在高浓度蛋白质溶液中减少或防止液-液相分离的方法

专利名称：在高浓度蛋白质溶液中减少或防止液-液相分离的方法
技术领域：
本发明一般涉及蛋白质制剂的领域。
背景技术：
来自生物技术的蛋白质和肽药物的可得性为大量疾病的治疗和预防创 造了新的选择。基于蛋白质的疗法，特别是基于单克隆抗体的疗法，已经 成为治疗疾病如癌症、变应性疾病、哞喘和类风湿性关节炎的一种重要方 法。
基于抗体的疗法一般以常规的间期施用给患者，并需要通过注射进行 若干mg/kg的给药(dosing)。皮下注射是这些疗法的一个优选的施用途径。 因为皮下注射使用的体积小(常为1.5 mL)，所以对于高剂量抗体疗法而言， 该施用途径需要高浓度的蛋白质制剂。
使用高浓度蛋白质溶液中的一个挑战是高于特定蛋白质浓度的蛋白质 溶液中乳光(即混浊)的发生。该现象能够造成不均匀的溶液并影响蛋白质 溶液的加工。另外，溶液的乳光可具有消极的商业后果。因此，期望获得 澄清的蛋白质溶液，使得在加工期间操作简便且最终药物产品有更吸引人 的外观。
因此，存在开发下述方法的需要，所述方法用于获得不是乳光的(即混浊的)高浓度蛋白质溶液。
发明概述
本发明涉及配制高浓度蛋白质溶液的方法。更明确地，本发明涉及减 少或防止以高蛋白质浓度配制的蛋白质溶液的液-液相分离的方法。因此， 本发明一般提供高浓度蛋白质溶液，其具有减少的乳光并因此视觉上
(visibly)是澄清的。如本文中所述，视觉上澄清的溶液有助于加工期间操作 的简便，并且作为商业化的产品更加吸引人。另外，本发明提供了使用蛋 白质溶液的液-液相分离浓缩和纯化蛋白质的方法。
本发明 一方面提供了测定蛋白质浓度的方法，在该浓度下再配制 (reformulate)在显示液-液相分离的蛋白质溶液中的蛋白质以便减少或防 止蛋白质溶液中的液-液相分离。更明确地，减少和/或防止液-液相分离的 方法包括将溶液维持或调节至期望的温度。例如， 一种方法包括允许显示 液-液相分离的蛋白质溶液经历液-液相分离成为上部和下部液相。然后测 量已经历了液-液相分离的蛋白质溶液的上部和下部相中蛋白质的浓度。大 于蛋， 质。
期望温度下的液-液相分离。在某些实施方案中，期望温度下在蛋白质溶液 中配制蛋白质的蛋白质浓度被选择为比下部相中蛋白质浓度高约0.5 %到 约40%。在其他实施方案中，期望温度下在蛋白质溶液中配制蛋白质的蛋 白质浓度被选择为比下部相中蛋白质浓度高约0.5%到约5%、约5%到约 10%、约10%到约20%、约20%到约30%、约30%到约40%、约5%到 约20%、约5%到约30%,或约5%到约40%。
在本发明的其他方面中，下述方法包括构建蛋白质溶液的相分离曲线 和选择在期望的温度下处于相分离曲线以外的浓度，所述方法用于测定下 述蛋白质浓度，在该浓度下再配制在显示液-液相分离的蛋白质溶液中的蛋 白质，以便减少或防止在期望的温度下蛋白质溶液中的液-液相分离。在期 望的温度下处于相分离曲线外的浓度允许再配制在蛋白质溶液中的蛋白质以便减少或防止在期望的温度下蛋白质溶液中的液-液相分离。在该方面的 某些实施方案中，通过绘制两个或多个不同温度下蛋白质溶液的处于平衡 中的两种共存液相的浓度构建相分离曲线，所述温度下该蛋白质溶液显示 液-液相分离。在某些实施方案中，两个或更多不同温度中至少一个是期望 的温度。
在本发明的另一方面中，下述方法包括提供至少第一蛋白质溶液，其 具有一种蛋白质浓度和笫 一温度，在该温度下第 一蛋白质溶液显示液-液相 分离，)，和至少第二蛋白质溶液，其处于第一蛋白质溶液的浓度下并具有 第二温度，在该温度下第二蛋白质溶液显示液-液相分离，所述方法用于确 定浓度，在该浓度下在蛋白质溶液中配制蛋白质以减少或防止在期望的温 度下蛋白质溶液中的液-液相分离。这些方法还涉及允许第一和第二蛋白质 溶液经历液-液相分离成为上部和下部相。测量第一和第二蛋白质溶液的上 部和下部相中蛋白质的浓度并用于构建相分离曲线。该相分离曲线指定了
在第一和第二温度下第一和第二蛋白质溶液的处于平衡中的上部和下部相 的浓度。在期望的温度下处于相分离曲线外的蛋白质浓度被选择用于在蛋 白质溶液中配制蛋白质，以便减少或防止在期望的温度下蛋白质溶液中的 液-液相分离。在该方面的某些实施方案中，允许第三蛋白质溶液经历液-液相分离，且在构建相分离曲线时包括其上层和下层的浓度，所述第三蛋 白质溶液具有与第一蛋白质溶液相同的蛋白质浓度和第三温度。在其他实 施方案中，允许第四蛋白质溶液经历液-液相分离，且在构建相分离曲线时 包括其上层和下层的浓度，所述第四蛋白质溶液具有与第一蛋白质溶液相 同的蛋白质浓度和第四温度。在另一实施方案中，允许第五蛋白质溶液经 历液-液相分离，且在构建相分离曲线时包括其上层和下层的浓度，所述第 五蛋白质溶液具有与笫一蛋白质溶液相同的蛋白质浓度和第五温度。通过 本文的教导能够明白，使用本文所述方法构建相分离曲线时可包括其他蛋 白质溶液。
在本发明的另一方面，下述方法包括提供第一浓度下第一蛋白质溶液 中的蛋白质、提供第二浓度下第二蛋白质溶液中的蛋白质和提供第三浓度
9下第三蛋白质溶液中的蛋白质，其中第一、笫二和第三蛋白质溶液处于第 一、第二和第三溶液不显示液-液相分离的温度下，所述方法用于确定浓度，
在该浓度下在蛋白质溶液中配制蛋白质以便减少或防止在期望的温度下蛋 白质溶液中的液-液相分离。该方法还包括将第一、第二和第三溶液冷却至 第一、第二和第三溶液的浊点温度，并通过针对第一、第二和第三浓度绘 制第一、第二和第三蛋白质溶液的浊点温度构建相分离曲线。在期望的温 度下处于相分离曲线外的浓度被确定为下述浓度，在该浓度下在蛋白质溶 液中配制蛋白质以便减少或防止在期望的温度下蛋白质溶液中的液-液相 分离。
在本发明的另一方面中，用于在蛋白质溶液中配制蛋白质的下述方法 包括在下述浓度下在蛋白质溶液中配制蛋白质，所述方法中蛋白质溶液在 期望的温度下不显示液-液相分离，所述浓度处于在期望的温度下蛋白质溶 液的相分离曲线外。
还在本发明的另一方面中，用于再配制在下述蛋白质溶液中蛋白质的 下述方法包括对显示液-液相分离的蛋白质溶液进行液-液相分离成为上部 和下部液相，所述蛋白质溶液在期望的温度下显示液-液相分离，所述方法 中再配制的蛋白质溶液在期望的温度下不显示液-液相分离。然后测量蛋白 质溶液的上部和下部相的浓度。在下述浓度下再配制在溶液中的蛋白质， 所述浓度高于蛋白质溶液下部相的浓度。这减少或防止在期望的温度下再 配制的蛋白质溶液中的液-液相分离。
在本发明的又一方面中，在蛋白质溶液中配制蛋白质使得该蛋白质溶
液在期望的浓度下不显示液-液相分离的方法包括在如下温度下储存蛋白 质溶液，所述温度高于发生液-液相分离的温度并且处于蛋白质溶液的相分 离曲线外。
在本发明的另一方面，从在期望的温度下显示液-液相分离的蛋白质溶 液获得在期望的温度下不显示液-液相分离的蛋白质溶液的方法包括允许 显示液-液相分离的蛋白质溶液在期望的温度下经历分离成为上部和下部 相。取出蛋白质溶液的下部相。该下部相是在期望的温度下不显示液-液相分离的蛋白质溶液。
本发明还提供了从显示液-液相分离的较低浓度蛋白质溶液获得较高
浓度蛋白质溶液的方法。该方法一般包括允许原始的蛋白质溶液分离成为 上部和下部相，并将下部相与上部相分离。下部相是下述蛋白质溶液，其
具有比较低浓度的蛋白质溶液更高的蛋白质浓度。
在本发明的另一方面中，在期望的溶液中浓缩蛋白质的方法包括在任 何溶液中配制该蛋白质，其中该蛋白质溶液显示液-液相分离。促进蛋白质 溶液中的液-液相分离，从而在蛋白质溶液中形成上部和下部相。将上部相 与下部相分离。该下部相具有比原始蛋白质溶液更高的蛋白质浓度。然后 进行緩沖液交换，将蛋白质从其所在的蛋白质溶液中转移至期望的溶液中。
本文使用的"蛋白质"包括蛋白质、肽、蛋白质片段、缀合蛋白质和 含有非天然存在的氨基酸的多肽。根据本发明的蛋白质可以是受体、配体、 转录因子、酶、凝结因子、信号转导蛋白和抗体。蛋白质也可以是多克隆 抗体或其抗原结合片段，或单克隆抗体或其抗原结合片段。
对蛋白质溶液而言期望的温度可以是将要加工、制造、储存或施用该 蛋白质溶液的温度。另外，可以通过重力分离或离心达成液-液相分离。
除非另有说明，本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所属领域 普通技术人员通常所理解的相同含义。尽管在本发明的实践或测试中能够 使用与本文所述的方法和材料类似或等效的方法和材料，但是合适的方法 和材料在下文描述。本文提到的所有的出版物、专利申请、专利和其他参 考文献被完整引入作为参考。另外，材料、方法和实施例仅用于阐述，而 非旨在限制。
根据附图、详述和权利要求书可以理解本发明的其他特征和优点。 附图概述


图1是曲线图，其描述了通过PEG沉淀测量的蛋白质相对溶解度和通 过500 nm处吸光度测量的乳光之间的反相关。该实验中的所有蛋白质以 90 mg/ml配制在pH 6.0的10 mM组氨酸中。图2是使用抗-Al抗体(50。C下在10 mM Tris pH 8.0中70 mg/ml)和抗 -81单克隆抗体(50°(:下在20 mM琥珀酸盐緩沖液pH 6.0中50 mg/ml)进行 液-液相分离现象的图解。在左侧管中观察到液-液相分离。
图3是涉及温度猝熄方法(temperature quench method)的实验步骤的 图示，所述方法用于构建以70 mg/ml配制在10 mM Tris pH 8中的抗-Al 抗体的相图。
图4是使用温度猝熄方法构建的以70 mg/ml配制在10 mM Tris pH 8 中的抗-Al抗体的相图。被认为是"超出"相图或相图"以外"的区域用 斜线画上阴影。被认为是相图"以内，，或"以下"的区域被填满。
图5是使用浊点方法构建的抗-Al抗体的相图。被认为是"超出"相 图或相图"以外"的区域用斜线画上阴影。被认为是相图"以内"或"以 下"的区域被填满。
图6提供了相图与在10。C的固定温度下以不同浓度被配制在10 mM TrispH8中的四种抗-Al抗体制剂外观的相关性。图中用星号指出IO'C下 的下部和上部相界浓度。该图表明使用"超出"相图或相图"以外"的浓 度配制的蛋白质制剂是澄清的，而具有落入相图"之内或内部"的浓度的 那些蛋白质制剂是乳白色的。
图7提供了以59 mg/ml配制在10 mM Tris pH 8中的抗-Al抗体制剂 上部和下部相中赋形剂浓度的比较，所述抗体制剂已经过液-液相分离。"透 析后"样品对应于在液-液相分离之前的蛋白质制剂。
图8提供了以59 mg/ml配制在10 mM Tris pH 8中的抗-Al抗体制剂 上部和下部相中蛋白质大小(SEC-HPLC)和电荷(CEX-HPLC)的比较，所 述抗体制剂已经过液-液相分离。
图9提供了以59 mg/ml配制在10 mM Tris pH 8中的抗-Al抗体制剂 上部和下部相中抗-Al的二级结构的比较，所述抗体制剂已经过液-液相分 离，所述比较使用FTIR酰胺I语。
图10提供了以59 mg/ml配制在10 mM Tris pH 8中的抗-Al抗体制 剂上部和下部相中蛋白质的三级结构的比较，所述抗体制剂已经过液-液相分离，所述比较使用荧光与45°角比色杯。 发明详述
对基于蛋白质的疗法而言，存在增长的实现高蛋白质浓度的需求。然 而，由于在高蛋白质浓度下配制的某些蛋白质溶液中液-液相分离的现象， 乳光(即蛋白质溶液的混浊)对蛋白质配方设计师(formulator)而言是一个主 要问题。本文公开的方法通过减少或防止期望的温度下的液-液相分离提供 了以高浓度配制蛋白质的新方法。因此，这些方法产生具有降低的乳光的 蛋白质溶液。本文所述的方法使用液-液相分离和/或相图测定适合在目的 緩沖液/溶液中配制蛋白质的浓度，所述浓度在期望的温度下使用，从而得 到的高蛋白质浓度溶液具有减少的液-液相分离并且视觉上是澄清的。本文 所述的方法还利用液-液相分离和相分离曲线测定适合在目的緩沖液/溶液 中配制蛋白质的温度，所述温度在固定的浓度下使用，使得得到的蛋白质 溶液具有减少的液-液相分离并且视觉上是澄清的。另外，本发明提供了浓 缩蛋白质溶液和纯化蛋白质的方法。
溶解度和乳光之间的关系
蛋白质溶液中蛋白质的溶解度与蛋白质溶液的乳光相关。"乳光"表 示蛋白质溶液的可检测的混浊或浊度。发明人已发现溶解度和乳光之间存 在反相关，特别是在高蛋白质浓度下。更明确地，蛋白质溶液中降低的蛋 白质溶解度与蛋白质溶液中高蛋白质浓度下蛋白质溶液提高的乳光相关。 该信息对配方设计师确定如何在高浓度下配制蛋白质是有用的。"高浓度" 表示大于约50 mg/ml (例如50 mg/ ml、 75 mg/ml、 100 mg/ml、 200 mg/ml、 300 mg/ml、 400 mg/ml、 500 mg/ml等等)的蛋白质浓度。在本申请通篇中 使用的术语"约"表示在所述值周围±20%的数值。如果具体的蛋白质溶液 是混浊的，则配方设计师可以找到配制蛋白质的备选方法，以减少或防止 蛋白质溶液的混浊。例如，可在若干緩冲液/溶液中测试高浓度下目的蛋白 质的溶解度，以测定蛋白质在所述緩冲液中的溶解度。如果溶解度在具体
13的緩沖液/溶液中很低，则很可能蛋白质溶液会是乳光的。因此，配方设计 师可选择其中蛋白质在高浓度下更可溶的不同緩沖液/溶液，从而使配方设 计师能够实现澄清的蛋白质制剂。
测定蛋白质溶液中蛋白质溶解度的方法是本领域公知的。美国临时申
请号60/801 ，862(并入本文作为参考)描述了使用聚乙二醇沉淀预测蛋白质 相对溶解度的新方法。
一般可通过用眼的简单目测法(即溶液是否是混浊或浑浊的)、直角光 散射或荧光测定乳光。然而在一些情况下，乳光是人眼不能探测的。在这 些情况下，和在需要定量读数的情况下，可以使用更灵敏的方法如分光光 度法或用于探测样品吸光度的等效手段测定乳光，所述分光光度法例如通 过4吏用可见光分光光度计(在400-600 nm范围内例如500 nm处测量)的自 动化分光光度法。测定乳光的其他方法包括光电浊度分析法(例如自动浊度 分析法)。
乳光和液-液相分离
液-液相分离可导致蛋白质溶液的乳光。"液-液相"分离(也已知为二 元液相分离和凝聚)表示一种现象，在低于相分离临界温度的温度下，蛋白 质溶液通过该现象分离成为不等的蛋白质浓度的两个共存液相中。通常在
具有高蛋白质浓度的蛋白质溶液中观察到液-液相分离；这类蛋白质溶液是 乳光的。
若干种因素在液-液相分离中起作用。这些因素包括，但不仅限于，蛋 白质溶液的温度、蛋白质溶液中的蛋白质浓度、溶液或緩沖液的pH、溶液 或緩冲液的离子强度，和蛋白质自身相互作用和溶解度特性。关于温度， 在溶液的温度低于相分离临界温度时观察到液-液相分离。"相分离的临界 温度"表示一个温度，在该温度下蛋白质溶液具有经历液-液相分离的潜能。
关于浓度，高浓度蛋白质溶液也更可能显示相分离。关于pH,如果以高蛋 白质浓度配制的蛋白质溶液的pH接近蛋白质的等电点(pI)，则蛋白质溶液 中可能发生液-液相分离。最后，以高浓度配制的蛋白质溶液中提高的离子
14强度有助于液-液相分离。
可如下促进液-液相分离将高浓度蛋白质溶液混合并允许蛋白质溶液 沉降。重力分离导致上部液相和下部液相的分离，它们由狭窄弯月面 (meniscus)隔开。除了重力分离以外，促进两相分离的备选方法是离心(例 如在4，000Xg下)。对于相同的蛋白质溶液而言，沉降速度在更低的温度下 更大，这归因于两相之间密度的较大差异。可以通过常规技术人员已知的 任何手段(例如通过使用巴斯德吸管)将下部相与上部相分离。
经历过液-液相分离的蛋白质溶液的上部相和下部相具有不同的蛋白 质浓度。下部相具有比上部相更高的蛋白质浓度。上部和下部相中蛋白质 的浓度可通过本领域已知的任何方法测定，包括但不仅限于，蛋白质内在 UV吸光度(280 nm下)的测量、Lowry测定法、Smith铜/双辛可宁酸 (bicinchoninic)测定法和Bradford染料测定法。
为了测定在期望的温度下以特定高浓度配制在选定的緩冲液/溶液中 时，未知的蛋白质是否会经历液-液相分离，将该蛋白质以特定的浓度配制 在期望的緩冲液/溶液中，混合并在期望的温度下温育。如果混合的蛋白质 溶液是混浊的，则首先指出液-液相分离是可能发生的。当然，在重力分离 或离心后如果蛋白质溶液分离成为上部和下部液相，则这会是显而易见的。
构建相图
如果蛋白质溶液在期望的温度下在期望的緩冲液/溶液中经历液-液相 分离，则必须找到避免该现象的方法。这对于药物制剂是特别重要的，因 为液-液相分离产生不均一的溶液，该溶液外观也是混浊的。本文所述的方 法提供了该问题的解决方法。在一些实施方案中，这些方法涉及相图的使 用。
在本申请的上下文中，相图(也已知为相分离曲线或共存曲线)是指出 相行为(即蛋白质溶液是否以一相或两相存在)作为蛋白质溶液中蛋白质浓 度和蛋白质溶液温度的函数的图谱。相图指定了给定温度下处于平衡中的 共存的液相的两种浓度。相图通常通过下述两种方法之一获得(l)温度猝 熄法，或(ii)浊点温度法。温度猝熄法
在构建相图的该方法的 一个非限制性实例中，将含有相同高浓度蛋白
质(例如约50-100 11^/1111)的蛋白质溶液的若干样品从蛋白质溶液不显示液-液相分离的温度降低至更低的温度。可以按照经验测定蛋白质溶液不显示 液-液相分离的温度。通常，温度越高，蛋白质溶液显示液-液相分离的机 会越低。 一般可从室温开始，并且如果在该温度下观察到目的蛋白质溶液 的相分离，可以移至更高的温度。 一旦确定了未发现发生相分离的温度， 则将所有蛋白质溶液从其现有温度移至该温度。然后将这些样品冷却至若 干不同的更低温度，在所述更低温度下发生液-液相分离。可以在控温箱中 将样品温育约30分钟，然后视觉检查溶液是混浊还是澄清。然后通过重力 分离或离心允许混浊样品平衡为上部和下部相。取出来自各蛋白质溶液的 上部和下部相的样品等分试样，并测量这些样品中的蛋白质浓度。通过绘
制蛋白质溶液的具体温度下各蛋白质溶液上部和下部相的浓度构建相图， 所述温度下所述溶液显示液-液相分离。通常，将温度绘制在y轴上并将蛋 白质浓度绘制在x轴上。实施例3中提供了构建相图的该方法的一个非限 制性说明。
浊点法
在该方法的一个非限制性实例中，已知蛋白质浓度并处于蛋白质溶液 不是乳光的温度下的一种或多种蛋白质溶液被置于光散射分光光度计中， 然后将温度緩慢降低。可根据经验测定蛋白质溶液不是乳光的温度。例如， 可以从室温开始并根据需要移至更高的温度，直至获得在给定浓度下不混 浊的溶液。在各温度下监测蛋白质溶液的光散射强度。通过入射束的广泛 多重散射引起的投射束的消失检测蛋白质溶液中相分离的开始。这对应于 溶液开始变得混浊。相分离开始并因此发生乳光的温度是浊点温度T;虫点。 然后针对蛋白质溶液的浓度绘制各蛋白质溶液的T鼓，获得基于浊点温度 的相图。通常将温度绘制在y轴上，将浓度绘制在x轴上。实施例4中提供了该方法的非限制性说明。 解释相图
高浓度蛋白质溶液的液-液相分离的相图像倒置的抛物线。曲线的升支
和降支在曲线的最高点汇合，所述最高点定义了临界温度(Tc)。临界温度 代表相分离能够开始发生的温度，只要蛋白质溶液中的蛋白质浓度在适宜 的范围内。在相分离曲线以外(即倒置抛物线以外)的区域中，蛋白质溶液 是均一和单相的。在曲线下的区域中，液-液相分离发生，且高密度相的沉 积导致宏观分离成为两个透明层，底部液相中具有高蛋白质浓度，上部液 相中具有低蛋白质浓度。
确定浓度的方法，所述浓度用于配制具有降低的乳光的蛋白质溶液
本申请部分涉及确定浓度的方法，以所述浓度在緩沖液/溶液中配制蛋 白质，其中得到的蛋白质溶液在期望的温度下不显示或显示减少的液-液相 分离。本申请还部分涉及确定浓度的方法，以所述浓度在緩沖液/溶液中配 制蛋白质使得蛋白质溶液在期望的温度下是基本澄清的(即具有减少的乳 光)。这些方法适用于测定新浓度，当原始配制的蛋白质溶液在期望的温度 下显示液-液相分离时以所述新浓度在緩冲液/溶液中再配制蛋白质。
通常，这些方法涉及测定用于在緩沖液/溶液中配制的蛋白质浓度，其 应是在期望的温度下处于蛋白质溶液相图以外的浓度。如果使用在期望的 温度下位于曲线以外和左側(更低浓度蛋白质溶液)或以外和右侧(更高浓度 蛋白质)的蛋白质浓度配制蛋白质溶液，则蛋白质溶液在期望的温度下在这 些浓度下不会显示液-液相分离或乳光。"期望的温度"表示将要使用、操 作或储存蛋白质的温度。期望的温度的非限制性实例包括将要制造、加工、 储存蛋白质溶液或将其施用给受试者的温度。
通常当配方设计师配制递增蛋白质浓度的蛋白质溶液时，他们不尝试 将蛋白质溶液的浓度提高到超出发生乳光或液-液相分离的浓度。本文中， 发明人惊人和意外地发现只要蛋白质浓度被提高到超出在期望的温度下的
17相图或在相图以外，则混浊或液-液相分离可以减少或甚至消失。这对于尝 试配制用于治疗的高浓度蛋白质(例如单克隆抗体)制剂的配方设计师而言 是极为重要的发现。
然而，如果事先(a pr':ori)已知在期望的浓度下需要蛋白质溶液，则不 必须制备蛋白质溶液的相图以实施本文所述的方法。例如，当配方设计师 以某浓度在緩冲液/溶液中配制蛋白质并发现配制的溶液在期望的温度下 经历液-液相分离或是乳光时，可以使用该方法。在该情况下，配方设计师 能够测定已经历了液-液相分离的蛋白质溶液的上部和/或下部相的浓度。 为了获得在期望的温度下不显示相分离的高浓度蛋白质溶液，应当选择比 下部相(例如具有更高蛋白质浓度的相)更大的浓度。为了获得在期望的温 度下不显示液-液相分离的低浓度蛋白质溶液，应当选择比上部相更低的浓 度。如果仅对配制高浓度蛋白质溶液感兴趣，测量经历过液-液相分离的蛋 白质溶液下层的浓度就足够了。如果以高于下层浓度的浓度配制蛋白质溶 液在发生相分离的温度下使用，则得到的蛋白质制剂在期望的温度下显示 减少的液-液相分离或无液-液相分离，并会是基本澄清的。在某些实施方 案中，蛋白质浓度被选择为比下部相中蛋白质的浓度高约0.5%到约5%、 约5%到约10%、约10%到约20%、约20%到约30%、约30%到约40%、 约5%到约20%、约5%到约30%或约5%到约40%。
另一方面，方法涉及通过构建相图测定在蛋白质溶液中配制蛋白质的 浓度。相图可以通过任何方法制备，包括但不仅限于温度猝熄法和浊点法。
如果使用温度猝熄法构建相图，则使用具有相同的蛋白质浓度并在两 个不同的温度下经历相分离的至少两种蛋白质溶液。在一些实施方案中， 使用具有相同蛋白质浓度并在三个不同温度下经历相分离的至少三种蛋白 质溶液。在其他实施方案中，使用具有相同蛋白质浓度并在四个不同温度 下经历相分离的至少四种蛋白质溶液。还在其他实施方案中，使用具有相 同蛋白质浓度并在五个不同温度下经历相分离的至少五种蛋白质溶液。可
使用上述温度猝熄法的任何变型构建蛋白质溶液的相图。
如果使用浊点法构建相图，则使用具有相同蛋白质的不同蛋白质浓度的至少两种蛋白质溶液。在一些实施方案中，使用具有相同蛋白质的不同 蛋白质浓度的至少三种蛋白质溶液。在其他实施方案中，使用具有相同蛋 白质的不同蛋白质浓度的至少四种蛋白质溶液。还在其他实施方案中，使 用具有相同蛋白质的不同蛋白质浓度的至少五种蛋白质溶液。
与使用的方法无关，相图会允许配方设计师选择蛋白质浓度，在所述 蛋白质浓度下蛋白质溶液在期望的温度或温度范围下显示出液-液相分离 的可能性降低。明确地，配方设计师会寻找要使用、储存、加工和/或制造 制剂的温度或温度范围，并基于该温度选择处于在该温度下相图以外的浓 度。在某些实施方案中，蛋白质浓度被选择为比相分离曲线上对应于期望
温度的最高蛋白质浓度(即上部相界限浓度)高约0.5%到约5%、约5%到 约10%、约10%到约20%、约20°/。到约30%、约30%到约40%、约5% 到约20%、约5%到约30%,或约5%到约40%。通过对给定的蛋白质溶 液针对若干不同的目的温度选择处于相图以外的浓度，可以在緩沖液/溶液 中配制蛋白质，所述緩冲液/溶液针对该温度范围不显示液-液相分离。当 给定的蛋白质溶液需要在不同的温度下被储存、使用、加工或制造时，这 尤其有用。
配制具有减少的乳光的蛋白质溶液的方法
本文所述的方法可用于以高浓度配制蛋白质，其中得到的蛋白质溶液 显示减少的乳光或无乳光。在一个特定的实施方案中，该方法适用于下述 情况蛋白质必须在特定的緩冲液/溶液中配制且其中在特定的浓度和期望 的温度下，蛋白质在该緩冲液/溶液中显示液-液相分离。在另一特定的实 施方案中，本申请的方法适用于下述情况其中必须将蛋白质从一种緩沖 液/溶液中再配制进另一緩冲液/溶液中，且其中当蛋白质被配制在新的緩沖 液/溶液中时显示液-液相分离。在这类情况下，使用从显示液-液相分离的 蛋白质溶液的相图鉴定的浓度，可以在緩沖液/溶液中配制蛋白质从而蛋白 质溶液在期望的温度下不显示液-液相分离。
为了以高浓度在緩沖液/溶液中配制在固定温度下使用的蛋白质，蛋白
19质浓度在期望的温度下处于蛋白质溶液相分离曲线以外或超过该曲线是足 够的。可以以比期望的温度下曲线上最高的浓度更高的任何浓度配制蛋白 质。
一般地，以下述浓度配制蛋白质，所述浓度比相分离曲线上对应于期
望温度的最高蛋白质浓度(即上部相界限浓度)高约0.5%到约5%、约5% 到约10%、约10%到约20%、约20%到约30%、约30%到约40%、约 5%到约20%、约5%到约30%、或约5%到约40%之间。
如果随着蛋白质制剂中蛋白质浓度提高，蛋白质溶液开始成为粘性的 或显示聚集的征兆，则可以使用降低粘度和/或减少聚集的任何方法降低蛋 白质溶液的粘度和/或聚集(例如美国临时申请号60/752,660和60/784,130, 均并入本文作为参考)。在一些实施方案中，为了降低高浓度蛋白质溶液的 粘度，可向蛋白质制剂中添加约0.5 mM到25 mM之间(例如0.5 mM到约 5 mM、约2 mM到约10 mM、约5 mM到约10 mM、约10 mM到约15 mM、 约15mM到约20mM、约13 mM到约25 mM)的氯化钩或氯化镁。在其 他实施方案中，为了减少高浓度蛋白质溶液的聚集，可以添加约lmM到 约145 mM之间(例如约lmM到约5 mM、约5 mM到约10 mM、约10 mM 到约20 mM、约20 mM到约50 mM、约50 mM到约100 mM、约100 mM 到约140mM)的甲硫氨酸。在其他的实施方案中，可向高浓度蛋白质制剂 中添加上文定义范围内的氯化钩/氯化镁和甲硫氨酸二者。
质溶液中的液-液相分离，可再次使用相图。在该情况下，应将温度提高至 高于相图上对应于期望浓度的最高温度。在某些实施方案中，将温度提高 约rC、约2。C、约3。C、约4。C、约5。C、约6。C、约7。C、约8。C、约9。C、 约10。C,比相图上对应于期望浓度的最高温度高约0.5。C到约5。C之间、约 0.5。C到约10。C之间，或约5。C到约10。C之间。
本发明还涉及从显示液-液相分离的蛋白质溶液获得不显示或显示减 少的液-液相分离的蛋白质溶液的方法。该方法一般涉及促进显示液-液相 分离的蛋白质溶液的液-液相分离，并分离蛋白质溶液的下部相。可通过例 如重力分离或离心促进液-液相分离。可以通过本领域已知的任何方法将下部相与上部相分离，包括使用巴斯德吸管。蛋白质溶液的下部相是不显示或显示与原始蛋白质溶液相比减少的液-液相分离的蛋白质溶液。
浓缩蛋白质的方法
本申请还涉及浓缩蛋白质的方法。在一个实施方案中，提供了从显示液-液相分离的较低浓度蛋白质溶液获得较高浓度蛋白质溶液的方法。该方法涉及促进原始蛋白质溶液的液-液相分离并将上部相与下部相分离。下部相是具有比原始的较低浓度蛋白质溶液更高的蛋白质浓度的蛋白质溶液。
可调整该方法从而将蛋白质从较低浓度蛋白质溶液浓缩至全新的緩冲液/溶液中。该方法包括上述步骤，但是还包括将蛋白质转移至新緩沖液/溶液的緩沖液交换步骤。进行緩沖液交换的方法可以使用本领域已知的任何方法进行，包括但不仅限于基于膜的方法，如透析、超滤和渗滤。
如果在浓缩后，蛋白质溶液开始成为粘性的或显示聚集的征兆，则可以使用降低粘度和/或减少聚集的任何方法降低蛋白质溶液的粘度和/或聚
集(例如美国临时申请号60/752,660和60/784,130)。在一些实施方案中，为了降低高浓度蛋白质溶液的粘度，可向蛋白质制剂中添加约0.5 mM到25mM之间(例如0.5 mM到约5 mM、约2 mM到约10 mM、约5 mM到约10mM、约10mM到约15mM、约15mM到约20mM、约13mM到约25mM)的氯化钙或氯化镁。在其他实施方案中，为了减少高浓度蛋白质溶液的聚集，可以添加约1 mM到约145 mM之间(例如约lmM到约5 mM、约5 mM到约10 mM、约10 mM到约20 mM、约20 mM到约50 mM、约50 mM到约100 mM、约100 mM到约140 mM)的甲硫氨酸。在其他的实施方案中，可向高浓度蛋白质制剂中添加上文定义范围内的氯化钙/氯化镁和甲硫氨酸二者。测量粘度和聚集的方法是本领域技术人员公知的。纯化蛋白质的方法
也可以利用液-液相分离将期望的蛋白质从其他蛋白质的混合物中纯化出来。这类纯化基于以目的蛋白质为基础对相分离条件的仔细选择。如果选择的相分离条件(例如pH、离子强度)对目的蛋白质是独特的，但对蛋
21白质要从中纯化的蛋白质混合物的剩余部分不是独特的，则在选定的相分离条件下只有目的蛋白质会相分离，并可以将富含蛋白质的底层作为纯的蛋白质溶液收集。
液-液相分离尤其适用于純化抗体或其抗原结合片段。这是因为与具有
小于7(通常远小于7)的等电点(pl)的多数蛋白质不同，多数抗体具有约8和9之间的pl。因为这些高pl,可以使用具有接近抗体pl的pH的緩沖液将抗体与其他蛋白质相分离。藉此，抗体将以高浓度存在于在下层中，
而剩余的蛋白质将在上层中。例如在纯化抗-Al抗体的过程中，含抗-Al和来自细胞碎片和培养基的其他蛋白质的蛋白质溶液可以被緩冲液交换至pH 8.0的緩冲液中，这对抗-Al抗体而言是最优的相分离条件。在这些条件下，抗-Al会分成两相，并可将底部高浓度层作为纯化的抗-Al抗体收集。
当然，用于纯化的上述步骤也可以被用于除抗体以外具有高等电点的蛋白质。
如果緩冲液条件可导致在具有约8-10的pH的緩冲液中多于一种蛋白质经历相分离，则可能从其他蛋白质的混合物中同时纯化两种或更多的蛋白质。即使仅期望一种蛋白质，该步骤也会提供比原始蛋白质混合物更纯净的蛋白质。如上所述，可通过重力实现或通过离心促进液-液相分离。
蛋白质
本文所述的方法一般适用于任何蛋白质。本文使用的"蛋白质"包括蛋白质、肽、蛋白质片段、缀合蛋白质和含有非天然存在的氨基酸的多肽。蛋白质可得自任何来源，例如分泌的重组蛋白质、从天然来源分离的蛋白质、非分泌的重组蛋白质或合成蛋白质。在某些实施方案中，蛋白质包括但不仅限于抗体、抗原结合的抗体片段、配体结合分子、可溶的受体、配体、凝结因子、信号转导蛋白和转录因子。
本文使用术语"抗体"包括多克隆抗体、单克隆抗体、具有多表位特异性的抗体组合物、双特异性抗体、双抗体，或其他纯化的抗体制剂和重组抗体。抗体可以是例如任何同种型(IgG、 IgA、 IgE、 IgM等)的完整抗体或其片段，其与目的蛋白质结合。可以使用常规技术将抗体片段化，并筛选片段对目的抗原的结合。优选抗体片段包含完整抗体的抗原结合和/或可变区。因此，术语抗体片段包括抗体分子的蛋白水解切割的区段或重组制备的部分，其能够选择性结合某蛋白质。这类蛋白质水解和/或重组片段的非限制实例包括Fab、 F(ab')2、 Fab'、 Fv和单链抗体(scFv),其含有通过肽接头连接的V[LI和/或V[H结构域。scFv可共价或非共价连接，形成具有两个或更多个结合位点的抗体。
在一些实施方案中，抗体是人源化的单克隆抗体。本文使用的术语"人源化的单克隆抗体，，是来自非人来源(受体)的单克隆抗体，其已被改变为
含有存在于等同人单克隆抗体(供体)中的至少一个或多个氨基酸残基。"完全人源化的单克隆抗体"是已被改变为含有存在于等同人单克隆抗体的抗原结合区中的所有氨基酸的单克隆抗体。人源化的抗体也可包含不存在于受体抗体或供体抗体任一个中的残基。可进行这些修饰以进一步改进和优
化抗体功能性。人源化的抗体也可任选地包含人免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分。
在某些实施方案中，要被配制、浓缩和/或纯化的蛋白质不包括溶菌酶、Y画晶体蛋白、P—乳球蛋白、竹芋蛋白(thaumatin)、刀豆球蛋白A(concanavalinA)和过氧化氢酶。
适合在本文公开的方法中使用的蛋白质浓度包括但不仅限于，5mg/mL至)j约50 mg/mL、约50 mg/mL f'j约100 mg/mL、约100 mg/mL至'j约200 mg/mL、约200 mg/mL到约300 mg/mL，和约300 mg/mL到约500mg/mli。
实施例
本发明还通过以下的实施例阐述。实施例仅就阐述的目的提供。它们不旨在理解为以任何方式限制本发明的范围或内容。实施例1
确定溶解度和乳光之间的关系
为了测试溶解度和乳光之间是否存在关系，研究了以90 mg/ml配制在10 mM组氨酸pH 6.0中的11种不同的单克隆抗体。测试这些抗体溶液的溶解度和乳光。如美国临时申请号60/801,862中所述通过PEG沉淀评价溶解度。通过测量抗体溶液在500 mn的吸光度测量乳光。图1中所示来自这些研究的数据表明，蛋白质的溶解度越低，蛋白质溶液的乳光越强。
因此，在高蛋白质浓度下，溶解度和乳光之间存在反相关。
实施例2液-液相分离
于5。C下以70 mg/ml在10 mM Tris pH 8.0中配制抗-Al单克隆抗体。该蛋白质溶液的pH接近该抗体的pl。当混合蛋白质溶液时其外观混浊；然而，当允许蛋白质溶液沉降时发生液-液相分离，得到上部和下部相(见图2，上图)。
于5'C下以50 mg/ml在20 mM琥珀酸盐pH 6.0中配制抗-Bl单克隆
抗体。当混合蛋白质溶液时溶液变得混浊；然而，当允许蛋白质溶液沉降时发生液-液相分离，得到上部和下部相(见图2，下图)。
当于5"C下以90 mg/ml在10 mM Tris pH 9.0中配制的抗-Cl抗体被混合并允许沉降时，观察到类似的液-液相分离现象(数据未显示)。
因此，在高浓度的若干种蛋白质中观察到液-液相分离。pH、离子强度和溶解度特性可有助于观察到的相分离。如在该实施例中看到的，显示液-液相分离的蛋白质溶液是乳光的。
实施例3
通过温度摔熄法构建抗-Al蛋白质溶液的相图
将抗-Al单克隆抗体的五个样品(其各以70 mg/ml在10 mM Tris pH8.0中配制)分别从室温冷却至16。C、 15°C、 10°C、 5'C和0。C，并允许经历宏观的重力驱动的分离，直到通过重力沉降实现两个澄清的液体层。从各
样品中分离来自上层和下层的等分试样，并使用UV-vis光谱法(280 nm)测量各层的浓度。针对蛋白质溶液的温度绘制上层和下层的浓度，得到相图(见图4)。
将抗-Al蛋白质溶液冷却至低于该緩沖液中的临界温度时，其经历液-液相分离。在曲线下的区域发生液-液相分离，并且高密度相的沉降导致宏观分离成为两个透明层，高蛋白质浓度相在底部，低蛋白质浓度相在顶部。在给定温度下，具有不同蛋白质浓度的两个液相平衡共存。
实施例4
通过浊点法构建抗-Al蛋白质溶液的相图
制备以200 mg/ml、50 mg/ml、30 mg/ml和10 mg/ml在10 mM Tris pH8.0中配制的四个抗-Al抗体样品。将这四种溶液于30。C下置于光散射分光光度计中。在该温度下，所有这些溶液是澄清的。緩慢冷却这些溶液时，
在各溶液中在具体的温度(T;M)下开始相分离。该现象的标志是由于入射束
的广泛多重散射引起的透射束的消失。在该T法点温度以下，溶液成为不透明的。对于各溶液而言，针对蛋白质溶液的浓度绘制浊点温度，得到蛋白质溶液的相图。
值得注意的是构建相图的温度猝熄法(实施例3)和浊点法显示给出基本类似的结果。
实施例5
使用相图预测乳光
为了测定相图是否可用于确定给定的蛋白质溶液是乳光的(即混浊的)或是澄清的，以不同的浓度在10 mM Tris pH 8.0中制备四种不同的抗-Al蛋白质溶液样品(即创建相图的实验中所使用的相同蛋白质和緩沖液)，所述不同的浓度落入该相图的不同区域(即相分离曲线以外或之外)。
如图5中所示，相图与乳光的发生良好相关。在相分离曲线以外，蛋
25白质溶液是澄清的并保留在单相中，但是在相分离曲线下，蛋白质溶液成
为混浊并在重力分离后分离成为两层。相图证明了在10。C的固定温度下，当浓度达到高于18 mg/ml时抗-Al溶液开始成为不透明的，但是当浓度继续提高至高于180 mg/ml时出乎意料地澄清。
因此，对由于液-液相分离而具有乳光趋势的蛋白质溶液而言，只要浓度超出相分离曲线，则在某温度下可达成高蛋白质浓度下的澄清溶液。
实施例6
分析液-液相分离的上部和下部相的特性
允许以59 mg/ml配制在10 mM Tris pH 8.0中的抗-Al经历液-液相分离，分离来自上部和下部相的等分试样并用于分析以下的特性两相中蛋白质的(i)緩冲液组份，(ii)高分子量种类，(iii)酸性种类，(iv)二级结构，和(v)三级结构。
緩冲液组份的分析表明两相中Tris和氯离子的浓度是基本同一的(见图7)。
通过尺寸排除高效液相层析进行的高分子量种类的分析指出上部和下部相中没有显著差异(见图8，上图)。
类似地，在两相中通过阳离子交换高效液相层析进行的酸性种类分析显示无显著差异(见图8，下图)。
通过FTIP酰胺I谱表征的来自两相的抗-Al的二级结构基本上相似(见图9)。
最后，通过荧光使用45。角比色杯表征的来自两相的抗-Al的三级结构也显示无显著差异(见图10)。
总之，这些数据提示经历液-液相分离的蛋白质溶液的上部和下部相是基本相似的。因此，蛋白质二级或三级结构、理化特性或赋形剂含量的差
异很可能不是液-液相分离的根本原因。其他实施方案应当理解尽管本发明已结合其详述被描述，但是前文描述旨在说明而 非限制本发明的范围，所述范围由附带的权利要求定义。其他方面、优点 和变更在以下权利要求书的范围内。
权利要求
1. 确定浓度的方法，在该浓度下再配制在显示液-液相分离的蛋白质溶液中的蛋白质以便减少或防止在期望的温度下该蛋白质溶液的液-液相分离，该方法包括(a)允许显示液-液相分离的蛋白质溶液经历液-液相分离成为上部和下部液相；(b)测量已经历了液-液相分离的蛋白质溶液中上部和下部相中蛋白质的浓度；和(c)选择大于下部相蛋白质浓度的蛋白质浓度用于再配制蛋白质，以便减少或防止在所述期望的温度下蛋白质溶液中的液-液相分离。
2. 确定蛋白质浓度的方法，在该浓度下再配制在显示液-液相分离的蛋 白质溶液中的蛋白质以便减少或防止在期望的温度下该蛋白质溶液的液-液相分离，该方法包括(a) 构建蛋白质溶液的相分离曲线；和(b) 选择在期望的温度下处于相分离曲线外的浓度， 其中在期望的温度下处于相分离曲线外的浓度是下述浓度，在该浓度下再配制蛋白质溶液中的蛋白质以便减少或防止在所述期望的温度下蛋白 质溶液中的液-液相分离。
3. 权利要求2的方法，其中通过温度摔熄方法或浊点方法构建相分离 曲线。
4. 权利要求2的方法，其中构建蛋白质溶液的相分离曲线包括绘制 在蛋白质溶液显示液-液相分离的至少两个或更多不同温度下蛋白质溶液 的两个处于平衡中的共存液相的浓度，其中所述两个或更多不同温度的至 少一个是期望的温度。
5. 确定浓度的方法，以所述浓度在蛋白质溶液中配制蛋白质以减少或 防止期望的温度下蛋白质溶液中的液-液相分离，所述方法包括(a)提供具有一种蛋白质浓度和第一温度的第一蛋白质溶液，在所述第一温度下第一蛋白质溶液显示液-液相分离；(b) 提供处于第一蛋白质溶液浓度和第二温度的第二蛋白质溶液，在 所述第二温度下第二蛋白质溶液显示液-液相分离；(c) 允许来自(a)和(b)的蛋白质溶液经历液-液相分离成为上部和下部相；(d) 测量笫一和第二蛋白质溶液的上部和下部相中蛋白质的浓度；(e) 构建相分离曲线，所述曲线指出在第一和第二温度下第一和第二 蛋白质溶液处于平衡中的上部和下部相的浓度；和(f) 确定在期望的温度下处于相分离曲线外的浓度， 其中在期望温度下处于相分离曲线外的浓度是在蛋白质溶液中配制蛋白质从而减少或防止所述期望的温度下蛋白质溶液中的液-液相分离的浓 度。
6. 权利要求5的方法，其还包括(a) 提供处于笫一蛋白质溶液浓度和第三温度下的第三蛋白质溶液， 在所述第三温度下第二蛋白质溶液显示液-液相分离；(b) 允许第一、第二和第三蛋白质溶液经历液-液相分离成为上部和下 部相；(c) 测量第一、第二和第三蛋白质溶液的上部和下部相中蛋白质的浓度；(d) 构建相分离曲线，所述曲线指出在第一、第二和第三温度下第一、第二和第三蛋白质溶液处于平衡中的上部和下部相的浓度；和(e) 确定在期望的温度下处于相分离曲线外的浓度， 其中在期望温度下处于相分离曲线外的浓度是在蛋白质溶液中配制蛋白质从而减少或防止期望的温度下蛋白质溶液中的液-液相分离的浓度。
7. 确定浓度的方法，以所述浓度在蛋白质溶液中配制蛋白质以减少或 防止期望的温度下蛋白质溶液中的液-液相分离，所述方法包括(a) 以第一种浓度在第一蛋白质溶液中提供蛋白质；(b) 以第二种浓度在第二蛋白质溶液中提供蛋白质；(c) 以第三种浓度在第三蛋白质溶液中提供蛋白质；其中第一、第二和笫三蛋白质溶液处于第一、第二和第三溶液基本澄 清的温度下；(d) 将第一、第二和第三溶液冷却至第一、第二和第三溶液的浊点温 度；和(e) 通过针对第一、第二和第三种浓度绘制第一、第二和第三蛋白质 溶液的浊点温度来构建相分离曲线，其中在期望温度下处于相分离曲线外的浓度是在蛋白质溶液中配制蛋 白质从而减少或防止在所述期望的温度下蛋白质溶液中的液-液相分离的 浓度。
8. 权利要求l-7中任一项的方法，其中所述蛋白质选自受体、配体、 转录因子、酶和抗体。
9. 权利要求l-7中任一项的方法，其中所述蛋白质是多克隆抗体或其 抗原结合片段。
10. 权利要求9的方法，其中所述蛋白质是单克隆抗体或其抗原结合 片段。
11. 权利要求1-7中任一项的方法，其中所述期望的温度是待加工、制 造、储存或施用蛋白质溶液的温度。
12. 权利要求1-7中任一项的方法，其中再配制蛋白质溶液中蛋白质的 蛋白质浓度被选择为比下部相中蛋白质浓度高约5%到约40%。
13. 权利要求1-7中任一项的方法，其中通过重力分离或离心实现液-液相分离。
14. 在蛋白质溶液中配制蛋白质使得该蛋白质溶液在期望的温度下不 显示液-液相分离的方法，其包括以下述浓度在蛋白质溶液中配制蛋白质， 所述浓度在期望的温度下处于该蛋白质溶液的相分离曲线外。
15. 在蛋白质溶液中配制蛋白质使得该蛋白质溶液在期望的浓度下不 显示液-液相分离的方法，其包括在如下温度下储存蛋白质溶液，所述温度 高于发生液-液相分离的温度并且在期望的蛋白质浓度下处于蛋白质溶液的相分离曲线外。
16. 用于再配制蛋白质溶液中蛋白质的方法，所述蛋白质溶液在期望 的温度下显示液-液相分离，所述方法使得再配制的蛋白质溶液在期望的温 度下不显示液-液相分离或显示减少的液-液相分离，所述方法包括(a) 使得显示液-液相分离的蛋白质溶液经历液-液相分离成为上部和 下部液相；(b) 测量蛋白质溶液的上部和下部相的浓度；和(c) 以高于蛋白质溶液下部相浓度的浓度再配制蛋白质。
17. —种方法，所述方法用于从在期望的温度下显示液-液相分离的蛋 白质溶液获得在所述期望的温度下不显示液-液相分离或显示减少的液-液 相分离的蛋白质溶液，该方法包括(a) 允许在期望的温度下显示液-液相分离的蛋白质溶液经历分离成为 上部和下部相；和(b) 取出蛋白质溶液的下部相；其中下部相是在期望的温度下不显示液-液相分离或显示减少的液-液相分离的蛋白质溶液。
18. —种方法，所述方法用于从显示液-液相分离的较低浓度蛋白质溶 液获得较高浓度蛋白质溶液，该方法包括(a)允许原始的蛋白质溶液分离成为上部和下部相；和 Ob)将上部相与下部相分离，其中下部相是具有比所述较低浓度蛋白质溶液更高的蛋白质浓度的蛋 白质溶液。
19. 在期望的溶液中浓缩蛋白质的方法，其包括(a) 在任何溶液中配制蛋白质，其中蛋白质溶液显示液-液相分离；(b) 促进蛋白质溶液中液-液相分离，从而形成上部和下部相；(c) 将上部相与下部相分离，其中下部相具有比原始蛋白质溶液更高 的蛋白质浓度，和(d) 进行緩冲液交换以将蛋白质从高浓缩蛋白质溶液转移至期望的溶液中。
20. 权利要求18或19的方法，其还包括向下部相中添加约0.5 mM到 约25 mM之间的氯化钩。
21. 权利要求18或19的方法，其还包括向下部相添加约l mM到约 145 mM之间的曱硫氨酸。
22. 权利要求18或19的方法，其还包括向下部相中添加约0.5 mM到 约25 mM之间的氯化钾或氯化镁，和约1 mM到约145 mM之间的曱石危氨 酸。
全文摘要
本发明描述了在蛋白质溶液中以高浓度配制蛋白质的方法，其中该蛋白质溶液缺乏或具有减少的液-液相分离。这类蛋白质溶液是基本澄清和基本均匀的。另外，提供了使用液-液相分离浓缩和纯化蛋白质的方法。
文档编号B01D37/00GK101489640SQ200780026178
公开日2009年7月22日 申请日期2007年6月12日 优先权日2006年6月12日
发明者A·坎托尔, N·W·沃恩, 黎 李 申请人:惠氏公司