专利名称：一种结冷胶发酵液的脱蛋白方法
技术领域：
本发明涉及一种发酵液的脱蛋白方法，尤其涉及一种微生物多糖结冷胶发酵液的脱蛋白方法。
背景技术：
结冷胶是由少动鞘氨醇单胞菌产生的一种新型微生物多糖，具有可再生性、良好的兼容性、热稳定性、pH范围宽、耐酸、抗酶解、用量低和香气释放性强等独特性能，在食品、制药、日化等工业中具有广泛的用途。由于其具有优于黄原胶、卡拉胶和海藻酸钠等凝胶剂的特性，成为微生物多糖研究的又一热点。
但是，在应用少动鞘氨醇单孢菌发酵生产微生物多糖结冷胶的过程中，由于结冷胶特殊的流体力学性质给其工业化生产带来诸多的工程问题，结冷胶发酵液脱蛋白便是其中最难解决的问题之一。结冷胶发酵液的高粘度、高杂质与低浓度的特性给脱蛋白造成极大的困难，成为直接决定结冷胶的质量与生产成本的关键工序。因此，如何有效地脱除结冷胶发酵液中的蛋白，降低结冷胶的提取成本，建立操作简单、易于放大的结冷胶发酵液的脱蛋白方法，是目前微生物多糖脱蛋白工艺迫切需要研究和开发的。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种成本低、操作简单、易于放大并绿色环保的结冷胶发酵液的脱蛋白方法。利用该方法可以获得高品质的结冷胶。
本发明的结冷胶发酵液的脱蛋白方法，包括发酵液预处理、脱酰基处理、酶法脱蛋白处理；其特征在于，所述发酵液的预处理方法是将发酵液升温至85-95℃，维持10-30分钟后再降至80℃；所述脱酰基处理方法是将预处理后的发酵液用1M的氢氧化钠调pH值至9-12，维持10-30分钟，然后用1M的盐酸调pH值至中性；所述酶法脱蛋白处理方法是向脱酰基处理后的发酵液中加入0.36AU g-1～0.96AU g-1的碱性蛋白酶，然后在pH 6-10，40℃-65℃条件下，反应1-6小时，用凯氏定氮法测定处理后的结冷胶的含氮量确定质量标准。
其中，所述发酵液优选是应用少动鞘氨醇单孢菌(Shingomonas paucimobilis)XLJCCTCC No.M206058发酵产生的微生物多糖结冷胶发酵液。
其中，所述发酵液的预处理方法优选是将发酵液升温至90℃，维持20分钟后再降至80℃。
其中，所述脱酰基处理方法优选是将预处理后的发酵液用1M的氢氧化钠调pH值至10，维持20分钟，然后用1M的盐酸调pH值至中性。
其中，所述酶法脱蛋白处理方法优选是向脱酰基处理后的发酵液中加入0.43AUg-1～0.66AU g-1的碱性蛋白酶，然后在pH 7-9，50℃-60℃条件下，反应3-6小时，用凯氏定氮法测定处理后的结冷胶的含氮量确定质量标准。
上述酶法脱蛋白处理方法最优选是向脱酰基处理后的发酵液中加入0.5AL g-1的碱性蛋白酶，然后在pH 8-9，55℃条件下，反应4小时，用凯氏定氮法测定处理后的结冷胶的含氮量确定质量标准。
应用上述的结冷胶发酵液的脱蛋白方法，处理后的结冷胶的含氮量为0.1-0.25％。达到美国食品与农业管理局(FDA)标准。
本发明所取得的实质性特点和显著技术进步在于1)本发明的脱蛋白工艺简单、易于放大。
2)本发明的方法中能耗低，原材料消耗少，生产成本大大降低，且符合绿色环保的要求。
3)产品含氮量小于0.3％，可以达到美国食品与农业管理局(FDA)标准。
具体实施例方式
下面结合实施例对本发明的内容做进一步的描述实施例1结冷胶的脱蛋白方法，包括发酵液预处理、脱酰基处理、酶法脱蛋白处理；其中脱蛋白方法中各工艺步骤和工艺条件是(1)菌种选择选用少动鞘氨醇单孢菌(Shingomonas paucimobilis)XLJ CCTCC No.M206058；(2)斜面培养将上述菌株接种于固体斜面培养基上，在30℃条件下，培养20小时；(3)一级种子培养将步骤(2)培养的菌体，在无菌条件下用接种环接3环于100mL种子液体培养基中，在30℃条件下，振荡培养10小时，制得一级种子液(4)扩大培养以体积比为5％的接种量，接一级种子液于500mL种子液体培养基中，30℃条件下，振荡培养8小时，制得二级种子液；(5)发酵罐培养以体积比为6％的接种量，接二级种子液于50L液体发酵培养基中，30℃、pH 7.0条件下，通风1.3vvm，培养50小时；(6)收集发酵产物待步骤(5)之发酵液粘度达15000cP时，收集发酵液，即为结冷胶粗多糖粗品，结冷胶粗多糖浓度为18g/L。
上述步骤(3)、(4)中所述种子液体培养基配方(1L蒸馏水计)为葡萄糖20g/L，蛋白胨5g/L，酵母浸粉1g/L，pH 7.0；步骤(2)所述固体斜面培养基为上述种子液体培养基成分添加质量体积百分比浓度为1.6％的琼脂粉。
上述步骤(5)中所述液体发酵培养基配方(1L蒸馏水计)为葡萄糖30g/L，尿素7.5g/L，NaHPO410g/L，KH2PO430g/L，K2SO410g/L，MgSO47HO27g/L，pH7.0。
(7)发酵液的预处理将步骤(6)所述发酵液升温至90℃，维持20分钟后再降至80℃。
(8)脱酰基处理将预处理后的发酵液用1M的氢氧化钠调pH值至10，维持20分钟，然后用1M的盐酸调pH值至中性。
(9)酶法脱蛋白处理向脱酰基处理后的发酵液中加入0.5AU g-1的碱性蛋白酶，然后在pH 9，55℃条件下，反应4小时，用凯氏定氮法测定处理后的结冷胶的含氮量确定质量标准。
测得结冷胶的含氮量为0.1％(质量百分比)，达到美国食品与农业管理局(FDA)标准。
实施例2结冷胶的脱蛋白方法，包括发酵液预处理、脱酰基处理、酶法脱蛋白处理；其中脱蛋白方法中各工艺步骤和工艺条件是(1)菌种选择选用少动鞘氨醇单孢菌(Shingomonas paucimobilis)XLJ CCTCC No.M206058；(2)斜面培养将上述菌株接种于固体斜面培养基上，在25℃条件下，培养24小时；(3)一级种子培养将步骤(2)培养的菌体，在无菌条件下用接种环接2环于50mL种子液体培养基中，在25℃条件下，振荡培养12小时，制得一级种子液；(4)扩大培养以体积比为8％的接种量，接一级种子液于500mL种子液体培养基中，25℃条件下，振荡培养10小时，制得二级种子液；(5)发酵罐培养以体积比为6％的接种量，接二级种子液于10L液体发酵培养基中，25℃、pH 6.8条件下，通风1.0vvm，培养56小时；(6)收集发酵产物待步骤(5)之发酵液粘度达12000cP时，收集发酵液，即为结冷胶粗多糖粗品，结冷胶粗多糖浓度为16g/L；上述步骤(3)、(4)中所述种子液体培养基配方(1L蒸馏水计)为葡萄糖20g/L，蛋白胨5g/L，酵母浸粉1g/L，pH 6.8；步骤(2)所述固体斜面培养基为上述种子液体培养基成分添加质量体积百分比浓度为1.5％的琼脂粉。
上述步骤(5)中所述液体发酵培养基配方(1L蒸馏水计)为葡萄糖30g/L，尿素7.5g/L，Na2HPO410g/L，KH2PO430g/L，K2SO410g/L，MgSO47HO27g/L，pH6.8；(7)发酵液的预处理将步骤(6)所述发酵液升温至85℃，维持30分钟后降至80℃；(8)脱酰基处理将步骤(7)预处理后的发酵液调pH值9，维持30分钟，然后调pH值至中性；(9)酶法脱蛋白处理向步骤(8)中的发酵液中加入碱性蛋白酶，比例为每升发酵液加入0.48AU的碱性蛋白酶，在pH6、40℃下，反应6小时；采用凯氏定氮法测定处理后的结冷胶的含氮量为0.25％(质量百分比)，达到美国食品与农业管理局(FDA)标准。
实施例3结冷胶的脱蛋白方法，包括发酵液预处理、脱酰基处理、酶法脱蛋白处理；其中脱蛋白方法中各工艺步骤和工艺条件是(1)菌种选择选用少动鞘氨醇单孢菌(Shingomonas paucimobilis)XLJ CCTCC No.M206058；
(2)斜面培养将上述菌株接种于固体斜面培养基上，在33℃条件下，培养18小时；(3)一级种子培养将步骤(2)培养的菌体，在无菌条件下用接种环接4环于100mL种子液体培养基中，在33℃条件下，振荡培养9小时，制得一级种子液；(4)扩大培养以体积比为10％的接种量，接一级种子液于1000mL种子液体培养基中，33℃条件下，振荡培养4小时，制得二级种子液；(5)发酵罐培养以体积比为10％的接种量，接二级种子液于液体发酵培养基中，33℃、pH 7.2条件下，通风1.5vvm，培养40小时；(6)收集发酵产物待步骤(5)之发酵液粘度达13000cP时，收集发酵液，即为结冷胶粗多糖粗品，结冷胶粗多糖浓度为17g/L；上述步骤(3)、(4)中所述种子液体培养基配方(1L蒸馏水计)为葡萄糖20g/L，蛋白胨5g/L，酵母浸粉1g/L，pH 7.2；步骤(2)所述固体斜面培养基为上述种子液体培养基成分添加质量体积百分比浓度为2.0％的琼脂粉；上述步骤(5)中所述液体发酵培养基配方(1L蒸馏水计)为葡萄糖30g/L，尿素7.5g/L，Na2HPO410g/L，KH2PO430g/L，K2SO410g/L，MgSO47HO27g/L，pH7.2；(7)发酵液的预处将步骤(6)所述发酵液升温至90℃，维持15分钟后降至80℃；(8)脱酰基处理将步骤(7)预处理后的发酵液调pH值10，维持20分钟，然后调pH值至中性；(9)酶法脱蛋白处理向步骤(8)中的发酵液中加入碱性蛋白酶，比例为每升发酵液加入0.80AU的碱性蛋白酶，在pH7.5、55℃下，反应4小时；采用凯氏定氮法测定处理后结冷胶的含氮量为0.13％，达到美国食品与农业管理局(FDA)标准。
实施例4结冷胶的脱蛋白方法，包括发酵液预处理、脱酰基处理、酶法脱蛋白处理；其中脱蛋白方法中各工艺步骤和工艺条件是(1)菌种的选择选用少动鞘氨醇单孢菌(Shingomonas paucimobilis)XLJ CCTCCNo.M206058；(2)斜面培养将上述步骤(1)的菌株接种于固体培养基上，在30℃下，培养20小时；(3)一级种子培养将步骤(2)培养的菌体，在无菌条件下用接种环接4环100mL种子液体培养基中，30℃条件下，在摇床上振荡培养10小时，制得一级种子；(4)扩大培养以体积比为5％的接种量，接一级种子于种子液体培养基中，30℃条件下，在摇床上振荡培养8小时，制得二级种子；(5)发酵罐培养以体积比为5％的接种量，接二级种子于液体发酵培养基培养基中，30℃、pH 7.0条件下，通风1.2vvm，培养48小时；(6)收集发酵产物待步骤(5)之发酵液粘度达12500cP时，收集发酵液，即为结冷胶粗多糖粗品，结冷胶粗多糖浓度为16.4g/L；上述步骤(3)、(4)中所述种子液体培养基配方(1L蒸馏水计)为葡萄糖20g/L，蛋白胨5g/L，酵母浸粉1g/L，pH 7.2；步骤(2)所述固体斜面培养基为上述种子液体培养基成分添加质量体积百分比浓度为1.8％的琼脂粉；上述步骤(5)中所述液体发酵培养基配方(1L蒸馏水计)为葡萄糖30g/L，尿素7.5g/L，Na2HPO410g/L，KH2PO430g/L，K2SO410g/L，MgSO47HO27g/L，pH7.2；(7)发酵液的预处理将步骤(6)所述发酵液升温至95℃，维持10分钟后降至80℃；(8)脱酰基处理将步骤(7)预处理后的发酵液调pH值12，维持10分钟，然后调pH值至中性；(9)酶法脱蛋白处理向步骤(8)中的发酵液中加入碱性蛋白酶，比例为每升发酵液加入0.96AU的碱性蛋白酶，在pH10、65℃下，反应1小时；采用凯氏定氮法测定处理后结冷胶的含氮量为0.20％，达到美国食品与农业管理局(FDA)标准。
权利要求
1.一种结冷胶发酵液的脱蛋白方法，包括发酵液预处理、脱酰基处理、酶法脱蛋白处理；其特征在于，所述发酵液的预处理方法是将发酵液升温至85-95℃，维持10-30分钟后再降至80℃；所述脱酰基处理方法是将预处理后的发酵液用1M的氢氧化钠调pH值至9-12，维持10-30分钟，然后用1M的盐酸调pH值至中性；所述酶法脱蛋白处理方法是向脱酰基处理后的发酵液中加入0.36AUg-1～0.96AUg-1的碱性蛋白酶，然后在pH 6-10，40℃-65℃条件下，反应1-6小时，用凯氏定氮法测定处理后的结冷胶的含氮量确定质量标准。
2.如权利要求1所述的结冷胶发酵液的脱蛋白方法，其特征在于，所述发酵液是应用少动鞘氨醇单孢菌(Shingomonas paucimobilis)XLJ CCTCC No.M206058发酵产生的微生物多糖结冷胶发酵液。
3.如权利要求1所述的结冷胶发酵液的脱蛋白方法，其特征在于，所述发酵液的预处理方法是将发酵液升温至90℃，维持20分钟后再降至80℃。
4.如权利要求1所述的结冷胶发酵液的脱蛋白方法，其特征在于，所述脱酰基处理方法是将预处理后的发酵液用1M的氢氧化钠调pH值至10，维持20分钟，然后用1M的盐酸调pH值至中性。
5.如权利要求1所述的结冷胶发酵液的脱蛋白方法，其特征在于，所述酶法脱蛋白处理方法是向脱酰基处理后的发酵液中加入0.43AUg-1～0.66AUg-1的碱性蛋白酶，然后在pH 7-9，50℃-60℃条件下，反应3-6小时，用凯氏定氮法测定处理后的结冷胶的含氮量确定质量标准。
6.如权利要求5所述的结冷胶发酵液的脱蛋白方法，其特征在于，所述酶法脱蛋白处理方法是向脱酰基处理后的发酵液中加入0.5AUg-1的碱性蛋白酶，然后在pH 8-9，55℃条件下，反应4小时，用凯氏定氮法测定处理后的结冷胶的含氮量确定质量标准。
全文摘要
本发明公开了一种结冷胶发酵液的脱蛋白方法，包括(1)发酵液的预处理，(2)发酵液脱酰基处理，(3)发酵液酶法脱蛋白处理等步骤；本发明方法有效地解决了目前微生物多糖后提取工艺中脱蛋白操作的瓶颈问题，具有工艺操作简单，操作条件温和，能耗低、原材料消耗少，提取成本低，易于放大等优点，且该工艺符合绿色工艺的要求，产品的含氮量达到美国食品与农业管理局(FDA)标准。
文档编号C12R1/01GK1932026SQ20061006878
公开日2007年3月21日 申请日期2006年9月12日 优先权日2006年9月12日
发明者许平, 王霞, 马翠卿 申请人:山东大学