生物活性肾细胞的制作方法

专利名称：生物活性肾细胞的制作方法
技术领域：
本发明涉及与健康个体相比较缺乏细胞组分但仍然保持治疗性质的生物活性肾细胞群体或级分，和分离和培养所述细胞群体的方法，以及利用所述细胞群体治疗有此需要的受试者的方法。此外，本发明涉及使用生物活性肾细胞群体给自体肾(native kidney)提供再生作用的方法。
背景技术：
慢性肾病(CKD)在美国影响超过1900万人并且通常为牵涉肥胖症、糖尿病和高血压的代谢病症的结果。数据调查显示增加率归因于继发于也在世界范围正在上升的两种疾病高血压和非胰岛素依赖型糖尿病(NIDDM)的肾衰竭的发展(UnitedStates Renal Data System:Costs of CKD and ESRD.ed.Bethesdaj MD，NationalInstitutes of Health, National Institute of Diabetes and Digestive and KidneyDiseases, 2007pp223_238)。已显示肥胖症、高血压和血糖控制不良全都为肾损害的独立风险因子，引起肾小球和肾小管损害以及导致蛋白尿和肾滤过功能的其它全身性可检测的改变(Aboushwareb,等人，World J Urol, 26:295-300, 2008 ；Amann, K.等人，Nephrol DialTransplant, 13:1958-66，1998)。通过生活方式的改变和目的在于控制潜在疾病状态的药物介入管理进展的1-3期的CKD患者，然而通过透析和通常包括抗高血压药、红细胞生成刺激剂(ESA)、铁和维生素D补充的给药方案来管理分期4-5的患者。再生医学技术可提供CKD的下一代治疗选择。Presnell等人W0/2010/056328描述了分离的肾细胞，包括肾小管细胞和红细胞生成素(EPO)生成肾细胞群体，和分离和培养所述细胞的方法，以及利用所述细胞群体治疗有此需要的受试者的方法。存在对提供肾功能的显著和持久的增强以减缓进展和提高该患者群体的生活质量的新型治疗模式的需要。发明概述在一个方面，本发明提供了用于给自体肾提供再生作用的方法。在一个实施方案中，该方法包括将自体肾与由富集的肾细胞群分泌产物体内接触的步骤。在另一个实施方案中，由不为构建体的部分的富集的肾细胞群体分泌产物，如本文中所描述的，例如，不将细胞群体接种在支架上。在一个其它实施方案中，从包含直接接种在支架上或支架中的富集的肾细胞群体的肾细胞构建体分泌产物。在另一个实施方案中，产物的分泌是对氧水平的生物响应。可通过低于大气氧水平来诱导分泌。在一个其它实施方案中，较低的氧水平低于约5%的氧。在一个实施方案中，再生作用为上皮细胞-间质细胞转化(epitheIial-mesenchymal transition ) (EMT)的减少。EMT 的减少可通过减弱 TGF-β 信号转导和/或减弱纤溶酶原激活物抑制剂-1 (PA1-1)信号转导来实现。在另一个实施方案中，再生作用为肾脏纤维化的减少和/功肾炎的减轻。在一些实施方案中，炎症的减轻可通过NF K B介导。在一个其它实施方案中，再生作用的特征在于自体肾中干细胞标志物的差异表达。表达可以为相对于非接触的自体肾中的表达体内接触的自体肾中的标志物表达的上调。
在一个方面，富集的肾细胞群体包括一个或多个细胞群体，即混合物，如上文中所描述的。在一个实施方案中，群体包括第一细胞群体B2，其包含富集的肾小管细胞群体。在另一个实施方案中，群体包括具有第一细胞群体B2和第二细胞群体的人肾细胞的混合物，所述第二细胞群体包含一种或多种红细胞生成素(EPO)生成细胞、肾小球细胞和血管细胞。在一个其它实施方案中，所述第二细胞群体为B4细胞群体。在另一个实施方案中，所述第二细胞群体为B3细胞群体。
在一个实施方案中，混合物还包括具有一种或多种红细胞生成素(EPO)生成细胞、肾小球细胞和血管细胞的第三细胞群体。在另一个实施方案中，所述第三细胞群体为B4细胞群体。在一个其它实施方案中，所述第三细胞群体为B3细胞群体。
在所有实施方案中，B2细胞群体具有约1.045g/mL至约1.052g/mL的密度。在所有实施方案中，B4细胞群体具有约1.063g/mL至约1.091g/mL的密度。在所有实施方案中，B3细胞群体具有约1.052g/ml至约1.063g/ml的密度。
在所有实施方案中，富集的肾细胞群体对于自体肾可以是非自体的。所有实施方案中，富集的肾细胞群体对于自体肾可以是非自体的。
在所有实施方案中，产物包括旁分泌因子、内分泌因子、邻分泌因子、RNA、囊泡、微囊泡、外来体及其任意组合。在一个其它实施方案中，囊泡包括一种或多种选自旁分泌因子、内分泌因子、邻分泌因子和RNA的分泌产物。在另一个实施方案中，产物分泌自包含直接接种在支架上或支架中的富集的肾细胞群体的肾细胞构建体。
在所有实施方案中，支架可包含生物相容性材料。在所有实施方案中，生物相容性材料可以为水凝胶。
在一个实施方案中，本发明提供了评估肾病(KD)患者是否响应于利用治疗剂的治疗。该方法可包括测定或检测与对照样品中囊泡的量相比较或相对于其的从利用治疗剂治疗的KD患者获得的测试样品中囊泡或它们腔内容物的量的步骤，其中与对照样品中囊泡或其腔内容物的量相比较测试样品中囊泡或其腔内容物的更高或更低的量表示被治疗的患者对利用治疗剂的治疗的响应。囊泡可以是肾来源的囊泡。测试样品可包含尿。囊泡可包含生物标志物，其可以为miRNA。治疗剂可包含富集的肾细胞群体。
附图简述


图1显示使用多层不连续梯度技术(A-左图)或单层混合梯度技术(B-右图)从新鲜分离的肾组织富集 红细胞生成素生成细胞级分。两种方法都导致非红细胞生成素生成细胞组分(主要地肾小管细胞)从红细胞生成素带的部分消耗，其表现为1.025g/mL至1.035g/mL。
图2显示了单独地收获和并行地用于相同的不连续梯度的“含氧量正常的”(21%的氧)和“缺氧”(2%的氧)啮齿类动物培养物的不连续梯度。
图3显示单独收获并且并行地用于相同的不连续梯度的“含氧量正常的”(21%的氧)和“缺氧”(2%的氧)犬培养物的不连续梯度。
图4显示HK17和HK19样品的组织病理学特征。
图5显示人NKA细胞中确定目标区域(ROI)的白蛋白转运的高含量分析(HCA)。
图6显示来源于非CKD和CKD肾的NKA细胞的白蛋白转运的定量比较。
图7描述了富集了肾小管细胞的B2亚级分与消耗了肾小管细胞的B4亚级分之间的标志物表达的比较分析。图8描述了富集了肾小管细胞的B2亚级分与消耗了肾小管细胞的B4亚级分之间的比较功能分析。图9显示在5/6NX大鼠的处理后S0X2mRNA在宿主组织中的表达。图10为显示CD24、CD133、UTFl、S0X2、NODAL和LEFTY的表达的时间过程的蛋白质印迹。图11描述了再生响应指数(RRI)的时间过程。图12提供了 UNFX-条件培养基的制备和分析的示意图。图13A-C显示来自UNFX培养物的条件培养基体外影响多个细胞过程，所述细胞过程潜在地与再生结果相关。图13A显示UNFX-条件培养基减弱TNF-a介导的NF_kB的激活。图13B显示UNFX-条件培养基增强HUVEC细胞培养物的促血管生成行为。图13C显示UNFX-条件培养基减弱上皮细胞的纤维化途径。图13D描述了由TGFii I和纤溶酶原激活物抑制剂-1 (PA1-1)建立的正反馈环。

图14A-B显示证明系膜细胞的纤维化途径的减弱的蛋白质印迹分析。图15A-C显示来自UNFX的条件培养基包含分泌的囊泡。图15A描述了分泌的囊泡，其为包括细胞质来源的内部组分(绿色)的双脂质(bilipid)结构(红色)。图15B-C显示FACS分选。图16A显不了其中制备总蛋白质并且测定其PA1-1和b肌动蛋白的蛋白质印迹。图 16B 描述了微小 RNA、miR-30b-5p。图17A-C显示在经历肾切除术后递送生物活性肾细胞后路易斯大鼠肾中的PA1-1的代表性免疫组织化学图像。图17D显示未处理的肾切除大鼠(红色正方形)、处理的肾切除大鼠(蓝色茭形)和对照动物(绿色三角形)的PA1-1表达的比较。图17E显示关于在处理后3和6个月采集的肾样品的代表性蛋白质印迹分析。图17F显示在NKA条件培养基的2小时暴露减少NF K B p65的核定位。图17G描述了 TNF α对NFkB途径的经典激活。图18Α-Β显示具有(A)由5/6肾切除术引起的进行性CKD和⑶由单侧肾切除术引起的非进行性肾功能不全的动物的NFkB ρ65亚单位的核定位。图18C-D显示(C)已经历5/6肾切除术的路易斯大鼠肾组织的提取物中NFkB ρ65的蛋白质印迹分析；和(D)关于提取物的电泳迁移位移测定(EMSA)。图18Ε显示从接受ΝΚΑ(图Α)或非生物活性肾细胞(图B)的肾内注射的具有确定的CKD的路易斯大鼠获得的组织的NF K B ρ65亚单位的免疫组织化学检测。图19A-C显示在植入后第I周和第4周生物材料的体内评估。图20A-D显示NKA构建体的活细胞/死细胞染色。图20E-G显示NKA构建体的转录组学图谱表征。图21Α-Β显示NKA构建体的分泌蛋白质组学图谱表征(secretomic profiling)。图22A-B显示NKA构建体的蛋白质组学图谱表征。图23A-C显示NKA构建体的共聚焦显微镜检查。图24A-B显示在植入后I周和4周NKA构建体的体内评估。图25A-D显示在植入后8周NKA构建体的体内评估。图26显示来自NKA构建体的条件培养基在体外减弱HK2细胞的TGF-β诱导的EMT。图27描述了在处理过程中用于将细胞暴露于低氧的方法。图28显示在暴露于2%的氧后，观察到下列现象:改变细胞在整个密度梯度上的分布，提高总梯度后产率(overall post-gradient yield)。图29A描述了经开发用以观察肾小管单层的体外修复的测定。图29B显示定量图像分析(BD Pathway855BioImager)的结果。图29C显示利用2%的氧诱导的细胞更精于肾小管上皮单层的修复。图30A描述了经开发用以观察肾小管单层体的体外修复的测定。图30B显示利用2%的氧诱导的细胞与未诱导的(21%的氧)细胞相比较增强迁移和伤口修复。图30C将迁移细胞的百分比对迁移时间作图。图3IA显示骨桥蛋白由肾小管细胞分泌并且响应损害而被上调(骨桥蛋白免疫细胞化学:赫斯特核染色(蓝色)、骨桥蛋白(红色)，IOx)。骨桥蛋白在建立的肾小管细胞单层中因损害而被上调，如通过免疫荧光(图31A)和ELISA(图31B)显示的。图32A显示细胞的迁移响应由骨桥蛋白部分介导(绿色=迁移细胞(5x))。图32B显示针对骨桥蛋白的中和抗体(NAb)减小肾细胞迁移响应50%。

图33显示细胞的低氧诱导调节组织重构基因的表达。图34描述了导致肾脏再生的细胞生物活性的低氧增强的假定机制。图35显示通过蛋白质印迹进行的微囊泡的检测。发明详述本发明涉及生物活性肾细胞(BRC)的异源混合物或级分，和分离和培养所述细胞的方法，以及利用BRC和/或从本文中描述的利用BRC接种的支架形成的含BRC的构建体治疗有此需要的受试者的方法。生物活性肾细胞可以为分离的肾细胞，包括肾小管细胞和红细胞生成素(EPO)生成肾细胞。BRC细胞群体可包括富集的肾小管和EPO生成细胞群体。BRC可来源于健康个体的肾细胞部分或它们本身为健康个体的肾细胞级分。此外，本发明提供了从不健康个体获得的肾细胞级分，所述不健康个体，当与健康个体的相应肾细胞级分相比较时可以缺少某些细胞组分，但仍然保持治疗性质。本发明还提供了与健康个体相比较缺少细胞组分的治疗活性细胞群体，在一个实施方案中，可从处于各种疾病状态的自体来源分离和扩增所述细胞群体。本发明还涉及通过将自体肾与由肾细胞分泌产物体内接触给自体肾提供再生作用的方法，以及制备所述分泌产物的方法。本发明还涉及标志物在利用本文中描述的方法进行治疗后测定肾再生的存在的用途。

定义除非另外定义，否则本文中使用的技术和科学术语具有与由本发明所属领域内的技术人员通常理解的含义相同的含义。Principles of TissueEnRineerinR,第3版(由RLanza, R Langer, &J Vacanti编著),2007为本领域技术人员提供了本申请中使用的许多术语的一般指导。本领域技术人员将意识到与本文中描述的方法和材料类似或等同的许多方法和材料，所述方法和材料可用于本发明的实施。事实上，本发明绝不限定于所述方法和材料。如本文中所用，术语“细胞群体”指通过从适当的组织来源，通常从哺乳动物直接分离获得的许多细胞。随后可在体外培养分离的细胞群体。本领域技术人将理解用于分离和培养用于本发明的细胞群体的各种方法和适用于本发明的细胞群体中的不同数目的细胞。细胞群体可以为来源于肾的未分级的异源细胞群体。例如，可从肾活检组织或从完整肾组织分离异源细胞群体。可选择地，异源细胞群体可来源于从肾活检组织或完整肾组织建立的哺乳动物细胞的体外培养物。未分级的异源细胞群体还可称为非富集的细胞群体。
术语“自体肾”意指活受试者的肾。受试者可以是健康的或不健康的。不健康的受试者可具有肾病。
术语“再生作用”意指给自体肾提供益处的作用。所述作用可包括但不限于对自体肾的损害程度的减轻或自体肾功能的恢复或稳定化的提高。肾损害可以为纤维化、炎症、肾小球肥大(glomerular hypertrophy)等形式,并且与受试者的肾病相关。
如本文中所用，术语“混合物”是指两种或更多种来源于未分级的异源细胞群体的分离的富级的细胞群体的组合。根据某些实施方案，本发明的细胞群体为肾细胞群体。
“富集的”细胞群体或制剂是指来源于起始肾细胞群体(例如，未分级的异源细胞群体)的细胞群体，其包含比起始群体中特定细胞类型的百分比更大的百分比的该细胞类型。例如，可富集起始肾细胞群体的第一、第二、第三、第四、第五等目标细胞群体。如本文中所用，术语“细胞群体”、“细胞制剂”和“细胞原型”可互换使用。
在一个方面，如本文中所用，术语“富集的”细胞群体是指来源于起始肾细胞群体的细胞群体(例如，来自肾活检组织或培养的哺乳动物肾细胞的细胞悬浮物)，其可包含比起始群体中能够生成EPO的细胞的百分比更大的百分比的能够生成EPO的细胞。例如，术语“B4”为来源于起始肾细胞群体的细胞群体，其包含与起始群体相比较更大百分比的EPO生成细胞、肾小球细胞和血管细胞。本发明的细胞群体可富集一种或多种细胞类型以及消耗其中的一种或多种其它细胞类型。例如，富集的EPO生成细胞群体可富集间质成纤维细胞，以及消耗肾小管细胞和集合管上皮细胞，相对于非富集的细胞群体即所述富集的细胞群体所源自的起始细胞群体中的间质成纤维细胞和肾小管细胞。在所有引用富集EPO或“B4”群体的实施方案中，富集的细胞群体为包含可以以氧调节的方式生成ΕΡ0(如通过来自内源自体EPO基因的氧可调节的EPO表达所显示的)的细胞的异源细胞群体。
在另一个方面，包含比起始群体中特定细胞类型例如血管细胞、肾小球细胞或内分泌细胞的百分比更大的百分比的该细胞类型的富集的细胞群体，与来源于健康个体或受试者的起始肾细胞群体相比较，也可缺少或缺乏一种或多种特定细胞类型，例如血管细胞、肾小球细胞或内分泌细胞。例如，术语“B4’ ”或B4prime”,在一个方面,与健康个体相比较，为来源于起始肾细胞群体的缺少或缺乏一种或多种细胞类型例如血管细胞、肾小球细胞或内分泌细胞(取决于起始样品的疾病状态)的细胞群体。在一个实施方案中，B4’细胞群体来源于患有慢性肾病的受试者。在一个实施方案中，B4’细胞群体来源于患有局灶性节段性肾小球硬化症(focal segmental glomerulosclerosis) (FSGS)的受试者。在另一个实施方案中，B4’细胞群体来源于患有自身免疫肾小球肾炎的受试者。在另一个方面，B4’为来源于包括所有细胞类型例如血管 细胞、肾小球细胞或内分泌细胞的起始细胞群体(所述起始细胞群体后来被消耗一种或多种细胞类型例如血管细胞、肾小球细胞或内分泌细胞或使得缺乏所述细胞类型)的细胞群体。在另一个方面，B4’为来源于包括所有细胞类型例如血管细胞、肾小球细胞或内分泌细胞的起始细胞群体(其中后来富集一种或多种特定细胞类型例如血管细胞、肾小管细胞或内分泌细胞)的细胞群体。例如，在一个实施方案中，B4’细胞群体可富集血管细胞，但消耗肾小球细胞和/或内分泌细胞。在另一个实施方案中，B4’细胞群体可富集肾小球细胞但消耗血管细胞和/或内分泌细胞。在另一个实施方案中，B4’细胞群体可富集内分泌细胞但消耗血管和/或肾小球细胞。在另一个实施方案中，B4’细胞群体可富集血管细胞和内分泌细胞但消耗肾小球细胞。在优选实施方案中，单独的或与另一种富集的细胞群体(例如B2和/或83)混合的B4’细胞群体保留治疗性质。例如在本文实施例例如实施例7-9中描述了 B4’细胞群体。在另一个方面，富集的细胞群体还可指来源于上文论述的起始肾细胞群体的细胞群体，所述细胞群体包含大于起始群体中表达一种或多种肾小管细胞标志物的细胞的百分比的百分比的表达一种或多种肾小管细胞标志物的细胞。例如，术语“B2”是指来源于起始肾细胞群体的细胞群体，所述细胞群体包含与起始细胞群体相比较更大百分比的肾小管细胞。此外，针对表达一种或多种肾小管细胞标志物富集的细胞群体(或“B2”)可包含一些来自集合管系统的上皮细胞。虽然使针对表达一种或多种肾小管细胞标志物(或“B2”)的细胞富集的细胞群体相对消耗了 EPO生成细胞、肾小球细胞和血管细胞，但富集的群体可包含与起始群体相比较更小百分比的此类细胞(ΕΡ0生成细胞、肾小球细胞和血管细胞)。一般地，使异源细胞群体消耗一种或多种细胞类型，以便消耗的细胞群体包含相对于消耗前的异源细胞群体中包含的细胞类型的比例更小比例的细胞类型。可被消耗的细胞类型是任何类型的肾细胞。例如，在某些实施方案中，可消耗的细胞类型包括具有<约1.045g/ml的密度的集合管(collecting duct)和肾小管系统的具有大粒度的细胞(称为“BI”)。在某些其它实施方案中，可被消耗的细胞类型包括具有>约1.095g/ml的密度的具有低粒度和活力的碎片和小细胞(称为“B5”)。在一些实施方案中，消耗相对地富集肾小管细胞的细胞群体的所有下列细胞氧可调节的EPO表达细胞、肾小球细胞和血管细胞。如本文中所用，术 语“缺氧”培养条件是指其中将细胞在培养系统中经历相对于其中将细胞在大气氧水平(约21%)下培养的标准培养条件有效氧水平降低的培养条件。非缺氧条件在本文中是指正常或含氧量正常的培养条件。如本文中所用，术语“氧可调节的”的是指细胞基于细胞有效氧的量调节基因表达(上调或下调)的能力。“缺氧诱导型(Hypoxia-1nducible) ”是指响应于氧张力减小的基因表达的上调(无论是预诱导还是起始氧张力)。如本文中所用，术语“生物材料”是指适用于引入活组织的天然或合成的生物相容性材料。天然生物材料为由活系统产生的材料。合成生物材料为不由活系统产生的材料。本文中公开的生物材料可以为天然与合成生物相容性材料的组合。例如本文中所用，生物材料包括例如多聚体基质和支架。本领域技术人员将理解，生物材料可以构造为多种形式，例如液体水凝胶悬浮物、多孔泡沫，并且可包括一种或多种天然或合成的生物相容性材料。如本文中所用，术语“贫血”是指因受试者的EPO生成细胞不能生成充足的功能性EPO蛋白，和/或EPO蛋白至全身性循环的不充足释放，和/或骨髓中的幼红细胞不能响应EPO蛋白而引起的红细胞数目的不足和/或血红蛋白水平的降低。患有贫血的受试者不能维持红细胞的动态平衡(erythroid homeostasis)。一般地,贫血可因肾功能的下降或丧失(例如慢性肾衰竭)、与相对EPO缺乏相关的贫血、与充血性心力衰竭相关的贫血、与骨髓抑制疗法例如化学疗法或抗病毒疗法(例如，AZT)相关的贫血、与非骨髓性癌相关的贫血、与病毒感染例如HIV相关的贫血以及慢性疾病例如自身免疫疾病(例如，类风湿性关节炎)、肝病和多器官系统衰竭的贫血而发生。
术语“ΕΡ0缺乏”是指可利用红细胞生成素受体激动剂(例如，重组EPO或EPO类似物)治疗的任何病况或病症，包括贫血。
如本文中所用，术语“肾病”是指与急性或慢性肾衰竭的任何分期或程度相关的病症，其可导致肾进行血液过滤和从血液除去过量液体、电解质和废物的功能的能力丧失。肾病还包括内分泌功能异常例如贫血(红细胞生成素缺乏)和矿物质不平衡(维生素D缺乏)。肾病可始于肾或可继发于多种病况包括(但不限于)心力衰竭、高血压、糖尿病、自身免疫性疾病或肝病。肾病可以为在对肾的急性损害后发展的慢性肾衰竭的病况。例如，通过贫血和/或对毒物的暴露而产生的肾损害可引起急性肾衰竭；急性肾损害的不完全恢复可导致慢性肾衰竭的发展。
术语“治疗”是指对肾病、贫血、EPO缺乏、肾小管转运缺陷或肾小球滤过缺陷的治疗性治疗和预防性或防止措施，其中目的是逆转、预防或减缓(减轻)靶向的病症。需要治疗的人包括已患有肾病、贫血、EPO缺乏、肾小管转运缺陷或肾小球滤过缺陷的人以及易于患有肾病、贫血、EPO缺乏、肾小管转运缺陷或肾小球滤过缺陷的人，或将预防其肾病、贫血、EPO缺乏、肾小管转运缺陷或肾小球滤过缺陷的人。如本文中所用，术语“治疗”包括肾功能的稳定和/或提闻。
如本文中所用，术语“体内接触”是指由富集的肾细胞群体(或包含肾细胞/肾细胞级分的混合物或构建体) 分泌产物与自体肾之间的直接体内接触。直接体内接触可以为天然的旁分泌、内分泌或邻分泌。分泌产物可以为本文中描述的不同产物的异源群体。
如本文中所用，术语“核糖核酸”或“RNA”是指其中每一个单元由含氮碱基、核糖和磷酸组成的核苷酸单元的链。RNA可为单链或双链形式。RNA可以为囊泡内的部分或与囊泡结合。囊泡可以为外来体。RNA包括但不限于mRNA、rRNA、小RNA、snRNA、snoRNA、微小RNA (miRNA)、小干扰RNA (siRNA)和非编码RNA。RNA优选为人RNA。
术语“构建体”是指沉积在由一种或多种合成或天然存在的生物相容性材料组成的支架或基质的表面上或其内的一种或多种细胞群体。可用由一种或多种合成或天然存在的生物相容性聚合物、蛋白质或肽组成的生物材料包被一种或多种细胞群体，或可将所述细胞群体沉积在所述生物材料上，包埋在其中，粘着于其上，接种于其中，或捕获于其中。可在体外或体内将一种或多种细胞群体与生物材料或支架或基质组合。一般地，选择用于形成支架/生物材料的一种或多种生物相容性材料来指导、促进或允许沉积在其上的细胞群体的至少一种形成多细胞三维组织。用于生成构建体的一种或多种生物材料也可被选择用以指导、促进或允许构建体或构建体的细胞组分至内源宿主组织的分散和/或整合，或指导、促进或允许构建体或构建体的细胞组分存活、移植、耐受或功能性操作。
术语“标志物”或“生物标志物”通常指DNA、RNA、蛋白质、糖类或基于糖脂的分子标志物，其在培养的细胞群体中的表达或存在可通过标准方法(或本文中公开的方法)来检测，并且与一种或多种在培养的细胞群体中作为特定类型的细胞的细胞一致。标志物可以为由细胞表达的多肽或染色体上可辨认的物理位置例如基因、限制性核酸内切酶识别位点或由自体细胞表达的编码多肽的核酸(例如，mRNA)。标志物可以为称为“基因表达标志物”的基因的表达区域，或不具有已知编码功能的DNA的一些区段。生物标志物可为细胞来源的，例如分泌产物。可互换使用的术语“差异表达的基因”、“差异基因表达”及它们的同义词是指其表达在第一细胞或细胞群体中相对于其在第二细胞或细胞群体中的表达被激活至更高或更低的水平的基因。术语还包括其表达在第一或第二细胞培养传代过程中在随时间过去在不同阶段被激活至更高或更低水平的基因。还应理解，可在核酸水平或蛋白质水平上激活或抑制差异表达的基因，或可将所述基因经历选择性剪接以导致不同的多肽产物。此类差异可通过例如多肽的mRNA水平、表面表达、分泌或其它分布的改变来证实。差异基因表达可包括两个或更多个基因或它们的基因产物之间的表达的比较，或两个或更多个基因或它们的基因产物之间的表达的比率的比较，或甚至相同基因的两种差异加工的产物的比较，这在第一与第二细胞之间是不同的。差异表达包括例如第一细胞与第二细胞之间的基因或其表达产物的时间或细胞表达模式的定量及定性差异。为了本发明的目的，当给定的基因在第一细胞与第二细胞中的表达之间存在差异时，认为存在“差异基因表达”。在来自细胞群体、混合物或构建体的施用之前的患者的细胞(第一细胞)中相对于来自施用之后的患者的细胞(第二细胞)中的表达可存在标志物的差异表达。术语“抑制”、“下调”、“表达不足”和“减少”可互换使用并且意指编码一种或多种蛋白质或蛋白质亚单位的基因的表达或其RNA分子或等同RNA分子的水平或一种或多种蛋白质或蛋白质亚单位的活性相对于一个或多个对照，例如，一个或多个阳性和/或阴性对照降低。在来自施用细胞群体、混合物或构建体之前的患者的细胞中相对于来自施用后的患者的细胞可存在表达不足。术语“上调”或“过表达”用于指编码一种或多种蛋白质或蛋白质亚单位的基因的表达或其RNA分子或等同RNA分子的水平，或一种或多种蛋白质或蛋白质亚单位的活性相对于一个或多个对照例如一个或多个阳性和/或阴性对照升高。在来自施用细胞群体、混合物或构建体后的患者的细胞中相对于来自施用前的患者的细胞存在过表达。术语“受试者”应当指任何单个人受试者，包括合适于进行治疗的患者，其正在经历或已经历肾病、贫血或EPO缺乏的一个或多个体征、症状或其它指标(indicator)。此类受试者包括但不限于新 近诊断的或先前诊断的以及现在正在经历肾病、贫血或EPO缺乏的再现或复发或处于发生所述疾病的风险中的受试者，不论病因如何。受试者先前可以已进行了肾病、贫血或EPO缺乏的治疗，或未进行这样的治疗。术语“患者”是指任何期望对其进行治疗的任何单个动物，更优选哺乳动物(包括这样的非人动物例如狗、猫、马、兔、动物园动物、牛、猪、绵羊和非人灵长类动物)。最优选地,本文中的患者为人。术语“样品”或“患者样品”或“生物样品”通常意指获自受试者或患者、体液、身体组织、细胞系、组织培养物或其它来源的任何生物样品。术语包括活检组织例如肾活检组织。术语包括培养的细胞，例如培养的哺乳动物肾细胞。用于从哺乳动物获得活检组织和培养的细胞的方法在本领域是公知的。如果单独使用术语“样品”，其仍然表示“样品”为“生物样品”或“患者样品”，即，术语可互换使用。术语“测试样品”是指来自已通过本发明的方法治疗的受试者的样品。测试样品可源于哺乳动物受试者的各种来源，包括但不限于血液、精液、血清、尿、骨髓、粘液、组织等。术语“对照”或“对照样品”是指其中预期阴性或阳性结果帮助与测试样品的结果关联的阴性或阳性对照。适用于本发明的对照包括但不限于已知显示特征在于正常红细胞系统动态平衡的指标的样品、已知显示特征在于贫血的样品、获自已知不为贫血的受试者的样品以及获自已知为贫血的受试者的样品。适用于本发明的方法的其它对照包括但不限于来源于已利用已知调节红细胞生成的药物试剂(例如，重组EPO或EPO类似物)治疗的受试者的样品。此外，对照可以为获自利用本发明的方法治疗之前的受试者的样品。其它适当的对照可以为获自已知患有任何类型或分期的肾病的受试者的测试样品和已知未患有任何类型或分期的肾病的受试者的样品。对照可以为正常健康匹配的对照。本领域技术人员将理解适用于本发明的其它对照。
“再生预后”、“再生性预后”或“再生的预后”通常是指本文中描述的细胞群体、混合物或构建体的施用或植入的可能再生过程或结果的预测或预计。对于再生预后，预测或预计可通过下列方面的一个或多个方面告知:植入或施用后有功能的肾的增强、植入或施用后有功能的肾的发育、植入或施用后增强的肾功能或能力的发展以及在植入或施用后由自体肾进行的某些标志物的表达。
“再生的肾”是指在植入或施用本文中描述的细胞群体、混合物或构建体后的自体肾。再生的肾的特征在于各种指标，包括但不限于自体肾的功能或能力的发展、自体肾的功能或能力的增强以及某些标志物在自体肾中的表达。本领域技术人员将理解，其它指标可适用于表征再生的肾。
细朐群体
先前已在2009年11月12日提交的美国申请N0.12/617，721 (将其公开内容通过引用整体并入本文)中描述了用于治疗肾病即提供肾功能的稳定化和/或增强和/或再生的肾细胞及其混合物的分离的异源群体(对于该群体已富集了特定的生物活性组分或细胞类型和/或消耗了特定的无活性或不期望的组分或细胞类型)。本发明提供了与健康个体相比较缺少细胞组分但仍然保持治疗性质即提供肾功能的稳定化和/或增强和/或再生的分离的肾细胞级分。本文中描述的细胞群体、细胞级分和/或细胞的混合物可来源于本文中描述的健康个体、患有肾病的个体或受试者。
生物活性细胞群体
在一个方面，本发明基于令人惊讶的发现:富集了其生物活性组分和消耗了无活性或不期望的组分的肾细胞的异源群体的某些亚级分提供了比起始群体更优的治疗和再生结果。例如，本发明 的生物活性组分，例如消耗了无活性或不期望的组分(例如BI和B5)的B2、B4和B3，单独地或混合地提供了肾功能的预期之外的稳定化和/或增强和/或再生。
在另一个方面，本发明基于令人惊讶的发现:消耗了或缺乏一种或多种细胞类型例如血管细胞、内分泌细胞或内皮细胞的特定亚级分B4，即B4’，单独地或当与其它生物活性亚级分例如B2和/或B3混合时保持治疗性质，例如肾功能的稳定化和/或增强和/或再生。在优选实施方案中，生物活性细胞群体为B2。在某些实施方案中，将B2细胞群体与B4或B4’混合。在其它实施方案中，将B2细胞群体与B3混合。在其它实施方案中，将B2细胞群体与B3和B4或B3和/或B4的特定细胞组分混合。
B2细胞群体的特征在于肾小管细胞标志物的表达，所述标志物选自如下标志物的一个或多个:兆蛋白、立方蛋白(cubilin)、透明质酸合酶2 (HAS2)、维生素D325-羟化酶(CYP2D25)、N_|丐粘蛋白(Ncad)、E_I丐粘蛋白(Ecad)、水通道蛋白(Aquaporin)-1(Aqpl)JjC通道蛋白-2 (Aqp2)、RAB17、成员RAS癌基因家族(Rab17) ,GATA结合蛋白3 (Gata3)、含FXYD结构域的离子转运调节剂4(Fxyd4)、溶质载体家族9(钠/氢交换器)、成员4(Slc9a4)、醛脱氢酶3家族、成员Bl(Aldh3bl)、醛脱氢酶I家族成员、成员A3(Aldhla3)和钙蛋白酶-8 (Capn8)以及集合管标志物水通道蛋白_4 (Aqp4)。B2为比B3和/或B4更大和更加颗粒化，从而具有约1.045g/ml至约1.063g/ml (啮齿类动物)、约1.045g/ml至1.052g/ml (人)和约1.045g/ml至约1.058g/ml (犬)的浮力密度。B3细胞群体的特征在于血管、肾小球和近端管标志物在一些EPO生成细胞中表达，与B2和B4相比较具有中等尺寸和粒度，从而具有约1.063g/ml至约1.073g/ml (啮齿类动物)、约1.052g/ml至约1.063g/ml (人)以及约1.058g/ml至约1.063g/ml (犬)的浮力密度。B3的特征在于标志物的表达，所述标志物选自如下标志物的一个或多个:水通道蛋白7 (Aqp7)、含FXYD结构域的离子转运调节剂2 (Fxyd2)、溶质载体家族17 (磷酸钠)、成员 3 (Slcl7a3)、溶质载体家族 3、成员 I (Slc3al)、claudin2 (Cldn2)、napsin A 天冬氨酸肽酶(Napsa)、溶质载体家族2 (促进葡萄糖转运蛋白)、成员2 (Slc2a2)、丙氨酰(膜)氨基肽酶(Anpep)、跨膜蛋白27 (Tmem27)、酰基-CoA合酶中间链家族成员2 (Acsm2)、谷胱甘肽过氧化酶3 (Gpx3)、果糖-1，6- 二磷酸酶I (Fbpl)和丙氨酸-乙醒酸氨基转移酶2 (Agxt2)。B3的特征也在于血管表达标志物血小板内皮细胞粘附分子(Pecam)和肾小球表达标志物podocin(Podn)。B4细胞群体的特征在于含有如下标志的一个或多个的血管标志物组的表达:PECAM、VEGF, KDR、HIFla,⑶31、⑶146 ;含有如下标志的一个或多个的肾小球标志物组的表达:Podocin (Podn)和去氧肾上腺素(Mphrin) (Neph);和与未分级的(UNFX)B2和B3相比较富集了氧可调节的EPO富集的群体。B4的特征还在于如下标志的一个或多个的表达:趋化因子(C-X-C基序)受体4(Cxcr4)、内皮素受体B型(Ednrb)、V型胶原、a 2(Col5a2)、钙粘蛋白5 (Cdh5)、纤溶酶原激活物、组织(Plat)、血管生成素2 (Angpt2)、激酶插入物结构域蛋白受体(Kdr)、分泌型蛋白质、富含酸性半胱氨酸的骨结合素(osteonectin) (Sparc)、丝甘蛋白聚糖(Srgn)、 ΜΡ金属肽酶抑制剂3 (Timp3)、维尔姆斯瘤I (Wt I)、无翅类型MMTV整合位点家族、成员4(Wnt4)、G蛋白`信转导的调节剂4(Rgs4)、血小板内皮细胞粘附分子(Pecam)和红细胞生成素(Epo)。B4的特征还在于与B2或B3相比较更小、颗粒化程度更低的细胞，具有约1.073g/ml至约1.091g/ml (啮齿类动物)、约1.063g/ml至约1.091g/mL (人和犬)的浮力密度。B4’细胞群体被定义为具有1.063g/mL至1.091g/mL的浮力密度，和表达如下标志物的一个或多个:PECAM、vEGF、KDR、HIFla、podocin、去氧肾上腺素、EPO, CK7、CK8/18/19。在一个实施方案中，B4’细胞群体的特征在于包含如下标志的一个或多个的血管标志物组的表达:PECAM、vEGF、KDR、HIFla、CD31、CD146。在另一个实施方案中，B4’细胞群体的特征在于内分泌标志物EPO的表达。在一个实施方案中，B4’细胞群体的特征在于包含如下标志的一个或多个的肾小球标志物组的表达=Podocin(Podn)和氧肾上腺素(N印h)。在某些实施方案中，B4’细胞群体的特征在于包含如下标志的一个或多个的血管标志物组的表达:PECAM、vEGF、KDR、HIFla以及在于内分泌标志物EPO的表达。在另一个实施方案中，B4’的特征还在于与B2或B3相比较更小、颗粒化程度更低的细胞，具有约1.073g/ml至约1.09Ig/ml (啮齿类动物)、约1.063g/ml至约1.091g/mL(人和犬)的浮力密度。
在一个方面，本发明提供了具有1.063g/mL至1.091g/mL的密度的人肾细胞的分离的富集的B4’群体，其包含包含红细胞生成素(EPO)生成细胞、血管细胞和肾小球细胞的至少一种。在一个实施方案中，B4’细胞群体的特征在于血管标志物的表达。在某些实施方案中，B4’细胞群体的特征不在于肾小球标志物的表达。在一些实施方案中，B4’细胞群体能够氧调节红细胞生成素(EPO)表达。
在一个实施方案中，B4’细胞群体不包括具有1.045g/mL至1.052g/mL的密度的包含肾小管细胞的B2细胞群体。在另一个实施方案中，B4’细胞群体不包括具有< 1.045g/ml的密度的包含集合管和肾小管系统的大颗粒细胞的BI细胞群体。在另一个实施方案中，B4’细胞群体不包括具有> 1.091g/ml的密度的包含具有低粒度和活力的碎片和小细胞的B5细胞群体。
在一个实施方案中，B4’细胞群体不包括具有1.045g/mL至1.052g/mL的密度的包含肾小管细胞的B2细胞群体；具有< 1.045g/ml的密度的包含集合管和肾小管系统的大颗粒细胞的BI细胞群体；和具有> 1.091g/ml的密度的包含具有低粒度和活力的碎片及小细胞的B5细胞群体。在一些实施方案中，B4’细胞群体可来源于患有肾病的受试者。
在一个方面，本发明提供了包含具有1.045g/mL至1.052g/mL的密度的第一细胞群体B2 (其包含分离的富集的肾小管细胞群体)和具有约1.063g/mL至1.091g/mL的密度的第二细胞群体B4’(其包含红细胞生成素(EPO)生成细胞和血管细胞但消耗了肾小球细胞)的人肾细胞的混合物，其中混合物不包括具有< 1.045g/ml的密度的包含集合管和肾小管系统的大颗粒细胞的BI细胞群体，或具有> 1.091g/ml的密度的包含具有低粒度和活力的碎片及小细胞的B5细胞群体。在某些实施方案中，B4’细胞群体的特征在于血管标志物的表达。在一个实施方案中，B4’细胞群体的特征不在于肾小球标志物的表达。在某些实施方案中，B2还包括集合管上皮细胞。在一个实施方案中，细胞的混合物能够进行受体介导的白蛋白吸收。在另一个实施方案中，细胞的混合物能够进行氧调节的红细胞生成素(EPO)表达。在一个实施方案中，混合物包含能够在体外和体内生成和/或刺激透明质酸(HA)的高分子量种类的生成的表达HAS-2的细胞。在所有实施方案中，第一和第二细胞群体可来源于肾组织或培养的肾细胞。
在一个实施方案中，混合物能够在体内递送后提供再生刺激物。在其它实施方案中，混合物能够在体内递送后减少肾小管滤过、肾小管吸收、尿生成和/或内分泌功能的衰退，稳定或增强所述功能。在一个实施方案中，B4’细胞群体来源于具有肾病的受试者。
在一个方面，本发明提供了包含具有1.063g/mL至1.091g/mL的密度的包含红细胞生成素(EPO)生成细胞、血管细胞和肾小球细胞的至少一种的人肾细胞的分离的富集的B4’群体。在一个实施方案中，B4’细胞群体的特征在于血管标志物的表达。在某些实施方案中，B4’细胞群体的特征不在于肾小球标志物的表达。不表达的肾小球标志物可以为podocin(参见实施例7)。在一些实施方案中,B4’细胞群体能够进行氧可调节的红细胞生成素(EPO)表达。
在一个实施方案中，B4’细胞群体不包括具有1.045g/mL至1.052g/mL的密度的包含肾小管细胞的B2细胞群体。在另一个实施方案中，B4’细胞群体不包括具有< 1.045g/ml的密度的包含集合管和肾小管系统的大颗粒细胞的BI细胞群体。在另一个实施方案中，B4’细胞群体不包括具有> 1.091g/ml的密度的包含具有低粒度和活力的碎片和小细胞的B5细胞群体。
在一个实施方案中，B4’细胞群体不包括具有1.045g/mL至1.052g/mL的密度的包含肾小管细胞的B2细胞群体；具有< 1.045g/ml的密度的包含集合管和肾小管系统的大颗粒细胞的BI细胞群体；以及具有> 1.091g/ml的密度的包含具有低粒度和活力的碎片和小细胞的B5细胞群体。
在一些实施方案中，B4’细胞群体可来源于患有肾病的受试者。在一个方面，本发明提供了包含具有1.045g/mL至1.052g/mL的密度的第一细胞群体B2 (其包含分离的富集的肾小管细胞群体)和具有1.063g/mL至1.091g/mL的密度的第二细胞群体B4’ (其包含红细胞生成素(EPO)生成细胞和血管细胞但消耗肾小球细胞)的人肾细胞的混合物，其中混合物不包括具有< 1.045g/ml的密度的包含集合管和肾小管系统的大颗粒细胞的BI细胞群体，或具有> 1.091g/ml的密度的包含具有低粒度和活力的碎片和小细胞的B5细胞群体。在某些实施方案中，B4’细胞群体的特征在于血管标志物的表达。在一个实施方案中，B4’细胞群体的特征不在于肾小球标志物的表达。在某些实施方案中，B2还包括集合管上皮细胞。在一个实施方案中，细胞的混合物能够进行受体介导的白蛋白吸收。在另一个实施方案中，细胞的混合物能够进行氧可调节的红细胞生成素(EPO)的表达。在一个实施方案中，混合物包含能够在体外和体内生成和/或刺激透明质酸(HA)的高分子量种类的表达HAS-2的细胞。在所有实施方案中，第一和第二细胞群体可来源于肾组织或培养的肾细胞。
在一个实施方案中，混合物能够在体内递送后提供再生刺激物。在其它实施方案中，混合物能够在体内递送后减小肾小球滤过、肾小管吸收、尿生成和/或内分泌功能的衰退、稳定或增强所述功能。在一个实施方案中，B4’细胞群体来源于患有肾病的受试者。
在优选实施方案中，混合物包含与B3和/或B4组合的B2。在另一个优选实施方案中，混合物包含与B3和/或B4’组合的B2。在其它优选实施方案中，混合物由(i)与B3和/或B4组合的B2 ;或(ii)与B3和/或B4’组合的B2组成或基本上由所述组分组成。
包含B4’细胞群体的混合物可包含也从非健康受试者获得的B2和/或B3细胞群体。非健康受试者可以为从其获得B4’级分的相同受试者。与B4’细胞群体相反，从非健康受试者获得的B2和B3细胞群体与来源于健康个体的起始肾细胞群体相比较通常不缺乏一个或多个特定的细胞类型。
通讨B2和B4牛 成诱明质酸
透明质烷(Hyaluronan)(也称为透明质酸或透明质酸盐)为糖胺聚糖(GAG)，其由非硫酸化的二糖单位，特别地N-乙酰葡糖胺和葡糖醛酸的规则重复序列组成。其分子量的范围可为400道尔顿(二糖)至超过百万道尔顿。其在所有组织例如皮肤、软骨和眼中以及在大多数(如果不是全部的话)成年动物的体液中被发现以可变的量存在。其在早期胚胎中特别丰富。由透明质酸，事实上一般GAG产生的空间允许其在细胞迁移、细胞附着、在伤口修复过程中、器官发生、免疫细胞粘附、细胞内信号转导的激活以及肿瘤转移中起作用。这些作用由结合透明质烷的特定蛋白质和蛋白聚糖介导。细胞运动性和免疫细胞粘附由细胞表面受体 RHAMM(Receptorfor Hyaluronan-Mediated Motility;Hardwick 等人，1992)和CD44(Jalkenan等人，1987 ；Miyake等人，1990)介导。透明质烷直接在细胞表面的内膜上合成，随着其合成，不断生长的聚合物挤出通过膜至细胞的外面。合成由单个蛋白质酶透明质烷合成酶(HAS)介导，其基因家族由至少3个成员组成。
最近已显示透明质酸与⑶44相互作用，并且此类相互作用可以，除其它作用以夕卜，将非居留细胞(non-resident cell)(例如间质干细胞(MSC))募集至受损害的肾组织并且增强肾再生(Kidney International (2007) 72，430 - 441)。预料之外地，已发现B2和B4细胞制剂能够通过透明质酸合酶-2(HAS-2)_在B2细胞群体中更特别地富含的标志物的作用在体外和体内表达更高分子量的透明质酸(HA)的种类。经显示在5/6Nx模型中利用B2的处理减少纤维化，伴随HAS-2的体内强表达以及处理的组织内预期的高分子量HA的生成。值得注意地，留下未处理的5/6Nx模型导致纤维化，有限的HAS-2被检测到并且几乎无高分子量的HA生成。不希望受理论束缚，假设主要由B2(以及一定程度上由B4)生成的HA的该抗炎高分子量种类与细胞制剂在肾脏纤维化的减少和在肾再生的帮助中协同作用。因此，本发明包括在包含透明质酸的生物材料中递送本发明的细胞原型。本发明还涉及通过直接生成或通过植入的细胞刺激生成来提供再生刺激物的生物材料组分。在一个方面，本发明提供了用于治疗有此需要的受试者的肾病、贫血和/或EPO缺乏的EPO生成肾细胞的分离的异源群体。在一个实施方案中，细胞群体来源于肾活检组织。在另一个实施方案中，细胞群体来源于完整肾组织。在一个其它实施方案中，细胞群体来源于从肾活检组织或完整肾组织建立的哺乳动物肾细胞的体外培养物。在所有实施方案中，这些群体是未分级分离的细胞群体，在本文中也称为非富集的细胞群体。在另一个方面，本发明提供了分离的红细胞生成素(EPO)生成肾细胞群体，将其进一步富集以便富集的群体中EPO生成细胞的比例大于原始或初始细胞群体中EPO生成细胞的比例。在一个实施方案中，富集的EPO生成细胞级分包含相对于未富集的初始群体中包含的间质成纤维细胞和肾小管细胞更大比例的间质成纤维细胞和更小比例的肾小管细胞。在某些实施方案中，富集的EPO生成细胞级分包含相对于未富集的初始群体中包含的肾小球细胞、血管细胞和集合管细胞更大比例的肾小球细胞和血管细胞以及更小比例的集合管细胞。在这样的实施方案中，这些群体在本文中被称为“B4”细胞群体。在另一个方面，本发明提供了与一种或多种另外的肾细胞群体混合的EPO生成肾细胞群体。在一个实施方案中，EPO生成细胞群体为富集了 EPO生成细胞的第一细胞群体例如B4。在另一个实施方案中，EPO生成细胞群体为未富集EPO生成细胞的第一细胞群体例如B2。在另一个实施方案中，将第一细胞群体与第二肾细胞群体混合。在一些实施方案中，第二细胞群体富集肾小管细胞，这可通过肾小管细胞的表型的存在来证明。在另一个实施方案中，肾小管细胞的表型可通过一个肾小管细胞标志物的存在来显示。在另一个实施方案中，肾小管细胞的表型可通过一个或多个肾小管细胞标志物的存在来显示。肾小管细胞标志物包括但不限于兆蛋白、立方蛋白、透明质酸合酶2(HAS2)、维生素D325-羟化酶(CYP2D25)、N-钙粘蛋白(Ncad)、E-钙粘蛋白(Ecad)、水通道蛋白-1 (Aqpl)、水通道蛋白-2(Aqp2)、RAB17、成员RAS癌基因家族(Rabl7)、GATA结合蛋白3 (Gata3)、含FXYD结构域的离子转运调节剂4(FxycM)、溶质载体家族9(钠/氢交换器)、成员4(Slc9a4)、醛脱氢酶3家族、成员Bl(Aldh3bl)、醛脱氢酶I家族，成员A3 (Aldhla3)和钙蛋白酶_8 (CapnS)。在另一个实施方案中，将第一细胞群体与几种类型的肾细胞(包括但不限于间质来源的(interstitium-deri ved)细胞、肾小管细胞、集合管来源的细胞、肾小球来源的细胞和/或来源于血液或脉管系统的细胞)的至少一种混合。EPO生成肾细胞群体可包含以与B2和/或B3的混合物的形式存在，或以富集的细胞群体的形式存在的B4或B4’，例如B2+B3+B4/B4，。
在一个方面，本发明的EPO生成肾细胞群体的特征在于EPO表达和对氧的生物响应，以便培养系统的氧张力的减小导致EPO表达的诱导。在一个实施方案中，EPO生成细胞群体富集EPO生成细胞。在一个实施方案中，当在其中使细胞在培养系统中经历有效氧水平的降低(与在有效氧的正常大气Γ21%)水平下培养的细胞相比较)的条件下培养细胞群体时，EPO表达被诱导。在一个实施方案中，在更低的氧条件下培养的EPO生成细胞相对于在正常氧条件下培养的EPO生成细胞表达更高水平的ΕΡ0。一般地，在降低的有效氧的水平(也称为缺氧培养条件)下培养细胞意指相对于在有效氧的正常大气水平(也称为正常或含氧量正常的培养条件)下培养细胞降低减少的氧的水平。在一个实施方案中，缺氧细胞培养条件包括在约低于1%的氧、约低于2%的氧、约低于3%的氧、约低于4%的氧或约低于5%的氧下培养细胞。在另一个实施方案中，正常或含氧量正常的培养条件包括在约10%的氧、约12%的氧、约13%的氧、约14%的氧、约15%的氧、约16%的氧、约17%的氧、约18%的氧、约19%的氧、约20%的氧或约21%的氧下培养细胞。
在一个其它实施方案中，获得EPO的诱导或增加的表达并且可通过在约低于5%的有效氧下培养细胞和将EPO表达水平与在大气(约21%)氧下培养的细胞相比较来观察EPO的诱导或增加的表达。在另 一个实施方案中，通过方法在能够表达EPO的细胞的培养物中获得EPO的诱导，所述方法包括其中在大气氧(约21%)下培养细胞一段时间的第一培养期和其中降低有效氧水平并且在约低于5%的有效氧下培养相同细胞的第二培养期。在另一个实施方案中，通过HIFla调节响应缺氧条件的EPO表达。本领域技术人员将理解可将本领域已知的其它氧操作培养条件用于本文中描述的细胞。
在一个方面，富集的EPO生成哺乳动物细胞群体的特征在于对灌注条件的生物响应(例如，EPO表达)。在一个实施方案中，灌注条件包括短暂的、间歇性或连续流体流动(灌注)。在一个实施方案中，当以通过流动将动力转移至细胞的方式间歇或连续地循环或搅动其中培养细胞的培养基时，EPO表达被机械地诱导。在一个实施方案中，以它们作为三维结构存在于给此类三维结构的形成提供构架和/或空间的材料中或其上的方式培养经历短暂、间歇性或连续性流体流动的细胞。在一个实施方案中，将细胞培养在多孔珠粒上并且利用摇摆平台、沿轨道运行的平台或旋转烧瓶将其经历间歇或连续流体流动。在另一个实施方案中，将细胞培养在三维支架上并且置于籍以固定支架的装置中，流体定向流过或穿过支架。本领域技术人员将理解，可将本领域已知的其它灌注培养条件用于本文中描述的细胞。
无活性的细胞群体
如本文中所述，本发明部分基于令人惊讶的发现:富集了生物活性组分并且消耗了无活性或不期望的组分的肾细胞的异源群体的某些级分提供了优于起始群体的治疗和再生结果。在优选实施方案中，消耗了本发明的细胞群体的BI和/或Β5细胞群体。例如，可消耗下列细胞群体的BI和/或Β5:Β2、Β3和Β4’的两种或更多种的混合物；Β2、Β3和Β4’的富集的细胞群体。
BI细胞群体包含集合管和肾小管系统的大颗粒细胞，所述细胞群体具有小于约1.045g/m的浮力密度。B5细胞群体由具有低粒度和活力的碎片和小细胞组成并且具有大于约1.091g/ml的浮力密度。分离和培养细胞群体的方法本发明，在一个方面，提供了用于分开和分离肾细胞组分例如富集的细胞群体以用于治疗用途(包括肾病、贫血、EPO缺乏、肾小管转运缺陷(tubular transportdeficiency)和肾小球滤过缺陷(glomerular filtration deficiency)的治疗)的方法。在一个实施方案中，从新消化的，即机械或酶促消化的肾组织或从哺乳动物肾细胞的异源体外培养物分离细胞群体。已意外地发现，在于密度梯度上分开之前于缺氧培养条件中培养肾细胞的异源混合物在B4(包括B4’ )以及B2和/或B3级分中提供了细胞的增加的分布和组成。对于从患病和非患病的肾分离的肾细胞观察到依赖于氧的细胞在B4和B2中的富集。不希望受理论束缚，这可归因于下列现象的一个或多个现象:1)在缺氧培养期过程中特定细胞组分的选择性存活、死亡或增殖；2)响应缺氧培养的细胞的粒度和/或尺寸的改变，从而影响浮力密度的改变和随后在密度梯度·分离过程中的定位；和3)响应缺氧培养期的细胞基因/蛋白质表达的改变，从而导致任何给定的梯度级分内的细胞的差异特征。从而，在一个实施方案中，富集了小管细胞的细胞群体例如B2是抗低氧的。用于分开和分离本发明的细胞群体的示例性技术包括基于目标群体内包含的不同细胞类型的差异比重在密度梯度进行的分离。任何给定的细胞类型的比重可受细胞内粒度的程度、细胞内水的体积及其它因素影响。在一个方面，本发明提供了用于分离跨多个物种包括但不限人、犬和啮齿类动物的本发明的细胞制剂例如B2和B4(包括B4’ )的最佳梯度条件。在优选实施方案中，将密度梯度用于获得来源于肾细胞的异源群体的新型富集的肾小管细胞级分的群体即B2细胞群体。在一个实施方案中，将密度梯度用于获得来源于肾细胞的异源群体的新型富集的EPO生成细胞级分的群体即B4细胞群体。在其它实施方案中，将密度梯度用于获得富集的肾的肾小管细胞、肾小球细胞和内皮细胞的亚群。在一个实施方案中，将EPO生成细胞和肾小管细胞与红细胞和细胞碎片分开。在一个实施方案中，将EPO生成肾小球和血管细胞与其它细胞类型和与红细胞及细胞碎分开，同时伴随地将肾小管细胞和集合管细胞的亚群与其它细胞类型和与红细胞及细胞碎片分开。在一个其它实施方案中，将内分泌细胞、肾小球细胞和/或血管细胞与其它细胞类型和与红细胞及细胞碎片分开，同时伴随地将肾小管细胞和集合管细胞的亚群与其它细胞类型和与红细胞及细胞碎片分开。本发明基于下文中描述的某些关键特征，通过部分使用包含60%的水中的非离子碘化化合物碘克沙醇的OPT1PREP (Axis-Shield)密度梯度培养基生成新型细胞群体。然而，本领域技术人员将承认，可根据本发明使用任何密度梯度或其它方法，例如使用本领域已知的细胞表面标志(包括用于分离本发明的细胞群体的必需特征)的免疫分离(immunological separation)。本领域技术人员还应当承认,通过密度梯度(尺寸和粒度)促成细胞亚群的分离的相同细胞特征可被开发利用来通过流式细胞术(前向散射=通过流式细胞仪的尺寸的反映，和侧向散射=粒度的反映)分离细胞亚群。重要地，密度梯度培养基应当对特定的目标细胞具有低毒性。虽然密度梯度培养基应当对特定的目标细胞具有低毒性，但本发明涉及在目标细胞的选择过程中起作用的梯度培养基的用途。不期望受理论束缚，利用包括碘克沙醇的梯度回收的本发明的细胞群体似乎是抗碘克沙醇的，因为在装载与回收步骤之间存在细胞的相当损失，这表明在梯度条件下对碘克沙醇的暴露导致某些细胞的消除。在碘克沙醇梯度后在特定条带上出现的细胞抗碘克沙醇和/或密度梯度暴露的任何不利作用。因此，本发明还涉及为轻度至中度肾毒素(nephrotoxin)的其它造影剂(contrast media)在本发明的细胞群体的分离和/或选择中的作用。此外，密度梯度培养基还不应当结合人血浆中的蛋白质或不利地影响目标细胞的关键功能。
在另一个方面，本发明提供了使用荧光激活细胞分选术(FACS)富集和/或消耗肾细胞类型的方法。在一个实施方案中，可使用BD FACSAria 或等同技术富集和/或消耗肾细胞类型。
在另一个方面，本发明提供了使用磁性细胞分选术富集和/或消耗肾细胞类型的方法。在一个实施方案中，可使用Miltenyi autoMACS 系统或等同技术富集和/或消耗肾细胞类型。
在另一个方面，本发明提供了肾细胞群体的三维培养的方法。在一个方面，本发明提供了通过连续灌注培养细胞群体的方法。在一个实施方案中，通过三维培养和连续灌注培养的细胞群体当与静态培养的细胞群体相比较显示更强的细胞结构(cellularity)和相互连接性(interconnectivity)。在另一个实施方案中，通过三维培养和连续灌注培养的细胞群体当与这样的细胞群体的静态培养物相比较时显示更多的EPO表达以及增多的肾小管相关基因例如e-钙粘蛋白的表达。
在另一个实施方案中，通过连续灌注培养的细胞群体显示当与静态培养的细胞群体相比较时更高的葡萄糖和谷氨酰胺消耗水平。
如本文(包括实施例3)中所描述的，可将低氧或缺氧状况用于制备本发明的细胞群体的方法。然而，可使用本发明的方法而无需低氧条件化步骤。在一个实施方案中，可使用含氧量正常的条件。
本领域技术人员将理解可将本领域已知的其它分离和培养方法用于本文中描述的细胞。
生物材料(聚合物基质或支架)
如Bertram等人，美国公布的申请20070276507(通过引用整体并入本文)中所述，可将聚合物基质或支架塑造成许多期望的构型以满足许多完整系统、几何或空间限制。在一个实施方案中，本发明的基质或支架可以是三维的并且可被塑造来使适合器官或组织结构的尺寸和形状。例如，在使用聚合物支架治疗肾病、贫血、EPO缺乏、肾小管转运缺陷或肾小球滤过缺陷中，可使用三维(3-D)基质。可使用多种差异塑形的3-D支架。自然地，可以以不同尺寸和形状塑造聚合物基质以使适合不同大小的患者。可以以其它方式塑造聚合物基质来适应患者的特殊需要。在另一个实施方案中，聚合物基质或支架可以是生物相容性的多聚聚合物支架。可从多种合成或天然存在的材料形成支架，所述材料包括但不限于开孔聚乳酸(OPLA= )、纤维素醚、纤维素、纤维质酯(cellulosic ester)、氟化聚乙烯、酚、聚-4-甲基戊烯、聚丙烯腈、聚酰胺、聚酰胺酰亚胺、聚丙烯酸酯、聚苯并恶唑、聚碳酸酯、聚芳醚腈、聚酯、聚酯碳酸酯、聚醚、聚醚醚酮、聚醚酰亚胺、聚醚酮、聚乙烯砜、聚乙烯、聚氟烯烃、聚酰亚胺、聚烯烃、聚卩惡二唑、聚苯撑氧(polyphenylene oxide)、聚苯硫醚(polyphenylene sulde) 了、聚 丙烯、聚苯乙烯、聚硫化物、聚砜、聚四氟乙烯、聚硫醚、聚三唑、聚氨酯、聚乙烯、聚偏二氟乙烯、再生纤维素、硅酮、尿素甲醛、胶原蛋白、层粘连蛋白、纤连蛋白、蚕丝、弹性蛋白、藻酸盐、透明质酸、琼脂糖或其共聚物或物理混合物。支架构型可从液体水凝胶悬浮物变化至软多孔支架至坚硬的保持形状的多孔支架。可从多种聚合物材料形成水凝胶，将所述水凝胶用于多种生物医学应用。可将水凝胶在物理上描述为亲水聚合物的三维网络。取决于水凝胶的类型，它们包含不同百分比的水，但完全不溶解于水。尽管它们含水量高，但水凝胶因亲水残基的存在能够另外结合大体积的液体。水凝胶可充分膨胀而不改变它们的凝胶状结构。根据使用的聚合物的性质和产品的其它专用设备，可特异性修改水凝胶的基本物理特征。优选，水凝胶由聚合物、生物来源的材料、合成产生的材料或其组合构成,所述材料在生物学上是惰性的并且在生理上与哺乳动物组织相容。水凝胶材料优选不诱导炎症响应。可用于形成水凝胶的其它材料的实例包括(a)经修饰的藻酸盐，(b)通过暴露于单价阳离子可胶化的多糖(例如结冷胶和角叉菜胶)，(C)为非常粘的液体或具有触变性并且通过结构的缓慢演变随时间过去形成凝胶的多糖(例如，透明质酸)和(d)聚合物水凝胶前体(例如，聚环氧乙烷-聚丙二醇嵌段共聚物和蛋白质)。美国专利N0.6，224，893B1提供了适用于制备根据本发明的水凝胶的各种聚合物以及此类聚合物的化学性质的详细描述。支架或 生物材料特征可使细胞能够附着支架或生物材料和与其相互作用，和/或提供可将细胞捕获入其中的多孔空间。在一个实施方案中，本发明的多孔支架或生物材料允许将细胞的一个或多个群体或混合物添加或沉积在构造为多孔支架的生物材料上(例如，通过细胞的附着)和/或支架的孔内(例如，通过细胞的捕获)。在另一个实施方案中，支架或生物材料允许或促进支架内细胞与细胞之间和/或细胞与生物材料之间的相互作用以形成本文中描述的构建体。在一个实施方案中，根据本发明使用的生物材料由以水凝胶形式存在的透明质酸(HA)组成，其包含大小从5.1kDA至>2xl06kDa范围的HA分子。在另一个实施方案中，根据本发明使用的生物材料由以多孔泡沫形式存在的透明质酸组成，其也包含大小从5.1kDA至>2xl06kDa范围的HA分子。在另一个实施方案中，根据本发明使用的生物材料由基于聚乳酸(PLA)的泡沫组成，其具有开孔结构和约50微米至约300微米的孔径。在另一个实施方案中，特定的细胞群体，优选B2但也可以是B4，直接提供和/或刺激通过透明质酸合酶-2(HAS-2)的高分子量透明质酸的合成，特别地在肾内植入后。本领域技术人员将理解本领域已知的其它类型的合成或天然存在的材料可用于形成本文中描述的支架。在一个方面，本发明提供了由上文提及的支架或生物材料制造的本文中描述的构建体。构律体在一个方面，本发明提供了具有一种或多种用于治疗有此需要的受试者的肾病、贫血或EPO缺乏的本文中描述的细胞群体的可植入构建体。在一个实施方案中，构建体由生物相容性材料或生物材料、由一种或多种合成或天然存在的生物相容性材料构成的支架或基质和一种或多种通过附着和/或捕获沉积在支架的表面上或包埋在其中的本文中描述的细胞群体或细胞混合物组成。在某些实施方案中，构建体由生物材料和一种或多种用生物材料组分包被的、沉积在生物材料上、沉积在其中、附着于其上、被捕获在其中、包埋在其中或与其组合的本文中描述的细胞群体或细胞混合物。可将本文中描述的任何细胞群体，包括富集的细胞群体或其混合物，与基质组合使用以形成构建体。
在另一个实施方案中，沉积的细胞群体或构建体的细胞组分为富集了氧可调节的EPO生成细胞的第一肾细胞群体。在另一个实施方案中，第一肾细胞群体除氧可调节的EPO生成细胞外还包含肾小球和血管细胞。在一个实施方案中，第一肾细胞群体为B4’细胞群体。在一个其它实施方案中，沉积的细胞群体或构建体的细胞组分包括第一富集的肾细胞群体和第二肾细胞群体。在一些实施方案中，未富集第二细胞群体的氧可调节的EPO生成细胞。在另一个实施方案中，第二细胞群体富集肾小管细胞。在另一个实施方案中，第二细胞群体富集肾小管细胞，所述第二细胞群体包含集合管上皮细胞。在其它实施方案中，肾小管细胞的特征在于一种或多种肾小管细胞标志物的表达，所述标志物可包括但不限于兆蛋白、立方蛋白、透明质酸合酶2 (HAS2)、维生素D325-羟化酶(CYP2D25)、N-钙粘蛋白(Ncad)、E-钙粘蛋白(Ecad)、水通道蛋白-1(六即1)、水通道蛋白-2(六即2)、狀817、成员RAS癌基因家族(Rabl7)、GATA结合蛋白3 (Gata3)、含FXYD结构域的离子转运调节剂4(Fxyd4)、溶质载体家族9(钠/氢交换器)、成员4(Slc9a4)、醛脱氢酶3家族、成员BI (Aldh3bl)、醛脱氢酶I家族，成员A3 (Aldhla3)和钙蛋白酶_8 (Capn8)。
在一个实施方案中，沉积在生物材料或支架上或与其组合以形成本发明的构建体的细胞群体来源于多种来源，例如自体来源。非自体来源也适合使用，包括但不限于异基因或同基因(自体或等基因(isogeneic))来源。
本领域技术人员将理解，存在几种用于将细胞群体沉积在生物材料上或另外地将细胞群体与生物材料组合以形成构建的适当方法。
在一个方面，本发明的构建体适用于本文中描述的使用的方法。在一个实施方案中，构建体适合于给需要任何病因学的肾病、贫血或任何病因学的EPO缺乏的治疗的受试者施用。在其它实施方案中，构建体适合于给需要红细胞的动态平衡的增强或恢复的受试者施用。在另一个实施方案中，构建体适合于给需要增强的肾功能的受试者施用。
在另一个方面，本发明提供了用于植入需要增强的肾功能的受试者的构建体，其包括:a)包含一种或多种生物相容性合成聚合物或天然存在的蛋白质或肽的生物材料；和
b)来源于患有肾病的受试者的哺乳动物肾细胞的混合物，其包含具有1.045g/mL至1.052g/mL的密度的包含分离的 富集的肾小管细胞群体的第一细胞群体B2和具有1.063g/mL至1.091g/mL的密度的包含红细胞生成素(EPO)生成细胞和血管细胞但消耗了肾小球细胞的第二细胞群体B4’，所述细胞混合物用生物材料包被，或将其沉积在生物材料上或其中，捕获于其中，悬浮于其中，包埋在其中和/或另外地与其组合。在某些实施方案中，混合物不包括具有< 1.045g/ml的密度的包含集合管和肾小管系统的大颗粒细胞的BI细胞群体，或具有> 1.091g/ml的密度的包含具有低粒度和活力的碎片和小细胞的B5细胞群体。
在一个实施方案中，构建体包括特征在于血管标志物的表达的B4’细胞群体。在一些实施方案中，B4’细胞群体的特征不在于肾小球标志物的表达。在某些实施方案中，混合物能够进行氧可调节的红细胞生成素(EPO)表达。在所有实施方案中，混合物可来源于哺乳动物肾组织或培养的肾细胞。
在一个实施方案中，构建体包括被构造为适用于混合物捕获和/或附着的三维(3-D)多孔生物材料。在另一个实施方案中，构建体包括被构建为适用于包埋、附着、悬浮或包被哺乳动物细胞的液体或半液体凝胶的生物材料。在另一个实施方案中，构建体包括由主要地高分子量种类的透明质酸(HA)组成的经构造以水凝胶形式存在的生物材料。在另一个实施方案中，构建体包括由主要地高分子量种类的透明质酸组成的经构造以多孔形式存在的生物材料。在另一个实施方案中，构建体包括由具有约50微米至约300微米的孔的基于聚乳酸的泡沫组成的生物材料。在另一个实施方案中，构建体包括可来源于对于需要增强的肾功能的受试者是自体的肾样品的一种或多种细胞群体。在某些实施方案中，样品为肾活检组织。在一些实施方案中，受试者患有肾病。在其它实施方案中，细胞群体来源于非自体肾样品。在一个实施方案中，构建体提供红细胞的动态平衡。分泌产物在一个其它方面，本发明涉及从富集的肾细胞群体或富集的肾细胞群体的混合物分泌产物，如本文中所描述的。在一个实施方案中，产物包括下列物质的一种或多种:旁分泌因子、内分泌因子、邻分泌因子和囊泡。囊泡可包括下列物质的一种或多种:旁分泌因子、内分泌因子、邻分泌因子、微囊泡、外来体和RNA。分泌产物还可包括不在微囊泡内的产物，包括但不限于旁分泌因子、内分泌因子、邻分泌因子和RNA。例如，已在囊泡的外部分检测到细胞外 miRNA (Wang 等人，Nuc Acids Res2010, l_12do1:10.1093/nar/gkq601, 2010 年 7 月7日)。分泌产物还可称为细胞来源的产物，例如细胞来源的囊泡。在一个其它实施方案中，分泌产物可以为来源于肾细胞的囊泡的部分。囊泡可以能够递送因子至其它目的地。在一个实施方案中，囊泡为分泌的囊泡。涉及几种类型的分泌的囊泡，包括但不限于外来体、微囊泡、外来体、膜颗粒、外来体-样囊泡和细胞凋亡囊泡(Thery等人2010.Nat.Rev.1mmunol.9:581-593)。在一个实施方案中，分泌的囊泡为外来体。在一个其它实施方案中，分泌的囊泡为微囊泡。在一个其它实施方案中，分泌的囊泡包含或包括一种或多种细胞组分。组分可以为下列组分的一种或多种:膜脂质、RNA、蛋白质、代谢产物、细胞质组分及其任意组合。在优选实施方案中，分泌的囊泡包括微小RNA，由或基本上由微小RNA组成。优选，miRNA为人miRNA。在一个实施方案中，一种或多种miRNA选自 miR-30b-5p、miR-449a、miR-146a、miR-130a、miR-23b、miR-21、miR-124 和 miR-151。在一个其它实施方案中，一 种或多种miRNA可选自let-7a-l、let_7a_2、let_7a_3、let_7b、let_7c、let_7d、let_7e、let_7f_l、let_7f_2、let_7g、let-71、mir-l-l、mir-l-2、mir-7_l、mir-7—2、mir-7—3、mir-9—1、mir-9—2、mir-9—3、mir-10a、mir-10b、mir_15a、mir_15b、mir-16-l、mir-16-2、mir-17、mir-18a、mir-18b、mir-19a、mir-19b-l、mir-19b-2、mir-20a、mir_20b、mir_21、mir_22、mir_23a、mir_23b、mir_23c、mir-24_l、mir-24_2、mir_25、mir-26a_l、mir-26a_2、mir_26b、mir_27a、mir_27b、mir_28、mir_29a、mir-29b_l、mir-29b-2、mir-29c、mir-30a、mir-30b、mir-30c-l、mir-30c-2、mir-30d、mir-30e、mir-31、mir-32、mir_33a、mir_33b、mir_34a、mir_34b、mir_34c、mir-92a_l、mir-92a_2、mir_92b、mir-93、mir_95、mir_96、mir_98、mir_99a mir_99b、mir-100、mir-101-1、mir-101_2、mir-103-1、mir-103-l_as、mir-103_2、mir-103-2_as、mir-105_l、mir-105_2、mir_106a、mir_106b、mir_107、mir_122、mir-124_l、mir-124_2、mir-124_3、mir_125a、mir-125b_l、mir-l 25b_2、mir-l 26、mir_l 27、mir_l 28-1、mir_l 28-2、mir_l 29-1、mir_l 29-2、mir_l 30a、mir_130b、mir_132、mir_132、mir-133a_l、mir-133a_2、mir_133b、mir_134、mir-135a_l、mir-135a-2、mir_135b、mir-136MI101351120、mir-137、mir-138-1、mir-138-2、mir-139、3! :τ-324:Λ3; :τ-325Λ3; :τ-326Λ3; :τ-328Λ3; :τ-329-1Λ3; :τ-329-2Λ3; :τ-330Λ3; :τ-331Λ3; :τ-335Λmir-337> mir-33 °mir-339> mir-34: mirl34:2y mir-1MT1mir-34: mir-36rmir-365°mir-36,°°mir-365-rmir-365-5°3! :τ-367Λ mir-369y mir-37pmir-sr^mir-375°mir-37,°°mirl374:ay mirl374:tK mirl374:cy mirl375y mirl376al;u mirl376al2y mirl376tK mirl376cy3! :τ-377Λ mir-37 °mir-378rmir-378cy mir-379y mir-38pmir-38rmir-385°mir-38,°°mir-38^mirl4:09y mir-4:l mir-4:lrmirl4:12y mir-4:2rmirl4:22a> mirl4:23y mirl4:24^mirl4:25y mirl4:29y mirl4:3;u mirl4:32y mirl4:33y mirl448y mirl449ay mirl449tK mirl449cymir-4:50a-rmir-^soa-^mir-4:50rmir-4:5rmirl4:52y mirl4:54^ mirl4:55y mir-4:6 mir-^IS,00mirl4:84^ mir-^IST1mir-4:8 mirl4:87a> mir-4:87rmirl4:88y mir-4:8 mir-4:9pmir-4:9rmirl4: 92y mirl4:93y mirl4:94^ mirl4:95y mir-4:96> mirl4:97y mirl4:98y mir-4:9^mir-500 mir-500rmir-50rmir-505°mir-50,°°mir-50^mir-soT1mir-506y mir-sor^mir-so^mir-sog-rmir-sog-^mir-sog-^mir-slpmir-sll-rmir-sll-^mir-s^-rmir-512-5°mir-513a-rmir-513a-5°mir-513rmir-513 mir-5H-rmir-5H-5°mir-5H-,°°mir-5Hrmir-515-rmir-515-5°mir-516a-rmir-516a-5°mir-516b-rmir-516b-5°mir-517ay mir-517rmir-517 mir-518a-rmir-518a-5°mir-518rmir-518cy mir—518dy mir-518ey mir—518f\ mir-519a-rmir-519a-5°mir-519rmir-519cymir-519dy mir-519ey mir-520 mir—520tK mir-520cy mir-520dy mir-520 mir—520f\mirl520gy mirl520tK mirl521l;u mirl521l2y mirl522y mirl523y mirl524:y mirl525ymir-526a-rmir-526a-5°mir-526rmir-527> mir-535°mir-539> mir-54:rmir-s^mirl54:3y mirl54:4:y mirl544tK mirl54:5y mirl54:8ally mirl54:8al2y mirl54:8al3ymirl54:8aal;u mirl54:8aal2y mirl54:8tK mirl54:8cy mirl54:8dl;u mirl54:8dl2y mirl54:8eymirl54:8fl;u mirl54:8fl2y mirl54:8fl3y mirl54:8fl4^ mirl54:8fl5y mirl54:8gy mirl54:8hl;umirl54:8hl2ymirl54:8hl3ymirl54:8hl4^mirl54:8il;umirl54:8il2ymirl54:8il3ymirl54:8il4^mirl54:8J\ mirl54:8ky mirl54:81y mirl54:8my mirl54:8rK mirl54:8CK mirl54:8PK mirl54:8symirl54:8ty mirl54:8lK mirl54:8vy mirl54:8wy mirl54:8; u mirl54:8yy mirl54:8zy mirl54:9ymir-550a-rmir-550a-5°mir-550b-rmir-550b-5°mir-551 mir-551rmir-555°mir-55,°°mir-554y mir-ssT1mir-556y mir-ssr^mir-55 °mir-559y mir-56rmir-565°CN 103154236 A 0.S 21/82 矧
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2办
权利要求
1.一种给自体肾提供再生作用的方法，所述方法包括将自体肾与由富集的肾细胞群体分泌的产物体内接触。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述产物包括旁分泌因子。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述产物包括内分泌因子。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述产物包括邻分泌因子。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述产物包括囊泡。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述囊泡包括微囊泡。
7.根据权利要求5所述的方法，其中所述囊泡包括外来体。
8.根据权利要求5-7中任一项所述的方法，其中所述囊泡包括选自旁分泌因子、内分泌因子、邻分泌因子和RNA的分泌产物。
9.根据权利要求1所述的方法，其中所述产物由包含直接接种在支架上或支架中的富集的肾细胞群体的肾细胞构建体分泌。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述支架包含生物相容性材料。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述生物相容性材料为水凝胶。
12.根据权利要求1或9所述的方法，其中所述产物的分泌为对氧水平的生物响应。
13.根据权利要求12所述的方法，其中分泌通过低于大气氧水平来诱导。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述更低的氧水平为低于约5%的氧。
15.根据权利要求1或9所述的方法，其中所述再生作用为上皮细胞-间质细胞转化(EMT)的减少。
16.根据权利要求15所述的方法，其中上皮细胞-间质细胞转化(EMT)的减少是通过减弱TGF-β信号转导来进行。
17.根据权利要求1或9所述的方法，其中所述再生作用为肾脏纤维化的减少和/或肾炎的减轻。
18.根据权利要求1或9所述的方法，其中所述再生作用的特征在于干细胞标志物在自体肾中的差异表达。
19.根据权利要求1或9所述的方法，其中所述群体包括包含富集的肾小管细胞的群体的第一细胞群体Β2。
20.根据权利要求1或9所述的方法，其中所述群体包括包含第一细胞群体Β2和第二细胞群体的人肾细胞的混 合物，其中Β2包括富集的肾小管细胞的群体并且其中所述第二细胞群体包括红细胞生成素(EPO)生成细胞、肾小球细胞和血管细胞中的一种或多种。
21.根据权利要求19或20所述的方法，其中所述Β2细胞群体具有约1.045g/mL至约1.052g/mL 的密度。
22.根据权利要求20所述的方法，其中所述第二细胞群体为具有约1.063g/mL至约1.091g/mL的密度的B4细胞群体。
23.根据权利要求20所述的方法，其中所述第二细胞群体为具有约1.052g/ml至约1.063g/ml的密度的B3细胞群体。
24.根据权利要求21-23中任一项所述的方法，其中所述混合物还包括第三细胞群体，其中所述第三细胞群体包含红细胞生成素(EPO)生成细胞、肾小球细胞和血管细胞中的一种或多种。
25.根据权利要求24所述的方法，其中所述第三群体为具有约1.063g/mL至约1.091g/mL的密度的B4细胞群体。
26.根据权利要求24所述的方法，其中所述第三细胞群体为具有约1.052g/ml至约1.063g/ml的密度的B3细胞群体。
27.根据权利要求1或9所述的方法，其中所述富集的肾细胞群体对于自体肾是非自体的。
28.根据权利要求1或9所述的方法，其中所述富集的肾细胞群体对于自体肾是自体的。
29.一种用于评估肾病(KD)患者是否响应于利用治疗剂的治疗的方法，所述方法包括检测与对照样品中囊泡或其腔内容物的量相比较或相对于其，获自利用治疗剂治疗的KD患者的测试样品中囊泡或其腔内容物的量，其中与对照样品中囊泡或其腔内容物的量相比较测试样品中囊泡或其腔内容物的更高或更低的量表示患者对利用治疗剂的治疗的响应。
30.根据权利要求29所述的方法，其中所述囊泡为肾来源的囊泡。
31.根据权利要求29或30所述的方法，其中所述囊泡包含生物标志物。
32.根据权利要求31所述的方法，其中所述生物标志物为miRNA。
33.根据权利要求29所述的方法，其中所述治疗剂包括富集的肾细胞群体。
34.根据权利要求2 9所述的方法，其中所述测试样品包括尿。
全文摘要
本发明涉及生物活性肾细胞群体、肾细胞构建体以及制备和使用所述细胞群体和构建体的方法。
文档编号C12N5/071GK103154236SQ201180034688
公开日2013年6月12日 申请日期2011年5月12日 优先权日2010年5月12日
发明者R.M.艾拉甘, R.W.凯勒, S.C.普雷斯内尔, S.乔德赫里, A.T.布鲁斯, C.W.根海默, B.R.考克斯, K.I.格思里, J.巴苏, S.M.华莱士, E.S.沃丁, O.A.奈特, N.D.桑哈, J.W.卢德洛, C.R.哈伯斯塔特, R.佩恩, 小尼尔.F.罗宾斯, D.麦科伊, D.杰恩, M.J.杰约, E.A.里韦拉, T.斯潘塞, B.沃茨 申请人:坦吉恩股份有限公司