一种浓缩酵母发酵液中蛋白的方法
【技术领域】
[0001 ] 本发明涉及一种浓缩发酵液中蛋白的方法，特别涉及浓缩酵母发酵液中蛋白的方法。属生物工程领域。
【背景技术】
[0002]酵母是一个优异的蛋白表达宿主，被广泛用于实验室研究和工业生产。酵母表达异源蛋白的时候可以采取胞外和胞内两种方式，由于胞外表达蛋白不需要破碎酵母细胞，而被广泛使用。
[0003]采用胞外表达的方式，后期处理的第一步即需要浓缩目标蛋白。现在常使用到的方法有:硫酸铵饱和沉淀、超滤杯浓缩和其他方法。其中，硫酸铵饱和沉淀方法所需设备简单，便于实际操作，使用最多，但其缺点是:加入过多硫酸铵以后溶液体积显著增加，所需硫酸铵的量很大，增加处理成本；沉淀得到的样品需要除盐，耗时耗力。超滤杯浓缩的方法，浓缩效率高，但是其设备比较昂贵，加之胞外表达的发酵液含有培养基成份和细胞代谢产物，容易堵塞超滤膜，这些缺点也影响了其广泛的使用。
[0004]因此亟需一种成本低、浓缩效率高、操作简单的浓缩酵母发酵液中蛋白的方法。
【发明内容】
[0005]针对硫酸铵饱和沉淀和超滤杯浓缩蛋白存在的不足之处，本发明提供了一种浓缩酵母发酵液中蛋白的方法，具体是利用疏水重力柱浓缩发酵液中的目标蛋白。
[0006]本发明所述的浓缩酵母发酵液中蛋白的方法包括如下步骤:
[0007](1)重力柱填充:将与重力柱相适应的滤膜装填在重力柱底部，加入疏水介质高载量苯基疏水色谱柱料，并用超纯水洗脱介质中的乙醇；
[0008](2)重力柱平衡:用1.5-3倍柱体积的硫酸铵平衡缓冲溶液对重力柱进行平衡；
[0009](3)发酵液挂柱:向发酵液上清加入硫酸铵固体或者饱和硫酸铵溶液，使发酵液上清中的硫酸铵终浓度为1-1.7M，将柱体积6-8倍的发酵液上清溶液加入平衡后的重力柱中，至含有硫酸铵的发酵液自行流出重力柱；
[0010](4)杂质蛋白洗脱:待发酵液挂柱后，用2-3倍柱体积硫酸铵平衡缓冲溶液洗脱挂柱发酵液中的杂质蛋白，直至洗脱液中检测不到杂质蛋白；
[0011](5)目标蛋白收集:杂质蛋白洗脱后，加入4倍柱体积的洗脱液对目标蛋白进行洗脱，洗脱过程中，检测洗脱液目标蛋白质的活性，并收集具有目标蛋白活性的溶液。
[0012]上述高载量苯基疏水色谱柱料的介质大小为90 μ m，设计流速为200?400cm/h。
[0013]步骤(2)和(4)中所述硫酸铵平衡缓冲溶为pH 7.0-8.0，1-1.7M硫酸铵溶液(用氨水调节pH)，且硫酸铵浓度和步骤(3)所述的发酵液上清中的硫酸铵溶液的pH值、浓度保持一致。硫酸钱的浓度越大，蛋白的吸附能力越强，减小硫酸钱的浓度能节约成本。
[0014]步骤(5)中所述洗脱液为无盐或者低盐的溶液，常用的有:pH为7.5-8.5、成分为25mM的Tris-HCl溶液和pH为5.7-7.6、成分为20mM的磷酸盐缓冲溶液等。
[0015]本发明所述的浓缩酵母发酵液中蛋白的方法与现有技术相比有以下优点:
[0016]1)本发明方法可以根据样品体积，装填不同体积的重力柱，既可以用于小量分析，也可用于实验室小量制备，还能够放大重力柱体积，用于工业生产。
[0017]2)本发明方法具有目标蛋白浓缩效率高、纯度显著提高，可用于实验室普通超滤管浓缩进行进一步的纯化，而不会发生堵塞的问题(发酵液直接用超滤管浓缩会堵塞超滤管，并且在超滤管的膜表面形成一层黄色的物质)。
[0018]3)本发明方法具有成本低廉的特点，是一种从酵母发酵液中浓缩目标蛋白质的简便方法。
【附图说明】
[0019]图1是lac3b纯化重力柱洗脱阶段不同洗脱体积的漆酶活性。
[0020]图2是galac纯化重力柱洗脱阶段不同洗脱体积的漆酶活性。
【具体实施方式】
[0021]下面结合附图对本发明的实施例进行详细说明。
[0022]实施例1
[0023]毕赤酵母中采用胞外表达的方式表达了云芝(Trametes versicolor)的lac3b漆酶。表达在5L的发酵罐中进行，发酵最后获得了 3L的发酵液，通过离心分离去除酵母细胞，最终得到了 2L的发酵液上清备用。
[0024]重力柱浓缩发酵液的lac3b蛋白步骤如下:
[0025](1)重力柱填充:选取高30cm，直径6cm重力柱，将滤膜装填在重力柱的底部避免介质外流，加入100ml疏水介质phenyl sefinose 6Fast Flow (high sub)(介质大小为90 μ m，设计流速为200?400cm/h，上海生工生物工程有限公司)。用2倍柱体积的超纯水(200ml)洗脱介质中的乙醇，流速可以达到35-40ml/min ；
[0026](2)重力柱平衡:待柱子不再滴水以后，加入1.5倍柱体积(150ml)的pH 7.0、
1.7M硫酸铵平衡缓冲溶液平衡柱子；
[0027](3)发酵液挂柱:向400ml的发酵液上清中缓慢加入硫酸铵固体90克，最终得到含有1.7M硫酸铵的发酵液上清600mL，加入平衡后的重力柱中，一共添加600ml的发酵液上清(6倍柱体积)，穿过介质的流速可以达到25-30ml/min ；
[0028](4)杂质蛋白洗脱:待发酵液挂柱后，用3倍柱体积(300ml)pH7.0,1.7M硫酸铵的溶液，洗脱挂柱发酵液中的杂质蛋白至洗脱液中检测不到杂质蛋白；
[0029](5)目标蛋白收集:杂质蛋白洗脱后，加入4倍柱体积(400ml)的25mM、pH 7.5的Tris-HCl洗脱液对目标蛋白进行洗脱，洗脱过程中，检测洗脱液目标蛋白质的活性(见图1)，并收集130?350ml洗脱溶液(约2倍柱体积)，lac3b蛋白的回收效率达到了 80%。
[0030]对比例1
[0031]饱和硫酸钱沉淀lac3b蛋白步骤如下:
[0032]取1L发酵液上清，缓慢的向其中加入固体硫酸铵，一直到硫酸铵不再溶解为止。最后共加入1050g硫酸铵。此时发酵液体积已经由原来的1L增大为2L，溶液的硫酸铵饱和度约为80%。然后将添加转子的发酵液放置于4°C层析柜中，在磁力搅拌器上搅拌16小时左右。最后取出发酵液，在12000g，4°C下离心30min，得到的沉淀用ddH20溶解。最后分别测试处理后发酵液和处理前发酵液的活性，计算lac3b蛋白的回收率约为10%。
[0033]综上所述，用含有100ml疏水介质的重力柱在4个小时内将1L发酵液浓缩5倍，最后得到200ml左右的蛋白溶液，lac3b蛋白的回收效率达到80%，相比饱和硫酸铵沉淀法浓缩lac3b蛋白浓缩效率高，纯度显著提高。
[0034]实施例2
[0035]首先在酿酒酵母中表达亚洲棉(Gossypium arboreum)的galac漆酶，最后得到
2.5L发酵液，通过离心去除酿酒酵母细胞，得到了 2L的发酵液上清，用于后续纯化。
[0036]重力柱浓缩发酵液的galac蛋白步骤与实施例1相同之处不再赘述，不同之处在于:步骤(2)中加入3倍柱体积(300ml)的1Μ、ρΗ8.0的硫酸铵平衡缓冲溶液平衡柱子；步骤(3)中向600ml的发酵液上清中缓慢加入200ml的常温下的饱和硫酸铵溶液，最终得到含有1M硫酸铵的发酵液上清800ml，添加800ml的发酵液上清溶液(8倍柱体积)挂柱；步骤(4)中用2倍柱体积(200ml) 1Μ、ρΗ8.0的硫酸铵溶液，洗脱挂柱发酵液中的杂质蛋白；步骤(5)中采用4倍柱体积20mM、pH 6.8的磷酸盐缓冲溶液为洗脱液，洗脱过程中测量不同洗脱体积的漆酶活性，结果见图2，收集了 100-400ml的洗脱溶液(3倍柱体积)。最终galac蛋白的回收效率达到了 84%。
【主权项】
1.一种浓缩酵母发酵液中蛋白的方法，其特征在于，包括如下步骤: (1)重力柱填充:将滤膜装填在重力柱底部，加入疏水介质高载量苯基疏水色谱柱料，用超纯水洗脱介质中的乙醇； (2)重力柱平衡:用1.5-3倍柱体积的硫酸铵平衡缓冲溶液对重力柱进行平衡； (3)发酵液挂柱:向发酵液上清加入硫酸铵固体或者饱和硫酸铵溶液，使硫酸铵终浓度达到1-1.7M后，加入6-8倍柱体积的发酵液到平衡后的重力柱中，至含有硫酸铵的发酵液自行流出重力柱； (4)杂质蛋白洗脱:待发酵液挂柱后，用2-3倍柱体积硫酸铵平衡缓冲溶液洗脱挂柱发酵液中的杂质蛋白，直至洗脱液中检测不到杂质蛋白； (5)目标蛋白收集:杂质蛋白洗脱后，加入4倍柱体积的洗脱液对目标蛋白进行洗脱，洗脱过程中，检测洗脱液目标蛋白质的活性，并收集具有目标蛋白活性的溶液。2.如权利要求1所述的一种浓缩酵母发酵液中蛋白的方法，其特征在于，步骤(1)中所述高载量苯基疏水色谱柱料的介质大小为90 μ m，设计流速为200?400cm/h。3.如权利要求1所述的一种浓缩酵母发酵液中蛋白的方法，其特征在于，步骤(2)和步骤(4)中所述硫酸铵平衡缓冲溶pH为7.0-8.0，成分为1-1.7M硫酸铵溶液，且硫酸铵浓度和发酵液上清中的硫酸铵溶液pH值及浓度一致。
【专利摘要】本发明涉及一种浓缩酵母发酵液中蛋白的方法，属生物工程领域。该方法包括如下步骤：(1)用滤膜装填重力柱底部，加入色谱柱料，用超纯水洗脱介质中的乙醇；(2)用1.5-3倍柱体积的硫酸铵平衡缓冲溶液平衡重力柱；(3)调节发酵液上清中硫酸铵终浓度为1-1.7M，添加柱体积6-8倍的发酵液上清溶液，加入平衡后的重力柱中，至含有硫酸铵的发酵液自行流出重力柱；(4)发酵液挂柱后，用2-3倍柱体积硫酸铵平衡缓冲溶液洗脱挂柱发酵液中的杂质蛋白；(5)加入4倍柱体积的洗脱液对目标蛋白进行洗脱。本发明方法具有目标蛋白浓缩效率高、纯度显著提高，可用于实验室普通超滤管浓缩进行进一步的纯化，而不会发生堵塞的问题。
【IPC分类】C07K1/16, C07K1/14
【公开号】CN105254703
【申请号】CN201510663242
【发明人】王刚刚, 谢天
【申请人】中国科学院成都生物研究所
【公开日】2016年1月20日
【申请日】2015年10月14日