一种昆虫性别调控构建物，调控方法及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种具有调控昆虫性别功能的转基因构建物。具体地，本发明所述的构建物包括：启动子、doublesex基因、和终止子，还包括四环素阻遏反式激活蛋白编码元件（TAV），并且所述元件插入在doublesex基因的第三个外显子中。所述的构建物在雌性昆虫个体中特异表达四环素阻遏反式激活蛋白，导致雌性个体在发育早期死亡而雄性个体不受影响；通过在饲料中添食四环素来控制毒性蛋白的表达，从而建立了一种可调控昆虫性别的转基因系统。
【专利说明】一种昆虫性别调控构建物，调控方法及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于生物技术和发育调控领域，具体地，本发明涉及一种昆虫性别调控构建物，调控方法及其应用。
【背景技术】
[0002]专养雄蚕在蚕业生产上是一项非常重要的技术，因为雄蚕茧的茧层率和鲜茧出丝率要比雌蚕茧高，而且雄蚕食桑量少，叶丝转化率高；此外，雄蚕体质强健，更容易饲养，而且雄蚕丝纤度细、净度好，适于剿制高品位生丝。为此，世界各国科学家对专养雄蚕技术进行了一系列的探索。
[0003]1975年俄罗斯科学家Strunnikov V.A.等运用辐射诱变等技术手段，育成了家蚕性连锁平衡致死系。在性连锁平衡致死系内自交，其后代雌雄性个体各有一半存活，使品系得以保持。当平衡致死系的雄虫与常规品系的雌虫交配的后代只有雄虫能够存活，雌虫全部致死，达到专养雄蚕的目的。1996年，浙江省农业科学院从俄罗斯科学院引进了以家蚕性连锁平衡致死系S-8、S-14，并开展了利用性连锁平衡致死技术实现专养雄蚕的研究。经10年攻关研究，创建了家蚕性连锁平衡致死系细胞控制基因和导入方法(专利号:ZL01132108.3)、回交改良家蚕性连锁平衡致死系的方法(专利号:ZL01126809.3)、一种杂交改良家蚕性连锁平衡致死系性状的方法(专利号:200810061660.5)三项国家发明专利；建立了一个低成本的雄蚕杂交种繁育方法；育成了秋华X平30、华菁X平60等家蚕性连锁平衡致死实用蚕品种，雄蚕率达99.8%，茧层率和出丝率比常规品种提高23%，综合经济效￡fL提闻20%左右。
[0004]利用辐射处理等手段可以使雄虫不育，然后通过大量饲养不育雄虫并进行野外释放，不育雄虫与自然种群中的雌虫交配后不能产生后代，从而达到害虫防治的目的。这种昆虫不育技术(Sterile Insect Technique, SIT)在防治螺旋蝇、柑橘大实蝇等害虫方面已经取得了成功。但是该方法也存在着一些问题，如处理后的害虫竞争力差、大规模饲养成本高
坐寸ο
[0005]由于性连锁平衡致死体系使用的家蚕品种是通过辐射突变所获得，品种内的染色体结构和遗传稳定性存在着变异的可能。因此，本领域目前迫切需要开发新型技术来弥补性连锁平衡致死系统的不足。
【发明内容】
[0006]本发明的目的就是提供一种昆虫性别调控构建物。
[0007]本发明的另一目的就是提供一种昆虫性别调控方法及其应用。
[0008]在本发明的第一方面，提供了一种转基因构建物，所述的构建物具有下述元件:doublesex基因(双性基因)和四环素阻遏反式激活蛋白编码元件(TAV)，并且所述四环素阻遏反式激活蛋白编码元件 (TAV)插入在doublesex基因(双性基因)的选择性剪切外显子中。[0009]在另一优选例中，所述四环素阻遏反式激活蛋白编码元件(TAV)插入在doublesex基因(双性基因)的第三个外显子中。
[0010]在另一优选例中，所述的构建物还包括四环素结合序列(TetO)。
[0011]在另一优选例中，所述的构建物还包括选自下组的元件或其组合:启动子、终止子、POly(A)元件、转运元件、基因靶向元件、筛选标记基因、增强子、抗性基因、转座酶编码基因。
[0012]在另一优选例中，所述的doublesex基因来自鳞翅目昆虫。
[0013]在另一优选例中，所述的鳞翅目昆虫包括(但不限于):家蚕、亚洲玉米螟、棉铃虫、或小菜蛾。
[0014]在另一优选例中，所述的doublesex基因来自家蚕。
[0015]在另一优选例中，所述的doublesex基因(双性基因)具有SEQ ID NO:1所示的序列。
[0016]在另一优选例中，所述的四环素阻遏反式激活蛋白编码元件具有SEQ IDNO:2所示的序列。
[0017]在另一优选例中，所述的筛选标记基因为荧光蛋白编码基因，优选gfp(绿色荧光蛋白编码基因、或DsRed红色荧光蛋白编码基因。
[0018]在另一优选例中 ，所述的四环素结合序列(TetO)具有SEQ ID NO:3所示的序列。
[0019]在另一优选例中，所述的doublesex基因与启动子或终止子可操作地连接。
[0020]在本发明的第二方面，提供了一种载体，所述载体含有第一方面所述的转基因构建物。
[0021]在另一优选例中，所述载体选自:细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、或动物细胞载体、穿梭载体。
[0022]在另一优选例中，所述的载体为转座子载体。
[0023]在本发明的第三方面，提供了一种宿主细胞，所述的宿主细胞含有第一方面所述的构建物或第二方面所述的载体，或所述的宿主细胞染色体整合有第一方面所述的构建物或第二方面所述的载体。
[0024]在另一优选例中，所述的宿主细胞还包括含有编码转座酶基因的载体或其染色体上整合有转座酶基因。
[0025]在另一优选例中，所述的宿主细胞为昆虫细胞。
[0026]在另一优选例中，所述的昆虫为鳞翅目昆虫，包括(但不限于):家蚕，亚洲玉米螟、棉铃虫、小菜蛾等。
[0027]在本发明的第四方面，提供了第一方面所述的构建物，第二方面所述的载体，或第三方面所述的宿主细胞的用途，被用于昆虫性别调控，或用于制备调控昆虫性别的组合物。
[0028]在本发明的第五方面，提供了一种制备转基因昆虫的方法，包括步骤:
[0029](a)提供昆虫细胞或昆虫卵，所述昆虫细胞或昆虫卵含有权利要求1-3任一所述的构建物或权利要求4所述的载体、或其染色体整合有权利要求1-3任一所述的构建物或权利要求4所述的载体；
[0030](b)将步骤(a)所述的昆虫细胞或昆虫卵再生为昆虫，从而获得所述的转基因昆虫。[0031 ] 在另一优选例中，所述的昆虫为鳞翅目昆虫。
[0032]在另一优选例中，步骤(a)所述的宿主细胞为家蚕初产卵细胞。
[0033]在本发明的第六方面，提供了一种转基因昆虫，所述的转基因昆虫含有第三方面所述的宿主细胞，或所述的转基因昆虫染色体整合有第一方面所述的构建物或第二方面所述的载体，或所述的转基因昆虫是由第三方面所述的宿主细胞再生而成的。
[0034]在另一优选例中，所述的转基因昆虫是用第五方面所述的方法制备的。
[0035]在本发明的第七方面，提供了第六方面所述转基因昆虫的用途，所述的转基因昆虫用于:
[0036](1)生产蚕丝；
[0037](2)提高蚕茧茧层率；
[0038](3)提高叶丝转化率；
[0039](4)提高蚕丝纤度；
[0040](5)提高蚕丝净度； [0041](6)或其组合。
[0042]在本发明的第八方面，提供了一种调节昆虫性别的方法，包括步骤:
[0043](a)提供昆虫细胞或昆虫卵，所述昆虫细胞或昆虫卵含有第一方面所述的构建物或第二方面所述的载体、或其染色体整合有第一方面所述的构建物或第二方面所述的载体，并所述的昆虫细胞或昆虫卵再生为昆虫；
[0044](b)在缺乏四环素的条件下饲喂步骤(a)所述的昆虫，获得雄性昆虫存活比例大于95%的昆虫群。
[0045]在另一优选例中，所述的昆虫为鳞翅目昆虫，优选家蚕。
[0046]在另一优选例中，所述的调节昆虫性别为:提高雄性昆虫在总昆虫中的比例。
[0047]在另一优选例中，步骤(b)获得雄性昆虫存活比例大于96% (优选大于98%)的昆虫群。
[0048]应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在
此不再一一累述。
【专利附图】
【附图说明】
[0049]下列附图用于说明本发明的具体实施方案，而不用于限定由权利要求书所界定的本发明范围。
[0050]图1:转基因载体pBac-1ElDsRed2-tet0_tTA示意图；DsRed表示作为分子标记的红色突光蛋白DsRed ；Tet0x7表示四环素结合序列；E1_E5表示doublesex基因的5个外显子结构；TAV表示四环素阻遏反式激活蛋白编码序列，其位于doublesex基因的第3个外显子内部。
[0051]图2:转基因家蚕阳性个体；图2A:正常视野下的蚕卵；图2B红色荧光视野下的蚕卵。
[0052]图3:死亡的雌性个体和正常发育的雄性个体；左侧为死亡的个体，颜色较深；右侧为正常发育的个体，颜色较浅。【具体实施方式】
[0053]本发明人经过广泛而深入的研究，首次提供了一种具有调控昆虫性别功能的转基因构建物。具体地，所述的构建物包括:启动子、doublesex基因、和终止子，还包括四环素阻遏反式激活蛋白编码元件(TAV)，并且所述元件插入在doublesex基因的第三个外显子中。所述的构建物在雌性昆虫个体中特异表达四环素阻遏反式激活蛋白，导致雌性个体在发育早期死亡而雄性个体不受影响；通过在饲料中添食四环素来控制毒性蛋白的表达，从而建立了一种可调控昆虫性别的转基因系统。在此基础上完成了本发明。
[0054]术语
[0055]如本文所用，术语“启动子”或“启动子区(域)”是指一种准确有效起始基因转录功能的核酸序列，引导基因核酸序列转录为mRNA，其通常存在于目的基因编码序列的上游(5，端)，一般地，启动子或启动子区域提供RNA聚合酶和正确起始转录所必需的其它因子的识别位点。
[0056]在本文中，所述启动子或启动子区(域)包括启动子的变体，启动子变体可以通过插入或删除调控区域，进行随机或定点突变等来获得。
[0057]如本文所用，“外源的”或“异源的”是指不同来源的两条或多条核酸或蛋白质序列之间的关系。例如，如果启动子与目的基因序列的组合通常不是天然存在的，则启动子对于该目的基因来说是外源的。特定序列对于其所插入的细胞或生物体来说是“外源的”。
[0058]如本文所用，“顺式调控元件”是指对基因的转录起始和转录效率起调节作用的保守性碱基序列。
[0059]本发明的启动子可以被可操作地与外源基因连接，该外源基因相对于启动子而言可以是外源(异源)的。
[0060]本发明所述的外源基因(也称为目的基因)优选doublesex基因，与启动子或终止子可操作地连接。所述的doublesex基因优选来自于鳞翅目昆虫(如家蚕)，并具有SEQID NO:1所示的序列。
[0061]如本文所用，术语“鳞翅目昆虫”没有特别的限制，包括(但不限于):家蚕，亚洲玉米螟，棉铃虫，小菜蛾。
[0062]doublesex基因(双性基因)
[0063]如本文所用，术语“doublesex基因”与“双性基因”可以互换使用。doublesex基因是昆虫性别决定机制中的最下游基因，在性别发育中起到重要作用。
[0064]编码家蚕doublesex基因开放阅读框的序列由5个外显子组成,其中第3和第4外显子在雌性中表达，而在雄性中不表达，从而在不同性别中由于性别特异性的选择性剪接作用最终导致编码不同的蛋白(见Suzuki etal, Dev Genes Evol.2003)。
[0065]在本发明的一个优选例中，doublesex基因的核苷酸序列如SEQ ID N0.:1所示。应理解，所述的doublesex基因还包括SEQ ID N0.:1所示核苷酸序列的活性片段，变体，或类似物。
[0066]所述的活性片段，变体， 或类似物可以是SEQ ID N0.:1所示核苷酸序列具有50%或以上(优选60%以上，70%以上，80%以上，更优选90%以上，更优选95%以上，最优选98%以上，如99%)同源性的具有相同或相似功能的核苷酸。核苷酸变体可以经过若干个(通常为1-60个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)取代、缺失或添加至少一个核苷酸所得的衍生序列，以及在5’末端和/或3’末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)核苷酸。核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变所述核苷酸的功能。
[0067]根据本文所述的核苷酸序列，本【技术领域】人员可方便地用各种已知方法制得本发明的编码核酸。这些方法例如但不限于:PCR，DNA人工合成等，具体的方法可参见J.萨姆布鲁克，《分子克隆实验指南》。作为本发明的一种实施方式，可通过分段合成核苷酸序列再进行重叠延伸PCR的方法来构建所述的核酸序列。
[0068]选择性剪切外显子
[0069]选择性剪切外显子是指doublesex基因的第三、四外显子(SEQ ID N0:1的647位-904位)。doublesex基因的外显子在不同性别昆虫中有不同的剪切方式，在雄性昆虫中，doublesex基因的第三、四外显子会被剪切掉，而雌性昆虫会保留。四环素阻遏反式激活蛋白编码元件(TAV)如果插入到doublesex基因第三或第四外显子中，在雄性昆虫中，TAV会与doublesex基因第三或第四外显子被选择性剪切掉，TAV不表达，在雌性昆虫中，doublesex基因第三或第四外显子不被剪切，TAV表达。
[0070]四环素结合序列(TetO)与四环素阻遏反式激活蛋白编码元件(TAV)的调控作用，本领域的普通技术人员均可以从常规途径获得所述技术方法和知识，如(Hinrichs etal, Science, 1994)。
[0071]转基因构建物 [0072]本发明提供了一种转基因构建物，所述的构建物具有下述元件:doublesex基因(双性基因)和四环素阻遏反式激活蛋白编码元件(TAV)，并且所述四环素阻遏反式激活蛋白编码元件(TAV)插入在doublesex基因(双性基因)的选择性剪切外显子中。
[0073]优选地，所述四环素阻遏反式激活蛋白编码元件(TAV)插入在doublesex基因(双性基因)的第三个外显子中。
[0074]所述的构建物还可以包括四环素结合序列(TetO);所述的四环素结合序列(TetO)具有SEQ ID NO: 3所示的序列。
[0075]在另一优选例中，所述的构建物还包括选自下组的元件或其组合:启动子、终止子、poly(A)元件、转运元件、基因靶向元件、筛选标记基因、增强子、抗性基因、转座酶编码基因。
[0076]所述的筛选标记基因优选荧光蛋白编码基因，更优选gfp(绿色荧光蛋白编码基因或DsRed红色荧光蛋白编码基因。
[0077]在另一优选例中，所述的四环素阻遏反式激活蛋白编码元件具有SEQ IDNO:2所示的序列。
[0078]载体，宿主细胞
[0079]本发明还提供了一种载体，所述载体含有本发明的转基因构建物。优选地，所述载体选自:细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、或动物细胞载体、穿梭载体；所述的载体为转座子载体。用于制备重组载体的方法是本领域普通技术人员所熟知的。只要其能够在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都是可以被米用的。[0080]本领域普通技术人员可以使用熟知的方法构建含有本发明所述的启动子和/或目的基因序列的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术
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[0081]本发明还提供了一种宿主细胞，所述的宿主细胞含有所述的构建物或载体，或所述的宿主细胞染色体整合有所述的构建物或载体。在另一优选例中，所述的宿主细胞还包括含有编码转座酶基因的载体或其染色体上整合有转座酶基因。
[0082]优选地，所述的宿主细胞为昆虫细胞。在另一优选例中，所述的昆虫为鳞翅目昆虫，包括(但不限于):家蚕，亚洲玉米螟，棉铃虫，小菜蛾等。
[0083]本发明的构建物或载体，可以用于转化适当的宿主细胞。宿主细胞可以是原核细胞，如大肠杆菌，链霉菌属、农杆菌:或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等动物细胞，如昆虫细胞。本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体和宿主细胞。用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物(如大肠杆菌)时，可以用CaCl2法处理，也可用电穿孔法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法:磷酸钙共沉淀法，常规机械方法(如显微注射、电穿孔、脂质体包装等)。转化植物也可使用农杆菌转化或基因枪转化等方法，例如叶盘法、幼胚转化法、花芽浸泡法等。
[0084]应用
[0085]本发明还提供了一种制备转基因昆虫的方法，包括步骤:提供本发明所述的转化宿主细胞(优选家蚕初产卵细胞)；将所述的宿主细胞再生为昆虫，从而获得所述的转基因昆虫。所述的昆虫优选为鳞翅目昆虫。
[0086]本发明还提供了一 种用上述方法制备的一种转基因昆虫。并且所述的转基因昆虫可以用于:生广香丝；提闻香苗苗层率；提闻叶丝转化率；提闻香丝纤度；提闻香丝净度；或其组合。
[0087]本发明还提供了一种调节昆虫性别的方法，包括步骤:获得本发明所述的转基因昆虫；在缺乏四环素的条件下饲喂所述的昆虫，获得雄性昆虫存活比例大于95%，优选大于96%，更优选大于98%的昆虫群。在另一优选例中，所述的调节昆虫性别为:提高雄性昆虫在总昆虫中的比例。
[0088]在本方面的一个具体实施例中，将本发明的转基因载体与可表达转座酶的辅助质粒混合后通过显微注射导入原胚期蚕卵，25°C条件下保护至孵化。孵化后的蚁蚕饲养至成虫后，自交或回交获得Gl代蚕卵，在Gl代胚胎发育后期(6-8天)在荧光显微镜下筛选出全身表达红色荧光的转基因个体。
[0089]Gl代转基因个体饲养至成虫后与正常个体回交得到G2代转基因杂合个体。G2代转基因杂合个体采用两种方式饲养:1.在饲料中添加四环素，雌性和雄性都可以正常发育。2.饲料中不添加四环素，雌性个体在幼虫早期死亡，而雄性个体发育不受影响。
[0090]本发明的主要优点在于:
[0091](I)本发明通过建立转基因昆虫品系，在雌性个体中特异表达四环素阻遏反式激活蛋白，导致雌性个体在发育早期死亡而雄性个体不受影响；
[0092](2)通过在饲料中添食四环素来控制毒性蛋白的表达，是一种可调控的转基因系统，便于建立纯和保持品系；
[0093](3)本发明首次利用转 基因手段开发出雌性致死的转基因家蚕品系，雌性致死的作用机制清晰；
[0094](4)本发明突破了以往通过传统育种方法选育费时费力，且作用机制不明了的瓶颈；
[0095](5)本发明不仅可在蚕业生产中发挥重要的作用，也可推广到害虫特别是鳞翅目害虫的遗传防治，为害虫防治提供新的途径。
[0096]下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如 Sambrook 等人，分子克隆:实验室手册(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress, 1989)中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。
[0097]实施例1
[0098]家蚕雌性特异致死转基因系统的构建
[0099]1.PBac-1ElDsRed2-tet0-tTA 转基因载体的构建
[0100]本实施例采用的PBaC-1ElDSRed2-tet0-tTA转基因载体是基于广泛应用于昆虫转基因研究的 Piggybac 转座子(Piggybac 转座子见 Fraser et al., Insect MolecularBiology, 1996)加以改造完成的。
[0101]首先在Piggybac转座子载体中导入了由IEl启动子(Kojima etal, VirusResearch, 2008)驱动的色突光蛋白DsRed (DsRed基因序列如SEQ ID NO:4所示)，构建成为pBac-1ElDSRed2转基因载体。成功转入此载体后，转基因阳性个体从胚胎后期可以全身表达红色荧光，便于筛选。
[0102]克隆来自家蚕的doublesex基因(doublesex基因序列如SEQ ID N0:1所示)，并将编码四环素阻遏反式激活蛋白TAV的DNA序列(TAV的DNA序列如SEQ IDNO:2所示)插入doublesex基因的第三个外显子内(第三个外显子的序列如SEQID NO:5所示)，插入位点为第三个外显子的第44位-第45位之间，构成了一个融合基因(融合基因序列为SEQ IDNO:6)。
[0103]由于性别特异的基因选择性剪接作用(雄性中表达doublesex基因不需要第三外显子的介入)，转基因雌性个体将完整表达TAV，而雄性个体则不表达。
[0104]在TAV和doublesex融合基因的上游导入了四环素结合序列TetO (TetO的序列如SEQ ID NO:3所示)，最终构建了目的转基因载体PBac-1ElDsRed2-tet0-tTA (图1)。
[0105]实施例2
[0106]转基因系统的建立
[0107]将实施例1制备的转基因载体pBac-1ElDsRed2-tet0_tTA与可表达Piggybac转座酶的质粒 PHA3PIG (该质粒见 Tamura et al., Nature Biotechnology, 2000)等量混合后注射到家蚕初产卵(产下后4-8小时)中。
[0108]注射质粒的纯化采用Qiagen公司的Plasmid Midi kit试剂盒,蚕卵的注射方法参照Kanda & Tamura (1991)描述的方法进行显微注射,注射后的蚕卵用无毒速干胶封口。注射后的蚕卵放在保湿盒子中，在25°C条件下进行催青直到孵化。
[0109]孵化后收集蚁蚕用桑叶饲养至上 簇结茧，蛹期25°C条件下保护至化蛾后，将当代(GO)的蚕蛾自交后，获得Gl代蚕卵。在Gl代蚕卵的胚胎发育后期利用荧光显微镜下挑出具有红色荧光的转基因个体进行饲养(图2)。[0110]发明人共注射了 768粒家蚕卵(G0代)，孵化了 492头，最终发育到成虫正常交配后得到的卵圈有95个(Gl代)。在这些卵的发育后期检测到12个卵圈具有阳性个体(红色荧光)。通过进一步的确认，挑选其中三个品系实施了下一步的试验，在这三个独立品系中得到的结果具有非常高的重复性。
[0111]实施例3
[0112]雌性特异性致死效果的鉴定
[0113]鉴定方法:
[0114]雌性特异性致死效果可以通过如下步骤进行鉴定:在桑叶上喷洒浓度为200 μ g/μ I四环素水溶液，喂食转基因家蚕，在此条件下转基因家蚕无论雌雄都可以正常发育；而如果在桑叶上不添加四环素喂食转基因家蚕，则有一半左右的家蚕会再幼龄期死亡(图3)。而死亡的幼虫经PCR检测，未扩增出雄性特异条带，可判断为雌性。
[0115]而作为对照，非转基因家蚕在喂食了添加200μ g/μ I四环素水溶液或无添加四环素水溶液后对发育无不良影响。
[0116]在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考 那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
【权利要求】
1.一种转基因构建物，其特征在于，所述的构建物具有下述元件:doublesex基因(双性基因)和四环素阻遏反式激活蛋白编码元件(TAV)，并且所述四环素阻遏反式激活蛋白编码元件(TAV)插入在doublesex基因(双性基因)的选择性剪切外显子中。
2.如权利要求1所述的构建物，其特征在于，所述四环素阻遏反式激活蛋白编码元件(TAV)插入在doublesex基因(双性基因)的第三个外显子中。
3.如权利要求1所述的构建物，其特征在于，所述的构建物还包括四环素结合序列(TetO)。
4.一种载体，其特征在于，所述载体含有权利要求1-3任一所述的转基因构建物。
5.一种宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞含有权利要求1-3任一所述的构建物或权利要求4所述的载体，或所述的宿主细胞染色体整合有权利要求1-3任一所述的构建物或权利要求4所述的载体。
6.权利要求1所述的构建物，权利要求4所述的载体，或权利要求5所述的宿主细胞的用途，其特征在于，被用于昆虫性别调控，或用于制备调控昆虫性别的组合物。
7.一种制备转基因昆虫的方法，其特征在于，包括步骤: (a)提供昆虫细胞或昆虫卵，所述昆虫细胞或昆虫卵含有权利要求1-3任一所述的构建物或权利要求4所述的载体、或其染色体整合有权利要求1-3任一所述的构建物或权利要求4所述的载体； (b)将步骤(a)所述的昆虫细胞或昆虫卵再生为昆虫，从而获得所述的转基因昆虫。
8.—种转基因昆虫，其特征在于，所述的转基因昆虫含有权利要求5所述的宿主细胞，或所述的转基因昆虫染色体整合有权利要求1-3任一所述的构建物或权利要求4所述的载体，或所述的转基因昆虫是由权利 要求5所述的宿主细胞再生而成的。
9.权利要求8所述转基因昆虫的用途，其特征在于，所述的转基因昆虫用于: (1)生产蚕丝； (2)提闻香苗苗层率； (3)提高叶丝转化率； (4)提高蚕丝纤度； (5)提高蚕丝净度； (6)或其组合。
10.一种调节昆虫性别的方法，其特征在于，包括步骤: (a)提供昆虫细胞或昆虫卵，所述昆虫细胞或昆虫卵含有权利要求1-3任一所述的构建物或权利要求4所述的载体、或其染色体整合有权利要求1所述的构建物或权利要求4所述的载体，并所述的昆虫细胞或昆虫卵再生为昆虫； (b)在缺乏四环素的条件下饲喂步骤(a)所述的昆虫，获得雄性昆虫存活比例大于95%的昆虫群。
【文档编号】C12N5/10GK103882013SQ201210559254
【公开日】2014年6月25日 申请日期:2012年12月20日 优先权日:2012年12月20日
【发明者】黄勇平, 谭安江, 孟智启, 牛宝龙, 尤朗 申请人:中国科学院上海生命科学研究院