小分子rna作为结核病标记物的应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了小分子RNA作为结核病标记物的应用。本发明通过实验得到结核病患者血清中miRNA表达谱，然后通过信息分析得到人群血清中miRNA表达量最高且与非结核病人群差异最大的10种miRNA。高表达量保证了以此靶标做为检测方法的灵敏度，同时与非结核病人群差异最大保证了该方法的特异性。基于上述筛选得到的10种miRNA，本发明构建了一种以小分子RNA为标记物，通过逆转录、实时荧光定量PCR技术对结核病进行诊断的试剂盒。该试剂盒的检测结果准确可靠，操作简便，适于推广应用。
【专利说明】小分子RNA作为结核病标记物的应用
【技术领域】
[0001]本发明属于分子诊断领域，具体涉及小分子RNA作为结核病标记物的应用。
【背景技术】
[0002]结核分支杆菌引起感染和死亡。世界卫生组织估算全球1/ 3的人口受结核菌感染,其主要原因是多重耐药结核菌(multidrug resistance tuberculosiscle bacillus,MDR-TB)的流行以及人类免疫缺陷病毒(human immune deficiency virus , HIV)感染、器官移植、免疫抑制剂使用等所致免疫损害宿主(immuno-compromised host , ICH)增多和高龄人口中机体免疫力低下等因素，使结核分支杆菌感染难以控制。为了进一步提高结核病的诊断、治疗和预防控制水平，现在迫切需要更为精确快速的诊断新技术用于临床标本分离和鉴定结核分支杆菌。
[0003]目前临床现有结核病诊断技术根据每种技术所针对的靶标不同可分为三大类。微生物学方法、血清学方法、分子生物学方法。
[0004]微生物学方法以涂片和各种培养方法为代表。其中的涂片法比较迅速，一般I个小时可以出结果，但是阳性率只有20%左右。罗氏培养法目前作为结核病诊断的金标准，所需要周期长，一般4-8周，而结核病强化期的治疗是2个月。如果等培养结果出来在对患者进行干预，将会延误治疗；但如果不等培养结果即进行治疗，又可能因为误诊使患者承受抗结核药物副作用所带来的痛苦。
[0005]而关于血清学方法，WHO已经发表公开声明，目前市场上所应用的血清学结核病诊断方法都不能取得满意的结果。
[0006]分子生物学方法是近来发展比较迅速的一个领域，各种方法都是以结核分枝杆菌的RNA或者DNA为靶标。但是该类方法所面临的问题是未能找到一个另人满意的靶标。
【发明内容】
[0007]针对现有技术所存在的问题，本发明的目的在于提供一种以小分子RNA为标记物，通过逆转录、实时荧光定量PCR技术对结核病进行诊断的试剂盒。
[0008]本发明所采取的技术方案是:
一种结核病的诊断试剂盒，其包括检测一种或多种小分子RNA的特异性PCR引物，所述小分子 RNA 包括 hsa_miR-92a、hsa-miR-122、hsa_let_7a、hsa-miR-486_5p、hsa_let_7b、hsa-miR-451、hsa_miR-320b、hsa_miR-320a、hsa-miR-192 和 hsa-miR-185。
[0009]其中，检测hsa-miR_92a的引物为:
RT-PCR 引物:
GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACACAGGC (SEQ ID NO:1)
realtime-F:GCGCGCTATTGCACTTGTCCCG (SEQ ID NO:2)
realtime-R:GTGCAGGGTCCGAGGT (SEQ ID NO:3)
检测hsa-miR-122的引物为:
【权利要求】
1.一种结核病的诊断试剂盒，其包括检测一种或多种小分子RNA的特异性PCR引物，其特征在于，所述小分子 RNA 包括 hsa-miR-92a、hsa-miR-122、hsa-let-7a、hsa-miR-486_5p、hsa_let_7b、hsa-miR-451、hsa_miR-320b、hsa_miR-320a、hsa-miR-192 和 hsa-miR-185。
2.根据权利要求1所述的诊断试剂盒，其特征在于: 检测hsa-miR_92a的引物为: RT-PCR 引物:
GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACACAGGC (SEQ ID NO:1)
realtime-F:GCGCGCTATTGCACTTGTCCCG (SEQ ID NO:2)
realtime-R:GTGCAGGGTCCGAGGT (SEQ ID NO:3) 检测hsa-miR-122的引物为: RT-PCR 引物:
GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCAAACA (SEQ ID NO:4)
realtime-F:GCGCGCTGGAGTGTGACAATGG (SEQ ID NO:5)
realtime-R:GTGCAGGGTCCGAGGT (SEQ ID N0:6) 检测hsa-let_7a的引物为: RT-PCR 引物:
GTCGTAT CCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACAACTAT (SEQ ID NO:7)
realtime-F:GCGCGCTGAGGTAGTAGGTTGT (SEQ ID N0:8)
realtime-R:GTGCAGGGTCCGAGGT (SEQ ID N0:9) 检测hsa-miR-486-5p的引物为: RT-PCR 引物:
GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCTCGGG (SEQ ID NO:10)
realtime-F:GCGCTCCTGTACTGAGCTGC (SEQ ID NO:11)
realtime-R:GTGCAGGGTCCGAGGT (SEQ ID NO:12) 检测hsa-let-7b的引物为: RT-PCR 引物:
GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACAACCAC (SEQ ID NO:13)
realtime-F:GCGCGCTGAGGTAGTAGGTTGT (SEQ ID NO:14)
realtime-R:GTGCAGGGTCCGAGGT (SEQ ID NO:15) 检测hsa-miR-451的引物为: RT-PCR 引物:
GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACAACTCA (SEQ ID NO:16)
realtime-F:GCGCGCGCAAACCGTTACCATTAC (SEQ ID NO:17)
realtime-R:GTGCAGGGTCCGAGGT (SEQ ID NO:18) 检测hsa-miR-320b的引物为: RT-PCR 引物:
GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTTGCCC (SEQ ID NO:19)
realtime-F:GCGCGCAAAAGCTGGGTTGAGA (SEQ ID NO:20)
realtime-R:GTGCAGGGTCCGAGGT (SEQ ID NO:21)
【文档编号】C12Q1/68GK103882095SQ201210559345
【公开日】2014年6月25日 申请日期:2012年12月20日 优先权日:2012年12月20日
【发明者】钟球, 周琳, 李海成, 陈涛 申请人:广东省结核病控制中心