用于固定二氧化碳的构建体、菌株及其制备方法
【专利摘要】本发明涉及用于在异养微生物(例如异养发酵菌株，例如大肠杆菌)中实现二氧化碳固定和/或减少二氧化碳排放的构建体，包含所述构建体的载体，包含所述构建体或用所述载体转化的异养微生物(例如异养发酵菌株，例如大肠杆菌)，以及在异养微生物(例如异养发酵菌株，例如大肠杆菌)中固定二氧化碳和/或减少二氧化碳排放的方法。
【专利说明】用于固定二氧化碳的构建体、菌株及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物质能源领域、生物化学领域和基因工程领域。具体而言，本发明涉及用于在异养微生物(例如异养发酵菌株，例如大肠杆菌)中实现二氧化碳固定和/或减少二氧化碳排放的构建体，包含所述构建体的载体，包含所述构建体或用所述载体转化的异养微生物(例如异养发酵菌株，例如大肠杆菌)，以及在异养微生物(例如异养发酵菌株，例如大肠杆菌)中固定二氧化碳和/或减少二氧化碳排放的方法。
【背景技术】
[0002]能源需求的持续快速增长与能源价格的不断攀升，石化能源供给的不足以及大量使用石化能源所导致的环境污染与气候变化等问题使得发展可再生替代能源迫在眉睫。针对减少对石油资源的依赖、降低二氧化碳排放等问题，以生物质资源利用为基础的、生产生物燃料和生化产品的技术是一个有吸引力和有效的手段。然而，生物燃料和生化产品的生产过程中的二氧化碳排放，使得生物制品的环境友好及“零碳排放”变得有争议。在生物质发酵过程中，由于微生物的代谢性质，二氧化碳排放在本质上是不可避免的。大多数具有活性和功能的生物大分子例如碳水化合物，脂肪和蛋白质在被降解和氧化的过程中，均伴有二氧化碳的产生/释放。例如，在以葡萄糖为底物、厌氧发酵生物质以生产生物制品及衍生糖类时，每产生一分子乙醇都伴有一分子二氧化碳的排放:C6H1206 — 2C2H50H+2C02。因此，无论从科学研究的角度，还是从优化工业生产及环境保护的角度来看，解决微生物发酵过程中的二氧化碳排放问题都非常必要。
[0003]在植物和自养微生物中，二氧化碳可以被固定并转化为有机生物质。目前已鉴定了六种不同的二氧化碳固定途径，包括例如卡尔文循环、核酮糖-单磷酸途径(Ribolose-Monophosphate Pathway)和丝氨酸途径(Serine Pathway)等(参见，例如图1B)。这些代谢途径存在于不同的生物体系中，并且由光、硫化物、氢等各种能量在厌氧或好氧的环境下提供还原力。
[0004]在本申请中，发明人创造性地将原核生物的CO2固定途径引入了异养微生物，从本质上减少了微生物发酵过程中的二氧化碳排放/释放(参见，例如图1C)，从而为解决微生物发酵过程中的二氧化碳排放问题提供了新的思路和手段。
【发明内容】
[0005]相关术语
[0006] 在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的细胞培养、分子遗传学、核酸化学、免疫学、分析化学等实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的常规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。
[0007]如本发明中所使用的，术语“异养”是相对于“自养”而言的，其具有本领域技术人员所通常理解的含义。通常，“自养微生物”是指，不依赖于任何有机营养物即可正常生活的微生物，“异养微生物”是指，必须依赖于至少一种有机营养物才可正常生活的微生物。自养微生物的一个典型代表是蓝细菌(Cyanobacterium),例如鱼腥藻、聚球藻或集胞藻(例如集胞藻PCC6803 (Synechocystis sp.PCC6803))。蓝细菌也称为蓝藻，其是能够利用太阳能来固定二氧化碳的光合自养型原核微生物。异养微生物的一个典型代表是大肠杆菌(E.coli)，例如大肠杆菌菌株BL21 (DE3)。大肠杆菌因容易培养、遗传学清晰、生长周期短等优点，已成为最广泛使用且最具有代表性的原核异养微生物。
[0008]如本发明中所使用的，磷酸核酮糖激酶(phosphoribulokinase, prk)是指，能够催化将5-磷酸核酮糖转化为1，5- 二磷酸核酮糖的下述反应的酶(EC2.7.1.19):
[0009]
【权利要求】
1.一种构建体,其包含第一基因和第二基因,其中所述第一基因选自: 1)磷酸核酮糖激酶(Prk)基因(EC2.7.1.19)； 2)其核苷酸序列与I)中的基因的核苷酸序列具有至少80%同一性，优选地至少85%同一性，更优选地至少90%同一性，更优选地至少95%同一性，例如至少96%同一性，至少97%同一性，至少98%同一性，或至少99%同一性，并且编码具有磷酸核酮糖激酶活性的蛋白质的基因；和 3)其核苷酸序列在严紧杂交条件，优选高严紧杂交条件下能够与I)中的基因的核苷酸序列杂交，并且编码具有磷酸核酮糖激酶活性的蛋白质的基因； 并且其中，所述第二基因选自: 4)I, 5- 二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(Rubisco)基因(EC4.1.1.39)； 5)其核苷酸序列与4)中的基因的核苷酸序列具有至少80%同一性，优选地至少85%同一性，更优选地至少90%同一性，更优选地至少95%同一性，例如至少96%同一性，至少97%同一'I"生，至少98%同一'丨生,或至少99%同一'丨生,并且编码具有1，5- 二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶活性的蛋白质的基因；和 6)其核苷酸序列在严紧杂交条件，优选高严紧杂交条件下能够与4)中的基因的核苷酸序列杂交，并且编码具有1，5- 二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶活性的蛋白质的基因。
2.权利要求1的构建体，其还包含与第一基因和/或第二基因可操作地连接的表达调控序列，例如启动子，终止子，和/或增强子。
3.权利要求2的构建体，其中所述启动子是组成型启动子或诱导型启动子，优选地所述启动子选自:T7启动子，CMV启动子，pBAD启动子，Trc启动子，Tac启动子，lacUV5启动子，更优选地所述启动子是T7启动子。
4.权利要求1-3任一项的构建体，其中所述磷酸核酮糖激酶(Prk)基因是来源于蓝细菌(例如鱼腥藻、聚球藻或集胞藻)或绿藻(例如原绿球藻)的磷酸核酮糖激酶(Prk)基因；例如所述磷酸核酮糖激酶(Prk)基因编码SEQ ID N0:7所示的蛋白；例如所述磷酸核酮糖激酶(Prk)基因具有如SEQ I D NO:1所示的序列。
5.权利要求1-4任一项的构建体，其中所述1，5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(Rubisco)基因是来源于蓝细菌(例如鱼腥藻、聚球藻或集胞藻)或绿藻(例如原绿球藻)或植物(例如拟南芥)的1，5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(Rubisco)基因；例如所述1，5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(Rubisc0)基因编码SEQ ID NO: 8_10所示的三个亚基；例如所述1，5- 二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(Rubisc0)基因具有如SEQ ID NO:2所示的序列。
6.权利要求1-5中任一项的构建体,其中所述构建体还可以包含用于筛选转化体的标记基因；优选地，所述标记基因是卡那霉素抗性基因，红霉素抗性基因或壮观霉素抗性基因。
7.—种载体,其包含权利要求1-6中任一项的构建体。
8.包含权利要求1-6中任一项的构建体和/或权利要求7的载体的宿主。
9.权利要求8的宿主，其是异养微生物，例如异养细菌、真菌和酵母，例如，酿酒酵母、毕氏酵母、黑曲霉、大肠杆菌、醋酸杆菌、假单胞菌、短杆菌、棒杆菌、枯草芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、丙酮丁醇芽孢梭菌 、丁酸梭状芽孢杆菌、巴氏芽孢梭菌，优选大肠杆菌。
10.权利要求8的宿主，其是保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心且保藏号为CGMCC N0.5435的大肠杆菌。
11.一种组合，其包含含有第一基因的第一构建体和含有第二基因的第二构建体，其中所述第一基因选自: 1)磷酸核酮糖激酶(Prk)基因(EC2.7.1.19)； 2)其核苷酸序列与I)中的基因的核苷酸序列具有至少80%同一性，优选地至少85%同一性，更优选地至少90%同一性，更优选地至少95%同一性，例如至少96%同一性，至少97%同一性，至少98%同一性，或至少99%同一性，并且编码具有磷酸核酮糖激酶活性的蛋白质的基因；和 3)其核苷酸序列在严紧杂交条件，优选高严紧杂交条件下能够与I)中的基因的核苷酸序列杂交，并且编码具有磷酸核酮糖激酶活性的蛋白质的基因； 并且其中，所述第二基因选自: 4)I, 5- 二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(Rubisco)基因(EC4.1.1.39)； 5)其核苷酸序列与4)中的基因的核苷酸序列具有至少80%同一性，优选地至少85%同一性，更优选地至少90%同一性，更优选地至少95%同一性，例如至少96%同一性，至少97%同一'I"生，至少98%同一'丨生,或至少99%同一'丨生,并且编码具有1，5- 二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶活性的蛋白质的基因；和 6)其核苷酸序列在严紧杂交条件，优选高严紧杂交条件下能够与4)中的基因的核苷酸序列杂交，并且编码具有1，5- 二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶活性的蛋白质的基因。
12.权利要求11的组合，其中第一构建体与第二构建体分别作为分离的组分存在，或作为二者的混合物存在。
13.权利要求11或12的组合，其中第一构建体还包含与第一基因可操作地连接的表达调控序列，和/或第二构建体还包含与第二基因可操作地连接的表达调控序列，所述表达调控序列例如选自启动子，终止子，和/或增强子。
14.权利要求13的组合，其中所述启动子是组成型启动子或诱导型启动子，优选地所述启动子选自:T7启动子，CMV启动子，pBAD启动子，Trc启动子，Tac启动子，lacUV5启动子，更优选地所述启动子是T7启动子。
15.权利要求11-14任一项的组合，其中所述磷酸核酮糖激酶(Prk)基因是来源于蓝细菌(例如鱼腥藻、聚球藻或集胞藻)或绿藻(例如原绿球藻)的磷酸核酮糖激酶(Prk)基因；例如所述磷酸核酮糖激酶(Prk)基因编码SEQ ID N0:7所示的蛋白；例如所述磷酸核酮糖激酶(Prk)基因具有如SEQ I D NO:1所示的序列。
16.权利要求11-15任一项的组合,其中所述1，5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(Rubisco)基因是来源于蓝细菌(例如鱼腥藻、聚球藻或集胞藻)或绿藻(例如原绿球藻)或植物(例如拟 南芥)的1，5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(Rubisco)基因；例如所述1，5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(Rubisc0)基因编码SEQ ID NO: 8_10所示的三个亚基；例如所述1，5- 二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(Rubisc0)基因具有如SEQ ID NO: 2所示的序列。
17.权利要求11-16中任一项的组合，其中所述第一构建体和/或第二构建体还包含用于筛选转化体的标记基因；优选地，所述标记基因是卡那霉素抗性基因，红霉素抗性基因或壮观霉素抗性基因。
18.—种组合，其包含第一载体和第二载体，其中所述第一载体包含权利要求11-17中任一项所定义的第一构建体，并且第二载体包含权利要求11-17中任一项所定义的第二构建体。
19.一种宿主,其包含权利要求11-17中任一项所定义的第一构建体和/或权利要求18所定义的第一载体，并且包含权利要求11-17中任一项所定义的第二构建体和/或权利要求18所定义的第二载体。
20.权利要求19的宿主，其是异养微生物，例如异养细菌、真菌和酵母，例如，酿酒酵母、毕氏酵母、黑曲霉、大肠杆菌、醋酸杆菌、假单胞菌、短杆菌、棒杆菌、枯草芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、丙酮丁醇芽孢梭菌、丁酸梭状芽孢杆菌、巴氏芽孢梭菌，优选大肠杆菌。
21.—种试剂盒，其包含， O权利要求1-6任一项的构建体，或权利要求7的载体；或者 2)权利要求11-18任一项的组合。
22.权利要求21的试剂盒，其还包含用于将构建体或载体引入宿主(例如异养微生物，例如异养细菌、真菌和酵母，例如，酿酒酵母、毕氏酵母、黑曲霉、大肠杆菌、醋酸杆菌、假单胞菌、短杆菌、棒杆菌、枯草芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、丙酮丁醇芽孢梭菌、丁酸梭状芽孢杆菌、巴氏芽孢梭菌，优选大肠杆菌)的试剂，例如转染试剂。
23.在异养微 生物中固定二氧化碳或者减少异养微生物的二氧化碳排放的方法，其包括， 将权利要求1-6任一项的构建体，或权利要求7的载体导入所述异养微生物中；或者，将权利要求11-17中任一项所定义的第一构建体和/或权利要求18所定义的第一载体，以及权利要求11-17中任一项所定义的第二构建体和/或权利要求18所定义的第二载体导入所述异养微生物中， 从而使所述异养微生物能够表达第一基因和第二基因。
24.权利要求23的方法，其中所述第一基因和第二基因被整合入所述异养微生物的基因组内。
25.权利要求23的方法,其中所述第一基因和第二基因作为游离体存在于异养微生物中。
26.权利要求23-25中任一项的方法,其中所述异养微生物选自异养细菌、真菌和酵母，例如，酿酒酵母、毕氏酵母、黑曲霉、大肠杆菌、醋酸杆菌、假单胞菌、短杆菌、棒杆菌、枯草芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、丙酮丁醇芽孢梭菌、丁酸梭状芽孢杆菌、巴氏芽孢梭菌，优选大肠杆菌。
27.权利要求1-6任一项的构建体或权利要求7的载体或权利要求11-18任一项的组合或者权利要求21或22的试剂盒用于在异养微生物中固定二氧化碳或者减少异养微生物的二氧化碳排放的用途。
28.权利要求27的用途，其中所述异养微生物选自异养细菌、真菌和酵母，例如，酿酒酵母、毕氏酵母、黑曲霉、大肠杆菌、醋酸杆菌、假单胞菌、短杆菌、棒杆菌、枯草芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、丙酮丁醇芽孢梭菌、丁酸梭状芽孢杆菌、巴氏芽孢梭菌，优选大肠杆菌。
29.在异养微生物中固定二氧化碳或者减少异养微生物的二氧化碳排放的方法，其包括将第一基因和第二基因导入所述异养微生物中；其中所述第一基因选自: 1)磷酸核酮糖激酶(Prk)基因(EC2.7.1.19)； 2)其核苷酸序列与I)中的基因的核苷酸序列具有至少80%同一性，优选地至少85%同一性，更优选地至少90%同一性，更优选地至少95%同一性，例如至少96%同一性，至少97%同一性，至少98%同一性，或至少99%同一性，并且编码具有磷酸核酮糖激酶活性的蛋白质的基因；和 3)其核苷酸序列在严紧杂交条件，优选高严紧杂交条件下能够与I)中的基因的核苷酸序列杂交，并且编码具有磷酸核酮糖激酶活性的蛋白质的基因； 并且其中，所述第二基因选自: 4)I, 5- 二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(Rubisco)基因(EC4.1.1.39)； 5)其核苷酸序列与4)中的基因的核苷酸序列具有至少80%同一性，优选地至少85%同一性，更优选地至少90%同一性，更优选地至少95%同一性，例如至少96%同一性，至少97%同一'I"生，至少98%同一'丨生,或至少99%同一'丨生,并且编码具有1，5- 二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶活性的蛋白质的基因；和 6)其核苷酸序列在严紧杂交条件，优选高严紧杂交条件下能够与4)中的基因的核苷酸序列杂交，并且编码具有1，5- 二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶活性的蛋白质的基因， 从而使所述异养微生物能够表达第一基因和第二基因。
30.权利要求29的方法，其中所述磷酸核酮糖激酶(Prk)基因是来源于蓝细菌(例如鱼腥藻、聚球藻或集胞藻)或绿藻(例如原绿球藻)的磷酸核酮糖激酶(Prk)基因；例如所述磷酸核酮糖激酶(Prk)基因编码SEQ ID N0:7所示的蛋白；例如所述磷酸核酮糖激酶(Prk)基因具有如SEQ ID NO:1所示的序列。
31.权利要求29或30的方法，其中所述1，5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(Rubisco)基因是来源于蓝细菌(例如鱼腥藻、聚球藻或集胞藻)或绿藻(例如原绿球藻)或植物(例如拟南芥)的1，5- 二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(Rubisco)基因；例如所述1，5- 二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(Rubisc0)基因编码SEQ ID NO:8-10所示的三个亚基；例如所述1，5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(Rubisc0)基因具有如SEQ ID NO:2所示的序列。
32.权利要求29的方法，其中通过一种或多种载体将第二基因导入所述异养微生物。
33.权利要求32的方法，其中通过同时编码1，5_二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(Rubisco)的亚基rbcL和rbcS或者亚基rbcL，rbcS和rbcX的I种载体将第二基因导入所述异养微生物，或者通过分别编码1，5- 二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(Rubisc0)的亚基rbcL和rbcS的2种载体将第二基因导入所述异养微生物，或者通过分别编码1，5- 二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(Rubisco)的rbcL, rbcS和rbcX亚基的3种载体将第二基因导入所述异养微生物。
34.权利要求29-33任一项的方法，其中所述第一基因和第二基因被整合入所述异养微生物的基因组内。
35.权利要求29-33任一项的方法，其中所述第一基因和第二基因作为游离体存在于异养微生物中。
36.权利要求29-35中任一项的方法,其中所述异养微生物选自异养细菌、真菌和酵母，例如，酿酒酵母、毕氏酵母、黑曲霉、大肠杆菌、醋酸杆菌、假单胞菌、短杆菌、棒杆菌、枯草芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、丙酮丁醇芽孢梭菌、丁酸梭状芽孢杆菌、巴氏芽孢梭菌，优选大肠杆菌。
37.一种试剂盒，其包含第一组分和第二组分，其中 第一组分包含编码磷酸核酮糖激酶(Prk)的载体，并且 第二组分包含编码1，5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(Rubisc0)的一种或多种载体， 其中，第一组分和第二组分分别作为分离的组分存在，或作为二者的混合物存在。
38.权利要求37的试剂盒，其中第二组分包含I种载体，其编码1，5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(Rubisco)的亚基rbcL和rbcS或者亚基rbcL, rbcS和rbcX。
39.权利要求37的试剂盒，其中第二组分包含2种载体，其分别编码1，5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(Rubisco)的亚基rbcL和rbcS。
40.权利要求37的试剂盒，其中第二组分包含3种载体，其分别编码1，5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(Rubisco)的亚基rbcL, rbcS和rbcX。
41.权利要求37-40任一项的试剂盒，其还包含用于将载体引入宿主(例如异养微生物，例如异养细菌、真菌和酵母，例如，酿酒酵母、毕氏酵母、黑曲霉、大肠杆菌、醋酸杆菌、假单胞菌、短杆菌、棒杆菌、枯草芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、丙酮丁醇芽孢梭菌、丁酸梭状芽孢杆菌、巴氏芽孢梭菌，优选大肠杆菌)的试剂，例如转染试剂。
42.权利要求37-41任一项的试剂盒用于在异养微生物中固定二氧化碳或者减少异养微生物的二氧化碳排放 的用途。
【文档编号】C12N1/15GK103882014SQ201210559843
【公开日】2014年6月25日 申请日期:2012年12月21日 优先权日:2012年12月21日
【发明者】吕雪峰, 杨柳, 高政绪, 谈晓明 申请人:中国科学院青岛生物能源与过程研究所