带g6pd1303?1497位点缺失的转基因斑马鱼模型及构建方法
【专利摘要】本发明公开了一种带g6pd1303?1497位点缺失的转基因斑马鱼模型，将g6pd基因带1303?1497位点缺失的gata1?g6pdM1303?1497?EGFP?PBSK?Isce I质粒与Isce I酶一起注入斑马鱼的单细胞期胚胎。本发明的优点是：同时驱动g6pd与EGFP基因，可实现1303?1497位点缺失的突变型g6pd基因在红细胞中表达的“可示踪”观察。
【专利说明】
带g6pd1303-1497位点缺失的转基因斑马鱼模型及构建方法
技术领域
[000?]本发明属于设计基因工程技术领域，特别涉及一种带g6pdl303-1497位点缺失的 转基因斑马鱼模型及构建方法。
【背景技术】
[0002] 葡萄糖_6_憐酸脱氛酶缺乏症（gluocose-6-phosphate dehydrogenase deficiency，简称G6H)缺乏症)俗称蚕豆病，是世界上最常见的遗传性溶血性红细胞酶缺陷 病。G6ro基因突变导致G6ro酶活性降低，主要通过两种机制影响酶的活性，即影响G6ro功能 结构区的作用和G6ro二聚体的形成。G6ro酶是参与红细胞酵解磷酸戊糖氧化途径的起始限 速酶，主要功能是催化生成重要的还原性物质还原型辅酶Π (NADPH)，而NADPH是维持机体 重要抗氧化物质还原型谷胱甘肽(GSH)还原状态所必需的辅酶。当机体G6H)酶活性缺乏时， 会影响NADPH的产生，NADPH是机体多种物质合成代谢的供氢体，同时维持还原型谷胱甘肽 (GSH的还原状态）的生成量，从而减弱机体还原型谷胱甘肽(GSH)及过氧化氢(H202)抗氧化 剂的抗氧化效果，使红细胞中的血红蛋白及红细胞膜在接触氧化性损伤时易损害。产生大 量的氧自由基，此时，红细胞膜无法抵抗氧化攻击，红细胞膜蛋白间聚合键遭受破坏，受累 红细胞因此失去变形能力，容易在血流的冲击及毛细血管的挤压作用下发生破溶，进而发 生急性溶血。
[0003] 目前全世界就G6PD缺乏症发病的详细机制尚不清楚，有待进一步的研究探讨。常 见临床表现包括新生儿黄疸、药物或感染造成的急性溶血、蚕豆病和先天性非球形细胞溶 血性贫血(CNSHA)等。现今，对G6PD缺乏症的治疗措施主要为早期筛查，避免诱发因素等预 防治疗措施。一旦经确诊后的病例给予服禁用药物，避免诱发因紊。高胆红素血症予以蓝光 照射、碱化血液、输白蛋白、输血等对症治疗，以及相关辅助治疗。国内外仍未有特异性治疗 G6H)缺乏症的治疗措施，也没有一种十分理想的动物实验模型可以很好的实现G6H)基因的 结构变化与功能之间关系的研究。
【发明内容】
[0004] 本发明要解决的技术问题是提供一种带g6pdl303-1497位点缺失的转基因斑马鱼 模型。
[0005] 为了解决上述技术问题，本发明的技术方案为一种带g6pdl303-1497位点缺失的 转基因斑马鱼模型，将g6pd基因带1303-1497位点缺失的gatal-g6pd M13Q3-1497-EGFP-PBSK-Isce I质粒与Isce I酶一起注入斑马鱼的单细胞期胚胎。
[0006] 本发明还提供了一种构建所述的带g6pdl303-1497位点缺失的转基因斑马鱼模型 的方法，包括以下步骤：
[0007] (1)将g6pdM13Q3-1497-EGFP-PCS 2+，gata-1-PBSK-IsceI质粒酶切连接构建gatal-g6pdM13Q3-1497-EGFP-PBSK-I see I 质粒；
[0008] (2)将所述gatal-g6pdM13Q3-1497-EGFP-PBSK-Isce I质粒通过显微注射的方式注入 单细胞期斑马鱼胚胎动物极胚盘内；
[0009] (3)通过观察24hpf期胚胎是否表达绿色荧光筛选出转基因的胚胎并孵化养至成 鱼作为代转基因斑马鱼；
[0010] (4)以所述F0代转基因斑马鱼与野生型交配后产生的表达绿色荧光的胚胎孵化并 养至成鱼作为F1代转基因斑马鱼；
[0011] (5)通过观察胚胎EGFP荧光情况和基因组PCR法鉴定转入的g6pdM13Q3- 1497-EGFP基 因的表达和插入情况。
[0012] 本发明还提供了一种带g6pdl303-1497位点缺失的转基因斑马鱼模型的应用，所 述转基因斑马鱼模型用于筛选治疗G6PD缺乏症药物的过程中示踪观察到药物处理过程中 红细胞的变化。所述转基因斑马鱼模型是转入1303-1497位点突变G6H)基因的转基因模型， 该段基因编码斑马鱼G6H)蛋白序列中435-499位氨基酸序列，与人类G6PD蛋白序列中447-489位氨基酸序列高度保守。人类G6PD蛋白序列中447-489位氨基酸序列为NADP+的结合位 点，包含了中国人G6H)缺乏症常见的G1376T、G1388A两个G6H)基因突变位点，该段氨基酸序 列的完整性直接影响G6H)结构完整性及功能完整性。
[0013] gata-Ι是原始红系发育中的特异性的转录因子，标记早期红系细胞。在24hpf，斑 马鱼的血液循环开始建立时可检测到gata-1-EGFP标记的红细胞随循环流动。48h之后 gata-Ι表达逐渐减少。所以利用gata-Ι作为驱动突变的g6pd基因的启动子可以使突变型 g6pd基因在红细胞中特异性表达。从而实现突变型g6pd基因在红细胞中表达的"可示踪"观 察。
[0014] 本发明通过生物学信息的比对，发现斑马鱼和人的G6PD蛋白同源性高达80%以 上。人类G6H)蛋白序列中447-489位氨基酸序列为NADP+的结合位点并包含中国人G6H)突变 的常见G1376T，G1388A两个突变位点，该段氨基酸序列的完整性直接影响G6PD结构完整性 及功能完整性。对比斑马鱼G6H)蛋白序列中435-499位氨基酸序列与人类G6PD蛋白序列中 447-489位氨基酸序列高度保守，随即构建敲除斑马鱼G6PD蛋白质435-499氨基酸序列对应 的cDNA序列1303-1497的基因序列的斑马鱼突变型g6pd，通过分子生物学技术将突变型 g6pd基因装入特定载体中，利用显微注射技术将目的质粒导入斑马鱼体内，实现显性负性 效应，进而建立G6H)缺乏症的斑马鱼模型，从而进一步研究斑马鱼中g6pd的突变对其G6PD 酶活性的影响，G6PD的结构及功能的变化导致红细胞受损的详细机制，为人类G6H)缺乏症 的详细机制及大规模高通量药物筛选提供基础。
[0015]相比于传统的G6PD缺乏症动物模型，本发明具有如下优点：
[0016] l、gata-l是原始红系发育中的特异性的转录因子，标记早期红系细胞。在24hpf， 斑马鱼的血液循环开始建立时可检测到gata-1-EGFP标记的红细胞随循环流动。利用gata-1作为驱动突变的g6pd基因的启动子可以使突变型g6pd基因在红细胞中特异性表达。
[0017] 2、gatal同时驱动g6pd与EGFP基因，可实现突变型g6pd基因在红细胞中表达的"可 示踪"观察。
[0018] 3、斑马鱼胚胎与成鱼通体透明，构建的该动物模型可以在显微镜下示踪胚胎和鱼 体内荧光标记红细胞在药物诱导下的变化规律，为筛选治疗G6PD缺乏症的药物提供可视的 动物模型。
【附图说明】
[0019] 图1为gatal-g6pdM13(^1497-EGFP转基因斑马鱼胚胎与幼鱼荧光表达情况照片。
【具体实施方式】
[0020] 下面结合附图对本发明的【具体实施方式】作进一步说明。在此需要说明的是，对于 这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，下面所描述 的本发明各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
[0021] 实施例一
[0022] 基因斑马鱼模型的构建方法，包括如下步骤：
[0023] (1)构建 gatal_g6pdM13()3-1497-EGFP-PBSK_IsceI 重组质粒：
[0024]将g6pdM13°3-1497-EGFP-PCS 2+、gata-1-PBSK-Isee I两个质粒按以下连接体系重组 连接：
[0025] A · g6pdM13°3-1497-EGFP-PCS2+质粒3yL，gata-1-PBSK-Isee I质粒5yL，10 X T4DNA Ligase Buffer lyL，T4DNA Ligase lyL，总体积 10yL。充分混匀后，4°C保存。
[0026] B.将重组后的gatal-g6pdM13Q3-1497-EGFP-PBSK_Isce I质粒转化及筛选单克隆菌 落：
[0027] 1)将1支感受态大肠杆菌悬液，于冰上解冻；
[0028] 2)将目的连接产物用移液器加入到感受态大肠杆菌悬液中，轻轻吹吸至混匀，于 冰上放置30min;
[0029] 3)将混合后的感受态大肠杆菌悬液置于42°C水浴锅热击90s，迅速于冰上放置 90s ；
[0030] 4)加入300μ1 LB液体培养基，37°C恒温振荡培养45min，转速160rpm;
[0031] 5)取20μ1及80μ1培养后的感受态大肠杆菌悬液均匀涂于含Amp抗性的LB固体培养 基，培养箱中37 °C过夜。
[0032] 6)选取类圆形的阳性的单菌落，用移液器挑取后混合入含lul/ml Amp的LB液体培 养基中，37 °C恒温箱，转速140rpm培养12h以上。
[0033] C.重组gatal_g6pdM13Q3-1497-EGFP-PBSK_Isce I质粒的质粒抽提：质粒提取采用市 售的质粒小抽试剂盒。
[0034] D.重组gatal_g6pdM13()3-1497-EGFP-PBSK_Isce I质粒的三酶切鉴定：
[0035] 用BamHI、EcoRI、XhoI对gatal-g6pdM13°3-1497-EGFP-PBSK-Isce I重组质粒进行三 酶切鉴定：
[0036] 取gatal-g6pdM13()3-1497-EGFP-PBSK-Isce I 2yL，加 BamHI，EcoRI，XhoI酶各lyL，加 lOXTangoTM buffer 2yL，2d.H20 3yL，总体积10yL，37°C中酶切3个小时，将酶切产物经 1 %琼脂糖凝胶电泳鉴定。
[0037] (2)目的质粒gatal_g6pdM13()3-1497-EGFP-PBSK_IsceI导入斑马鱼体内：
[0038] A.收集斑马鱼0.75hpf时相即单细胞期的Tuebingen野生型品系斑马鱼胚胎，在体 视镜下选取形态完整的胚胎，用egg water清洗干净。将胚胎置于显微注射模具上，将胚胎 动物极对准显微注射方向；
[0039] Β·按以下注射体系将gatal-g6pdM13Q3-1497-EGFP-roSK-Isce I质粒显微注射入单 细胞期斑马鱼胚胎的动物极中：gatal-g6pdM13Q3-1497-EGFP-PBSK-Isce I质粒（198.04ngAx L)0.2yL，ISceI 0.4yL，5X IScel buffer 0.1yL，2d.H20 1.3yL，总体积2yL。
[0040] C.将注射gatal_g6pdM13Q3-1497-EGFP-PBSK_Isce 1 质粒后的斑马鱼胚胎用egg water饲养，发育至9hpf，在焚光体式镜下观察绿色焚光蛋白的表达情况，筛选出可以表达 绿色荧光的胚胎，待胚胎发育至24hpf时，筛选出血液循环中表达绿色荧光蛋白的胚胎，作 为代饲养至性成熟期；
[00411 (3)F1代Tg:gatal-g6pdM13()3-1497-EGFP转基因品系斑马鱼绿色荧光蛋白表达情况 的观察，见图1:
[0042]将饲养至性成熟期的F0代Tg:gatal-g6pdM13Q3-1497-EGFP转基因品系斑马鱼与 Tuebingen野生型品系斑马鱼交配，收集子代胚胎，以egg water饲养，分别于llhpf、24hpf、 36hpf、48hpf发育时相，在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达情况，选择子代胚胎的血 液循环表达绿色荧光蛋白的作为F1代Tg:gatal-g6pd M13(^1497-EGFP转基因品系斑马鱼饲 养，同时初步筛选出对应的的代Tg: gatal-g6pdM13(^1497-EGFP转基因品系斑马鱼。
[0043] (4)基因组PCR法鉴定F1代Tg:gatal-g6pdM13Q3- 1497-EGFP转基因品系斑马鱼基因组 中插入的目的基因：
[0044] A.将待筛的 F0 代 Tg:gatal-g6pdM13Q3-1497-EGFP 转基因品系斑马鱼与 Tuebingen 野 生型品系斑马鱼交配，收集血液循环可以表达绿色荧光蛋白的子代胚胎，提取基因组DNA:
[0045] 1)收集血液循环可以表达绿色荧光蛋白的发育至36hpf的子代胚胎，随机选取2枚 胚胎转移至 1.5ml EPP管中，吸尽egg water，加入 100yL Lysis buffer，于PCR仪中，98°C， 消化lOmin;
[0046] 2)加入 proteinK( 10mg/ml) 10yL，于水浴锅中 55°C 消化过夜；
[0047] 3)将消化过夜的胚胎置于PCR仪中，98°C，10min;
[0048] 4)向EPP管中加入等体积的氯仿，12000rpm离心10min，吸上清至新的1.5mlEPP管 中；
[0049] 5)重复步骤(4);
[0050] 6)加入总体积1/10的NaAc，加入等体积同量的异丙醇，上下轻5min, 12000rpm离心 15min,吸弃上清；
[0051 ] 7)加入预先配好的70%无水乙醇.2(1.!120.111117/1:油6,75(^离心5111；[11;
[0052] 8)重复步骤(7);
[0053] 9)超净工作台中室温下开盖干燥20min;并以One drop测定基因组DNA含量。
[0054] B.以所提取的基因组DNA作为模板，按以下扩增体系扩增鉴定子代转基因斑马鱼 中g6pdM13(^1497基因片段：
[0055] KOD-Plus 10XBuffer,1.25yL；2mM dNTPs,1.25yL；25mM MgS04,lyL；50ymol/yl Primer 正向，0 · 25yL; 50μηιο1/μ1 Primer反向，0 · 25yL;
[0056] Genomic DNA,5yL；2d.H20,3.25yL；KOD-Plus(1.OU/μΙ),0.25yL〇
[0057] 总体积12.5yL。向PCR管中依次加入上述样品瞬时离心混匀，PCR反应条件如下：
[0058]
[0059] PCR扩增产物经1 %琼脂糖凝胶电泳检测大小，电压100V，时间30min，缓冲液1 X TAE，鉴定F1代Tg:gatal-g6pdM13()3_1497-EGFP转基因品系斑马鱼基因组中扩增出外源性导入 的目的突变型g6pd M13(^1497基因。
[0060] 实施例二
[0061] -种转基因斑马鱼模型的应用，采用实施例1所得转基因斑马鱼模型用于筛选治 疗G6H)缺乏症药物的过程中示踪观察到药物处理过程中红细胞的变化。该转基因斑马鱼模 型是转入1303-1497位点突变G6PD基因的转基因模型，该段基因编码斑马鱼G6PD蛋白序列 中435-499位氨基酸序列，与人类G6PD蛋白序列中447-489位氨基酸序列高度保守。人类 G6H)蛋白序列中447-489位氨基酸序列为NADP+的结合位点，包含了中国人G6H)缺乏症常见 的G1376T、G1388A两个G6PD基因突变位点，该段氨基酸序列的完整性直接影响G6PD结构完 整性及功能完整性。gatal-g6pd M13(^1497-EGFP转基因斑马鱼胚胎与幼鱼荧光表达情况见图 1，斑马鱼胚胎与成鱼通体透明，构建的该动物模型可以在显微镜下示踪胚胎和鱼体内荧光 标记红细胞在药物诱导下的变化规律，为筛选治疗G6PD缺乏症的药物提供可视的动物模 型。
[0062] 以上结合附图对本发明的实施方式作了详细说明，但本发明不限于所描述的实施 方式。对于本领域的技术人员而言，在不脱离本发明原理和精神的情况下，对这些实施方式 进行多种变化、修改、替换和变型，仍落入本发明的保护范围内。
【主权项】
1. 一种带g6pdl303-1497位点缺失的转基因斑马鱼模型，其特征在于，将g6pd基因带 1303-1497位点缺失的gatal-g6pd M13Q3-1497-EGFP-PBSK-Isce I质粒与Isce I酶一起注入斑 马鱼的单细胞期胚胎。2. -种构建所述的带g6pdl303-1497位点缺失的转基因斑马鱼模型的方法，其特征在 于，包括以下步骤： (1) 将g6pdM13°3-1497-EGFP-PCS2+，gata-1-PBSK-IsceI 质粒酶切连接构建 gatal-g6pdM13°3-1497-EGFP-PBSK-I see I 质粒； (2) 将所述gatal-g6pdM13Q3-1497-EGFP-PBSK-Isce I质粒通过显微注射的方式注入单细 胞期斑马鱼胚胎动物极胚盘内； (3) 通过观察24hpf期胚胎是否表达绿色荧光筛选出转基因的胚胎并孵化养至成鱼作 为F0代转基因斑马鱼； (4) 以所述F0代转基因斑马鱼与野生型交配后产生的表达绿色荧光的胚胎孵化并养至 成鱼作为F1代转基因斑马鱼； (5) 通过观察胚胎EGFP荧光情况和基因组PCR法鉴定转入的g6pdM13(^1497-EGFP基因的表 达和插入情况。3. -种带g6pdl303-1497位点缺失的转基因斑马鱼模型的应用，其特征在于，所述转基 因斑马鱼模型用于筛选治疗G6PD缺乏症药物的过程中示踪观察到药物处理过程中红细胞 的变化。
【文档编号】A61K49/00GK106035233SQ201610451399
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年6月22日
【发明人】舒莉萍, 何志旭, 吴西军, 周艳华, 夏海雄, 宋锦, 庹媛媛, 尚鲁俊
【申请人】贵州医科大学