一种基于多重延伸连接的探针扩增方法、其用途和试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及基于多重延伸连接的探针扩增法的技术领域。更特别地，本发明涉及 根据本发明的方法用于检测葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因 SNP的用途；以及用于本发明方法 的试剂盒。
【背景技术】
[0002] 葡萄糖 _6_ 憐酸脱氧酶（Glucose-6-phosphate dehydrogenase，G6PD)是胞楽 中一种重要的酶，广泛存在于所有细胞内，对红细胞的完整性和正常功能尤其重要。葡萄 糖-6-憐酸脱氧酶缺乏（Glucose-6-phosphate dehydrogenase deficiency，G6PDd)是最常 见的遗传性酶病。据估计，全世界至少有4亿人携带G6H)缺陷的基因，其中大约有3. 5亿 分布于症疾流行国家，参见 Nkhoma ET，Poole C，Vannappagari V，Hall SA，Beutler E:The global prevalence of glucose-6-phosphate dehydrogenasedeficiency: a systematic review and meta-analysis. Blood Cells Mol Dis 2009,42:267_278。尽管 G6PD 缺 乏的患病率在不同的国家、不同地区、不同人群之间有很大差别，但其在疟疾流行国家 的流行率高达 8%，参见 Howes RE, Piel FB，Patil AP，Nyangiri 0A，Gething PW，Dewi M，Hogg MM，Battle KE，Padilla CD，Baird JK，Hay SI:G6PD deficiency prevalence and estimates of affected populations in malaria endemic countries:a geostatistical model-based map. PLoS Med 2012, 9:e100 1339X6PD缺乏已成为世界范围内特别是疟疾流 行地区重要的公共卫生问题。
[0003] G6H)缺乏是由于编码葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的G6H)基因的突变引起酶的活性 下降，表现出G6H)缺乏的表型。G6H)基因位于X染色体长臂2区8带（Xq28)，全长约 18kb，包含 13 个外显子，12 个内含子，参见 Martini G，Toniolo D，Vulliamy T，Luzzatto Lj Dono Rj Viglietto G，Paonessa Gj Di Urso M，Persico MG:Structural analysis of the X-Iinked gene encoding human glucose 6-phosphate dehydrogenase. EMBO J 1986, 5:1849-1855,编码含515个氨基酸的蛋白亚基，有活性的G6H)酶由两个或四个 亚基组成，参见 Au SW，Naylor CE, Gover S，Vandeputte-Rutten L，Scopes DA，Mason PJ，Luzzatto L，Lam VM，Adams MJ: Solution of the structure of tetrameric human glucose 6-phosphate dehydrogenase by molecular replacement. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 1999,55:826-834。
[0004] G6H)缺乏的遗传表现为典型的X染色体连锁模式。由于男性只有一个G6H)等位基 因，为半合子（hemizygote)，因此，可能表现为正常或缺乏；而女性有两个G6H)等位基因， 由于其中一条X染色体随机失活（莱昂假说），两个G6H)等位基因中有一个失活，为遗传 嵌合体（mosaic)，参见 Beutler E，Yeh M，Fairbanks VF: The normal human female as a mosaic of X-chromosome activity: studies using the gene for C-6-PD-deficiency as a marker. Proc Natl Acad Sci USA 1962, 48:9-16 ；Davidson RGjNitowsky HMjChilds B:Demonstration of Two Populations of Cells in the Human Female Heterozygous for Glucose-6-Phosphate Dehydrogenase Variants. Proc Natl Acad Sci USA 1963,50:481-485。因此，女性患者可能表现为正常、缺乏（纯合子）或介于正常和缺乏的 中间体（杂合子）。女性杂合子的临床表现复杂多样，有些无症状或临床症状轻，有些会发 生严重的急性溶血性贫血。在某些人群中G6H)缺乏的等位基因突变频率很高，纯合子并不 罕见。
[0005] G6ro基因是人类基因组中具有高度多态性的基因之一。据最新报道，目前已发 现的G6H)基因突变类型有186种，编码的酶表现出不同的残余活性（residual enzyme activity)。这些突变中，绝大多数（85. 4%，159/186)为单点错义突变（missense)，少数 (8.0%，15/186)为多点突变（两个或两个以上取代），缺失突变（deletion)占的比例很 小（5. 3%)，仅有2个突变（1%)发生在内含子区，参见Minucci A，Moradkhani K，Hwang MJ, Zuppi C, Giardina B, Capoluongo E:Glucose-6-phosphate dehydrogenase(G6PD) mutations database:review of the〃old〃and update of the new mutations. Blood Cells Mol Dis 2012,48:154-165。
[0006] G6H)缺乏可能是酶分子数量减少的定量改变，也可能是酶结构不同引起定性改 变，或两者都有。研究发现，所有已知的基因突变均发生在编码区，尚未发现有突变影响基 因表达调控区，这表明Gero缺乏是由于酶稳定性下降引起的，而不是基因表达缺乏引起 的。G6ro基因的突变在人群中非常常见，但不同人群中各种突变型出现的频率却有很大 的不同，有一些位点已经达到多态性的频率（polymorphic frequencies)。G6PD A -型是 非洲和欧洲南部最常见的突变型，并且在北美、南美、意大利以及西印度群岛等地的发生 频率也很高。其次，最常见的是G6H)地中海型（Mediterranean)和G6H) Union型，被报 道发生于萨丁尼亚岛，加那利群岛，参见Cabrera VM, Gonzalez P, Salo WL:Human enzyme polymorphism in the Canary Islands. VII. G6PD Seattle in Canarians and North African Berbers. Hum Hered 1996, 46:197-200 和中国，参见 Perng LI,Chiou SS, Liu TC, Chang JG:A Novel C-Substitution to T-Substitution at Nucleotide 1360 of Cdna Which Abolishes a Natural Hha-I Site Accounts for a New G6pd Deficiency Gene in Chinese. Human Molecular Genetics 1992, 1:205-205 等地。
[0007] 尽管G6H)缺乏广泛分布于世界各地，但在疟疾流行区，G6H)缺乏的发病 率更高。从历史上来看，大量的流行病学研究发现G6H)缺乏的地理分布与疟疾的 分布很类似，据此有学者提出Gero缺乏患病率升高是疟疾自然选择的假说，参见 Ruwende C, Hill A:Glucose-6-phosphate dehydrogenase deficiency and malaria. J Mol Med(Berl) 1998, 76:581-588 ；Louicharoen C1Patin E1Paul RjNuchprayoon I,Witoonpanich B,Peerapittayamongkol C,Casademont I,Sura T,Laird NM, Singhasivanon P, et al:Positively Selected G6PD_Mahidol Mutation Reduces Plasmodium vivax Density in Southeast Asians. Science 2009,326:1546-1549 ； Motulsky AG:Metabolic polymorphisms and the role of infectious diseases in human evolution. Hum Biol 1960,32:28-62。最新的痕疾地图计划（Malaria Atlas Project, MAP)公布了 2010年全球间日疟的分布地图，使用空间统计模型详细描述了全球 各地间日疟的地方流行特点。报道发现，Gero缺乏与间日疟流行在地理分布上存在共定位 的现象，在间日疟流行的国家和地区Gero缺乏患病率很高。据该统计模型估计，疟疾流行 国家的G6H)缺乏的等位基因频率（allele frequency)高达8%，也就是大约2. 2亿男性和 1. 33亿女性携带突变基因型。这项研究也支持了疟疾是G6H)缺乏优势选择背后的驱动力 量这一理论。在疟疾流行区开展G6ro缺乏的研究有着重要的公共卫生意义。
[0008] 在我国，绝大多数疟疾是间日疟，主要集中在中部和南部地区。其中，云南省和海 南省的发病率最高，参见 Wardrop NA, Barnett AG, Atkinson JA, Clements AC:Plasmodium vivax malaria incidence over time and its association with temperature and rainfall in four counties of Yunnan Province, China. Malar J 2013, 12:452。
[0009] 云南省是我国疟疾流行最严重的地区之一，从1999年至2004年以来，疟疾报告病 例数量排第一位，疟疾发病率排第二位