重组蛋白通过与PNGaseF共表达在活体内去糖基化的制作方法

重组蛋白通过与PNGaseF共表达在活体内去糖基化的制作方法【专利摘要】本发明阐述用于通过使用瞬时表达系统在植物中与细菌性PNGase?F(肽：N-糖苷酶F)共表达使重组N-糖基化蛋白在活体内去糖基化的材料和方法。阐述例如在植物中以非糖基化形式产生所关注的重组蛋白的方法。还提供在植物中表达活性细菌性PNGase?F的方法。【专利说明】重组蛋白通过与PNGaseF共表达在活体内去糖基化【
技术领域：
】[0001]此文件涉及用于在植物中以非糖基化形式产生重组蛋白的材料和方法。【
背景技术：
】[0002]已经研究基于植物的表达作为一种产生重组医药蛋白的方法。此技术尤其可用于表达糖基化蛋白。举例来说，哺乳动物糖蛋白当在转基因植物中表达时有效糖基化。[0003]然而，植物糖基化蛋白质的能力对基于植物的表达系统的有效性也存在重要限制。举例来说，一些真核生物(例如，疟原虫属(Plasmodium)寄生虫)缺少用于N-连接糖基化的机制。源自这些物种的蛋白质可含有多个当在植物中表达时可异常糖基化的潜在糖基化位点，此由于(例如)表位的不正确/改变的折叠或遮蔽而导致降低的功能性和免疫原性。实际上，碳水化合物的附着可强烈影响蛋白质的物理-化学性质，且因此可改变必需的生物学功能，例如蛋白质的免疫原性、特定活性和配体-受体相互作用。[0004]异常N-糖基化对于许多治疗应用产生许多问题。举例来说，癌细胞经常以蛋白质N-糖基化异常增加为特征(米哈依(Mihai)等人，(2009)癌症研究(CancerRes.)69:5673)。另外，细胞表面受体(包括整合素和钙粘素)的异常N-糖基化似乎与癌进展和转移中的变化相关联(果(Guo)等人，(2002)癌症研究62=6837-6845;帕特里奇(Partridge)等人，(2004)科学(Science)306:120-124;和伊佐治(Isaii)等人(2004)生物化学杂志(J.Biol.Chem.)279:19747-19754)。而且，植物与哺乳动物的N-连接聚糖之间存在重要结构差异。举例来说，植物复合N-聚糖含有人类复合聚糖中不存在的β1，2-木糖和α?，3-岩藻糖残基。另外，应注意，由于不同的糖基化阶段，当在转基因植物中表达时可产生多种形式的重组蛋白，由此在蛋白质纯化期间分离这些形式产生额外的工作。[0005]已经努力人源化在植物中表达的生物医药的N-连接糖基化和N-聚糖(巴克(Bakker)等人(见上文)；圣_捷雷-杜帕斯(Saint-Jore-Dupas)等人，(2007)生物技术趋势(TrendsBiotechnol.)25(7):317-323;弗雷(Frey)等人，(2009)植物生物技术杂志(PlantBiotechnol.J.)7(I):33-48;松尾(Matsuo)和松村(Matsumura)(2011)植物生物技术杂志9(2)=264-281;伊东美咲(Misaki)等人，(2003)糖生物学(Glycobiol.)13(3)；199-205;帕劳克帕(Palacpac)等人，(1999)美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sc1.USA)96(8):4692-4697;斯特拉瑟(Strasser)等人，(2009)生物化学杂志284(31):20479-20485;和维齐纳(Vezina)等人，(2009)植物生物技术杂志7(5):442-455)。[0006]然而，之前尚未在任何真核系统(包括在植物系统)中满意地实现蛋白质在活体内的酶去糖基化。举例来说，例如使用衣霉素(tunicamycin)阻断N-糖基化的策略在植物中导致蛋白质的不均匀表达(霍里(Hori)和艾尔宾(Elbein)(1981)植物生理学(PlantPhysiol.)67:882-886;和弗兰克(Frank)等人，(2008)植物生理学148(3):1354-1367)。【
发明内容】[0007]此文件提供使用瞬时表达方法在植物细胞中产生去糖基化形式的蛋白质(例如，特别的候选疫苗或治疗性蛋白质)的材料和方法。使用这些方法产生的蛋白质对于其功能性和免疫原性来说可尤其有用。[0008]此文件部分地基于研发在细胞中通过瞬时表达细菌性肽:N-糖苷酶F(PNGaseF)与所关注的另一种多肽的组合在植物细胞中产生去糖基化蛋白的方法。之前还未在植物系统中表达细菌性PNGaseF。如下文实例中所阐述，细菌性PNGaseF是与多种重组蛋白(特别地，痕疾(malaria)候选疫苗Pfs48FlE、炭疽芽孢杆菌(B.anthracis)保护性抗原(PA)和对抗炭疽芽孢杆菌PA的抗体)在本塞姆氏烟草(Nbenthamiana)中瞬时共表达。细菌性PNGaseF在活体内具有完全活性且成功地从靶标糖蛋白裂解N-连接的寡糖，获得所表达蛋白质的均匀性。[0009]因此，本文所述的研究展现蛋白质的酶去糖基化可在活体内使用引入的去糖基化酶在真核系统中实现。此方法可用于在瞬时植物表达系统中以去糖基化形式产生治疗性蛋白质和抗体。此对于一些蛋白质来说可极为重要，尤其那些在其天然宿主中不糖基化但当在其它真核宿主中表达时可异常糖基化的蛋白质，此潜在地导致降低的功能性和免疫原性。本文所提供的方法可在植物(例如，本塞姆氏烟草)中通过共表达许多靶标(例如，蛋白质、抗体、候选疫苗)与修饰酶(例如PNGaseF)来修饰这些靶标具有广泛应用。[0010]在一个方面中，此文件的特点在于生成所关注的去糖基化多肽的方法。所述方法可包括产生真核细胞，所述真核细胞包含(a)第一核酸，其包含编码细菌性PNGaseF多肽的第一核苷酸序列，其中所述第一核苷酸序列可操作地连接到启动子，以便当所述启动子被激活时，表达所述PNGaseF多肽；和(b)第二核酸，其包含编码所关注多肽的核苷酸序列，其中第二核苷酸序列可操作地连接到启动子，以便当所述启动子被激活时，表达所述所关注的多肽，其中通过PNGaseF多肽的作用，所关注的多肽去糖基化。所述方法可包括将第一和第二核酸同时引入到细胞中、将第一和第二核酸分别引入到细胞中。第一和第二核酸可存在于同一核酸构筑物中。真核细胞可为植物细胞(例如，本塞姆氏烟草(Nicotianabenthamiana)细胞)。第一核苷酸序列可与SEQIDNO:1中所阐述的序列具有至少90%序列一致性。PNGaseF多肽可具有与SEQIDNO:2中所阐述的序列具有至少90%序列一致性的氨基酸序列。第一和第二核酸可经由土壤杆菌(Agrobacterium)构筑物引入到细胞中。[0011]在另一方面中，此文件的特点在于真核细胞，其包含(a)第一核酸，其包含编码细菌性PNGaseF多肽的第一核苷酸序列，其中第一核苷酸序列可操作地连接到启动子，以便当所述启动子被激活时，表达PNGaseF多肽；和(b)第二核酸，其包含编码所关注多肽的核苷酸序列，其中第二核苷酸序列可操作地连接到启动子，以便当所述启动子被激活时，表达所关注的多肽。真核细胞可为植物细胞(例如，本塞姆氏烟草细胞)。第一核苷酸序列可与SEQIDNO:1中所阐述的序列具有至少90%序列一致性。PNGaseF多肽可具有与SEQIDNO:2中所阐述的序列具有至少90%序列一致性的氨基酸序列。[0012]此文件的特点还在于在植物细胞中表达活性细菌性PNGaseF多肽的方法，其包含将包含编码细菌性PNGaseF多肽的核苷酸序列的核酸引入到植物细胞中，其中核苷酸序列可操作地连接到启动子，以便当启动子被激活时，表达PNGaseF多肽。核苷酸序列可与SEQIDNO:1中所阐述的序列具有至少90%序列一致性。PNGaseF多肽可具有与SEQIDNO:2中所阐述的序列具有至少90%序列一致性的氨基酸序列。核酸可经由土壤杆菌构筑物引入到植物细胞中。植物细胞可为本塞姆氏烟草细胞。[0013]在另一方面中,此文件的特点在于表达系统,其包含(a)第一核酸,其包含编码细菌性PNGaseF多肽的第一核苷酸序列，其中第一核苷酸序列可操作地连接到启动子，以便当第一核酸引入到真核细胞中且启动子被激活时，表达PNGaseF多肽；和(b)第二核酸，其包含编码所关注多肽的核苷酸序列，其中第二核苷酸序列可操作地连接到启动子，以便当第二核酸引入到真核细胞中且启动子被激活时，表达所关注的多肽。第一核苷酸序列可与SEQIDNO:1中所阐述的序列具有至少90%序列一致性。PNGaseF多肽可具有与SEQIDNO:2中所阐述的序列具有至少90%序列一致性的氨基酸序列，且其中多肽保持糖苷酶活性。真核细胞可为植物细胞(例如，本塞姆氏烟草细胞)。[0014]除非另有定义，否则本文中所使用的所有技术和科学术语具有与所属领域的技术人员通常所理解的含义相同的含义。尽管本发明的实践可使用类似或等效于本文所述的方法和材料的方法和材料，但下文阐述适宜方法和材料。本文所提及的所有出版物、专利申请案、专利和其它参考文件的全部内容均以引用方式并入本文中。倘若出现冲突，则将以本说明书(包括定义)为准。另外，材料、方法和实例仅为说明性而非限制性。[0015]附图和下文说明中陈述了本发明一个或一个以上实施例的细节。根据本说明书和图式以及权利要求书，本发明的其它特征、目的和优势将变得显而易见。【专利附图】【附图说明】[0016]图1展示如本文所述在本塞姆氏烟草中表达的PNGaseF的核苷酸和氨基酸序列。图1A展示来自脑膜脓毒性伊丽莎白菌(Elizabethkingiameningoseptica)(基因库(GENBANK)?登录号J05411)的PNGaseF基因的核苷酸序列(SEQIDNO:1)，其作为密码子最优化用于在本塞姆氏烟草中与编码His6-标签和KDEL(SEQIDNO:5)的核苷酸融合表达。图1B展示PNGaseF的推导的氨基酸序列(SEQIDNO:2)。MGFVLFSQLPSFLLVSTLLLFLVISHSCRA(SEQIDNO:3)是烟草PR-1a信号肽；DYKDDDDK(SEQIDNO:4)是FLAG表位。[0017]图2展示来自共表达PfS48F1和细菌性PNGaseF的本塞姆氏烟草叶的提取物的西方墨点法(Westernblot)。叶样品是在OTPI(渗入后天数)、6DPI和7DPI时获得，且在用于TSP(总可溶蛋白质)的提取缓冲液中研磨，在用于TSPT(利用0.5%曲拉通X-100提取的TSP)的含有曲拉通(Triton)X-1OO的提取缓冲液中研磨，且在用于TP(总蛋白质)的含有IX十二烷基硫酸钠(SDS)样品缓冲液的提取缓冲液中研磨。PNGaseF(图2A)是利用抗FLAG多克隆抗体检测；Pfs48FlE(图2B)是利用小鼠单克隆抗His抗体检测。1，TP;2，TSP;3，TSPT。[0018]图3展示经纯化PNGaseF的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)凝胶(图3A)和比较Pfs48Fl在活体外和活体内条件下的去糖基化的西方墨点法(图3B)。对于图3A来说，PNGaseF是如下文实例I中所述使用抗FLAG琼脂糖管柱从本塞姆氏烟草纯化，且通过SDS-PAGE分析经纯化蛋白质。对于图3B中所示的西方墨点法，将经纯化Pfs48FlE在非变性条件下与增加量的从植物中纯化的PNGaseF或与从纽英伦生物实验室(NewEnglandBiolabs)获得的PNGaseF—起培育。Pfs48Fl蛋白质是利用抗His标签单克隆抗体检测。将通过经纯化或市售PNGaseF去糖基化的Pfs48Fl与在活体内通过共表达PNGaseF去糖基化的Pfs48Fl(右起第二泳道)相比较。“MWM”是指分子量标记物[SEEBLUE*Plus2预染标准物(图3A)，和MAGICMARK?XP西方蛋白质标准物(图3B);两种标记物均来自英杰公司(Invitrogen);加利福尼亚州卡尔斯巴德(Carlsbad,CA)]。[0019]图4描绘西方墨点法,其展示炭疽芽孢杆菌(Bacillusanthracis)的保护性抗原(PA)(图4A)和对抗炭疽芽孢杆菌PA的抗体(图4B)与PNGaseF的共表达。对于PNGaseF与炭疽芽孢杆菌PA和对抗炭疽芽孢杆菌PA的抗体的共表达，使用pGRD4_PA83_l/pB1-PNGaseF和pB1-PA-A/pGRD4_PNGaseF构筑物用于渗入到本塞姆氏烟草植物中。将叶样品(从利用PA渗入的植物在OTPI时和从利用对抗炭疽芽孢杆菌PA的抗体的抗体渗入的植物在6DPI时获得)在提取缓冲液中研磨，离心，并在SDS-样品缓冲液中稀释。在西方墨点分析之前，使10μI样品在SDS-PAGE上运行。利用抗His单克隆抗体探测PA带。利用兔抗α人类抗体探测对抗炭疽芽孢杆菌PA的抗体。[0020]图5图解说明从Pfs48Fl的糖基化(菱形)和去糖基化(正方形)形式的比较性ELISA分析获得的结果。在所述分析中使用识别Pfs48Fl的表位I(图5A)、IIb(图5B)、III(图5C)和V(图5D)的单克隆抗体。[0021]图6图解说明mAbV结合到Pfs48Fl变体的亲和力。如实例I中所解释使用以下各项实施动力学分析:来自经转化本塞姆氏烟草的经纯化Pfs48Fl(图6A)、利用PNGaseF在活体外去糖基化的经纯化Pfs48Fl(图6B)和来自共表达PNGaseF的经转化本塞姆氏烟草纯化的活体内去糖基化Pfs48Fl(图6C)。Pfs48Fl的活体内去糖基化和活体内去糖基化Pfs48Fl的纯化如本文实例中所述执行。[0022]图7图解说明mAb结合到Pfs48Fl变体的亲和力，如由对通过Pfs48Fl变体的结合由游离mAbIII所生成的信号的抑制所展示。[0023]图8描绘经转化本塞姆氏烟草中表达的臂_Pfs48Fl的西方墨点法。经转化植物的叶样品是在7DPI时获得，且在用于TSP的提取缓冲液中研磨或在用于TP的含有SDS的提取缓冲液中研磨，如所指示使用或不使用二硫苏糖醇(DTT)。[0024]图9图解说明活体内去糖基化Pfs48Fl和叶绿体靶向臂_Psf48Fl对mAbIII(图9A)和mAbV(图9B)的结合亲和力，如从比较性ELISA分析所测定。【具体实施方式】[0025]本文所阐述的材料和方法可用于在植物(例如，本塞姆氏烟草)中产生去糖基化形式的蛋白质(例如，候选疫苗和治疗性蛋白质)。使用这些方法产生的蛋白质对于其功能性和免疫原性可尤其有用。[0026]定义[0027]趁璧:术语“核酸”、“多核苷酸”和“寡核苷酸”在本文中互换使用，是指至少三个核苷酸的聚合物。核苷包含连接到糖分子的含氮碱基。在多核苷酸中，磷酸酯基团共价连接相邻核苷以形成聚合物。聚合物可包括天然核苷(例如，腺苷、胸苷、鸟苷、胞苷、尿苷、脱氧腺苷、脱氧胸苷、脱氧鸟苷和脱氧胞苷)、核苷类似物、化学修饰碱基、生物修饰碱基(例如，甲基化碱基)、嵌入碱基和/或经修饰的糖(例如，经修饰嘌呤或嘧啶)。参见科恩伯格(Kornberg)和贝克(Baker)(1992)DNA复制(DNARerlication),第2版，加利福尼亚州旧金山弗里曼(Freeman,SanFrancisco,CA):沙伊德(Scheit)(1980)核苷酸类似物(NucleotideAnalogs),约翰威利(JohnWiley),纽约(NewYork,NY))和美国专利公开案第20040092470号和其中关于各种核苷酸、核苷和可用于本文所述多核苷酸中的主链结构的进一步讨论的参考文献。多核苷酸可具有任何长度和序列，且可为单链或双链。当此文件提供核酸序列时，也提供互补序列。另外，当序列是作为DNA提供时，也提供相应的RNA序列(即，T由U代替的序列)。[0028]核酶构筑物:本文所用的术语“核酶构筑物”是指已经人工修饰的核酶或衍生自此核酸。举例来说，核酸构筑物相对于天然存在的核酸分子可含有突变、缺失或取代。核酸构筑物可包含两个或两个以上衍生自或源自不同来源(例如不同有机体)的核酸片段(例如，重组多核苷酸)。核酸构筑物的一个或一个以上部分的序列可完全由人来发明。[0029]核酸序列:本文所用的术语“核酸序列”是指核酸物质本身，且并不局限于以生物化学方式表征特定核酸(例如，DNA或RNA)分子的序列信息(即，在五个碱基字母A、G、C、T或U中所选字母的接续)。[0030]基通:出干此文件的目的，术语“基因”具有此项技术中所了解的含义。一般来说，术语“基因”是指包括编码蛋白质的部分的核酸；此术语任选地除编码序列(开放阅读框)以外可涵盖调控序列，例如启动子、增强子、终止子等。此定义并不打算排除将术语“基因”应用于非蛋白编码表达单元，相反澄清一下，在大多数情形中，此文件中所用的术语是指蛋白质编码核酸。将了解，基因的定义可包括不编码蛋白质、而是提供(例如)用于功能RNA分子(例如tRNA或rRNA)的转录的模板的核酸。[0031]基因产物或表达产物:一般来说，基因产物或表达产物是从基因转录的RNA或由从所述基因转录的RNA编码的多肽。基因或多核苷酸的表达是指(I)RNA从基因或多核苷酸的转录；⑵从所述基因或多核苷酸转录的RNA的翻译，或⑴和(2)二者。[0032]载述:“载体”是指能够介导核酶分子进入(例如，转移或运输)细胞中的核酶或病毒、病毒基因组或其部分(例如，病毒壳体或病毒基因组的组份)。当载体为核酸时，待转移的核酸分子通常连接到(例如，插入到)载体核酸分子。核酸载体可包括引导适宜宿主细胞内的自主复制的序列(例如，复制起源)，或可包括足以使所有核酸的部分整合到宿主细胞DNA中的序列。有用的核酸载体包括(例如)DNA或RNA质粒、粘粒和天然存在或经修饰的病毒基因组或其部分或可包装在病毒壳体中的核酸(DNA或RNA)。质粒载体通常包括复制起源和一种或一种以上可选择标记。质粒可包括部分或所有病毒基因组(例如，病毒启动子、增强子、加工或包装信号等)。可用于将核酸分子引入到细胞中的病毒或其部分(例如，病毒壳体)称为病毒载体。有用的动物病毒载体包括腺病毒、逆转录病毒、慢病毒、痘苗病毒和其它痘病毒、单纯性疱疫病毒(herpessimplexvirus)和其它类似物。有用的植物病毒载体包括那些基于烟草花叶病毒(tobamovirus)、等轴不稳环斑病毒(ilarvirus)等的病毒载体。当将病毒载体引入宿主细胞中时，其可能含有或可能不含有足够的产生传染性病毒的病毒基因信息，即，病毒载体可能具有复制缺陷且对本发明的某些实施例来说，这些复制缺陷病毒载体可能是优选的。当缺乏足够信息时，可能(但不必)由宿主细胞或引入细胞中的另一载体供应。“表达载体”是包括一个或一个以上表达控制序列的载体，且“表达控制序列”是控制和调控另一DNA序列的转录和/或翻译的DNA序列。[0033]所关注的多核苷酸:如本文所用，术语“所关注的多核苷酸”是指待表达细胞的任何靶标序列，如本文所述。所关注的多核苷酸可为(例如)蛋白质编码多核苷酸，但也可为提供用于结构RNA或活性RNA(例如，核酶或干扰RNA)的转录的模板的序列。在一些实施例中，多核苷酸可为本质上不在相关类型的细胞中表达、或不以当通过人工干预实现表达时表达多核苷酸的水平表达的基因，如本文所述。在某些实施例中，所关注的多核苷酸可包括不是在相关细胞中自然发现但在其它细胞类型或有机体中自然发现的序列。或者或另外，所关注的多核苷酸可为根据本文件并非天然与其所相连的载体序列相连的多核苷酸。[0034]可操作地连接:如本文所用，术语“可操作地连接”是指两个核酸序列之间的关系，其中一个核酸序列的表达是由(例如)另一核酸序列控制、调控或调节。举例来说，核酸序列的转录是由可操作地连接的启动子引导；核酸的转录后加工是由可操作地连接的加工序列引导；核酸序列的翻译是由可操作地连接的翻译调控序列引导；核酸或多肽的运输或定位是由可操作地连接的运输或定位序列引导；且多肽的翻译后加工是由可操作地连接的加工序列引导。可操作地连接到第二核酸序列的核酸序列通常是直接或间接地共价连接到此一序列，但任何有效的三维缔合均是可接受的。应注意，单一核酸序列可可操作地连接到多个其它序列。举例来说，单一启动子可直接转录多种RNA物种。当RNA聚合酶能够将编码序列转录到mRNA中，且接着可翻译成由所述编码序列编码的蛋白质时，那么所述编码序列“可操作地连接”细胞中的表达控制序列且“在其控制下”。[0035]宿主细胞:术语“宿主细胞”包括重组表达载体可引入其中的细胞。与所揭示表达系统和方法一起使用的宿主细胞通常为真核细胞，例如植物细胞。如本文所用，“转化”和“转染”涵盖通过许多种技术中的一者将核酸分子(例如，载体)引入到细胞中。[0036]Mk:如本文所用，术语“多肽”是指氨基酸链，无论长度或翻译后修饰(例如，糖基化或磷酸化)。多肽可包括全长蛋白质或其片段或变体。“所关注的多肽”是指表达细胞的靶标序列，如本文所述。在一些实施例中，所关注的多肽可为本质上不在相关类型的细胞中表达、或不以当通过人工干预实现表达时表达多肽的水平表达的多肽，如本文所述。在某些实施例中，所关注的多肽可包括不是在相关细胞中自然发现但在其它细胞类型或有机体中自然发现的序列。[0037]%—致性:“一致性”是指两个或两个以上核酸序列或两个或两个以上氨基酸序列相同的程度。评估窗口内两个序列之间的％—致性是通过以下来计算:将序列进行比对，确定评估窗口内的与同一核苷酸或氨基酸相对的核苷酸或氨基酸的数目，允许引入间隙以使一致性最大化，除以窗口中核苷酸或氨基酸的总数且乘以100。[0038]任何核酸或氨基酸序列的％—致性是如下确定。首先，使用来自独立版本的BLASTZ(含有BLASTN2.0.14版和BLASTP2.0.14版)的BLAST2Sequences(B12seq)程序将核酸或氨基酸序列与经鉴别核酸或氨基酸序列进行比较。此独立版本的BLASTZ可从菲什&理查森(Fish&Richardson，s)网站(wwwifr.com/blast)或美国政府的国家生物技术信息中心(NationalCenterforBiotechnologyInformation)网站(ffffffincb1.nlm.nih.Rov/blast/executables)获得。关于解释如何使用B12seq程序的说明可在伴随BLASTZ的自述文件找到。[0039]B12seq使用BLASTN或BLASTP算法执行两个序列之间的比较。BLASTN用于比较核酸序列，而BLASTP用于比较氨基酸序列。为比较两个核酸序列，各选项设定如下:_i设定为含有待比较的第一核酸序列的文件(例如，CAseql.txt)；-1设定为含有待比较的第二核酸序列的文件(例如，C:\seq2.txt)；-p设定为blastn;_o设定为任何所要的文件名(例如，C:\output.txt)；-q设定为-1；-r设定为2;且所有其它选项保持其默认设置。举例来说，可使用以下命令来生成含有两个序列之间的比较的输出文件=C=\B12seq-1c=\segl.txt-1c:\seg2.txt~pblastn-oc:\output.txt-g-1-r20为t匕较两个氨基酸序列，B12seq的选项是如下设定:_i设定为含有待比较的第一氨基酸序列的文件(例如，Cj\seql.txt);_i设定为含有待比较的第二氨基酶序列的文件(例如，C:\seq2.txt);_p设定为blastp；-o设定为任何所要的文件名(例如，C:\output.txt);且所有其它选项保持其默认设置。举例来说，可使用以下命名来生成含有两个氨基酸序列之间的比较的输出文件:C:\B12seg-1c:\segl.txt~ic:\seg2.txt~pblastp-oc:\output.txt。如果革巴标序列与经鉴别序列的任一部分共享同源性，那么所指定的输出文件将呈现与经比对序列具有同源性的那些区域。如果靶标序列与经鉴别序列的任一部分不共享同源性，那么所指定的输出文件将不呈现经比对序列。比对时，通过计算与来自开始于任一匹配位置且结束于任一其它匹配位置的鉴别序列的序列对准的靶标序列中连续核苷酸或氨基酸残基的数目来确定长度。匹配位置是在靶标和经鉴别序列二者中呈现相同核苷酸或氨基酸残基的任何位置。由于空隙不是核苷酸或氨基酸残基，因此靶标序列中存在的空隙不予计数。同样，由于计数的是靶标序列核苷酸或氨基酸残基而非来自经鉴别序列的核苷酸或氨基酸残基，因此经鉴别序列中的空隙不予计数。[0040]所确定长度上的％—致性通过计数在所述长度上的匹配位置的数目并将所述数目除以长度，随后将所得值乘以100来确定。举例来说，如果(I)将1000核苷酸靶标序列与SEQIDNO:1中所阐述的序列进行比较，⑵所述B12seq程序呈现与SEQIDNO:1中所阐述的序列的区域对准的来自靶标序列的200个核苷酸，其中所述200个核苷酸区域的第一个和最后一个核苷酸是匹配放热，且(3)在这200个对准核苷酸上的匹配数目为180，那么所述1000核苷酸靶标序列含有200的长度且在所述长度上的％—致性为90(SP，(180^-200)*100=90)。[0041]将了解，与经鉴别序列对准的单一核酸或氨基酸靶标序列可具有不同长度，其中每一长度具有其自身％—致性。另外，应注意，％—致性值舍入到最接近的十分位。举例来说，78.11,78.12,78.13和78.14向下舍入到78.1，而78.15,78.16,78.17,78.18和78.19向上舍入到78.2。还应注意，长度值通常应为整数。[0042]经分离:如本文所用，术语“经分离”是指化合物或实体是(a)与至少一些通常与其缔合的组份分开(例如，经纯化)；(b)在活体外合成；和/或(C)通过涉及人工的工艺产生或制备。[0043]天然地:如本文所用，术语“天然地”和“天然存在的”是指其相关形式在自然界中存在的工艺、事件或事情。相比之下，术语“非天然存在”是指其存在或形成涉及人工的工艺、事件或事情。[0044]去糖基化:关于在存在或以其它方式暴露于PNGaseF多肽所产生的多肽，本文所用的术语“去糖基化”是指多肽的N-连接糖基化程度小于原本如果不是在存在或以其它方式暴露于PNGaseF多肽时所产生的多肽的糖基化程度。“去糖基化”多肽的N-连接糖基化水平与不是在存在或以其它方式暴露于PNGaseF多肽时所产生的相同多肽的N-连接糖基化水平相比减少至少约10%(例如，10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%)。[0045]核酸和载体[0046]本文提供的教示可用于将任何所关注的多核苷酸递送到细胞(例如，植物细胞)和/或使其在所述细胞中表达。蛋白质编码多核苷酸可表达(例如)酶、抗体、激素、细胞因子、调控因子、结构蛋白、或任何其它所关注的蛋白质或多肽。经编码蛋白质可为天然存在的蛋白质，或可为经设计或经改造蛋白质，包括(例如)融合蛋白(例如，纳入部分或全部植物病毒蛋白质(例如运动蛋白或外壳蛋白)的融合蛋白)。在一些实施例中，所关注的多核苷酸可含有编码标签(例如，6X-His标签、HA标签、Myc标签或FLAG标签)的蛋白质。这些标签可简化蛋白质的分离和/或纯化。在一些实施例中，标签可为可可裂解标签(例如，可通过蛋白酶(例如凝血酶)裂解的标签)，以便在纯化之后可容易地移除标签，获得具有野生型序列的蛋白质。[0047]在一些实施例中，多核苷酸可编码治疗活性蛋白质。实例性蛋白质包括(但不限于)激素(例如，胰岛素、甲状腺激素、儿茶酚胺、促性腺激素、促激素、催乳素、催产素、多巴胺、牛生长激素、降钙素、促卵泡激素和瘦素)、生长激素(例如，人类生长激素)、生长因子(例如，表皮生长因子、神经生长因子、血小板衍生生长因子、胰岛素样生长因子等等)、生长因子受体、细胞因子和免疫系统蛋白质[例如，白介素、集落刺激因子(CSF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、促红细胞生成素、肿瘤坏死因子(TNF)、TNF受体(可溶形式)、干扰素、整合素、地址素(addressin)、选择素、归巢受体、T细胞受体、免疫球蛋白、可溶性主要组织相容性复合体抗原、免疫活性抗原，例如细菌、寄生虫或病毒抗原或过敏原、自身抗原和抗体]、酶(例如，组织型纤溶酶原激活物、链激酶、胆固醇生物合成或降解酶、类固醇生成酶、激酶、DNAse、磷酸二酯酶、甲基化酶、去甲基化酶、脱氢酶、纤维素酶、蛋白酶、脂肪酶、磷酸脂酶、芳香酶、细胞色素、腺苷酸或鸟苷酸环化酶、神经氨酸苷酶等等)、受体(例如，类固醇激素受体和肽受体)、结合蛋白(例如，类固醇结合蛋白、生长激素或生长因子结合蛋白等等)、转录和翻译因子、癌蛋白质或原癌蛋白质(例如，细胞周期蛋白质)、肌蛋白(例如，肌球蛋白、原肌球蛋白等等)、脊髓蛋白(myeloprotein)、神经活性蛋白、肿瘤生长抑制蛋白(例如，血管抑素或内皮抑素，二者均抑制血管生成)、抗败血症蛋白(例如，杀菌渗入性增加蛋白质)、结构蛋白(例如，胶原蛋白、丝蛋白、纤维蛋白原、弹性蛋白、微管蛋白、肌动蛋白和肌球蛋白)和血液蛋白(例如，凝血酶、血清白蛋白、因子VI1、因子VII1、胰岛素、因子IX、因子X、组织型纤溶酶原激活物、蛋白质C、血管假性血友病因子(vonWillebrandfactor)、抗凝血酶II1、葡糖脑苷脂酶、促红细胞生成素粒细胞集落刺激因子(GCSF)或经修饰因子VII1、抗凝血剂，例如水蛭素(huridin)等等)。当然，此文件并不限于获准用于治疗用途的蛋白质，而且也涵盖任何多核苷酸的表达(无论编码还是不编码蛋白质)，且特定涵盖编码任何治疗活性蛋白质的任何多核苷酸的表达(无论起源是原核还是真核)。[0048]在一些实施例中，多核苷酸可编码一种或一种以上疫苗组份。一般来说，可希望疫苗包括当人类或动物感染病原体或经历一些其它不想要的事件(例如，发生肿瘤)时人类或动物免疫系统所暴露的蛋白质或蛋白质的多个部分。可调配成疫苗的蛋白质和多肽包括(但不限于)病毒外壳蛋白、病毒G蛋白、微生物细胞壁蛋白、微生物毒素蛋白和肿瘤特异性抗原。[0049]在一些实施例中，多核苷酸可用于表达合成或修饰生物活性剂的酶。举例来说，某些酶(例如，聚酮合成酶、多肽合成酶和萜烯合成酶)合成具有所关注生物活性的小分子，包括治疗活性(例如，抗生素、抗癌或免疫抑制活性)。另外，己知大量修饰蛋白质或小分子底物的酶(例如，激酶、水解酶和转移酶)。针对可使用本文所述的表达系统在植物中表达的其它蛋白质参见例如美国专利第6，500,644号。[0050]在一些实施例中，多核苷酸可编码诊断或研究试剂，包括例如抗体。在再其它实施例中，多核苷酸可编码营养相关蛋白质。这些蛋白质包括例如在由人类或家养动物(例如，猫和狗)消耗的食物中天然发现的蛋白质。其它实例包括具有平衡氨基酸组成的蛋白质，例如，组成例如用于全胃肠外营养的蛋白质的蛋白质。[0051]本文所提供的多核苷酸可编码PNGaseF多肽或保持糖苷酶活性的PNGaseF多肽的片段。PNGaseF是由革兰氏阴性菌(gram-negativebacterium)脑膜炎脓毒性黄杆菌(Flavobacteriummeningosepticum)分泌的34.8kDa酶(普卢默(Plummer)等人，(1984)生物化学杂志259(17):10700-10704;和塔伦蒂诺(Tarentino)等人，(1990)生物化学杂志265(12):6961-6966)。除非α(1-3)核心经岩藻糖基化，否则PNGaseF裂解N-连接糖蛋白中高甘露糖型混合且复杂寡糖的最内GIcNAc与天冬酰胺残基之间的键。通常，本文所述的PNGaseF多核苷酸编码功能性PNGaseF多肽或其当在细胞中表达时可提供去糖基化活性的片段。确定PNGaseF多肽或片段是否具有糖苷酶活性的方法包括那些此项技术中熟知的方法。举例来说，PNGaseF多肽的糖苷酶活性可如下文实例I中所述在活体外和活体内测试。通常，本文所提供的PNGaseF多肽片段所保留的糖苷酶活性可为具有SEQIDNO:2中所阐述的氨基酸序列的PNGaseF多肽的糖苷酶活性水平的至少10%(例如，至少10%、至少20%、至少25%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少75%、至少80%或至少90%)。[0052]还提供含有核酸的载体，例如本文所阐述的那些。在本文所提供的表达载体中，核酸(例如，编码PNGaseF或编码所关注的多肽的核酸)可可操作地连接到一个或一个以上表达控制序列。表达控制序列的实例包括启动子、增强子和转录终止区。启动子是由DNA分子的区域构成的表达控制序列，其通常在转录开始的点(一般接近RNA聚合酶II的起始位点)上游100个到500个核苷酸内。为获得在启动子控制下的编码序列，必需将多肽的翻译阅读框的转移起始位点定位用于启动子下游一个与约五十个核苷酸之间。增强子在时间、定位和水平方面提供表达特异性。不像启动子那样，增强子可在位于距转录位点各个位置处时起作用。增强子也可位于转录起始位点的下游。[0053]适宜表达载体包括(但不限于)源自(例如)以下的质粒和病毒载体:噬菌体、杆状病毒、烟草花叶病毒和其它植物病毒、疱疹病毒、巨细胞病毒、逆转录病毒、痘苗病毒、腺病毒和腺相关病毒。许多载体和表达系统是从诸如诺维珍(Novagen)(威斯康星州麦迪逊(Madison,WI))、克隆技术(Clontech)(加利福尼亚州帕罗奥图(PaloAlto,CA))、斯曲塔基因公司(Stratagene)(加利福尼亚州拉霍亚(LaJolla,CA))和英杰公司(Invitrogen)/生命技术公司(LifeTechnologies)(加利福尼亚州卡尔斯巴德)等公司购得。[0054]表达载体可包括经设计以促进所表达核酸序列的后续操纵和/或追踪(例如，纯化或定位)的标签序列。标签序列(例如绿色荧光蛋白(GFP)、谷胱甘肽S-转移酶(GST)、聚组氨酸、c-myc、血球凝集素或FlagTM标签(柯达公司(Kodak),康涅狄格州纽黑文(NewHaven7CT))序列)通常表达为与所编码多肽的融合物。这些标签可插入多肽的任何地方，包括在羧基或氨基末端处。[0055]多肽[0056]本文所述的材料和方法可适用于在真核细胞(例如，植物细胞)中产生多肽、特别是去糖基化多肽。如上文所指示，在一些实施例中，多肽可为医药蛋白，但所述方法一般并不限于多肽的特定用途。举例来说，可产生用于各种工业过程或生物修复过程中的任一者的酶(例如，降解污染物的酶)。因此，即使没有明确表示，本文所提供的说明和权利要求书认为适用于任何所关注的核酸或蛋白质，包括那些具有治疗应用者和没有治疗应用者。[0057]所表达的蛋白质或多肽可为或可不为在自然界中不在植物中表达的蛋白质或多肽。根据本文所阐述的方法可在细胞(例如，植物细胞)中表达的多肽的非限制性实例包括医药蛋白、例如激素(例如，胰岛素、甲状腺激素、儿茶酚胺、促性腺激素、促激素、催乳素、催产素、多巴胺、牛生长激素、降钙素、促卵泡激素和瘦素)、生长激素(例如，人类生长激素)、生长因子(例如，表皮生长因子、神经生长因子、胰岛素样生长因子、血小板衍生生长因子等等)、生长因子受体、细胞因子和免疫系统蛋白质(例如，白介素、CSF、G-CSF,GM-CSF、促红细胞生成素、TNF、TNF受体(可溶形式)、干扰素、整合素、地址素、选择素、归巢受体、T细胞受体、免疫球蛋白、可溶性主要组织相容性复合体抗原、免疫活性抗原，例如细菌、寄生虫或病毒抗原或过敏原、自身抗原和抗体)、酶(例如，组织型纤溶酶原激活物、链激酶、胆固醇生物合成或降解酶、类固醇生成酶、激酶、DNAse、磷酸二酯酶、甲基化酶、去甲基化酶、脱氢酶、纤维素酶、蛋白酶、脂肪酶、磷酸脂酶、芳香酶、细胞色素、腺苷酸或鸟苷酸环化酶、神经氨酸苷酶等等)、受体(类固醇激素受体和肽受体)、结合蛋白(例如，类固醇结合蛋白、生长激素或生长因子结合蛋白等等)、转录和翻译因子、癌蛋白质或原癌蛋白质(例如，细胞周期蛋白质)、肌蛋白(例如，肌球蛋白或原肌球蛋白等等)、脊髓蛋白、神经活性蛋白、肿瘤生长抑制蛋白(例如，血管抑素或内皮抑素，二者均抑制血管生成)、抗败血症蛋白(例如，杀菌渗入性增加蛋白质)、结构蛋白(例如胶原蛋白、丝蛋白、纤维蛋白原、弹性蛋白、微管蛋白、肌动蛋白和肌球蛋白)、血液蛋白例如(凝血酶、血清白蛋白、因子VI1、因子VII1、胰岛素、因子IX、因子X、组织型纤溶酶原激活物、蛋白质C、血管假性血友病因子、抗凝血酶II1、葡糖脑苷脂酶、促红细胞生成素G-CSF、经修饰因子VIII和抗凝血剂，例如水輕素)等等。[0058]在一些实施例中，所表达多肽可为抗原蛋白或多肽。举例来说，本文所述的方法可用于产生由受感染个体的免疫系统识别的传染性有机体的蛋白质(或其部分)。这些蛋白质或多肽可用于开发用于保护免于被相关有机体感染的疫苗。仅给出几个特定实例，根据本发明所阐述的方法可产生来自以下的有用抗原蛋白:炭疽病(anthrax)(例如,炭疽芽孢杆菌致死因子(LF)或PA)、霍乱病(cholera)(霍乱弧菌(Vibriocholerae))、巨细胞病毒、大肠杆菌(E.coli)的肠毒性菌株、口蹄病病毒、B型肝炎(例如，B型肝炎表面抗原或HBsAg)、C型肝炎(例如，HCV核心蛋白)、人类免疫缺陷病毒(例如，Tat、Rev、Nef、gpl60或gp120)、人类乳头状瘤病毒(例如，E7或E6)、流感(例如，HA或NA)、疟疾(例如，恶性疟原虫(Plasmodiumfalciparum)Pfs25、Pfs28、Pfs48/45或Pfs230)、麻疫病毒、诺沃克病毒(Norwalkvirus)、痕疫(例如，鼠疫耶尔森菌(Yersiniapestis)Fl或LcrV)、铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、狂犬病病毒、呼吸道合胞病毒(例如,F蛋白或G蛋白)、鼻病毒、轮状病毒、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、传染性胃肠炎病毒、锥虫(例如，布氏锥虫(Trypanosomabrucei)α-微管蛋白或β-微管蛋白)、肺结核或SARS。[0059]表达系统和宿主细胞[0060]此文件还提供可用于在宿主细胞(例如，植物细胞)中产生去糖基化多肽的表达系统。表达系统可包括含有编码PNGaseF多肽的多核苷酸序列的表达载体、以及含有编码所关注的多肽或蛋白质的所关注的多核苷酸的表达载体。在一些情形中，编码PNGaseF多肽的多核苷酸序列和编码所关注的多肽或蛋白质的所关注的多核苷酸可包括在同一核酸构筑物中。编码PNGaseF多肽和所关注的多肽或蛋白质的多核苷酸序列可各自可操作地连接到启动子，以便当将多核苷酸引入到真核细胞(例如，本塞姆氏烟草细胞)中且启动子被激活(例如，条件性或组成性)时，表达PNGaseF多肽和所关注的多肽或蛋白质。可操作地连接到PNGaseF编码序列和所关注的多肽的编码序列的启动子可相同或不同。在一些情形中，编码PNGaseF多肽的多核苷酸的序列可与SEQIDNO:1中所阐述的序列具有至少90%序列一致性(例如，至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性或100%序列一致性)。在一些情形中，所编码PNGaseF多肽可具有与SEQIDNO:2中所阐述的序列具有至少90%序列一致性(例如，至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97198%或99%序列一致性、或100%序列一致性)的氨基酸序列。[0061]各种不同系统中的任一者均可通过瞬时或稳定转化用于在植物中表达蛋白质或多肽。用于在植物组织中瞬时表达蛋白质或多肽的技术可利用(例如)植物病毒。病毒转化可是一种转化胚芽和植物的相对快速且低成本方法，所述胚芽和植物可在获得所要产物之前收获而无实验或世代延迟(experimentalorgenerationallag)。另一方面,未减毒的病毒可感染其它植物，此潜在地造成环境问题。[0062]在一些实施例中，所关注的多肽的表达可在组成型启动子的控制下。在其它实施例中，所关注的多肽的表达可为可诱导型，或可在组织、定时或发育调控的启动子的控制下。在一些情形中，举例来说，编码所关注的多肽的RNA的产生可在诱导型(例如，外源诱导型)启动子的控制下。外源诱导型启动子可响应外部而非内部刺激用于增加或降低转录物的表达。大量环境因素可用作这些外部刺激。在一些实施例中，转录可由热诱导型启动子(例如热休克启动子)来控制。[0063]在受控可调控生长环境的情况下，外部诱导型启动子可特别地有用。举例来说，使用热休克启动子，可简单地升高所包含环境的温度来诱导相关转录物的表达。当然，将了解，由于室外温度不能控制，因此热诱导型启动子不能用于室外。可使用的其它外部诱导型启动子包括光诱导型启动子，如果所包含可调控环境中的光一直开启，那么其可维持为组成型启动子。或者，可通过简单地打开灯而在发育期间的特定时间启动所关注的多肽的表达。[0064]在其它实施例中，化学诱导型启动子可用于诱导所关注的多肽的表达。在这些实施例中，可将化学品雾化或喷洒在种子、胚芽或植物上以诱导相关多肽的表达。喷洒和雾化可精确控制并引导到所要的特定种子、胚芽或植物上。所包含环境没有使化学品分散远离预期接受者的风或气流，以便化学品停留在所预期接受者上。[0065]此文件还提供具有病毒表达系统(例如，快速表达、高生产水平)和土壤杆菌转化(例如，受控投与)的优点的表达系统。举例来说，此文件提供其中土壤杆菌构筑物(即，可在土壤杆菌中复制且因此可通过土壤杆菌的递送来递送到植物细胞的构筑物)包括在引入到植物中之后引导携带用于所关注的蛋白质或多肽的基因的病毒序列(例如，包括病毒复制序列)的表达的植物启动子的系统。此系统允许蛋白质或多肽在植物中的受控、高水平瞬时表达。[0066]在一些情形中，去糖基化多肽可在转基因植物中产生，其中PNGaseF转基因和/或编码所关注的多肽的转基因稳定地整合到基因组DNA中并表达(例如，在细胞核中)。生成这些植物的方法己为此项技术己知。[0067]还提供含有本文所述核酸和载体的宿主细胞。核酸分子(例如，载体)可通过许多种技术中的一者引入到宿主细胞中，其包括(但不限于)所属领域己充分确立的技术。举例来说，核酸可通过基于土壤杆菌的转化(包括真空介导的转化)引入到宿主细胞中。例如，参见下文的实例。用于转化和转染宿主细胞的适宜方法也可在(例如)萨姆布鲁克(Sambrook)等人,分子克降:实验室手册(MolecularCloning:ALaboratoryManual)(第2版)，冷泉港实验室(ColdSpringHarborLaboratory),纽约(NewYork)(1989)中找到。这些包括(例如)磷酸钙沉淀、电穿孔、热休克、脂质转染、显微注射和病毒介导的核酸转移。另外，裸DNA可在活体内直接递送到细胞(参见例如，美国专利第5，580，859号和第5，589，466号)。[0068]根据本文所提供的系统和方法可利用对瞬时转染敏感的任何植物。一般来说，可希望使用适合在界定条件下(例如在室温和/或水性系统)中生长的植物。还可能希望选择通常人类或家养动物不消耗和/或通常不为人类食物链的部分的植物，以便其可在外面生长而没有所表达的多核苷酸可能不希望的被摄取的问题。然而，在一些实施例中，可希望使用可食用植物。[0069]所要植物的特性可由待表达的特定多核苷酸决定。举例来说，当多核苷酸编码待以闻广率广生的蛋白质时(例如，当表达治疗性蛋白质时可能如此)，选自具有相对闻生物质的植物可是有用的(例如，烟草，其出于其它原因还可特别有用，例如具有短的生长期且不在人类食物链中)。在一些实施例中，可使用作物植物或作物相关植物。[0070]可特别地与本文所述的表达系统和方法一起使用的植物包括(但不限于)被子植物(例如，烟草属(Nicotiana)，包括本塞姆氏烟草)、苔藓植物(例如，苔纲(Hepaticae)、藓纲(Musci)等)、蕨类植物(例如，蕨、马尾草和石松植物)、裸子植物(例如，针叶树、铁树(cycase)、银杏(Ginko)、买麻藤目(Gnetales))和藻类植物(例如，绿藻纲(Chlorophyceae)、褐藻纲(Phaeophyceae)、红藻纲(Rhodophyceae)、蓝藻纲(Myxophyceae)、黄藻纲(Xanthophyceae)和裸藻纲(Euglenophyceae))。[0071]本文所提供的系统和方法可用于在植物中在发育的任何阶段(包括例如成熟植物、幼苗、幼芽和种子)转染和/或表达多核苷酸。所述系统和方法可用于转染植物的任何部分(例如，根、叶、茎等)。[0072]方法[0073]此文件还提供在细胞(例如，植物细胞)中产生所关注的去糖基化多肽的方法。一般来说，方法可包括将编码PNGaseF的表达载体和编码所关注的多肽的表达载体递送到细胞中。举例来说，产生所关注的多肽的方法可包括将编码细菌性PNGaseF多肽的第一核酸和编码所关注的多肽的第二核酸引入到真核细胞中(例如，植物细胞，例如本塞姆氏烟草细胞)。编码PNGaseF多肽和所关注的多肽的第一和第二核酸内的核苷酸序列可可操作地连接到启动子，以便当启动子被激活(例如，组成性或条件性)时，表达PNGaseF多肽和所关注的多肽，且通过PNGaseF多肽的作用，所关注的多肽去糖基化。用于评价糖基化水平的方法包括此项技术中熟知的那些方法(例如，十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和西方墨点分析，如下文实例中所阐述，以及质谱和多糖检测)。[0074]连接到第一和第二核酸的启动子可为相同或不同启动子。另外，第一和第二核酸可包含在单独的构筑物内或在单一构筑物内。在一些实施例中，编码PNGaseF多肽的核酸所包括的序列可与SEQIDNO:1中所阐述的序列具有至少90%序列一致性(例如，至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性或100%序列一致性)。在一些情形中，所编码PNGaseF多肽可具有与SEQIDNO:2中所阐述的序列具有至少90%序列一致性(例如，至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性或100%序列一致性)的氨基酸序列。[0075]本文还提供在植物细胞中表达活性细菌性PNGaseF多肽的方法。所述方法可包括(例如)将编码细菌性PNGaseF多肽的核酸引入到植物细胞(例如，本塞姆氏烟草细胞)中。核酸可包括编码PNGaseF多肽且可操作地连接到启动子的核苷酸序列，以便当核酸引入到植物细胞中表达PNGaseF多肽。在一些情形中，核酸所包括的序列可与SEQIDNO:1中所阐述的序列具有至少90%序列一致性(例如，至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性或100%序列一致性)。在一些实施例中，所编码PNGaseF多肽可具有与SEQIDNO:2中所阐述的序列具有至少90%序列一致性(例如，至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性或100%序列一致性)的氨基酸序列。[0076]表达载体可使用此项技术中己知的技术递送到植物中。举例来说,载体可直接施加到植物(例如，经由研磨剂接种、机械化喷雾接种、真空渗入、粒子轰击或电穿孔)。或者，可制备病毒粒子(例如，来自先前感染的植物)，且可根据己知技术施加到其它植物。表达载体可同时或相继引入到细胞中。当使用相继引入时，引入第一表达载体(通常编码PNGaseF的载体)与引入第二表达载体(通常编码所关注的多肽的载体)之间可经过任何适宜时间长度。举例来说，第一和第二表达载体的引入可相隔I分钟到60分钟、I小时到24小、时或1天至丨J30天。[0077]应注意,在一些实施例中,第一表达载体、第二表达载体或两种表达载体可稳定转化到植物细胞中，以便生成转基因株系。举例来说，如果植物是针对PNGaseF编码序列的转基因植物，那么其可利用编码所关注的多肽的载体瞬时转化，以便所表达的所关注的多妝去糖基化。[0078]在一些实施例中，土壤杆菌转化可用于将一个或一个以上表达构筑物引入到细胞中。土壤杆菌是革兰氏阴性家族根瘤菌科(Rhizobiaceae)的代表属。此物种是植物肿瘤(例如冠瘿(crowngall)和毛根病)的原因。在以肿瘤为特征之去分化植物组织中，由土壤杆菌产生称为冠瘿碱之氨基酸衍生物并由植物使其分解代谢。负责冠瘿碱表达的细菌基因是嵌合表达盒的控制元件的方便来源。根据本文所述的方法，土壤杆菌转化系统可用于生成以去糖基化形式表达所关注的多肽的植物。[0079]土壤杆菌转化方法可容易地应用以重新生成表达医药蛋白的植物。一般来说，利用土壤杆菌转化植物涉及通过与携载含有(例如)编码医药蛋白的基因的植物/细菌载体的根癌土壤杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)共培养转化在组织培养基中生长的植物细胞。土壤杆菌将载体转移到植物宿主细胞且接着使用抗生素处理来消除。表达医药蛋白的经转化植物细胞可经选择，分离并重新生成完整植株(海伦斯(Hellens)等人，(2000)植物分子生物学(PlantMol.Biol.)42=819-832;皮隆-斯密特(Pilon-Smits)等人，(1999)植物生理学(PlantPhysiolog.)119(I):123-132;巴菲尔德(Barfield)和普阿(pua)(1991)植物细胞报告(PlantCellReports)10(6/7):308-314;和德拉西瓦(delaRiva)等人，(1998)生物技术电子杂志(ElectronicJ.Biotechnol.)I(3):在线版本ISSN0717-3458)。[0080]土壤杆菌表达载体可包括编码医药蛋白的基因(或表达盒)，其经设计以在植物中操作且在表达盒的上游和下游具有伴随序列。伴随序列一般具有质粒或病毒起源且为载体提供将DNA从细菌转移到所要植物宿主的所需特性。基本的细菌/植物载体构筑物可提供宽宿主范围的原核细胞复制起始点和原核细胞可选标记。适宜原核可选标记包括(例如)赋予抗生素(例如氨节西林(ampicillin)或四环素(tetracycline))抗性的标记。载体中也可存在编码此项技术中熟知的附加功能的其它DNA序列。举例来说，如果所关注的多肽的编码并不易于检测，那么细菌/植物载体构筑物也可包括适用于确定植物细胞是否已经转化的可选标记基因(例如，nptll卡那霉素(kanamycin)抗性基因)。[0081]某些载体可包括编码所关注的蛋白质的核酸。在给定转化中可使用一种、两种或两种以上表达载体。重组表达载体除蛋白质编码序列以外可含有至少以下元件:启动子区、植物5'非翻译序列、起始密码子(取决于是否有自己的表达基因)和转录与翻译终止序列。另外，可包括允许蛋白质加工和易位的的转录和翻译终止子和/或信号分泌序列。各种启动子、信号序列和转录和翻译终止子阐述于(例如)劳顿(Lawton)等人，(1987)植物分子生物学9:315-324和美国专利第5，888，789号中。另外，抗生素抗性的结构基因可用于选择(弗雷利(Fraley)等人，(1983)美国国家科学院院刊80=4803-4807)。在盒的5'和3'末端的独特的限制性内切酶位点可允许容易地插入到预先存在载体中。[0082]可用于土壤杆菌介导的转化的其它二元载体系统可阐述于(例如)PCT公开案第W00020612号中。另外，土壤杆菌介导的转化的讨论发现于高尔文(Gelvin)(2003)微生物学与分子生物学评论(Microbiol.Mol.Biol.Reviews)67(I):16-37,和洛朗斯(Lorence)和万普特(Verpoorte)(2004)分子生物学方法(MethodsMol.Biol.)267:329-350中。[0083]在一些实施例中，用于在植物中快速(例如，瞬时)表达蛋白质或多肽的系统可利用土壤杆菌构筑物来递送编码所关注的蛋白质或多肽的病毒表达系统。特别地，可制备含有土壤杆菌序列(包括复制序列)和携载编码所关注的蛋白质或多肽的核酸的植物病毒序列(包括自我复制序列)的“投放载体(launchvector)”。投放载体可通过(例如)可允许实质上系统性递送的农杆菌渗入法(agroinfiltration)引入到植物组织中。对于瞬时转化来说，投放载体的非整合T-DNA拷贝可保持瞬时存在于细胞核中且可经转录，以引起所编码多肽的引起(迦毗罗(Kapila)等人，(1997)植物科学(PlantSc1.)122:101-108)。与病毒载体的表达不一样，土壤杆菌介导的瞬时表达并不能导致所关注的基因的系统性表达。此系统的优点是克隆大于2个kb的基因以生成原本不可能利用病毒载体获得的构筑物(沃因奈特(Voinnet)等人，(2003)植物杂志(PlantJ.)33:949-956)。而且，使用此技术，可转化具有一个以上转基因的植物，以便可表达并组装多聚体蛋白质(例如，抗体或复杂蛋白质的亚单元)。另外，通过单独的渗入或使用混合培养物可实现借助与不同土壤杆菌的共渗入共表达多个转基因的可能性。[0084]在一些实施例中，投放载体可包括允许在土壤杆菌中选择(或至少检测)以及允许在渗入组织中选择/检测的序列。而且，投放载体通常包括在植物中转录以获得病毒RNA生产、随后生成病毒蛋白质的序列。病毒蛋白质和病毒RNA的产生可获得编码所关注的医药活性蛋白的RNA的多个拷贝的快速产生。此产生可导致在相对较短时期内所关注的蛋白质的快速蛋白质生产。因此，可生成用于蛋白质生产的高效系统。[0085]利用病毒表达载体的农杆菌渗入法可用于产生有限量的特定多肽以在决定其是否值得生成转基因植物之前验证表达水平。或者或另外，利用病毒表达载体的农杆菌渗入技术可用于快速生成能够作为主要生产平台产生巨大量蛋白质的植物。因此，此瞬时表达系统可在工业规模上使用。[0086]本文还提供各种不同土壤杆菌质粒、二元质粒和其衍生物(例如，pBIV、pBI1221和pGreen)中的任一者，其可用于本文所述的系统和方法中的这些和其它方面。众多适宜载体己为此项技术得知且可根据此项技术中己知的方法或本文所阐述的那些方法经引导和/或经修饰，以用于本文所提供的所述方法中。[0087]实例性载体是pGRD4，其基于烟草花叶病毒(TMV)且使用pGreen/pSoup系统作为二元表达载体通过引入花椰菜花叶病毒(Cauliflowermosaicvirus)35S启动子、nos终止子和来自投放载体PBID4的锤头状核酶序列经改造。参见(例如)庄司(Shoji)等人(2009)疫苗27:1087-1092。另一种实例性投放载体称为pBID4。此载体含有在引入到植物中之后驱动重组病毒基因组的初始转录的花椰菜花叶病毒(DNA植物病毒)的35S启动子和nos终止子(土壤杆菌胭脂碱合成酶的转录终止子)。载体另外含有包括用于病毒复制(126/183K)和细胞间运动(MP)的基因的烟草花叶病毒基因组的序列。载体另外含有编码所关注的多肽的基因，其在插入到烟草花叶病毒基因组序列内的独特克隆位点中且在外壳蛋白亚基因组mRNA启动子的转录控制下。由于此“靶标基因”(即，编码所关注的蛋白质或多肽的基因)代替TMV外壳蛋白的编码序列，因此所得病毒载体是不能有效在环境中传播和存活的自我复制裸RNA。左边界和右边界序列(LB和RB)划定在利用携载有载体的重组土壤杆菌渗入植物后转移到植物细胞中的投放载体区的界限。在将携载有此载体的土壤杆菌引入到植物组织中(通常通过农杆菌渗入法进行，但另外可通过注射或其它方式进行)后，在LB与RB之间生成多个单链DNA(ssDNA)序列拷贝并于数分钟内释放。随后可通过病毒复制来扩增这些引入的序列。靶标基因的翻译可导致在短时期内积累大量的所关注的蛋白质或多肽。[0088]在一些实施例中，土壤杆菌介导的瞬时表达可产生多达约5g或更多所关注的蛋白质/kg植物组织。举例来说，在一些实施例中，每kg植物组织可产生多达约4g、3g、2g、Ig或0.5g蛋白质。在一些情形中，每kg植物组织可产生至少约20mg到500mg、约50mg至Ij500mg、约50mg到200mg、或约50mg、60mg、70mg、80mg、90mg、100mg、llOmg、120mg、130mg、140mg、150mg、160mg、170mg、180mg、190mg、或约200mg、250mg、300mg、350mg、400mg、450mg、500mg、550mg、600mg、650mg、700mg、750mg、800mg、850mg、900mg、950mg、1000mg>1500mg、1750mg、2000mg、2500mg、3000mg或更多革巴标蛋白质。应注意，在一些情形中，蛋白质的表达水平可较小，因此每kg植物组织产生约0.1μg到20mg(例如,每kg植物组织约0.1μg到10μg、约10μg到50μg、约50μg到500μg或约500μg到lmg)，尤其在PNGaseF多肽的情况下。[0089]在一些实施例中，这些表达水平可在从渗入起约6周、5周、4周、3周或2周内达到。在一些情形中，这些表达水平可在从引入表达构筑物起约10天、7天、5天、4天、3天、2天或甚至I天内达到。因此，从引入(例如渗入)到采集的时间通常小于约2周、10天、I周或更少。另外，这些实施例的一个极引人注目的方面在于，蛋白质可在从选择氨基酸序列起约8周或更短时间内(甚至包括“预备”表达研究的时间)产生。另外，每一批蛋白质通常可在约8周、6周、5周或更短时间内产生。所属领域技术人员将认识到，这些数量可视所使用的植物类型而略有变化。大部分幼芽(包括豌豆)将在指定数量的范围内。所属领域技术人员基于所利用的特定植物的生物学将了解其它预期的调节。[0090]多核苷酸表达产物可从表达其的植物组织分离，且可经调配用于其预期用途(例如，作为医药剂或诊断剂、或作为试剂)。在一些情形中，表达产物可与一些或所有表达所述产物的植物组织一起调配。[0091]当希望将表达产物从表达其的一些或所有植物组织分离出时，可使用任何可用纯化技术。宽范围的分馏和分离程序阐述于(例如)斯科普斯(Scopes)等人，蛋白质纯化:理论和实践(ProteinPurification:PrincirlesandPractice),第3版；詹森(Janson)等人，蛋白质纯化:理论、高分辨率方法和应用(ProteinPurificationprinciples,HighResolutionMethods,andApplications),威利出版基团(ffiley-VCH)，1998，斯普林格出版社(Springer-Verlag)Jl^A(NY),1993;和罗(Roe),蛋白质纯化技术(ProteinPurificationTechniques).牛津大学出版社(OxfordUniversityPress),2001。通常，其可用于使产物多于约50%纯(例如，多于约60%、70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%纯)。[0092]当希望将产物与植物材料一起调配时，通常将希望利用对相关接受者(例如，人类或其它动物)无毒性的植物。可收获相关植物组织(例如，叶)并根据所属领域中己知的技术进行加工，同时适当考虑到维持所表达产物的活性。在一些实施例中，在可食用植物(且，特别地植物的可食用部分)中表达多核苷酸可是有用的，以便所述材料随后可吃掉。举例来说，当多核苷酸编码口服递送(在适当调配时)后有活性的营养相关蛋白质或治疗性蛋白质时，食用植物部分中产生蛋白质且将所表达多核苷酸与表达所述多核苷酸的一些或所有植物材料一起调配用于口服递送可是有用的。[0093]在多核苷酸编码疫苗组份时，所述组份可根据己知技术调配。举例来说，疫苗组份可与一种或一种以上有机或无机、液体或固体、医药上适宜的载剂材料一起调配。如本文所述产生的疫苗组份可采用多种剂型，例如片剂、胶囊、糖锭、分散液、悬浮液、溶液、明胶胶囊、药丸、囊片、乳霜、软膏、气溶胶、粉末包、液体溶液、溶剂、稀释剂、表面活性剂、等渗剂、增稠或乳化剂、防腐剂和固体粘结剂，只要蛋白质的生物活性不会被此剂型破坏即可。[0094]一般来说，这些组合物可包括各种医药上可接受的载剂、佐剂、或媒剂或其组合中的任一者或一者以上。有用的医药上可接受的载剂、佐剂和媒剂包括(例如)与药物投与相容的溶剂、分散介质、包衣、抗细菌和抗真菌剂、等渗和吸收延迟剂等等。实例性材料阐释于下文中。应注意，疫苗组合物可包括一种或一种以上佐剂以当投与给个体时增强疫苗的免疫原性。举例来说，疫苗组合物可包括(例如，但不限于)以下佐剂:皂树(Quillajasaponaria)的提取物(QS;包括食品级QS的经纯化亚部分，例如QuilA和QS-21)、明帆(alum)、氢氧化招、磷酸招、MF59、Malp2、不完全弗氏佐剂(incompleteFreund'sadiuvant)、完全弗氏佐剂和3_0_脱酰基化单磷酰基脂质A(3D-MPL)。另外，实例性佐剂包括免疫调节性寡核苷酸，例如未甲基化CpG序列，如W096/02555中所揭示。也涵盖不同佐剂的组合，包括本文所提及的那些。举例来说，QS21可与3D-MPL以(例如)QS21:3D-MPL大约1:10到10:1;1:5到5:1;或实质上1:1的比率一起调配。适用于人类疫苗调配物中的经纯化QS提取物的剂量通常为0.01mg到IOmg/千克体重。[0095]当多核苷酸编码治疗剂时，所述药剂可根据己知技术调配。举例来说，有效量的医药活性产物可与一种或一种以上有机或无机、液体或固体、医药上适宜的载剂材料一起调配。所产生的医药活性产物可采用多种剂型，例如片剂、胶囊、糖锭、分散液、悬浮液、溶液、胶囊、乳霜、软膏、气溶胶、粉末包、液体溶液、溶剂、稀释剂、表面活性剂、等渗剂、增稠或乳化剂、防腐剂和固体粘结剂，只要产物的生物活性不会被此剂型破坏即可。[0096]根据调配者的判断，可用作医药上可接受的载剂的物质包括(但不限于)糖类，例如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，例如玉米淀粉和马铃薯淀粉；纤维素和其衍生物，例如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和乙酸纤维素；粉状黄蓍胶；麦芽；明胶；滑石粉；赋形剂，例如可可油和栓剂蜡；油类，例如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油；二醇，例如丙二醇；酯，例如油酸乙酯和月桂酸乙酯；琼脂；缓冲剂，例如氢氧化镁和氢氧化招；海藻酸；无热原水；等渗盐水；林格氏溶液(Ringer'ssolution);乙醇；和磷酸盐缓冲溶液、以及其它无毒性相容性润滑剂(例如月桂基硫酸钠和硬脂酸镁)、着色剂、释放剂、涂布剂、甜味剂、调味剂、芳香剂，防腐剂和抗氧化剂(还参见雷明顿制药科学(Remington'sPharmaceuticalSciences),第15版,E.W.马T(E.W.Martin).马克出版公司(MackPublishingC0.),宾夕法尼亚州伊斯顿(Easton,PA),1975)。举例来说，多核苷酸表达产物可借助常规混合、制粒、制糖衣、溶解、冻干或类似工艺作为医药组合物来提供。[0097]在一些实施例中，医药制剂的作用可通过减缓医药活性产物(例如，蛋白质)的吸收来延长。举例来说，经皮下或经肌内注射的产物的吸收可通过使用具有差的水溶解性的结晶或非晶形材料的液体悬浮液来实现。因此，产物的吸收速率取决于其溶解速率，而溶解速率继而可取决于大小和形式。或者，可通过将产物溶解或悬浮于油性媒剂中来实现不经肠投与的产物的延迟吸收。可通过在生物可降解聚合物(例如，聚丙交酯-聚乙交酯)中形成蛋白质的微胶囊基质来制备可注射的储积形式。视产物对聚合物的比率和所采用特定聚合物的性质，可控制释放速率。其它生物可降解聚合物的实例包括聚(原酸酯)和聚(酸酐)。储积可注射调配物可通过将产物包埋于与身体组织相容的脂质体或微乳液中来制备。[0098]医药活性产物的肠内投与制剂可以固体、半固体、悬浮液或乳液形式引入，且可与任何医药上可接受的载剂(例如，水、悬浮剂和乳化剂)一起混合。表达产物也可借助泵或持续释放形式投与，尤其是当作为预防措施投与时，以便防止疾病在个体中的发展或以改善或延迟已经确立的疾病。[0099]医药活性产物任选地与植物组织一起可特别适用于作为医药组合物口服投与。收获的植物材料可以各种途径中的任一者进行加工(例如，风干、冷冻干燥或提取)，此取决于所要治疗产物的性质和其所要形式。在一些实施例中，这些组合物可单独经口摄入或与食物或饲料或饮料一起摄入。用于口服投与的组合物可包括经转染植物；经转染植物的提取物和从经转染植物纯化的蛋白质，其作为干粉末、食品、水性或非水性溶剂、悬浮液或乳液提供。非水性溶剂的实例包括(但不限于)丙二醇、聚乙二醇、植物油、鱼油和可注射有机酯。水性载剂包括水、水-醇溶液、乳液或悬浮液，包括盐水和经缓冲介质的不经肠媒剂，包括氯化钠溶液、林格氏右旋糖溶液、右旋糖加氯化钠溶液、含有乳糖和固定油的林格氏溶液。干燥粉末的实例包括已经干燥(例如冷冻干燥、风干或喷雾干燥)的任何转染植物生物质。举例来说，植物可通过将其置于约120华氏度(degreesFahrenheit)的市售风干器中直到生物质含有小于5重量％水分来风干。经干燥的植物可经储存以进一步加工为块体固体，或可进一步通过研磨成所要筛目大小的粉末来加工。或者，冷冻干燥可用于易受风干影响的产物。产物可通过将其置于真空干燥器中并在真空下干燥冷冻直到生物质含有小于约5重量％水分来冷冻干燥。干燥物质可如本文所述进行进一步加工。[0100]可用于获得在植物中表达的医药活性产物的另一方法是通过提取。经转染植物可经提取以从残余生物质移出所要产物，由此增加产物的浓度和纯度。植物也可在缓冲溶液中进行提取。[0101]举例来说，新收获的植物可以1:1的比率(以重量计)转移到一定量的经(例如)磷酸盐缓冲液缓冲的冰冷的水中。也可添加蛋白酶抑制剂。植物可通过剧烈掺和或研磨同时悬浮于缓冲溶液中来破坏，且所提取的生物质可通过过滤或离心移出。溶液中所携载的多肽产物可进一步通过额外步骤纯化，或可通过冷冻干燥或沉淀转换成干粉末。提取也可通过在压机中压制或当其通过紧密间隔的辊时通过碾碎来实施。从碾碎的植物榨出的流体可根据所属领域中熟知的方法收集和加工。通过压制进行提取允许释放较浓形式的产物，但是，产物的总产量可能低于在溶液中提取时的产物。[0102]蛋白质制剂(例如，提取物、粉末、干燥制剂和经纯化蛋白质产物)也可在有或没有一种或一种以上上文所提及赋形剂的情形下以囊封形式使用。可使用诸如肠溶包衣、释放控制包衣和医药调配技术中熟知的其它包衣等包衣和壳来制备片剂、糖衣丸、胶囊、药丸和颗粒的固体剂型。这些固体剂型中的活性产物可与至少一种惰性稀释剂(例如蔗糖、乳糖或淀粉)混合。这些剂型除惰性稀释剂以外还可包含其它物质，例如压片润滑剂和其它压片助剂(例如硬脂酸镁和微晶纤维素)。在胶囊、片剂和药丸的情形中，剂型还可包含缓冲剂和/或遮光剂，且可为使得活性成份仅或优先在(例如)胃肠道的某一部分释放的组合物。可使用的包埋用组合物的实例包含聚合物质和蜡。[0103]医药组合物可以治疗或预防性地投与。在一些实施例中，组合物可用于治疗或预防疾病。举例来说，可治疗患有疾病或处于发展疾病风险中的任何个体。将了解，个体可认为处于发展疾病的风险中，但未诊断出具有所述疾病的任何症状。举例来说，如果个体具有鉴别为与发展特定疾病的增加的风险相关的特定基因标记，那么个体将认为处于发展所述疾病的风险中。同样，如果个体家族的多个成员经诊断患有特定疾病(例如，癌症)，那么个体可认为处于发展所述疾病的风险中。[0104]用于口服投与的液体剂型包括(但不限于)医药上可接受的乳液、微乳液、溶液、悬浮液、糖浆和酏剂。除活性化合物以外，液体剂型可含有所属领域通常使用的惰性稀释剂(例如水或其它溶剂)、增溶剂及乳化剂，例如，乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1，3-丁二醇、二甲基甲酰胺、油(尤其棉籽油、花生油、玉米油、胚芽油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油)、甘油、四氢糠醇、聚乙二醇和山梨糖醇酐的脂肪酸酯和其混合物。除惰性稀释剂以外，口服组合物也可包括佐剂，例如，润湿剂、乳化和悬浮剂、甜味剂、调味剂和芳香剂。[0105]用于直肠或阴道投与的组合物可为栓剂，其可通过将组合物与一种或一种以上适宜无刺激性赋形剂或载剂(例如可可油、聚乙二醇或栓剂蜡)混合来制备，这些赋形剂或载剂在环境温度下为固体但在体温下为液体且因此在直肠或阴道腔内融化并释放活性蛋白质。[0106]用于医药组合物的局部或经皮投与的剂型包括软膏、膏糊、乳霜、洗液、凝胶、粉末、溶液、喷雾剂、吸入剂或贴片。若需要，在无菌条件下将活性产物或其制剂与医药上可接受的载剂和任一所需的防腐剂或缓冲剂混合。眼用调配物、滴耳剂和滴眼剂也涵盖在本发明范围内。另外，此文件涵盖透皮贴片的使用，其可提供医药活性蛋白到体内的受控递送。这些剂型可通过将医药活性产物悬浮或分散于适当介质中制得。也可使用吸收增强剂来增加医药活性蛋白穿过皮肤的通量。可通过提供速率控制膜或通过将化合物分配于聚合物基质或凝胶中来控制速率。[0107]组合物通常以实现所要结果所需的量和时间来投与。在一些实施例中，医药组合物的“治疗有效量”是有效用于治疗、减弱或预防宿主的疾病的量。因此，如本文所用，“有效治疗、减弱或预防疾病的量”是指医药组合物用以治疗、减弱或预防任何宿主的疾病的无毒但足够量。[0108]所需确切量将随个体而变化，此取决于个体的物种、年龄和一般状况、疾病的阶段、特定医药混合物、其投与模式等等。受感染的植物和/或其蛋白质制剂优选调配成剂量单位形式以易于投与和剂量的均匀性。本文所用的表达“剂量单位形式”是指适合于待治疗患者的医药活性多核苷酸表达产物的物理离散单位。然而，应理解，组合物的总日用量优选由主治医师在合理的医学判断范围内确定。任一特定患者或生物体的特定治疗有效剂量水平可取决于多种因素，其包括所治疗病症和病症的严重程度；所用特定化合物的活性；所用特定组合物；患者的年龄、体重、一般健康状况、性别、患者的饮食、患者的药代动力学状况、所用特定化合物的投与时间、投与途径和排泄速率；治疗持续时间；与所用特定化合物组合或同时使用的药物；和医学技术中熟知的类似因素。[0109]本发明将进一步阐述于以下实例中，所述实例并不限制权利要求书中所述数的本发明的范围。[0110]实例[0111]实例1-材料和方法[0112]PNGaseF在本塞姆氏烟草中的克隆和表达:将PNGaseF基因最优化以在本塞姆氏烟草中表达(对于密码子最优化，mRNA稳定性、RNA不稳定序列敲除等)并通过具有侧接PacI(5丨-末端)和XhoI(3丨-末端，在终止密码子之后)位点的GENEARTAG(德国雷根斯堡(Regensburg,Germany))来合成。为使用瞬时表达系统在本塞姆氏烟草植物中表达PNGaseF，从PNGaseF序列移除编码信号肽的核苷酸(氨基酸1_40)，并将编码烟草PR-1a信号肽(MGFVLFSQLPSFLLVSTLLLFLVISHSCRA;SEQIDNO:3)的核苷酸添加到所述编码序列的5'端。将编码ER驻留信号(KDEL;SEQIDNO:5)和FLAG表位亲和力纯化标签(SEQIDN0:4)的序列添加到3'端。将所得序列使用Pac1-XhoI限制性内切酶位点插入到投放载体pGRD4(罗伊(Roy)等人，(2010)病毒学(Virol.)405(I):93-99)或二元表达载体pBI121(陈(Chen)等人，(2003)分子育种(MolBreeding)11:287-293)中以分别获得pGRD4-PNGaseF和pB1-PNGaseF。然后将pGRD4_PNGaseF和pB1-PNGaseF(与用于pGRD4-PNGaseF的pSoup—起，其提供反式复制功能(海伦斯等人，(2000)植物分子生物学42?):819-832))引入到根癌土壤杆菌菌株GV3101中。使所得细菌菌株在BBL培养基(10g/L大豆水解产物、5g/L酵母提取物、5g/LNaCl和50mg/L卡那霉素)中在28°C下生长过夜。细菌是通过手动渗入到6周龄在土壤中生长的本塞姆氏烟草植物中来引入。在渗入后5天、6天和7天时,收获叶组织并使用子弹掺和机(bulletblender)均质化。提取物通过离心(13，OOOXg)澄清并用于进一步分析。[0113]PNGaseF的纯化:PNGaseF是使用抗FLAG抗体-管柱色谱进行纯化以确认其活体外去糖基化活性。将8克冷冻叶在24mlTBS缓冲液(50mMTris-HCl,pH7.4,150mMNaCl)中使用研钵和研杵进行碾磨。通过过滤通过神奇滤布(Miracloth)(卡尔生物化学公司(Calbiochem),加利福尼亚州圣地亚哥(SanDiego,CA))去除植物碎屑，随后在13，OOOxg下离心10分钟，且然后过滤通过0.22微米注射器式过滤器(安可乐斯有机化学公司(ACROSorganics))。根据制造商说明书制备含有Iml抗FLAGM2亲和力凝胶(Cat编号A2220，西格玛(Sigma)，密苏里州圣路易斯(St.Louis，MO))的管柱，并将24ml澄清上清液与Iml所述凝胶混合并在4°C下旋转I小时，之后将整个混合物返回到管柱中并将管柱用20体积的TBS缓冲液冲洗。将结合蛋白使用0.1M甘氨酸缓冲液(pH3.5)在6个500μI体积的试管中洗脱，并立即向每一试管中添加5μIlMTris-Cl以中和甘氨酸缓冲液。[0114]从本塞姆氏烟草纯化的PNGaseF的去糖基化能力:为测试经纯化PNGaseF在活体外的去糖基化能力以及比较48F1在活体外和活体内的去糖基化程度，将不同量的(IOng到200ng)的经纯化PNGaseF与Pfs48Fl(在本塞姆氏烟草中表达且从其纯化)一起在37°C下在PBS缓冲液中培育I小时，并通过西方墨点法分析0.75μg非去糖基化和去糖基化Pfs48Fl连同活体内去糖基化PFs48Fl。为测试是否表达PNGaseF去糖基化本塞姆氏烟草蛋白质，通过SDS-PAGE比较来自对照(未转化)本塞姆氏烟草和经细菌性PNGaseF、PNGaseF+pl9(植物的RNA沉默抑制子)和pl9转化的本塞姆氏烟草的总蛋白质。将来自每一叶的叶孔(每一者20mg)使用子弹掺和机(泽漠研究公司(Zymoresearch))在4°C下研磨2分钟，且在13，OOOxg下达10分钟的两个离心步骤之后，将样品与IXSDS-样品缓冲液一起沸腾并将10μI每一样品加载到SDS-PAGE中。[0115]PfS48F1、炭疽芽孢杆菌PA和对抗炭疽芽孢杆菌PA的抗体(C)与PNGaseF的共表达:为使Pfs48Fl、炭疽芽孢杆菌PA和对抗炭疽芽孢杆菌PA的抗体与PNGaseF—起表达，使用pB1-Pfs48Fl/pGRD4-PNGaseF、pGRD4-PA83-1/pB1-PNGaseF和pB1-PA/pGRD4-PNGaseF构筑物用于渗入本塞姆氏烟草植物中。使用PacI和XhoI限制性内切酶位点将Pfs48Fl(氨基酸28-401，基因库?登录号EU366251)、炭疽芽孢杆菌PA(氨基酸30-764，基因库?登录号AAA22637)和PA抗体的HC和LC(梅特(Mett)等人，(2011)人类疫苗(Hum.Vaccin.)7:183-190)的序列插入到投放载体(pGRD4)或二元表达载体pBI载体中。如上文所述执行土壤杆菌转化、植物渗入和叶蛋白质提取。[0116]西方墨点分析:如所述制备来自渗入本塞姆氏烟草的蛋白质样品。在OTPI(渗入后天数)、6DPI和7DPI时获得叶样品，且在提取缓冲液中研磨用于TSP，在具有0.5%曲拉通X-100的提取缓冲液中研磨用于TSPT，且在提取缓冲液与IX十二烷基硫酸钠(SDS)样品缓冲液中研磨用于TP。将这些蛋白质样品在13，OOOxg下离心10分钟以移除不可溶碎屑，并在10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶上分离，转移到聚偏二氟乙烯薄膜(密理博(Millipore)；马萨诸塞州比勒利卡(Billerica，MA))上并用0.5%I型封阻剂(I_block)(应用生物系统公司(AppliedBiosystems);加利福尼亚州卡尔斯巴德)封阻。为检测Pfs48Fl,将薄膜与抗poly-His的一级抗体(罗氏应用科学(RocheAppliedScience);第安纳州印第安纳波利斯(Indianapolis，IN))一起培育，随后辣根过氧化物酶(HRP)-偶联山羊抗小鼠抗体一起培育。为检测PNGaseF，将在兔中生产的抗FLAG单克隆抗体(Cat.编号F2555;西格玛)用作一级抗体，且辣根过氧化物酶(HRP)-偶联抗兔IgG用作二级抗体。与抗His/FLAG抗体反应的蛋白质使用Sl.;PHRSK;N/U./WestPico化学发光底物(皮尔斯生物科技公司(PierceBiotechnology);伊利诺伊州罗克福德(Rockford,IL))可视化。使用GeneSnap软件在GENEGNOME?上获得图像并使用基因工具(GeneTools)软件(Syngene；Frederick,MD)进行量化。[0117]用于Pfs48Fl的叶绿体靶向表达的质粒构建:编码38氨基酸序列(MLIAHPQAFPGAIAAPISYAYAVKGRKPRFQTAKGSVRI；SEQIDNO:6)且涵盖黄瓜坏死病毒(Cucumb盯Necrosis王行rus)外壳蛋白的臂结构域的基因己展示在受感染植物(本塞姆氏烟草)中起到叶绿体转运肽的作用(享(Xiang)等人，(2006)病毒学杂志(J.Virol.)80(16):7952-64)，所述基因针对本塞姆氏烟草经密码子最优化且从以下两个寡核苷酸组装:[0118]I)[0119]5'-AGTCTTAATTAAATGCTTATTGCTCACCCACAAGCTTTCCCAGGAGCTATTGCTGCTCCAATTTCTTACGCTTACGCTG-3'(SEQIDNO:7);和[0120]2)[0121]5'-GAGTCCGTCTCAAATCCTCACAGATCCCTTAGCAGTCTGGAACCTTGGCTTCCTACCCTTCACAGCGTAAGCGTAAGAAA-3'(SEQIDNO:8)。[0122]PCR扩增是使用5'-AGTCttaattaaATGCTTATTGCTCACCCAC-3'(正向)(SFQIDNO:9)和5'-gagtccgtctcaAATCCTCACAGAT-3'(反向)(SEQIDNO:10)引物执行。PqcI和BsmBI限制性位点加下划线。PCR扩增是使用上文所述寡核苷酸作为DNA模板使用PhusionFlash高保真PCR主要混合物(HighFidelityPCRMasterMix)(纽英伦生物实验室)以35个循环执行:在98°C下变性I秒，在58°C下退火5秒且在72°C下延伸7秒，其中在72°C下最后延伸60秒。PCR产物由PacI和BsmBI消化以进一步克隆。Pfs48Fl基因的扩增是使用5'-gagtccgtctcaGATTAACAACGATTTCTGCAAGC-3^(正向)(SEQIDNO:11)和5'-gagtcctcgagTCAGTGGTGGTGATGGTGATGA-3;(反向)(SEQIDNO:12)引物且pGRD4_4SFl作为DNA模板来执行。BsmBI和XhoI限制性位点加下划线。PCR是使用PhusionFlash高保真PCR主要混合物(纽英伦生物实验室，cat编号F-548L)以35个循环执行:在98°C下变性10秒，在65°C下退火5秒且在72°C下延伸15秒，其中在72°C下最后延伸60秒。PCR产物由BsmBI和XhoI消化。PCR产物克隆到利用PacI和XhoI消化的p⑶R4载体中以生成臂-Pfs48fl表达质粒。如上文所述引入蛋白质并在本塞姆氏烟草植物中表达。[0123]在活体去糖基化Pfs48Fl的纯化:为纯化来自本塞姆氏烟草植物的去糖基化Pfs48Fl重组蛋白，将50g渗入有pB1-Pfs48Fl和pGRD4_PNGaseF植物材料在150ml提取缓冲液中均质化并在搅拌的同时与0.5%曲拉通(最终浓度)一起在4°C下培育20分钟。培育之后，将溶解产物在48，OOOg下离心40分钟，且粗提取物通过加载于5mLHisTrapFF(Cat.编号17-5255-01，GE医疗(GEHealthcare))上的神奇滤布过滤，并利用15体积50mM磷酸钠缓冲液(pH8.0)、0.5MNaCl和20mM咪唑冲洗。蛋白质用50mM磷酸钠缓冲液(pH8.0)、0.5MNaCl和IOOmM咪唑洗脱。将洗脱部分浓缩并对PBS(pH7.5)进行透析。[0124]来自本塞姆氏烟草植物的Pfs48Fl的纯化:为纯化来自本塞姆氏烟草植物的Pfs48Fl重组蛋白，将750g植物材料在2.25L提取缓冲液中均质化并在搅拌的同时与0.5%曲拉通(最终浓度)一起在4°C下培育20分钟。培育之后，将溶解产物在48，OOOg下离心40分钟，且粗提取物通过神奇滤布过滤，并加载到具有70mL载有Ni的螯合琼脂糖大珠粒的管柱上。管柱利用15体积50mM磷酸钠缓冲液(pH8.0)、0.5MNaCl、20mM咪唑和20%甘油冲洗。蛋白质利用50mM磷酸钠缓冲液(pH8.0)、0.5MNaCl、300mM咪唑和20%甘油洗脱。洗脱的蛋白质部分首先对IOmM磷酸钠缓冲液(pH6.5)、50mMNaClUOmMEDTA和10%甘油进行透析，且然后进入IOmM磷酸钠缓冲液化册.5)、10%甘油中。在旋转减慢之后，将经透析样品加载到5mL利用IOmM磷酸钠缓冲液(pH6.5)和10%甘油平衡的CaptoQ中。蛋白质用IOmM磷酸钠缓冲液(pH6.5)、10%甘油和600禮NaCl洗脱。将洗脱的部分浓缩到高达2.6mg/mL且对PBS(pH7.5)进行透析。[0125]比较性ELISA分析:使用ELISA评估去糖基化和糖基化形式的Pfs48Fl被针对恶性疟原虫表面蛋白Pfs48/45的各种表位(1、lib,III和V)引发的大鼠mAbs的识别(奥池科若夫(Outchkourov)等人，(2007)生物化学杂志282:17148-17156;和鲁芬(Roeffen)等人，(2001)实验寄生虫学(Exp.Parasitol.)97:45-49)。将ELISA板(96孔马克西索普板(MaxiSorpplate)[NUNC,明尼苏达州罗切斯特(Rochester,NY)])用于PBS中的抗-4xHismAb(凯杰(Qiagen)Cat.编号34670;加利福尼亚州巴伦西亚(Valencia,CA))以50μL/孔(5μg/mL)在4°C下涂覆过夜。用0.5%于PBS中的I型封阻剂封阻之后，添加所要量(Ing到1000ng)的去糖基化和糖基化形式的Pfs48Fl并培育2小时。将板洗涤之后，添加50μI(2μg/mL于I型封阻剂中)各种针对Pfs48/45引发的mAbs并培育2小时。使用HRP-偶联山羊抗大鼠多克隆抗体(I:25,000于I型封阻剂中)检测结合抗体并使用邻苯二胺(OPD)作为底物在490nm的波长下可视化。[0126]mAby结合糖基化和去糖基化Pfs48Fl变体的亲和力分析:mAbV结合Pfs48Fl的糖基化和去糖基化(在活体外和活体内)变体的Kd是使用KinExA3200仪器(萨比戴恩公司(Sapidyne),爱达荷州博伊西(Boise,ID);布雷克(Blake)等人，(1999)分析生物化学(Anal.Biochem.)272:123-134)通过在与相应Pfs48Fl结合配偶体达到平衡之后测定溶液中剩余的游离抗体的量进行评估。mAbV浓度保持恒定，同时连续稀释所选糖基化或去糖基化Pfs48Fl蛋白质。将mAbV与糖基化Pfs48Fl以107nM、69nM和22nM混合；与活体外去糖基化Pfs48Fl以42.4nM、16.2nM和4nM混合；且与活体内去糖基化Pfs48Fl以42.4nM、10.6nM和4nM混合。电泳缓冲液(runningbuffer)为IxPBS(ρΗ7.5)，其含有0.02%叠氮化钠作为防腐剂。将样品及二级抗体用经lmg/mL牛血清白蛋白(BSA)增强的电泳缓冲液稀释。二级抗体为Dylight649_偶联山羊抗大鼠(杰克逊免疫研究(JacksonImmunoResearch),宾夕法尼亚州西格罗夫(WestGrove,PA)),其以0.5μg/mL使用。在所有实验中使用PNGase处理的Pfs48Fl作为用于流动池珠粒包(PMMA珠粒，萨比戴恩公司)的涂覆试剂。所有样品和标记抗体的流速均为0.25mL/min。样品体积在0.35mL到3.0mL的范围内。[0127]将从三种经每一Pfs48Fl平衡的不同抗体浓度获得的滴定数据拟合到KinExA软件(版本3.1.2)中所包括的总体1:1结合模型。将针对mAbV和Pfs48Fl生成的数据拟合到标准1:1结合模型，其中测定Kd、活性结合位点浓度(ABC)和信号最大值和最小值。在此情形中，Pfs48Fl(糖基化)的浓度是通过相对BSA的光密度测定法使用考马斯(Coomassie)染色的SDS-PAGE来确定。将针对mAbV以及去糖基化形式的Pfs48Fl生成的数据拟合到同一1:1结合模型，但使用未知抗原浓度模型(谢(Xie)等人，(2005)免疫法杂志(J.1mmunol.Meth.)304:1-14)。在此模型中，从拟合以及LCM确定Kd和信号参数。LCM涉及未知浓度的配体以确定ABC(从利用mAbV和Pfs48Fl的实验)，其允许当抗原浓度较不充分的表征或未知时直接比较结合数据。在此情形中，使用西方墨点法估计活体内去糖基化Pfs48Fl的浓度，以便将结合分析标准化为糖基化Pfs48Fl的浓度。[0128]糖基化和去糖基化Pfs48Fl变体抑制m.AbIII的定性分析:Pfs48Fl变体(糖基仳和在活体外和活体内去糖基化的PNGaseF)抑制mAbIII的定性分析是使用KinExA3200仪器。制备以140nM结合位点和70nM标称蛋白质浓度含有mAbIII和最终浓度为250nM的Pfs48变体(糖基化或去糖基化PNGaseF)中的一者的溶液并培育，并使用KinExA仪器确定每一反应混合物中游离mAbIII的量。每一PfS48F1变体在反应混合物中的初始浓度是基于在mAbV实验中所确定的LCM值。将在没有Pfs48Fl的溶液中的mAbIII生成的信号视为100%。[0129]实例2-细菌件PNGaseF在本塞姆氐烟草中的表汰[0130]如实例I中所述，将PNGaseF编码序列(314个氨基酸，其代表没有信号序列的全长催化活性蛋白质)最优化(图1)，克隆到PGRD4表达载体中，并在本塞姆氏烟草中表达。PNGaseF的平均表达水平为约150mg/kg新鲜生物质。PNGaseF的表达通过免疫墨点分析使用抗FLAG单克隆抗体来证实(参见图2A)。[0131]实例3_Pfs48Fl与细菌件PNGaseF的共表汰[0132]将PfS48F1E疟疾候选疫苗与细菌性PNGaseF在本塞姆氏烟草中瞬时共表达以测试N-连接的寡糖在活体内环境中是否将从Pfs48Fl裂解。将PNGaseF与FLAG表位、随后C-末端ER驻留信号KDEL(SEQIDNO:5)一起表达。结果呈现于图2中。共表达PNGaseF在活体内有活性且成功地从Pfs48Fl裂解N-连接的寡糖。PNGaseF消化之后产生的Pfs48Fl的迁移类似于在活体外使用PNGaseF的商业来源(纽英伦生物实验室)以酶方式去糖基化的Pfs48Fl(图2B)。当Pfs48Fl(pGRD4_PNGaseF)与PNGaseF(pBI121_Pfs48Fl)共表达时，去糖基化Pfs48Fl的表达水平为约50mg/kg。去糖基化Pfs48Fl的溶解度为约95%。PNGaseF的表达通过免疫墨点分析证实(图2A)。[0133]实例4-炭疽芽孢杆菌的保护性抗原(PA)和对抗炭疽芽孢杆菌的PA的抗体(C)与PNGaseF的共表汰[0134]将在活体内去糖基化策略应用于两种其它糖蛋白，即炭疽芽孢杆菌的保护性抗原(PA)和对抗炭疽芽孢杆菌PA的抗体。共表达结果呈现于图4中。具有一个糖基化位点的重链(HC)中观察到迁移率位移，但在缺少糖基化位点的轻链(LC)中没有位移。这些结果连同与Pfs48Fl的共表达指示PNGaseF成功地从所有测试糖蛋白裂解N-连接聚糖，且此策略可用于在本塞姆氏烟草中使用瞬时表达系统以去糖基化形式产生治疗性蛋白质和抗体。[0135]实例5-来自本塞姆氐烟草的PNGaseF的钝化[0136]为证实PNGaseF的活体外活性，如实例I中所述将来自本塞姆氏烟草的重组酶使用抗FLAG琼脂糖管柱纯化。通过SDS-PAGE分析经纯化PNGaseF蛋白质(图3A)。考马斯染色展示经纯化PNGaseF具有高均质性水平。使用在本塞姆氏烟草中表达的Pfs48FlE糖蛋白测试经纯化PNGaseF的去糖基化能力。结果呈现于图3B中。经纯化植物PNGaseF能够在活体外使Pfs48Fl去糖基化，且去糖基化程度通过增加经纯化PNGaseF的量增加。将通过经纯化植物产生的PNGaseF和市售PNGaseF(纽英伦生物实验室；马萨诸塞州伊普斯威奇(Ipswich,MA))纯化的Pfs48Fl的去糖基化与Pfs48Fl在活体内通过共表达PNGaseF的去糖基化相比较。[0137]实例6-去糖基化和糖基化形式的Pfs48Fl的抗原性的评估[0138]为估计去糖基化和糖基化形式的Pfs48Fl的抗原性(结合抗体的能力)，如实例I中所提及使用ELISA测定两种形式的蛋白质。在测试中使用检测恶性疟原虫表面蛋白的表位1、lib、II和V的四种mAb。结果分别展示于图5A、5B、5C和中。与糖基化形式(菱形)相比，去糖基化Pfs48Fl(正方形)更易于由四种mAb中的三者识别。[0139]识别IIb的mAb(mAbIIb;图5B)仅展示糖基化形式的Pfs48Fl的背景水平的信号，且去糖基化对应物并未展示较好的亲和力。此意味着mAbIIb的差的表位识别是由于除Pfs48Fl蛋白质的异常糖基化以外的原因。[0140]实例7-mAbV结合棺物产牛的Pfs48Fl的亲和力[0141]选择针对Pfs48Fl的表位V引发的mAb以定量方式估计抗体对糖基化和去糖基化Pfs48Fl蛋白质的亲和力。如实例I中所述实施评估。图6A图解说明利用糖基化Pfs48Fl获得的结果，其中发现Kd值为11.48nM。从活体外去糖基化Pfs48Fl观察到较强的亲和力，其展示Kd值为4.76nM(图6B)。活体内去糖基化Pfs48Fl展示对mABV的最强的亲和力，其中Kd值为2.57nM。如图3B中所注意到，活体内去糖基化(右起第2泳道)在移除碳水化合物方面比活体外处理(左起第2到6泳道)更有效。图6中所展示的结果与图3B中所展示的结果组合展示，Pfs48Fl在活体内的广泛去糖基化进一步改良蛋白质对mAbV的亲和力。[0142]实例8-mAbIII与Pfs48Fl夺体之间的定件抑制比较[0143]如实例I中所述检查糖基化对Pfs48Fl对mAbIII的亲和力的影响。利用将来自未结合mAb的信号水平设定为100%，配体对mAb的结合将导致信号的“抑制”。由此，信号抑制的程度可诠释为结合亲和力的量度。当添加到mAbIII的溶液中时，所有三种Pfs48Fl变体均导致信号抑制，如图7中所示。当mAb与活体内去糖基化Pfs48Fl混合时，观察到最强的信号抑制。这些结果展示，与活体外去糖基化PfS48F1和糖基化Pfs48Fl相比，活体内去糖基化导致Pfs48Fl最强的亲和力和经改良抗原性。[0144]实例9-与靶向叶緑体的Pfs48Fl讲行比较[0145]植物叶绿体可用于产生蛋白质(维尔玛(Verma)等人，(2008)自然-实验手册(NatureProtocols)3:739-758)。植物叶绿体的用途(称为叶绿体转化技术(ChloroplastTransformationTechnology,CTT))可大量产生适当折叠且正确二硫化物键结的蛋白质。像细菌表达系统一样，叶绿体不会使其蛋白质糖基化。[0146]为比较通过在活体内去糖基化和CTT获得产物，使用通过使蛋白质靶向叶绿体绕过糖基化的常规方法使Pfs48Fl在植物细胞中表达。如实例I中所解释，使Pfs48Fl与38氨基酸叶绿体靶向信号的融合物(臂_Pfs48Fl)在细胞质中表达，并将其抗原性与活体内去糖基化Pfs48Fl的抗原性相比较。[0147]来自经转化以表达臂-Pfs48Fl的本塞姆氏烟草的叶样品的西方墨点法展示，臂-Pfs48Fl蛋白质成功地在靶标植物中表达，且在可溶部分中发现显著部分的总表达Pfs48Fl，如从TSP泳道所检测(图8)。如实例I中所解释，使用活体内去糖基化Pfs48Fl和臂-Pfs48Fl执行比较性ELISA分析。图9展示利用mAbIII(板面A)和利用mAbV(板面B)获得的结果。尽管叶绿体靶向方法使臂_Pfs48Fl免于糖基化，但所得蛋白质并未展示对抗体的可检测水平的亲和力。另一方面，活体内去糖基化Pfs48Fl展示对两种抗体的亲和力，如从当较多蛋白质添加到反应时信号增加所证明。这些结果展示，通过PNGase-F在活体内去糖基化的Pfs48Fl所获得的蛋白质比通过叶绿体靶向所获得者更易于被抗体识别。[0148]其它实施例[0149]应了解，尽管己结合其详细说明阐述本发明，但上文说明是打算说明而非限制本发明的范围，本发明的范围是由所附权利要求书的范围界定。其它方面、优点和修改将在所附权利要求书的范围内。【权利要求】1.一种用于生成所关注的去糖基化多肽的方法，其包含产生包含以下各项的真核细胞:(a)第一核酸，其包含编码细菌性PNGaseF多肽的第一核苷酸序列，其中所述第一核苷酸序列可操作地连接到启动子，以便当所述启动子被激活时，表达所述PNGaseF多肽；和(b)第二核酸，其包含编码所述所关注多肽的核苷酸序列，其中所述第二核苷酸序列可操作地连接到启动子，以便当所述启动子被激活时，表达所述所关注的多肽，其中通过所述PNGaseF多肽的作用，使所述所关注的多肽去糖基化。2.根据权利要求1所述的方法，其包含将所述第一和第二核酸同时引入到所述细胞中。3.根据权利要求1所述的方法，其包含将所述第一和第二核酸分别引入到所述细胞中。4.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一和第二核酸存在于同一核酸构筑物中。5.根据权利要求1所述的方法，其中所述真核细胞是植物细胞。6.根据权利要求5所述的方法，其中所述植物细胞是本塞姆氏烟草(Nicotianabenthamiana)细胞。7.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一核苷酸序列与SEQIDNO:1中所阐述的序列具有至少90%序列一致性。8.根据权利要求1所述的方法，其中所述PNGaseF多肽具有与SEQIDNO:2中所阐述的序列具有至少90%序列一致性的氨基酸序列。9.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一和第二核酸是经由土壤杆菌(Agrobacterium)构筑物引入到所述细胞中。10.一种真核细胞，其包含:(a)第一核酸，其包含编码细菌性PNGaseF多肽的第一核苷酸序列，其中所述第一核苷酸序列可操作地连接到启动子，以便当所述启动子被激活时，表达所述PNGaseF多肽；和(b)第二核酸，其包含编码所关注多肽的核苷酸序列，其中所述第二核苷酸序列可操作地连接到启动子，以便当所述启动子被激活时，表达所述所关注的多肽。11.根据权利要求10所述的真核细胞,其中所述真核细胞是植物细胞。12.根据权利要求10所述的真核细胞，其中所述植物细胞是本塞姆氏烟草细胞。13.根据权利要求10所述的真核细胞，其中所述第一核苷酸序列与SEQIDN0:1中所阐述的序列具有至少90%序列一致性。14.根据权利要求10所述的真核细胞，其中所述PNGaseF多肽具有与SEQIDNO:2中所阐述的序列具有至少90%序列一致性的氨基酸序列。15.一种用于在植物细胞中表达活性细菌性PNGaseF多肽的方法，其包含将包含编码所述细菌性PNGaseF多肽的核苷酸序列的核酸引入到所述植物细胞中，其中所述核苷酸序列可操作地连接到启动子，以便当所述启动子被激活时，表达所述PNGaseF多肽。16.根据权利要求15所述的方法，其中所述核苷酸序列与SEQIDNO:1中所阐述的序列具有至少90%序列一致性。17.根据权利要求15所述的方法，其中所述PNGaseF多肽具有与SEQIDNO:2中所阐述的序列具有至少90%序列一致性的氨基酸序列。18.根据权利要求15所述的方法，其中所述核酸是经由土壤杆菌构筑物引入到所述植物细胞中。19.根据权利要求15所述的方法，其中所述植物细胞是本塞姆氏烟草细胞。20.—种表达系统,其包含:(a)第一核酸，其包含编码细菌性PNGaseF多肽的第一核苷酸序列，其中所述第一核苷酸序列可操作地连接到启动子，以便当将所述第一核酸引入到真核细胞中且所述启动子被激活时，表达所述PNGaseF多肽；和(b)第二核酸，其包含编码所关注多肽的核苷酸序列，其中所述第二核苷酸序列可操作地连接到启动子，以便当将所述第二核酸引入到所述真核细胞中且所述启动子被激活时，表达所述所关注的多肽。21.根据权利要求20所述的表达系统，其中所述第一核苷酸序列与SEQIDNO:1中所阐述的序列具有至少90%序列一致性。22.根据权利要求20所述的表达系统，其中所述PNGaseF多肽具有与SEQIDNO:2中所阐述的序列具有至少90%序列一致性的氨基酸序列，且其中所述多肽保持糖苷酶活性。23.根据权利要求20所述的表达系统，其中所述真核细胞是植物细胞。24.根据权利要求23所述的表达系统，其中所述植物细胞是本塞姆氏烟草细胞。【文档编号】C12N9/80GK103906840SQ201280037381【公开日】2014年7月2日申请日期:2012年6月7日优先权日:2011年6月7日【发明者】塔尔兰·马梅多夫,维达季·尤西波夫申请人:艾比欧公司