与仿生细胞化肾单位有关的系统、方法和装置制造方法

与仿生细胞化肾单位有关的系统、方法和装置制造方法
【专利摘要】本文公开了用于在细胞化的肾单位的仿生环境中培养细胞的系统和装置，以及用于制造和使用细胞化的肾单位的方法。
【专利说明】与仿生细胞化肾单位有关的系统、方法和装置
[0001]相关专利和申请
[0002]本申请要求于2011年6月15日提交的第61/497，376号美国临时申请和于2011年6月16日提交的第61/497，854号美国临时申请的权益，将其全部内容引入本文作为参考。
[0003]MM
[0004]一般地，本公开涉及用于在细胞化的肾单位的仿生环境中培养细胞的系统和装置，以及用于制造和使用细胞化的肾单位的方法。
[0005]直量
[0006]在控制的体外条件下生长的肾细胞在肾功能性研究、医疗装置制备和药物测试中具有广泛的潜在应用。肾细胞培养允许生物学家研究与肾相关的细胞的功能并观察细胞对各种条件的响应。高度受控制的肾环境可以用于执行肾的一些功能以帮助肾病患者，并且可以被组织工程使用以生成用于移植到肾病患者体内的特异性肾组织。此外，肾细胞培养可以在用于肾治疗和用于测试药物的肾毒性的药物开发中使用。控制的体外环境也可以用于其它类型的细胞，如用于刺激干细胞的希望的细胞功能。
[0007]这些应用中的 每一种得益于引起体外细胞在体内准确复制细胞的条件。尽管存在用于培养肾细胞的装置和方法，但传统的体外肾细胞环境是静态的，未能解释肾单位中经历的剪切应力。此外，以前的肾细胞培养的体外环境没有提供仿生信号(cue)，如由胞外基质(ECM)提供的那些，因此在以前的环境中生长的细胞不具有它们在体内所具有的表型和形态，例如细胞形状或排列。肾单位中肾细胞的适当排列，尤其是细胞之间的细胞间连接的形成对于肾细胞执行其过滤和吸收功能是必要的。因此，在先前的装置中生长的肾细胞未能模拟肾单位的条件。
[0008]概沭
[0009]因此，需要可以用于生长更好地复制肾单位的体内条件的肾细胞培养物的仿生装置。特别地，控制流动通道中细胞的几何形状和排列的装置可以用于建立比先前的装置更加接近地模拟体内条件的体外环境。微制造和微成型技术可以用于制备人工细胞基底，所述人工细胞基底具有模拟细胞外基质(ECM)对肾细胞的作用的微-、亚微-和纳米-拓扑图案(topographical pattern)。拓扑表面的设计允许紧密控制在基底上面生长的细胞。这种表面图案(surface patterning)连同附加的流动通道参数如通道高度、通道横截面积和流速一起可以用于建立紧密模拟特异性细胞类型的体内环境的高度受控制的体外条件。
[0010]因此，在一些方面中，本文公开了用于构建和利用人造器官(如生物人工肾)的装置和方法。在一些实施方案中，本技术的生物人工肾包括:包括至少一个拓扑表面的微流体流动通道；与所述流动通道流体连通用于允许流体流入所述流动通道的入口 ；和接种在所述拓扑表面上的肾细胞，其中选择所述流动通道的表面的拓扑图，以使肾细胞形成置于所述表面以上的细胞层，以实现通过至少一个表面的拓扑图至少部分地确定的排列、行为或形态。另外地或供选择地，在一些实施方案中，选择所述表面的拓扑图以促进细胞层中的细胞与至少一个表面的粘附增加。另外地或供选择地，在一些实施方案中，所述表面拓扑图使得细胞层的排列、行为或形态复制肾中的细胞的排列、行为或形态。
[0011]在一些实施方案中，所述流动通道在生物人工肾中形成。在一些实施方案中，所述流动通道形成为一种或多种结构的部分，所述结构选自亨利袢(Loop of Henle)、集合小管和远端小管。
[0012]在一些实施方案中，本技术的生物人工肾包括流体源，用于使流体经由入口流动通过流动通道，其中所述流体诱导在细胞层上的剪切应力。在一些实施方案中，所述流体源配置成使流体以一定流速流动，所述流速在生物人工肾的至少一个区域中产生在细胞层上的一定水平的剪切应力，所述剪切应力为约10.0达因/cm2。在一些实施方案中，在生物人工肾的至少一个区域中的所述剪切应力的水平小于或等于约1.0达因/cm2 ;在其他实施方案中，在生物人工肾的至少一个区域中的所述剪切应力的水平小于或等于约0.1达因/cm2 ；在再其他的实施方案中，在生物人工肾的至少一个区域中的所述剪切应力的水平小于或等于约0.02达因/cm2。
[0013]另外地或供选择地，在一些实施方案中，所述流体通道如此配置，使得流体在生物人工肾的第一区域以第一流速流动，并且在生物人工肾的第二区域以第二流速流动。在一些实施方案中，所述第一流速产生在第一区域中的细胞层上的第一水平的剪切应力，并且所述第二流速产生在第二区域中的细胞层上的第二水平的剪切应力。在一些实施方案中，所述第一和第二水平的剪切应力是不同的。暴露于不同剪切应力水平的生物人工肾的不同区域可以包括装置的任何结构，所述装置包括细胞层。以举例的方式而不是以限制的方式，在一些实施方案中，生物人工肾包括一个或多个集合管、远端小管和亨利袢，所述亨利袢包括升支和降支。在一些实施方案中，所述第一区域是所述亨利袢的升支，而第二区域是所述亨利袢的降支。在一些实施方案中，所述第一区域是亨利袢，而所述第二区域是集合管和远端小管中的一个或多个。
[0014]另外地或供选择地，在一些实施方案中，所述通道如此成形，使得流体通过流动通道的流动沿着流动通道的长度产生多个剪切应力值。在一些实施方案中，流动通道的至少一个表面具有至少两种不同的拓扑图。在一些实施方案中，流动通道的第一表面具有第一拓扑图，并且流动通道的第二表面具有第二拓扑图。显示不同拓扑图的生物人工肾的不同区域可以包括装置的任意结构，所述装置将包括细胞层。以举例的方式而不是以限制的方式，在一些实施方案中，生物人工肾包括集合管、远端小管和亨利袢中的一个或多个，所述亨利袢包括升支和降支。在一些实施方案中，第一表面在亨利袢的升支中，并且第二表面在亨利袢的降支中。在一些实施方案中，第一表面在亨利袢中，而第二表面在集合管和远端小管中的一个或多个中。在一些实施方案中，人工肾包括在第一和第二表面之间的过渡拓扑表面。
[0015]在一些实施方案中，第一表面的拓扑图包括具有第一间距的嵴，并且第二表面的拓扑图包括具有第二间距的嵴。在一些实施方案中，第一表面的拓扑图包括在相对于流体流动的第一方向上的嵴，并且第二表面的拓扑图包括在相对于流体流动的第二方向上的嵴。在一些实施方案中，第一拓扑图包括嵴，而第二拓扑图包括凹陷(pit)和柱(post)家族中的一种或多种拓扑图。在一些实施方案中，表面的拓扑图包括嵴，所述嵴的宽度为约5 μ m或更小。
[0016]在一些实施方案中，生物人工肾包括置于基底的一部分上的亲细胞性物质(如胶原)，用于在基底的所述部分中生长细胞层。在一些实施方案中，基底的所述部分形成流动通道的表面。
[0017]在一些实施方案中，生物人工肾包括至少第二流动通道，所述第二流动通道具有至少一个第二流动通道的表面，所述第二流动通道的表面具有在其中形成的拓扑图。在一些实施方案中，第一流动通道与第二流动通道被膜隔开。在一些实施方案中，第一流动通道接种有肾上皮细胞；另外地或供选择地，在一些实施方案中，第二流动通道接种有血管上皮细胞。在一些实施方案中，第一流动通道包括血液流动层，并且第二流动通道包括滤液层。
[0018]在一些实施方案中，第一通道的至少一个表面包括与第二通道中的相应表面不同的表面拓扑图。例如，在一些实施方案中，第一通道中的表面拓扑图包括与第二通道的表面拓扑图不同的间距或形状。在一些实施方案中，生物人工肾包括用于使流体流动通过第一流动通道和第二流动通道的第一流体源，其中所述流体诱导第一通道中的细胞层上的第一剪切应力和第二流动通道中的细胞层上的第二剪切应力。在一些实施方案中，第一剪切应力与第二剪切应力不同。
[0019]在一些实施方案中，接种在人工肾中的肾细胞包括一种或多种细胞类型，所述细胞类型选自近端小管细胞、肾近端小管上皮细胞、Madin-Darby犬肾细胞、原代内髓集合管细胞、原代近端小管细胞、胚胎干细胞、成体干细胞、诱导多能干细胞和内皮细胞。
[0020]附图的简要i兑明
[0021]参照以下附图，可以从以下说明性描述中更好地理解所述系统和方法，其中:
[0022]图1A是在平坦表面上生长的肾细胞培养物的略图；
[0023]图1B是根据本发明的说明性的实施方案，在具有拓扑图案的基底上生长的肾细胞培养物的略图；
[0024]图1C是在平坦表面上生长的肾`细胞培养物的照片；
[0025]图1D是根据本发明的说明性的实施方案，在具有拓扑图案的基底上生长的肾细胞培养物的照片；
[0026]图2A是根据本发明的说明性的实施方案，具有仿生流动通道的装置的分解实体模型；
[0027]图2B是根据本发明的说明性的施方案，具有来自图2A的仿生流动通道的组装的装置的实体模型；
[0028]图2C是根据本发明的说明性的实施方案，用于与图2B的仿生流动装置一起使用的流动系统的框图；
[0029]图3是根据本发明的说明性的实施方案，用于生成和使用图2的仿生流动通道之一的方法的流程图；
[0030]图4是根据本发明的说明性的实施方案，说明用于制备具有拓扑图案的基底的方法的一系列略图；
[0031]图5是是根据本发明的说明性的实施方案，用于在表面上建立亲细胞和疏细胞区域并在所述表面上生长细胞的方法的流程图；
[0032]图6A、6B、6C和6D是具有不同的拓扑特征的仿生流动通道的三个说明性的实施方案的横截面的透视图；
[0033]图7A是其拓扑图案具有渐变的基底的说明性实施方案的透视图；[0034]图7B、7C和7D是其拓扑图案沿着通道具有变化的流动通道表面的三个说明性的实施方案的顶视图；
[0035]图8A、8B、8C、8D、8E和8F是具有不同的拓扑图案的三个基底的说明性的实施方案的透视图；
[0036]图9A和9B是根据本发明的说明性的实施方案，用于使用图2的仿生流动通道之一的方法的流程图；
[0037]图10是根据本发明的说明性的实施方案的包括微制造的生物人工亨利袢、远端小管和集合管的组装的集成装置的示意图，所述装置包括用于刺激图案化的细胞生长的拓扑结构；
[0038]图11是根据本发明的说明性的实施方案的微制造的生物人工亨利袢的未组装的层的示意图，所述亨利袢包括用于刺激图案化的细胞生长的拓扑结构；
[0039]图12是根据本发明的说明性的实施方案的微制造的生物人工亨利袢中的流动行为的示意图，所述亨利袢包括用于刺激图案化的细胞生长的拓扑结构；
[0040]图13是根据本发明的说明性的实施方案的微制造的生物人工亨利袢的组装的层的示意图，所述亨利袢包括用于刺激图案化的细胞生长的拓扑结构；
[0041]图14是根据本发明的说明性的实施方案的接种在图10的微制造的生物人工亨利袢的过滤层的细胞的示意图，所述亨利袢包括用于刺激图案化的细胞生长的拓扑结构；
[0042]图15A、15B、15C和15D是本发明的仿生流动装置的说明性的实施方案的照片；
[0043]图15E是粘附到ECM包被区域的通道内的细胞的相衬图像。
`[0044]图16A是在本发明的说明性实施方案中的用于制造嵴/沟图案表面的镍合金模具的照片；
[0045]图16B是在本发明的说明性实施方案中的聚苯乙烯基底的照片；
[0046]图16C是在图16B中显示的聚苯乙烯基底的边缘轮廓的照片；
[0047]图17A显示了在空白基底(上排)或暴露于0、0.02或1.0达因/cm2FSS2小时的拓扑基底(下排)上生长的HK-2细胞的汇合层的荧光标记的细胞核。箭头指示在拓扑基底上的沟的方向；
[0048]图17B是显示细胞对齐到沟的百分比的条形图。前三个条代表在空白基底(无拓扑图)上生长并分别暴露于0、0.02或1.0达因/Cm2FSS的细胞，后三个条代表在拓扑基底上生长并分别暴露于0、0.02或1.0达因/cm2FSS的细胞；
[0049]图18A和18B显示在空白基底或拓扑基底上培养并暴露于0、0.02或1.0达因/Cm2FSS的细胞的ZO-1表达的代表性的图像；
[0050]图19A是显示沿细胞周长整合并通过细胞周长均一化的ZO-1强度的条形图。前三个条代表在空白基底(无拓扑图)上生长并分别暴露于0、0.02或1.0达因/Cm2FSS的细胞。后三个条代表在拓扑基底上生长并分别暴露于0、0.02或1.0达因/Cm2FSS的细胞；
[0051]图19B是显示沿细胞周长测量的ZO-1强度的标准偏差的条形图。前三个条代表在空白基底(无拓扑图)上生长并分别暴露于0、0.02或1.0达因/Cm2FSS的细胞。后三个条代表在拓扑基底上生长并分别暴露于0、0.02或1.0达因/Cm2FSS的细胞。
[0052]详细描沭
[0053]为了提供对本发明的整体理解，现在将描述某些说明性的实施方案，包括用于在仿生环境中培养细胞的装置和方法。然而，本领域普通技术人员应理解，本文描述的系统和方法可以改变和修改为适用于待解决的应用，并且本文描述的系统和方法可以在其他合适的应用中采用，并且这样的其他添加和修改不会偏离其范围。
[0054]仿生流动装置包括具有流体入口和流体出口的流动通道。为了建立复制器官结构如肾单位的流动通道，将器官的细胞的培养物在流动通道的至少一侧上生长。在体内，细胞外基质(ECM)在结构上支持肾单位的细胞，并导致内衬肾单位的细胞以特定排列彼此对齐。在仿生流动通道中，细胞生长在其上的表面的拓扑图的适当选择导致细胞具有将由ECM建立的对齐和/或排列。具有拓扑图的仿生流动通道不仅可以用于复制肾结构，还可以复制膀胱、消化系统、心脏、静脉、动脉、毛细血管、淋巴系统或经历流体流动的任意其他结构的部分。
[0055]示例性的表面拓扑图对肾细胞的影响显示于图1中。图1A和IB显示了肾细胞培养物的两个略图。图1C和ID显示了拍摄自肾细胞培养物的两张照片。图1A是在平坦表面104上生长的肾细胞102的培养物的略图，所述平坦表面如典型的培养板、培养皿或烧瓶。传统地，肾细胞在流体静止状态下培养，不经历剪切应力或拓扑图。即使肾细胞经历流体流动和剪切应力，细胞也不会对齐并且其形态不会被影响。如图1A中所示，通常培养的肾细胞102不具有特征形状或对齐，而似乎是随机对齐的。此外，细胞102不形成超结构并且通常不彼此接合。图1C是在平坦表面104上生长的肾细胞的培养物的照片。图1C说明了细胞102是如何缺乏特征形状并随机对齐的。
[0056]图1B是在具有示例性的拓扑图案的表面154上生长的肾细胞152的培养物的略图。表面具有比细胞152更窄的沟156和嵴158。每个细胞152跨越数个沟156和嵴158。与细胞外基质(ECM)类似，该沟和嵴的图案导致肾细胞152延长并自身与嵴平行对齐，促进细胞间连接，并促进细 胞152粘附到表面154。左侧给出的比例尺给出了一些肾上皮细胞的近似尺寸，然而，肾细胞的实际尺寸在整个肾单位中变化很大。细胞152的形态也是示例性的；一些类型的肾细胞，特别是柱状细胞，更多是矩形的。在图1B中，沟156和嵴158大致具有相同的宽度，但他们不是必须这样的。对于具有约IOmm的延长的宽度的肾细胞，如细胞152，沟156和嵴158的宽度应为约5mm或更小，以使延长的细胞与一个以上的嵴接触。在图1B中，沟156和嵴158的宽度为约800nm。沟156和嵴158可以比这个更窄，但是如果他们窄于20nm，结构将对肾细胞具有有限的作用。然而，拓扑图案的尺寸取决于细胞的大小。此外，对于某些应用，理想的是具有与细胞宽度相关的更宽的沟，以使细胞静止在沟中。在这样的实施方案中，嵴可以比沟更窄。在其他实施方案中，嵴可以比沟更宽。
[0057]除了控制细胞的方向和形状外，与在非结构或“空白”基底上生长相同时间段的细胞相比，沟和嵴还导致肾细胞152接合在一起并形成更确定的和发育良好的连接。在体内观察到的紧密的细胞连接对于肾单位适当地过滤血液和重吸收水分是必要的。紧密连接防止流体(包括液体和溶解的溶质)在细胞之间通过，因此离开肾单位壁的流体必须通过上皮细胞，其可以控制何种流体和/或溶质通过。当表面拓扑图，如沟156和嵴158，导致汇合细胞对齐以使其膜可以结合以形成该流体不可渗透的屏障时，这些细胞连接也将在体外环境中形成。流动通道可以在与表面154相关的任何方向上排列，以导致流体在任何方向上流过细胞152。在图6显示的实施方案中，流体平行或垂直于沟156和嵴158流动。
[0058]图1D为说明本发明的一个可能的实施方案的结果的照片。图1D显示在具有拓扑结构154的基底上生长的肾细胞培养物。如在图1B中说明的，细胞152似乎以更加对齐和紧密连接的方式生长。
[0059]图2A为显示用于在仿生环境中培养细胞的装置200的示例性的实施方案的分解实体模型。图2B显示组装的装置。装置200包括基底202和具有三个流动通道212的流动池204。基底202的顶端具有图2中未显示的拓扑图案，如图1B的图案。流动通道212的壁也可以或供选择地具有拓扑图，如图1B的图案。在基底202的刨光侧的顶部是细胞层，细胞优选地限制于在流动池202中的流动通道212底部的基底区域。基底202可以由热塑性塑料制成，所述热塑性塑料如聚苯乙烯或聚酰亚胺、生物可降解的聚酯(如聚己内酯(PCL)),或软弹性体(如聚癸二酸甘油酯(PGS))。基底202可以供选择地由聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚(N-异丙基丙烯酰胺)、或由例如碳或氧化锌形成的纳米管或纳米线制成。基底202可以由任何材料制成，在所述材料上可以形成微米级拓扑图并且可以生长细胞。拓扑图案的实例显示于图7A-7D和图8A-8F，并且用于化学图案化基底202的方法如图4所述。用于生长细胞层的方法如图5所述。
[0060]流动池204具有从底部切入流动池204的三个流动通道212。在一些实施方案中，流动池由透明材料如PDMS制成。供选择地，流动池可以由其他材料制成，如以上列出的任意可能的基底材料。3D实体打印机或光刻可以用于产生流动池204中的流动通道212。如图2B所示，当组装时，基底202形成流动通道的底壁，并且流动池中的流动通道212包括顶壁和两个侧壁。顶壁、底壁和侧壁在本文中共同称为“壁”。流动池204和基底202可以可逆地连接，以使在实验进行后，可以移除流动池204以能够检查细胞层。入口 214和出口216允许管道进入流动通道212。入口 214提供用于将流体引入流动通道212的通路,而出口 216提供用于将穿过流动通道212的流体移除的通路。进入入口 214的管道连接于控制注入流动通道212中的体积 和速度的工具(means)，如具有注射泵的注射器。流体注入系统可以是仿生流动系统的一部分，装置200安装在所述系统中。示例性的流动系统240的框图显示于图2C中。流动系统可以包括另外的特征，如温度控制系统和观察设备。通过入口端口 214引入的流体流沿着流动通道212的壁和在沿着通道底部的培养的细胞上产生均匀的层流。
[0061]穿过培养的细胞的层流模拟在肾单位内的流体的流动，并在流体和培养的细胞之间引入剪切应力。调节流体的流速导致沿着细胞的剪切应力改变。在肾近端小管中，细胞经历约I达因/Cm2的剪切应力(流体剪切应力或“FSS”);然而，所经历的剪切应力沿着肾单位的长度变化。观察到剪切应力低至0.015达因/cm2，因此能够通过控制流速改变剪切应力允许使用单一的装置设计产生一系列仿生条件。对于具有宽度w和高度h的矩形通道，和具有粘度m的流体，壁到切应力t和流速Q具有以下关系:
[0062]T =-
hhl
[0063]除了通过改变流速来改变通道的剪切应力外，如果通道的几何形状沿着通道的长度变化，在单一通道中的剪切应力可以沿着通道的长度变化。例如，在沿着流动方向的通道的第一区域中具有第一高度和在通道的第二区域具有第二、更低的高度的流动通道中，在通道的更低的第二区域中的流体流动比在更高的第一区域中具有更高的流速。因此，在第二区域中的细胞比第一区域经历更高的剪切应力。通过平稳地改变通道高度，细胞层经历渐变的剪切应力。变化的剪切应力可以用于复制肾单位的不同部分，所述肾单位的不同部分可以具有不同的功能。此外，细胞的不同类型和排列与经历不同水平的剪切应力的肾单位的区域相关，因此沿着具有不同的细胞类型或排列的基底的区域可以与不同高度的流动通道对齐以使细胞经历适当的剪切应力。
[0064]图2中的流通通道212具有矩形的横截面，但是流动通道对于不同的流体动力学可以具有非矩形的横截面。例如，流动通道可以具有半圆形的、三角形的或梯形的横截面。剪切应力可以使用横截面几何结构的剪切应力方程来确定。流动通道可以沿其长度具有两种或多种不同的横截面形状。
[0065]组装的流动装置200可以放置在图2C的框图中显示的流动系统240中，以容纳组件并控制流动通道环境。流动系统包括固定装置242、观察设备244、流体注入系统250和温度控制系统260。
[0066]固定装置242包括使用例如3D实体打印机制成的塑料盖和塑料底。流动通道装置200位于固定装置242的盖和底之间，所述盖和底通过例如螺丝或夹具保持在一起。因此，固定装置242使装置的基底202和流动池204保持在一起，优选地形成可逆的密封，以使流体不能渗漏出流动通道212。
[0067]观察设备244用于在实验过程中和/或之后观察细胞，而流动通道装置200容纳在固定装置242中。如果通道壁是透明的，光学显微镜可以用于在实验过程中观察样品。在一些实施方案中，观察设备包括指向流动通道中的光源和在流动通道下方的用于检测超常光传输(“EOT”)信号的光学传感器。在这样的实施方案中，流动池204和基底202两者应由允许光传输的材料制成。在其他实施方案中，电极置于用于检测细胞的汇合、形状和代谢的流动通道中。在一些实施方案中，在固定装置的外部进行成像，可能地在流动通道装置200被拆卸后，并且流动系统240不具有观察设备244。
[0068]流体注入系统250包括注射器252和注射泵254。注射器252含有待流过流动通道212的流体，且注射泵254控制注射器2`52，以控制所流动的流体的量、流速和所述流体流动的时间长度。流体注入系统250可以用于注入两种或多种不同的流体，包括但不限于，缓冲流体、反应物流体、固定液和染色剂。流体注入系统250还可以包括用于合并流体的装置；例如，注射泵254可以包括阀，用于将反应物引入缓冲液中，或用于将染色剂引入缓冲液中。注射泵254可以由处理器(如通用处理器)控制。
[0069]基底202和/或流动池204可以由绝缘材料制成以保持在流动通道212中的温度稳定性。流动系统240可以包括温度控制系统260或孵育器。温度控制系统包括温度传感器262、温度控制器264和加热元件266以将流动通道212保持在仿生温度下，即98.6 T。可以选择更高或更低的温度以模拟不同的条件，例如发烧或损伤。温度262传感器检测系统温度并将其发送至温度控制器264。根据当前的系统温度，温度控制器264确定是否应当向系统增加热量。温度控制器264向加热元件266 (如热敏电阻)发送指令，以在必要时向系统增加热量。在一些实施方案中，温度系统还可以冷却装置200。温度控制器或第二温度控制器还保持待流入流体通道212中的流体温度。流动系统240还可以包括二氧化碳控制器270，以调节流动通道内的二氧化碳水平。二氧化碳控制器270可以包括二氧化碳传感器、处理器和用于在必要时升高或降低二氧化碳水平的工具。在一些实施方案中，二氧化碳控制器整合至温度控制系统260中。[0070]在一些实施方案中，流动系统240连接到具有通用处理器的计算机。计算机可以充当温度控制器264，并且来自温度传感器262的温度发送到计算机并保存到存储器中。类似地，计算机可以充当二氧化碳控制器，并且来自二氧化碳传感器的二氧化碳水平可以发送到计算机并保存到存储器中。计算机还可以控制注射泵254使流体流动自动化并保存与流体流动有关的数据。计算机还可以控制观察设备，保存获得自观察设备的图像或其他数据，以及对数据进行分析。
[0071]装置200可以包括多于或少于三个流动通道212。可以制备包括一百个或更多个流动通道212的高通量装置。在一些实施方案中，高通量装置包括九十六个流动通道。两个或多个流动通道212的入口 214可以流体连接以使流体同时通过多个流动通道212流动，并且如果流动通道212的几何形状是相同的，以相同的流速流动。流动系统240可以配置成同时自动运行多个实验，或一次进行一个实验。在装置200中的一个流动通道中进行的实验在流体、流速、流动通道几何形状和温度中的至少一项可以与在不同的流动通道中进行的实验不同。装置200可以是一次性的，或在使用后，全部或部分装置(例如，基底202或流动池204)可以拆卸并清洁以重复使用。 [0072]图3是建立和使用图1所示的仿生流动通道之一的方法300的流程图。方法300包括以下步骤:获得刨光的基底(302 )，化学图案化基底(304)、生长细胞层(306 )，组装流动通道(308 )，使流体流过流动通道(310 )，和固定细胞用于分析(312 )。
[0073]第一步302用于制备或获得具有拓扑图案的表面，所述拓扑图案如图1B的表面152上的沟156和嵴158。表面可以使用例如直接光刻、可光图案化的抗蚀剂、注塑成型、直接微加工、深RIE蚀刻或热压印或其任意组合生成。用于通过热压印产生刨光的基底以用于装置200中的示例性的方法如图4所述。在一些实施方案中，金属(如金)的薄层被蒸发到拓扑表面上来帮助光学成像以用于分析样品。在一些实施方案中，金属层允许使用用于检测表面等离子体共振(SPR)的光学传感器分析细胞培养物。在一些实施方案中，由于分子头基对金属的强的亲和力，金属层还用于化学图案化在基底上的某些亲细胞和疏细胞分子。金属层足够薄以维持表面的拓扑图。金属层可以具有纳米孔以用于SPR检测。纳米孔可以为约IOOnm宽并使用例如光刻技术、电子束光刻技术、聚焦离子束(FIB)或其他方法碾磨在金属中。金属层可以供选择地由银、铝、铍、铼、锇、钾、铷、铯、氧化铼、氧化钨、铜、钛或另一种适用于成像或其他分析的材料制备。在一些实施方案中，铬或其他金属粘合剂的薄层在金或其他金属层之前首先蒸发到表面上。
[0074]接下来，化学图案化结构化的表面(步骤304)以制备疏细胞和/或亲细胞区域，用于分离细胞生长与流动通道区域。如果肾细胞在整个表面上(如基底202)生长，那么将流动池204密封到基底202将压碎流动通道212外部的区域内的细胞。这造成内容物从压碎的细胞渗漏到流动通道212中，可以提供由存活细胞接收的生化信号。这样的渗漏可以对实验步骤具有不希望的影响。因此，细胞应限制在形成组装的流动池壁(即，顶部、底部和/或侧面)的表面区域。对于装置200，细胞层限制在不接触流动池204的基底202的区域，即，在流动通道212以下的区域。为了产生这些区域，亲细胞材料可以放置在流动通道表面上以促进流动通道内的区域的细胞生长。另外地或供选择地，疏细胞材料可以放置在不形成流动通道壁的表面上，以防止在流动通道表面外部的细胞生长。一旦产生拓扑表面并进行化学图案化，将ECM蛋白施加到表面并将细胞悬液置于蛋白层以上以生长含有一种或多种类型细胞的细胞培养物(步骤306)。用于产生表面的亲细胞和疏细胞区域(如基底202)和在表面上生长细胞的一种方法如图5所述。
[0075]一旦细胞长大(步骤306)，组装流动通道(步骤308)。在一些实施方案中，流动池可逆地组装以使至少一个壁可以移除用于观察。在一些实施方案中，流动池204放置在基底200之上并使用例如螺丝或夹具连接。供选择地，装置200可以如图2C所述组装在固定组件242中。然后使流体流过组装的流动通道(步骤310)。选择流速以产生如图2所述的希望的剪切应力，并且流速通过流体注入系统控制。流体可以含有试剂和缓冲流体。试剂是根据所进行的实验选择的；例如，流体可以包括药剂或潜在的毒素，以测试物质的功效或毒性。流体可以在任意持续时间内流过流动通道，所述持续时间例如为约数秒、数分钟、数小时或数日。流体流动的持续时间取决于所进行的实验类型。例如，用于成像经历特定剪切应力的细胞的实验仅可以持续短时间，约数十秒至数分钟。另一方面，用于测定潜在的毒素或潜在的治疗剂对细胞的影响的实验可以需要更长的暴露时间，约数小时、数日或更长。流速可以随时间变化，并且在一些实施方案中，细胞可以经历间断的流体流动。
[0076]接下来,如果要进行流动后分析(post-flow analysis),则固定细胞以用于分析(步骤312)。首先，通过使第二溶液(如磷酸盐缓冲盐水(PBS))流动通过流动通道来漂洗细胞，随后，使含有固定剂(如甲醛或其他醛)的第三溶液流动通过通道，以使通道可以被拆卸而不损伤细胞。固定剂在溶液中的百分比和选择的固定剂类型取决于分析方法和在流动通道中的细胞类型。使用流体注入系统将漂洗溶液和固定剂通过入口 214注入。可以使用相同的注入机构(例如注射泵)和管道并用注射器替换，或固定装置可以包括通过管道连接到相同入口的至少两个或三个注射泵。染色剂还可以在拆卸流动通道之前或之后施加到细胞，以增加成像对比度。
[0077]图4是说明用于制备具有拓扑图案的表面(如图1的表面102)的方法的一系列略图。方法涉及蚀刻氧化硅母模(步骤A-E)，电成形镍阴模(步骤F)，和使用热压印由镍模具制备拓扑表面(步骤G-1)。氧化硅母模是使用光刻技术产生的。步骤A说明将光致抗蚀剂溶液404涂覆在氧化硅晶片402上。光致抗蚀剂404可以使用旋涂施加。在旋涂后,氧化硅晶片402可以被烘烤以蒸发残留溶剂。随后将光掩模406层叠在光致抗蚀剂404的顶部(步骤B)以光刻地图案化抗蚀剂404。在图4中，光掩模406具有嵴图案的横截面。拓扑图的图案由选择的光掩模确定。供选择的拓扑图案可以由不同的光掩模制成，其显示于图6中。通过将顶面暴露于光408来显影光致抗蚀剂404，以产生蚀刻掩模410 (步骤C)。在图4中，使用了负性光致抗蚀剂404，因此当显影时，暴露于光408的部分光致抗蚀剂层404变得不溶于显影剂，而未暴露部分是可溶的并溶解。供选择地，可以使用正性光致抗蚀剂。一旦在光致抗蚀剂404中生成图案以制备蚀刻掩模410，硅晶片可以再次被烘烤，并且晶片402被显影以将光致抗蚀剂410从暴露于光的区域去除。最后，使用化学剂蚀刻氧化硅晶片402，所述化学剂去除晶片的未被蚀刻掩模410保护的最上层(步骤D)。在一些应用中，去除的氧化硅的深度约为1微米。为了制备如图4所示的具有直角边缘的图案，使用各向异性的蚀刻剂；如果需要圆形的孔，可以使用各向同性的蚀刻剂。最后，剥离蚀刻掩模410以产生母模412 (步骤E)。
[0078]其他方法可以用于产生母模412。例如，电子束光刻或其他纳米光刻技术可以用于将特征蚀刻到抗蚀剂中，特别是如果希望的拓扑图包括宽度约为数纳米或数十纳米的非常小型的特征。
[0079]一旦产生了母模412，将镍414电成形到硅晶片(步骤F)。镍源414和母模412放置在电解池中。电源416在镍源414和氧化硅母模412之间产生电压差，其导致镍电镀在母模412上以形成镍模418，所述镍模418是母模412的阴模。镍模418从母模分离并朝下放置并压在热塑性塑料420上。将热塑性塑料通过热压印挤压到镍模418中的沟中(步骤G)。升高的热量和压力导致热塑性塑料420填充到镍模中。随后，压印的热塑性塑料422在恒压下冷却(步骤H)，然后从镍模418中移除(步骤I)。在模塑的热塑性塑料422中的拓扑表面随后可以用作流动通道的壁。
[0080]图5是根据本发明的一个说明性的实施方案的产生表面的亲细胞和疏细胞区域并在表面上生长细胞的方法的流程图。该方法涉及在将形成流动通道壁的区域的表面上产生疏水区域(步骤502和504)，使用亲水性物质填充表面的其余部分(步骤506)，使用蛋白涂覆疏水区域(步骤508)，并在蛋白上方(即亲细胞区域)生长细胞层(步骤510和512)。一般地，细胞外基质(ECM)蛋白粘附于疏水分子。细胞在类似于体内条件的条件下旺盛地成长，因此细胞倾向于在含有ECM蛋白的区域中生长，而在不含ECM蛋白的区域中不生长。
[0081]首先，将疏水性溶液施加到PDMS压模(步骤502)并压模在具有拓扑图的表面上(步骤504)。压模使用压力保持并释放以使分子的疏水性自组装单层(SAM)保留在表面上。用于疏水性SAM的分子通常具有结合于基底的头基和结合于ECM蛋白的疏水性尾基(如CH3)。在一些实施方案中，十六烷硫醇用于SAM。可以用于SAM的其他分子包括烷基硫醇、官能化的硫醇、二硫醇和硅烷。
[0082]PDMS压模的涂饰表面可以是所压模的流动通道的侧面的大小，或所涂饰的表面可以仅覆盖待使用细胞填充 的流动通道的区域。例如，如果不希望使细胞生长在靠近流体入口和出口的通道末端，则使用仅覆盖流动通道的中央部分的矩形压模。对于具有多个流动池的装置，单一 PDMS压模可以具有用于压模多个流动通道的壁的图案。
[0083]表面的其余部分回浸亲水性溶液，如聚乙二醇(PEG)，以在不是流动通道壁的表面的部分上形成妨碍细胞生长的SAM (步骤506)。如图1所描述的，这防止细胞在希望的区域外生长，以防止从当拆卸装置时压碎的细胞中渗漏以及有害的边缘效应，如压碎的细胞和在通道内的细胞之间的负通讯。
[0084]使用细胞外基质(ECM)蛋白涂覆具有两种SAM的拓扑表面(步骤508)。蛋白粘附于疏水SAM，但是亲水SAM抑制蛋白吸附。这导致蛋白集中在亲水区域，当组装装置时，所述亲水区域将形成流动通道的壁。在一些实施方案中，不同类型的细胞可以生长在流动通道的不同区域中或在具有在相同表面上形成的壁的不同流动通道上。为了将细胞类型分离到表面的某些区域，表面可以使用不同的蛋白和/或SAM分子处理，以促进某种细胞类型在某区域生长。其他方法可以用于产生亲细胞区域。例如，热聚物(thermopolymer)基底可以使用氧等离子体来处理以增强亲细胞性，并且任意未处理的区域将是疏细胞的。
[0085]然后将处理表面放置在陪替氏培养皿中以生长细胞(步骤510)。陪替氏培养皿充满细胞悬液，并在一些实施方案中置于设置在5%C02和37° C的孵育器中(步骤512)。细胞仅粘附于蛋白涂覆的亲细胞区域。将细胞培养至高汇合，以使当组装时流动通道壁将覆盖一层细胞。通常生长的用于体外肾模型的细胞包括人近端小管细胞，如来自HK-2细胞系的细胞；肾近端小管上皮细胞(RPTEC) ;Madin-Darby犬肾(MDCK)细胞；和通常从小鼠或大鼠收集的原代内髓集合管aMCD)细胞或原代近端小管细胞。在各种实施方案中，生长了干细胞衍生的细胞、肾祖细胞或由肾组织收获的细胞。另外地或供选择地，在一些实施方案中，用于本技术的细胞包括干细胞(例如，胚胎干细胞、成体干细胞、诱导多能干细胞)和/或内皮细胞。可以生长来自人类、其他哺乳动物生物体或其他生物体的细胞。
[0086]一旦细胞长成，将生长细胞的培养基移除(步骤514)。通常地，从细胞层外的区域移除培养基。因此，一些水分留在具有细胞层的区域内，但是基底的其余部分是干燥的。然后，将流动微通道在拓扑表面上方组装(步骤516)。一旦流动微通道在拓扑表面上方，微通道可以充满细胞培养基。
[0087]图6A显示了仿生流动通道的一个说明性实施方案的横截面的透视图，所述流动通道具有平行于流动通道的方向的嵴和沟。嵴和沟可以不是等比例的。如图1所述，嵴和沟的宽度可以在20nm至5微米。例如，嵴和/或沟的宽度可以独立地为20-40nm、30_50nm、50-100nm、100-200nm、200-400nm、400-600nm、600-800nm、800nm-l 微米。以另外的实例的方式，嵴和/或沟的宽度可以独立地为1-2微米、2-3微米、3-4微米或4-5微米。流动通道的高度可以在100至200微米。可以使用更大或更小的高度，但是如果流动通道比100微米高窄得多时，流体通过通道的流动可能不是层流。在图6A显示的实施方案中，细胞层可以在流动通道的底层602以上生长，并且嵴和沟将导致细胞与通过通道的流动平行地对齐。
[0088]在图6B显示的实施方案中，底面和顶面两者是结构化的并且细胞在两者上培养，这可以更好地复制体内肾单位或另外的器官。图6A中的底层602和图6B中的顶层612和底层616和图6D中的层632、636和640可以是拓扑基底，如图2的基底202。在一些实施方案中，图6B中的层616具有至少两个穿过其的孔，以使流体可以通过一个孔流入流动通道，并通过另一个移除。在图6B中，具有穿过其形成的细长的孔的中层614夹在顶层616和底层612之间。当置于顶层616和底层612之间时，细长的孔的侧壁形成流动通道的侧壁。
[0089]图6C显示了仿生流动通道的另一个说明性的实施方案的横截面的透视图，所述流动通道具有垂直于流动通道的方向的嵴和沟。嵴和沟可以不是等比例的。图6C的拓扑图和流动通道的尺寸范围与图6A中给出的范围相同。细胞层将在该流动通道的底层622以上生长，并且嵴和沟将导致细胞与通过通道的流动方向垂直地对齐。通道的顶面和/或侧面还可以是结构化的并具有生长在其上的细胞(未显示)。
[0090]如在图6C的右侧可以观察到的，底层622的整个顶面是结构化的，具有嵴和沟。由于流动通道的侧面可以不密封，流过流动通道的流体可以通过由沟产生的孔628从流动通道的侧面渗出。因此，在一些实施方案中，拓扑表面仅在将形成流动通道的壁的部分表面上形成；表面的其余部分是光滑的。这可以通过使用光掩模来实现，所述光掩模完全覆盖基底表面，除了将成为流动通道壁的区域。当组装流动通道时，结合到流动池或侧壁的光滑表面将在流动通道的侧面沿其长度形成密封，防止流体从侧面流出嵴和沟。
[0091]图6D说明了仿生流动通道的另一个说明性的实施方案的透视图。在该实施方案中，底壁、顶壁和两个侧壁均为结构化的，并且细胞在其每个上培养，这可以更好地复制体内肾单位或另外的器官。在该说明性的实施方案中，结构由平行于流动通道的方向的嵴和沟组成。在一些实施方案中，图6D中的层632具有穿过其的至少两个孔，以使流体可以通过一个孔流入流动通道，并通过另一个移除。当壁636夹在顶层632和底层640之间时，形成细长的孔。细长的孔的侧壁形成流动通道的侧壁。
[0092]图7显示嵴和/或沟宽度具有变化的拓扑图案的数个实施方案。图7A是在其拓扑图案中具有渐变的基底的透视图。嵴和沟的宽度穿过表面从左到右变窄。流动通道可以在基底上方组装，以导致流体与沟平行地或垂直地流动。在一些实施方案中，嵴的宽度保持恒定而沟的宽度改变；在其他实施方案中，沟的宽度保持恒定而嵴的宽度变化。拓扑图案具有变化的表面可以用于实验，以检查不同嵴和/或沟宽度对特定类型的细胞的影响。此外，对于体内的结构的区域中具有变化的细胞特征的器官结构，如图7A中所示的平稳地改变表面拓扑图可以用于产生模拟这样的特征的流动通道。
[0093]图7B、7C和7D是其拓扑图案沿着通道具有变化的流动通道表面的顶视图。流动通道可以不是等比例的。穿过通道的流动方向是朝向页面下方的，如图7D的右侧箭头所示。在其他实施方案中，流体可以在相反的方向上流动。图7B是具有两个不同区域702和704的表面的顶视图，所述两个不同区域具有不同的沟宽度。上部区域702具有更窄的沟宽度，以使沟和嵴约为相同的宽度。下部区域704具有比上部区域702明显更宽的沟。在下部区域704中的沟也比嵴宽。具有两个不同的拓扑区域的流动通道可以用于模拟具有两种不同细胞类型或细胞排列的体内结构。例如，肾小管具有沿其长度改变的细胞类型，并且肾小管的基底膜中的变化可以通过改变流动通道的拓扑图在体外进行模拟。
[0094]图7C的沟也是朝向流动通道的末端更宽；然而，嵴呈扇形分散以使沟平稳地变宽，沿着通道而不是不同的区域在窄沟和更宽的沟之间产生平稳的过渡。具有一个或多个该类型的侧面的流动通道可以用于模拟在结构中的细胞类型或细胞排列具有渐变的体内结构。具有该类型的拓扑图的流动通道还可以用于实验，以检查不同嵴和/或沟宽度对特定类型的细胞的影响 。
[0095]图7D是具有彼此不同的恒定拓扑图712和716的两个区域和介于恒定拓扑图的两个区域之间的过渡区域714的非矩形通道的顶视图。流动通道712的起始端具有窄的宽度和窄的沟，并且流动通道716的末端更宽并且具有更宽的沟。所有区域712、714和716具有相同数量的嵴。如果在图7D的表面上方的流动通道具有恒定的高度，那么由于第一区域712比最后的区域716的通道宽度更小并且流速更高，因此在第一区域712中所经历的剪切应力将比在最后的区域716中的剪切应力更高。该作用可以供选择地通过改变通道高度来实现。当几何形状改变时，过渡区域714帮助维持层流。在图3、4和5中描述的制造方法可以用于建立具有图7所示的任何拓扑图和几何形状的流动通道装置。
[0096]表面拓扑图可以具有除了图6和7中所示的直角嵴和沟以外的图案。一些可能的拓扑表面显示于图8A至8C中，图8A至8C为具有不同拓扑图案的三种基底的透视图。图8A显示由窄沟隔开的三角形的嵴。边缘可以比图8A所显示的更圆。图SB显示了圆形柱的随机阵列。图8C显示了柱的线性阵列。图8D显示了倒置的圆锥形凹陷的线性阵列。图SE显示了圆锥形柱的线性阵列。图8F显示了倒置的半球形凹陷的线性阵列。可以宽泛地分类为凹陷和柱的任意结构可以排列成随机或线性阵列。此外，图8不旨在包括所有可能的凹陷和柱的设计，而是提供了可能的设计的说明。凹陷和柱家族还可以包括但不限于，柱、圆锥、半球、圆角凹陷(filleted pit)和倒角柱(chamfered post)。由于不同类型的细胞可以具有不同的体内环境并且可以对仿生信号(cue)作出不同的应答，因此所选择的拓扑图取决于所培养的细胞类型。虽然嵴和沟已显示提供导致肾细胞对齐的仿生信号，但细胞外基质在身体的不同部分是不同的，因此当在图8所示类型的拓扑图或另一种类型的拓扑图上生长时，在不同器官中或甚至在肾的其他部分中的细胞可以更好地模拟其体内特征。与图4所示的方法相似的方法可以用于形成图8A-8F中显示的基底。可以使用其他技术，特别是用于制备三角形沟或具有边缘既不为直角也不为圆形的沟的其他图案。如图7所描述的，特征的尺寸和/或距离可以在不同的区域中或在渐变中沿着表面变化。此外，单一的流动通道可以具有多种类型的拓扑图，如柱的区域和嵴和沟的区域，或散布有嵴和沟的柱。
[0097]图9A和9B显示了仿生流动通道的两种示例性的用途。图9A为用于使用仿生流动通道(如图2的装置200)的方法900的流程图，以检查潜在毒素的细胞毒性。该方法在高通量药物筛选中是有用的，研究人员可以在投资化合物的进一步的药物开发之前筛选细胞毒性化合物。对于毒性测试，根据图3的步骤310所述的方法，将对某种类型的细胞具有潜在毒性的材料以一定浓度放置在溶液中，并通过含有该类型的细胞的培养物的流动通道流动(步骤902)。在一些实施方案中，特别是如果潜在的毒素难以生产或难以获得时，注入系统包括注入阀，所述注入阀在缓冲流体在流动通道内建立层流后释放潜在的毒素。使用注入阀使实验中消耗的潜在毒素的量降至最低。如果观察设备指向流动通道，那么当潜在的毒素通过通道流动时，可以分析样品。
[0098]根据图3的步骤312所描述的方法，在潜在地有毒的溶液已经流动通过通道后，漂洗并固定细胞(步骤904)以保存实验结果用于观察。然后将染色剂或荧光标记在拆卸流动通道之前或之后施加到细胞，以增加成像对比度(步骤906)。可以使用适于细胞类型和观察设备的任何染色方法，如苏木精和伊红(H&E )染色、银染色或免疫荧光染色。在一些实施方案中，染色剂为不能穿过健康细胞的细胞膜的活体染料，如台盼蓝或碘化丙锭。将活体染料引入具有潜在的毒素的流动通道。如果化合物是有毒的，其可以导致细胞膜的破裂并允许染料穿过膜并使细胞染色。
[0099]一旦流体已经流动通过通道并制备细胞，分析细胞以确定潜在的毒素的毒性。在各种实施方案中，使用通透性分析(permeability assays)、细胞活性分析、代谢活性分析或活/死分析确定毒性。如果物质是有毒的，其可以导致细胞经历坏死，导致细胞停止生长和分裂或导致细胞凋亡。经历坏死的细胞可以迅速膨胀，失去膜完整性，停止代谢并释放其内容物。如以上所述，活体染料的`使用可以显示这样的影响。活体染料染色和/或细胞死亡的其他影响可以使用例如光学显微镜、电子显微镜或数字全息显微镜观察。可以在实验过程中或实验后使用用于确定细胞生活力的其他技术。细胞计数器，如CASY计数器或Coulter计数器,可以计数存活细胞的数量。如果细胞下的表面包括金电极,基于电细胞-基底阻抗传感器(ELECTRIC CELL-SUBSTRATE IMPEDENCE SENSING (ECIS))的方法可以用作细胞的汇合、形状和代谢的传感器。
[0100]图9B是使用仿生流动通道(如图2的流动通道212)以检查潜在的治疗剂的功效的方法950的流程图。方法950可以用于高通量筛选中，以确定潜在的药物化合物是否可以具有治疗效果。对于功效测试，根据图3的步骤310所述的方法，将可能对流动通道中某种类型的细胞有益的化合物以一定浓度放置在溶液中，并通过流动通道流动(步骤952)。在一些实施方案中，特别是如果化合物难以生产或难以获得时，注入系统可以包括注入阀，所述注入阀在缓冲流体在流动通道内建立层流后释放该化合物。如果观察设备指向流动通道，那么当化合物通过通道流动时，可以分析样品。[0101]根据图3的步骤312所描述的方法，在溶液已经流动通过通道后，漂洗并固定细胞(步骤904)以保存实验结果用于观察。在一些实施方案中，可以在拆卸流动通道之前或之后将染色剂或荧光标记施加到细胞，以增加成像对比度(步骤906)。可以使用适于细胞类型和观察设备的任何染色方法，如苏木精和伊红(H&E)染色或银染色。
[0102]一旦准备好细胞，对其进行分析以确定化合物对细胞具有何种作用，如果有的话。结合于特定蛋白或核酸的试剂可以施加到细胞层以确定在分析过程中蛋白或核酸的存在。潜在的治疗化合物的物理作用可以使用例如光学显微镜、电子显微镜或数字全息显微镜观察。感兴趣的特征取决于细胞类型和所研究药物的希望的作用。用于分析的方法应根据研究所感兴趣的细胞特征进行选择。
[0103]虽然本发明的优选的实施方案已在本文中显示和描述，但对于本领域技术人员明显的是，这样的实施方案仅以举例的方式提供。本领域技术人员将进行许多变化、改变和替代而不背离本发明。应懂得本文描述的本发明的实施方案的各种替代方案可以用于实践本发明。意图的是，以下权利要求限定本发明的范围，并且覆盖在这些权利要求及其等同物的范围内的方法和结构。
[0104]在一些实施方案中，一个或多个拓扑表面在生物人工装置中形成，用于通过模拟肾或肾单位功能来复制或基本上复制器官功能，所述装置如提交于2005年9月28日并于 2010 年 9 月 7 日授权的名称为 “Systems, Methods, and Devices Relating to aCellularized Nephron Unit”的第7，790，028号美国专利中所描述的装置。人工肾的任何特征，包括亨利袢、远端管、集合管和相关的血管可以包括一种或多种上述的拓扑表面，以更好地复制肾的体内条件。例如，血液流动层和/或过滤层的表面可以具有在其中形成的拓扑图。包括可渗透水的细胞、泵盐细胞或其它类型的细胞的细胞层可以在拓扑表面或拓扑表面的部分上生长。更具体地，选择每个通道的拓扑图使得生长在其上的细胞呈现肾的希望的部分的形态和表型。因此，在一个实施方案中，接种泵盐细胞的通道的部分形成为具有第一纳米拓扑图，并且接种可渗透水的细胞的通道的部分形成为具有不同的纳米拓扑图。本文或第7，790，028号美国专利中所述的任何制造技术或制造技术的组合可以用于制备这样的生物人工装置。
[0105]示例性的生物人工装置
[0106]以举例的方式而不是以限定的方式提供了包括亨利袢、远端小管和集合管的整合的生物人工肾的说明性的实施方案。示例性的装置(及其构件)包括用于肾细胞生长的拓扑表面和细胞生长区域，其能够暴露于流体剪切应力(FSS)以刺激肾细胞生长模式和细胞功能，其更加接近地模拟在体内发现的细胞生长模式和功能。虽然本文描述了生物人工亨利袢的各种实施方案，但应理解用于图案化亨利袢中的细胞的拓扑生长表面和FSS特征可以应用于生物人工肾的其它结构，包括但不限于生物人工远端小管和集合管。此外，虽然以下讨论描述了嵴和沟，但本文公开的任意表面拓扑图可以包括在生物人工肾的一个或多个区域中，以使细胞生长更加接近地模拟体内系统的细胞生长。非限定性的示例性的拓扑图或拓扑修饰包括改变拓扑特征的间距、改变拓扑特征相对于流体流动的方向(例如，平行于流体流动的方向，或垂直于流体流动的方向)、和包括凹陷和柱家族的拓扑图中的任意一种或多种。此外，在不同的拓扑区域可以包括过渡表面，以允许从一种细胞排列、行为和/或形态分级地或渐变地变成另一种。[0107]如本领域已知的，肾的不同区域经历不同的剪切应力。流速和直径两者均影响剪切应力，并且两者可以沿着肾、肾单位或小管的任意给定区域改变。不希望束缚于理论，认为由于流体沿着小管被重吸收到组织，因此流速(体积流量)通常在更高的“上游”。因此，肾单位的流速从高到低可能为以下顺序:近端小管、然后是降支亨利袢、然后是亨利袢的升支、然后是远端小管、接着是集合管的起始。剪切力可能与流速从高到低具有相同趋势；然而，当给定区域的直径改变时，流量和剪切力之间的相关性可能不明确。除了直径的变化以外，当评价流量和剪切力时考虑的另一个因素是流入大血管中的更小的支流的影响。例如，集合管直径增大，但是流速在“下游”升高。这是由于更小的支流流入了更大的血管的下游。
[0108]因此，生物人工肾可以被配置成将任何给定区域中的细胞暴露于经历具体的FSS或FSS系列，或FSS循环(通常为“FSS”曲线)。也就是说，将生物人工肾的第一区域中的细胞暴露于第一 FSS曲线，而可以将生物人工肾的其它区域中的细胞暴露于不同的FSS曲线。例如，在一些实施方案中，在一个或多个FSS曲线中的FSS水平为约0.02-1.0达因/cm2。在一些实施方案中，在一个或多个FSS曲线中采用约0.1达因/cm2或更低的FSS水平。在再其它的实施方案中，在一个或多个FSS曲线中使用约0.01,0.02,0.05,0.07,0.09,0.1、
0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、
8.0,9.0或高达约10.0达因/cm2的FSS水平。在一些实施方案中，一个或多个FSS曲线中使用10.0达因/cm2或更高的FSS水平。在一些实施方案中，在FSS曲线中的FSS速率在细胞生长过程中改变/波动，以实现希望的细胞排列、细胞图案和/或其它希望的细胞特性(例如，改变的紧密连接蛋白的表达、细胞外基质蛋白、希望的细胞功能等)。
[0109]A.整合装置
[0110]在肾中，血液首先通过肾小球过滤，滤液流出肾小球并进入近端小管，然后进入亨利袢，然后进入远端小管和集合管。根据一个实施，本发明的仿生装置用于替代亨利袢、远端小管和集合管，提供肾小球和近端小管的功能。图10显示了根据该实施的说明性的整合装置的示意图。如显示的，图10的装置100包括模拟亨利袢的生物人工袢10、远端小管20和集合管30，其均互相连通以替代其生物对应物。可以向这些结构中的每一个提供拓扑特征以使在其中的细胞生长具体地图案化。此外，可以设计不同结构(例如，亨利袢、远端小管和集合管)使得在该结构中的细胞暴露于流体剪切应力，借以进一步在位置上和功能上使在该结构中的细胞图案化。
[0111]如所说明的，装置100包括血液流动层200和过滤层300，和置于两层200和300之间的膜。如所显示的，血液流动层200包括袢10的血液流动层210，集合管30的血液流动层230和远端小管20的血液流动层220 ;血液流动层200的三个组件:血液流动层210、220和230基本上位于一个平面。在供选择的实施方案中，组件血液层210、220和230形成基本上三维的网络或基本上位于两个或多个平面上。血液流动层200进一步包括在其中形成的微流体通道或微通道，其允许血液从血液入口 110流入装置100并通过血液出口 120流出装置。
[0112]如所说明的，装置100包括过滤层300，所述过滤层300也包括三个组件，袢10的过滤层310、集合管30的过滤层330和远端小管20的过滤层320。类似地，这些组件过滤层可以位于相同的平面或位于多个平面中。类似地，这些组件过滤层可以形成基本上三维的网络。过滤层300还包括在其中形成的微流体通道或微通道，其允许滤液从滤液入口 130流入装置100并通过滤液出口 140流出装置。
[0113]在涉及三维微流体网络的某些实施方案中，采用垂直连接或垂直气孔以使网络中的不同层彼此流体连通。“垂直连接”或“垂直气孔” 一般地是指垂直地将一层中的一个微通道与相同层或第二层中的至少另一个微通道连接的部分或完整通孔。垂直连接一般地基本上垂直于其所连接的层或微通道。中空纤维可以加入装置和系统中以形成这样的垂直气孔。
[0114]还如所说明的，装置100包括膜。膜包括三个组件，袢10的膜410、远端小管20的膜420和集合管30的膜430。组件膜410、420和430各自位于其各自的组件血液流动层和组件过滤层之间。如所说明的，组件膜410、420和430彼此分离。在供选择的实施方案中，组件膜410、420和430可以是单张膜的部分。
[0115]如所显示的，膜和其组件具有暴露于血液流动层200的顶面，和暴露于过滤层300的底面。
[0116]在某些实施方案中，膜及其组件是半渗透的。优选地，膜的孔径比细胞直径小，使得细胞不能穿过(即，对动物细胞具有低渗透性)，而低分子量的营养物和流体可以穿过(即，对营养物具有高渗透性)。细胞大小不同，但是一般地为微米级。在某些实施方案中，膜由血液相容性材料制成。优选地，平均膜孔径为亚微米级，以确保有效地筛选细胞。半渗透膜包括大量不同的膜类型和形态，其可以分类如下:(1)由在密集的聚合物基质中的圆柱形通孔组成的径迹蚀刻膜，其通常通过离子蚀刻制成；或(2)纤维膜，其通过聚合物纤维的各种沉积技术制成。虽然这些膜不具有明确限定的孔拓扑图，但制备方法被充分限定，以使纤维膜具有具体的分子量界限。径迹蚀刻型膜是优选的，因为他们限制了在一个维度上的流体运动。优选地，流体运动是在垂直方向上的。纤维膜允许在横向上和垂直地流体运动。
[0117]可以采用任意合适的方法来提供合适的多孔膜，所述方法包括本领域已知的那些和在所引用的美国专利和专利申请(如第6，942，879号、第6，455，311号美国专利，和第20060136182 号、第 20`050238687 号、第 20050202557 号、第 20030003575 号、第 20020182241号美国专利申请)以及其他参考文献中描述的那些。
[0118]B.包括拓扑表面和FSS区域的生物人工亨利袢刺激肾细胞生长模式更接近地模拟体内系统
[0119]1.一般结构
[0120]亨利袢的一个基本功能是产生高浓度的尿素、盐和其它溶质。根据本发明的一个说明性实施方案模拟亨利袢的功能的生物人工袢描绘于图11中。显示于图11中(还作为组装装置的部分描绘于图10中)的说明性的生物人工亨利袢包括大体上U-形的微流体通道，所述微流体通道具有在相应的过滤层310中形成的降支18和升支20以将滤液流从滤液入口 130携带通过出口 132。此外，生物人工袢10包括生物人工血管，所述生物人工血管也包括在相应的血液流动层210中形成的降支12和升支14以将血流从血液入口 110携带通过出口 112。位于支12和14的大部分之间的多孔介质16允许在血液流动层的两个支12和14之间扩散。如图12所示，两个支12和14之间的连通有助于血液流动层210的逆流系统在血液流动层210的微通道的尖端28处产生高浓度的血液。
[0121]在示例性的实施方案中，单一的生物人工血管与图13所示的大体上U-形的小管通过袢膜410偶联，以制备生物人工亨利袢10。[0122]如图11和13所示，根据说明性的实施方案，该生物人工亨利袢10在两个微制造层210和310上形成，所述两个微制造层210和310被可渗透水分和蛋白(多孔)的膜410隔开。如图12所示，肾小球滤液在一层(滤液层310)中循环，而血液在另一层(血液流动层210)中循环。
[0123]生物人工袢10，特别是在滤液层310中的大体上U-形的微通道，还可以如图14所示包括多个肾上皮细胞。降支18包括或内衬通常仅允许水分通过的细胞22。升支20内衬细胞24，所述细胞24将NaCl泵出小管或微通道且通常不允许水分通过。这些还一般地分别称为容水性(water-permissive)或可渗透水的细胞和泵盐细胞。根据一个特征，通过具有适当地可渗透的微通道壁将盐泵出升支小管并循环液流的行为产生逆流倍增器(countercurrent multiplier)。在这样的排列中，在u_形尖端26处的溶质浓度变得比在入口 130和出口 132处的浓度高得多。在特定的实施方案中，大体上U-形的微通道具有不同的深度或直径，其中微通道具有大体上圆柱形的形状。例如，升支20可以比降支18更厚。在一个示例性的实施方案中，升支20具有大体上圆柱形的形状和约60微米的直径，而降支18具有大体上圆柱形的形状和约12微米的直径。
[0124]认为在生物或天然亨利袢中的泵盐细胞通常不如在肾近端小管中发现的那些有功效。根据一个方法，选择在肾近端小管细胞的通常可接受的速率的10-90%下泵NaCl的细胞包括在生物人工袢10的升支20中。因此，它们在1.6xl0^6mmol/s/cm2或更高的速率下泵Na+。
[0125]2.在升支和降支内的拓扑表面和FSS
[0126]因此，根据一个说明性的实施方案，本发明的人工亨利袢结构包括具有升支和降支的微通道，其包括用于肾细胞生长的一个或多个拓扑表面。在一个非限定性的实例中，表面包括嵴/沟拓扑图。在特定的实施方案中，嵴和沟为约0.75 μ m宽和0.75 μ m深，具有约1.5 μ m的间距。技术人员将理解的是，本文描述的供选择的表面拓扑图可以在任一个支或两个支中构造，产生改变的或供选择的细胞图案。
[0127]在一些实施方案中，拓扑细胞生长表面涂覆有细胞外基质蛋白，如IV型胶原，所述细胞外基质蛋白吸附到包括例如十六烷硫醇分子的自组装单层(SAM)。随后将肾细胞(例如，HK-2细胞)接种到生长表面上，并且在一些实施方案中，细胞经受0.01 - 10.0达因/cm2的FSS。细胞可以在生长过程中、汇合后或在生长的过程中和在细胞汇合处两者暴露于FSS0另外地或供选择地，FSS可以连续地或周期性地施加到细胞。在一些实施方案中，采用
0.02-1.0达因/cm2的FSS。在再其它的实施方案中，使用约0.01,0.02,0.05,0.07,0.09、
0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、
7.0,8.0,9.0或10.0达因/cm2的FSS。在一些实施方案中，FSS速率在细胞生长过程中改变/波动，以实现希望的细胞对齐、细胞图案和/或其它希望的细胞特性(例如，改变的紧密连接蛋白的表达、细胞外基质蛋白、希望的细胞功能等)。如本领域已知的，肾单位的不同区域(例如，亨利袢、集合小管和远端小管的不同区域)经历不同的剪切应力。因此，生物人工肾可以被配置成将任何给定的区域中的细胞暴露于经历具体的FSS或FSS系列，或FSS循环。
[0128]如实施例1所示，与在没有FSS的空白的、非结构化的表面上生长的细胞相比，在这样的条件下(即，在拓扑基底和在FSS下)的肾细胞生长在低至0.02达因/cm2和高至1.0达因/cm2的剪切应力下产生具有增强的对齐、粘附特性和/或紧密连接特性的细胞。通过本技术的方法生长的细胞更加接近地模拟在体内环境中发现的那些，并且因此比在“标准”条件下(例如，在平坦的或非结构化的表面上并且在没有FSS的条件下)生长的细胞更优越地用于生物人工装置，如人工肾单位或其部分。
[0129]在以上例示的生物人工亨利袢中，升支将内衬在约1.6xl(Tmmol/s/cm2下主动运输Na+并阻断其它运输的细胞，并且降支将内衬允许运输水分并阻断或基本上阻断大部分(如果不是全部)其它种类(包括蛋白和滤液中的其它分子)的运输的细胞。由于细胞将在拓扑表面上生长并暴露于FSS，因此预期细胞图案、粘附和/或紧密连接性质将不仅在细胞水平上影响生物人工装置的整体结构(参见例如，实施例1)，而且还将影响装置的功能。基于与其他细胞的邻近度并且暴露于FSS，将促进细胞更加像其体内对应物发挥作用。因此，细胞功能将更加接近地模拟体内细胞功能。
[0130]如以上所述，相似的拓扑特征可以设计在远端小管和集合管中，并且在这些结构中的肾细胞可以同样地暴露于FSS以刺激希望的图案。
实施例
[0131]提供了以下实施例以更加完整地说明本技术的各种实施方案。这些实施例决不应被解释为限制本发明的范围。
[0132]实施例1-流体剪切应力增强细胞与拓扑图案的对齐
[0133]A.仿生流动装置
[0134]构建了包括嵴/沟特征的本技术的仿生流动装置。流动装置的结构显示在图15A-D中。流动装置包括流体通道的阵列以控制流体剪切应力(FSS)和具有控制的表面特性的细胞基底。拆卸的(图15B)和组装的(图15C)装置包括两层:微模塑通道和在拓扑上图案化的基底，所述基底使用E CM蛋白处理以提示细胞粘附和功能。装置的横截面说明了在微流体通道内并粘附于拓扑基底的肾小管细胞的汇合层(图15D)。在通道内并粘附到ECM涂布的区域的细胞的相衬图像(图15E)。
[0135]将拓扑特征从镍合金模具热压到聚苯乙烯基底(分别为图16A和B)。聚苯乙烯基底的边缘轮廓显示了限定的嵴/沟特征(图16C)。嵴和沟为0.75 μ m宽和0.75 μ m深，具有
1.5 μ m的间距(比例尺，I μ m)。
[0136]B.流动i秀导的剪切应力表征
[0137]流动装置的表征表明通道设计会向细胞粘附区域提供已知的和均匀的FSS。使用COMSOL Multiphysics软件的计算模型模拟预测在细胞粘附区域和大部分基底表面区域上方的均匀的剪切应力(数据未显示)。COMSOL模拟预测穿过细胞粘附区域和大部分基底表面区域的均匀的剪切应力。剪切应力分布显示了在通道的入口和出口处的更高的剪切应力，所述更高的剪切应力在包括圆形细胞粘附区域的大部分通道中快速发展为均匀的剪切应力(数据未显示)。穿过腔室底板在距离入口 12.5mm处作剪切应力轮廓图，并且该图表明，穿过通道的宽度，剪切应力改变小于5% (数据未显示)。
[0138]C.细胞粘附区域
[0139]细胞粘附区域包括吸附到十六烷硫醇分子的自组装单层膜(SAM)的IV型胶原蛋白。简言之，2.5mm直径的圆形聚二甲基硅氧烷(PDMS)压模的表面使用ImM的十六烷硫醇溶液(HDT的200标准乙醇(200prOOfethanOl)溶液)涂饰。将溶液压模到拓扑表面(基底)上并稳固地保持30秒。30秒之后释放压模。然后，使用2mM PEG(在200标准乙醇中)回浸表面2小时。通过抽吸去除PEG溶液，并使用乙醇彻底漂洗表面。然后，在室温下在30μ8/ml IV型胶原溶液(在PBS中)中孵育基底3小时。通过抽吸去除胶原溶液，并使用PBS彻底漂洗基底。
[0140]SAM提供了一个示例性的模型化学，所述模型化学提供了细胞外基质(ECM)蛋白的一致的和可表征的吸附，产生对粘附细胞的可重复的基于ECM的信号。SAM还使通过微接触印刷(μ CP)对表面的化学图案化成为可能，其允许在诸如多表型共培养和细胞形态影响等的应用中选择性放置细胞。如通过SEM所检查到的，IV型胶原涂层覆盖嵴的顶部以及沟内的表面两者(数据未显示)。拓扑图案化和μ CP的组合允许物理和化学图案两者的不同控制以根据使用者指定的配置提示细胞。
[0141]如下将人肾近端小管上皮细胞(ΗΚ-2细胞；ATCC CRL-2190)接种在装置的功能化的嵴/沟表面上并生长至汇合。将细胞悬液溶液(包含培养基和HK-2)置于包含拓扑和化学图案化的基底的陪替氏培养皿中以使初始接种密度为300个细胞/mm2。培养基是补充了 0.5%FBS、10ng/mLhEGF、5 μ g/mL 胰岛素、0.5 μ g/mL 氢化可的松、0.5 μ g/mL 肾上腺素、
6.5ng/mL三碘甲状腺原氨酸、10 μ g/mL转铁蛋白、100U/ml青霉素和100 μ g/mL链霉素的DMEM/F12基础培养基。将细胞置于37°C和5%C02的孵育器中。每隔一天更新培养基。细胞在3-4天内达到汇合。 然后，在与如以上描述的相同的条件下，将细胞暴露于0、0.02或
1.0达因/cm2FSS下2小时。
[0142]P.结果
[0143]结果显示在图17中。在结构化的基底上的细胞显示与沟对齐，而在空白的基底上的细胞则没有(图17A ;箭头表明在拓扑基底上的沟的方向)。由于沟和FSS的存在，在10°内与沟对齐的细胞核的百分比显著增加(图17B)。关于图12B:前三个条代表在空白(非结构化的)基底上生长并暴露于0、0.02或1.0达因/Cm2FSS的细胞。后三个条代表在结构化的基底上生长并暴露于0、0.02或1.0达因/Cm2FSS的细胞。I达因/cm2FSS的存在显著增加了粘附到拓扑基底上的细胞的核的对齐。在0.02达因/Cm2FSS下也观察到了实质性改
进。数据表示为平均值土标准偏差。*，P〈0.001与空白相对，τ =0样品，t，P〈0.005与拓
扑相对，τ=0基底。(比例尺，30 μ m)。
[0144]剪切应力和拓扑图两者均影响HK-2细胞中紧密连接(“TJ”)的形成。TJ形成的强度通过在FSS条件下定量在空白和拓扑基底上的细胞周长周围的ZO-1强度来测量。对ZO-1进行如下可视化。使用0.5%Triton X-100的PBS溶液渗透化细胞，接着使用1%BSA在室温下封闭30分钟。将细胞与第一抗体(Z0-1594, Invitrogen)—起在室温下孵育I小时。采用PBS清洗细胞三次并与第二抗体(山羊抗小鼠IgG, Alexa Fluor488, Invitrogen)—起在室温下孵育I小时。采用PBS洗涤细胞三次并将盖玻片固定在具有ProLong Gold plusDAPI (InvitiOgen)的载玻片上并且在显微分析之前允许固化过夜。图像分析包括使用常规计算机成像程序测量ZO-1标记的强度以测定ZO-1的荧光强度。对于细胞的所有边界定量强度并且也定量连接的连续性。
[0145]结果显示在图18和19中，图18A和B显示了在空白和拓扑基底上培养并暴露于
0、0.02或1.0达因/Cm2FSS的细胞的ZO-1表达的代表性图像。随着拓扑图和FSS刺激物的添加，ZO-1边缘的形态从间断过渡到连续的。箭头表明了嵴/沟拓扑图的方向。图19A显示了沿细胞周长整合并通过细胞周长、定量的紧密连接表达和分布归一化的ZO-1强度。与那些在空白表面上培养的细胞相比，在拓扑基底上培养的细胞的ZO-1强度显著增加。与暴露于τ =0条件的拓扑基底上的细胞相比，在拓扑基底上的暴露于所有水平的FSS的细胞显示ZO-1强度显著增加。图19C显示了沿细胞周长测量的ZO-1强度的标准偏差并定量了紧密连接的连续性。与在空白表面上的细胞相比，所有拓扑样品的ZO-1强度的标准偏差降低并且对暴露于拓扑基底和FSS两者的细胞群体来说最低。在两个小时的FSS之后，在空白表面上的细胞群体不存在ZO-1强度差异。数据表示为平均值土标准偏差。*，Ρ〈0.05与空白相对，τ=0样品；#，P〈0.001与空白相对，τ=0样品；卞，P〈0.001与拓扑相对，τ =0样品。(比例尺，15 μ m)。
[0146]当施加拓扑图和FSS时，如通过Z0-1TJ所定义的细胞周长过渡到具有更多的荧光信号的更高强度。全部的荧光信号以及荧光信号的位置表明了升高的ZO-1表达和细胞周长的迁移。在细胞周长周围的ZO-1强度的标准偏差充当TJ连续性的可量化的度量标准。更低的标准偏差转换为更加连续的ZO-1周长。如通过ZO-1强度标准偏差所测量的，伴随拓扑图和FSS的施加，细胞周长从更加间断的形态过渡到连续的形态。总之，TJ强度和连续性的升高表明使用拓扑基底和FSS暴露生长的细胞向质量屏障功能前进，并向小管特异性功能移动。在拓扑基底上细胞对FSS响应的增强表明这两种物理刺激物的协同影响。通过仿生流动装置提示的 细胞很可能是稳定的以形成具有肾近端小管的自然过滤行为的发育良好的、高度功能化的上皮层，所述仿生流动装置显示ZO-1标记的TJ的高的和连续的强度。
【权利要求】
1.一种生物人工肾，其包括: 微流体流动通道，其包括至少一个拓扑表面； 与流动通道流体连通的入口，用于允许流体流入所述流动通道；和 接种在所述拓扑表面上的肾细胞；其中 选择所述流动通道的表面的拓扑图，以使所述肾细胞形成置于所述表面以上的细胞层，以实现通过至少一个表面的拓扑图至少部分地确定的排列、行为或形态。
2.根据权利要求1所述的生物人工肾，其中选择所述表面的拓扑图以促进细胞层中的细胞与至少一个表面的粘附增加。
3.根据权利要求1所述的生物人工肾，还包括流体源，用于使流体经由入口流动通过流动通道，其中所述流体诱导在细胞层上的剪切应力。
4.根据权利要求3所 述的生物人工肾，其中所述流动通道形成为一种或多种结构的部分，所述结构选自亨利袢、集合小管和远端小管。
5.根据权利要求3所述的生物人工肾，其中所述流体源配置成使流体以一定流速流动，所述流速在生物人工肾的至少一个区域中产生在细胞层上的一定水平的剪切应力，所述剪切应力的水平小于或等于约10.0达因/Cm2。
6.根据权利要求3所述的生物人工肾，其中所述流体源配置成使流体以一定流速流动，所述流速在生物人工肾的至少一个区域中产生在细胞层上的一定水平的剪切应力，所述剪切应力的水平小于或等于约1.0达因/Cm2。
7.根据权利要求3所述的生物人工肾，其中所述流体源配置成使流体以一定流速流动，所述流速在生物人工肾的至少一个区域中产生在细胞层上的一定水平的剪切应力，所述剪切应力的水平小于或等于约0.1达因/cm2。
8.根据权利要求3所述的生物人工肾，其中所述流体源配置成使流体以一定流速流动，所述流速在生物人工肾的至少一个区域中产生在细胞层上的一定水平的剪切应力，所述剪切应力的水平为约0.02达因/cm2。
9.根据权利要求3所述的生物人工肾，其中所述流体通道如此配置，使得流体在生物人工肾的第一区域以第一流速流动，并且在生物人工肾的第二区域以第二流速流动。
10.根据权利要求9所述的生物人工肾，其中所述第一流速产生在第一区域中的细胞层上的第一水平的剪切应力，并且其中所述第二流速产生在第二区域中的细胞层上的第二水平的剪切应力，并且其中所述第一和第二水平的剪切应力是不同的。
11.根据权利要求9所述的生物人工肾，其中所述生物人工肾包括亨利袢，所述亨利袢包括升支和降支，并且其中第一区域是所述亨利袢的升支，而第二区域是所述亨利袢的降支。
12.根据权利要求9所述的生物人工肾，其中所述生物人工肾包括集合管、远端小管和予利祥，所述予利祥包括升支和降支，其中弟一区域在予利祥中，而弟二区域在集合管和远端小管中的一个或多个中。
13.根据权利要求1所述的生物人工肾，其包括第一和第二表面，其中所述流动通道的第一表面具有第一拓扑图，并且其中所述流动通道的第二表面具有第二拓扑图。
14.根据权利要求13所述的生物人工肾，其中所述生物人工肾包括亨利袢，所述亨利袢包括升支和降支，其中所述第一表面在亨利袢的升支中，并且其中所述第二表面在亨利袢的降支中。
15.根据权利要求13所述的生物人工肾，其中所述生物人工肾包括集合管、远端小管和亨利袢，所述亨利袢包括升支和降支，其中第一表面在亨利袢中，并且其中第二表面在集合管和远端小管中的一个或多个中。
16.根据权利要求13所述的生物人工肾，其包括在第一和第二表面之间的过渡拓扑表面。
17.根据权利要求13所述的生物人工肾，其中所述第一表面的拓扑图包括具有第一间距的嵴，并且所述第二表面的拓扑图包括具有第二间距的嵴。
18.根据权利要求13所述的生物人工肾，其中所述第一表面的拓扑图包括在相对于流体流动的第一方向上的嵴，并且所述第二表面的拓扑图包括在相对于流体流动的第二方向上的嵴。
19.根据权利要求13所述的生物人工肾，其中所述第一拓扑图包括嵴，而第二拓扑图包括凹陷和柱家族中的一种或多种拓扑图。
20.根据权利要求1所述的生物人工肾，其中所述表面的拓扑图包括嵴，所述嵴的宽度为约5 μ m或更小。
21.根据权利要求1所述的生物人工肾，其包括置于基底的一部分上的亲细胞性物质，用于在基底的所述部分中生长细胞层，并且其中基底的所述部分形成流动通道的表面。
22.根据权利要求21所述的生物人工肾，其中所述亲细胞性物质包括胶原蛋白。
23.根据权利要求1所 述的生物人工肾，其中所述表面拓扑图使得细胞层的排列、行为或形态复制肾中的细胞的排列、行为或形态。
24.根据权利要求1所述的生物人工肾，还包括至少第二流动通道，所述第二流动通道具有至少一个第二流动通道的表面，所述第二流动通道的表面具有在其中形成的拓扑图。
25.根据权利要求24所述的生物人工肾，其中所述第一流动通道与所述第二流动通道被膜隔开。
26.根据权利要求24所述的生物人工肾，其中所述第一流动通道接种有肾上皮细胞。
27.根据权利要求24所述的生物人工肾，其中所述第二流动通道接种有血管上皮细胞。
28.根据权利要求24所述的生物人工肾，其中所述第一流动通道包括血液流动层，并且所述第二流动通道包括滤液层。
29.根据权利要求24所述的生物人工肾，其中所述第一通道的至少一个表面包括与所述第二通道中的相应表面不同的表面拓扑图。
30.根据权利要求29所述的生物人工肾，其中所述第一通道中的表面拓扑图包括与所述第二通道中的表面拓扑图不同的间距或形状。
31.根据权利要求24所述的生物人工肾，还包括用于使流体流动通过第一流动通道和第二流动通道的第一流体源，其中所述流体诱导第一通道中的细胞层上的第一剪切应力和第二通道中的细胞层上的第二剪切应力。
32.根据权利要求31所述的生物人工肾，其中所述第一剪切应力与所述第二剪切应力不同。
33.根据权利要求1所述的生物人工肾，其中所述肾细胞包括一种或多种细胞类型，所述细胞类型选自近端小管细胞、肾近端小管上皮细胞、Madin-Darby犬肾细胞、原代内髓集合管细胞、原代近端小管细胞、胚胎干细`胞、成体干细胞、诱导多能干细胞和内皮细胞。
【文档编号】C12M3/00GK103764190SQ201280037209
【公开日】2014年4月30日 申请日期:2012年6月15日 优先权日:2011年6月15日
【发明者】约瑟夫·L·查莱斯特, 埃尔斯·弗罗利希, 杰弗里·T·伯恩斯坦 申请人:查尔斯斯塔克布料实验室公司