征在于，编码具有进行植物细胞壁木葡聚糖重建之功能的酶的基因是编码木葡聚糖内部转移酶或其功能等价物的基因。
5.权利要求4的植物启动子，其特征在于，编码木葡聚糖内部转移酶或其功能等价物的基因来自azuki bean(Vigna angularis)。
6.权利要求4的植物启动子，其特征在于，编码木葡聚糖内部转移酶或其功能等价物的基因来自西红柿(Lycopersicon esculentum)。
7权利要求4的植物启动子，其特征在于，编码木葡聚糖内部转移酶或其功能等价物的基因来自烟草(Nicotina tabacum)。
8.权利要求4的植物启动子，其特征在于，编码木葡聚糖内部转移酶或其功能等价物的基因来自小麦(Triticum asestivum)。
9.权利要求1的植物启动子，其特征在于，该启动子包含于选自序列表中SEQ ID NO1、2、3、4、5、6、7和8的任一核苷酸序列中。
10.权利要求1的植物启动子，它可与权利要求9的任一核苷酸序列杂交且在植物、植物细胞、或植物细胞再生的转基因植物的至少一种中具有启动子活性。
11.包含权利要求1至10的任一项的植物启动子的DNA片段，它以能表达有用基因的状态与有用的基因相连。
12.权利要求11的DNA片段，其特征在于有用的基因是编码蛋白质的基因。
13.权利要求11的DNA片段，其特征在于有用的基因是编码反义RNA的基因。
14.权利要求11的DNA片段，其特征在于有用的基因是编码假目标(decoy)的基因。
15.权利要求11的DNA片段，其特征在于有用的基因是核酶。
16.转移进了权利要求11至15中任一项的DNA片段的植物。
17.转移进了权利要求11至15中任一项的DNA片段的植物细胞。
18.从转移进了权利要求11至15中任一项的DNA片段的植物细胞再生的转基因植物。
19.包含权利要求1至10中任一项的植物启动子的载体。
20.包含权利要求11至15中任一项的DNA片段的载体。
21.权利要求19或20的载体，它是质粒载体。
22.权利要求19或20的载体，它是病毒载体。
23.用权利要求19至22中任一项的载体转化的植物。
24.用权利要求19至22中任一项的载体转化的植物细胞。
25.从权利要求24的植物细胞再生的转基因植物。
26.从权利要求16、18、23或25的植物获得的种子。
27.一种从植物中生产蛋白质的方法，包括收集在用载体转化的植物中由含权利要求12的DNA片段的载体表达的蛋白质。
28.一种从植物细胞中生产蛋白质的方法，包括培养用含权利要求12的DNA片段的载体转化的植物细胞并从所得的培养物中收集由载体表达的蛋白质。
29.一种从转基因植物中生产蛋白质的方法，包括从用含权利要求12的DNA片段的载体转化的植物细胞再生转基因植物并从转基因植物收集由该载体表达的蛋白质。
30.一种控制植物形态的方法，包含将权利要求11至15中任一项的DNA片段转移进植物。
31.一种控制转基因植物形态的方法，包含将权利要求11至15中任一项的DNA片段转移进植物细胞然后再生转基因植物。
32.一种控制植物形态的方法，包含用含权利要求11至15中任一项的DNA片段的载体转化植物。
33.一种控制转基因植物形态的方法，包含从用含权利要求11至15中任一项的DNA片段的载体转化的植物细胞再生转基因植物。
34.一种克隆植物启动子的方法，包含使用编码具有进行植物细胞壁木葡聚糖重建之功能的酶的基因。
35.一种克隆权利要求34的植物启动子的方法，其特征在于编码具有进行植物细胞壁木葡聚糖重建之功能的酶的基因是木葡聚糖内部转移酶或其功能等价物的基因。
全文摘要
本发明公开了一种能在特定的位点和时间诱导表达的植物启动子,其中植物细胞壁木葡聚糖的重建是必需的,即,植物启动子来源于编码木葡聚糖内部转移酶的基因或编码具有与其等价功能的物质的基因;还公开了使用植物启动子改变植物功能的方法以及克隆该植物启动子的方法。
文档编号C12N15/82GK1185808SQ9619430
公开日1998年6月24日 申请日期1996年3月26日 优先权日1995年3月30日
发明者大场利治, 高桥秀一, 安间美子, 浅田起代藏, 加藤郁之进 申请人:宝酒造株式会社