光活化嵌合视蛋白及其使用方法
【专利摘要】本文提供包含在质膜上表达的光活化嵌合蛋白的组合物；和使用所述组合物来选择性地使兴奋性或抑制性神经元去极化的方法。
【专利说明】光活化嵌合视蛋白及其使用方法
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002]本申请要求于2010年11月5日提交的美国临时专利申请号61/410，736 ;于2010年11月5日提交的美国临时专利申请号61/410，744;以及于2011年7月26日提交的美国临时专利申请号61/511，912的优先权，这些专利申请各自的公开内容以引用的方式全部并入本文。
【技术领域】
[0003]本申请涉及包含在质膜上表达光活化嵌合蛋白的动物细胞的组合物；和使用所述组合物来选择性地使存在于前额叶皮质中的相同微回路中的兴奋性或抑制性神经元去极化的方法。
[0004]背景
[0005]对大多数精神病障碍的神经生理学底物的了解不多，尽管关于与复杂的行为表型，如在孤独症和精神分裂症中所观察到的那些表型相关的遗传因素的信息快速涌现(Cichon 等，The American Journal of Psychiatryl66(5):540(2009) ;0，Donovan等，Human Geneticsl26 (I): 3 (2009))。一个正显露的值得注意的原则是极为广泛的看起来似乎不相关的遗传异常可以引起同一类别的精神病表型(如社会行为机能障碍^olstein和Rosen-Sheidley, Nature Reviews2 (12):943(2001))。这个出人意料的型态指出需要鉴别出可以在普通病理生理学原则下统一不同的遗传因素的简化回路级(circuit-level)见解。
[0006]一种这样的回路级假设是皮质细胞的兴奋与抑制的比率(细胞的E/I平衡)提高可以引起孤独症的社会性和认知性缺陷(Rubenstein, CurrentOpinion in Neurology23 (2): 118 ；Rubenstein 和 Merzenich,Genes,Brain,andBehavior2 (5): 255 (2003))。这种假设可以潜在地统一大量不同的病理生理学证据，包括观察到许多孤独症相关基因与离子通道和突触蛋白的功能获得性表型有关(Bourgeron, Current Opinion in Neurobiologyl9 (2), 231 (2009))并且约 30% 的孤独症患者还表现出临床上明显的癫痫发作(Gillberg和Billstedt, Acta PsychiatricaScandinavica，102(5):321 (2000))。然而，还不清楚此种不平衡(与疾病症状相关的)是可以在长期(例如在发展过程中)还是在短期时间跨度上操作。此外，这种假设并未得到普遍接受，部分是因为它还不易于直接测试。在社会性和认知性任务期间，无论在临床环境中还是在自由行为的实验哺乳动物中，药理学和电学的干预缺乏必要的特异性来选择性地促进新皮质兴奋性细胞而非抑制性细胞的活性(以根本不同于受体调节的方式)。这也许涉及到多种挑战，如已证明孤独症和精神分裂症的社会性和认知性缺陷对于临床中的常规精神药理学治疗基本上无反应。
[0007]光遗传学是遗传学方法和光学方法的组合，被用来控制活组织(甚至是自由移动的哺乳动物和其它动物体内的活组织)的靶细胞中的特定事件，具有为比肩功能完整的生物系统所需要的时间精确度(毫秒时间跨度)。光遗传学的特点是将快速光活化通道蛋白引入靶神经元细胞的质膜，从而允许在时间上精确地操纵神经元膜电位同时通过使用特异性靶向机制来维持细胞类型解析。可以用来研究神经系统的功能的微生物视蛋白包括被用来促进响应于光的去极化的视紫红质通道蛋白(ChR2、ChRU VChRl、以及SFO)。在短短的几年中，光遗传学领域已深化了对特定细胞类型如何在活体内促进生物组织(如神经回路)的功能的基础性科学理解。此外，在临床方面，光遗传学带动的研究使得对帕金森氏(Parkinson's)病和其它神经障碍和精神病障碍获得了深入了解。
[0008]然而，现有的用于探究皮质E/Ι平衡的比率提高可能与孤独症和其它障碍(如精神分裂症)的社会性和认知性缺陷相关的假设的光遗传学工具存在限制。常规的视紫红质通道蛋白光电流展现出显著的脱敏作用，这妨碍了 E/Ι平衡的阶梯状变化的产生(转为要求斜坡或脉冲，这将不适合用于研究细胞的E/Ι平衡的稳定变化)；此外，SFO和常规的ChR两者均由蓝光驱动，这妨碍了驱动不同回路元件(如兴奋性和抑制性神经元)群体的作用的制剂内比较。因此，需要允许操纵皮质E/Ι平衡和监测皮质切片中的Y振荡的工具，以便容许研究这些操纵如何影响存在于前额叶皮质中的相同微回路中的下游神经元。
[0009]发明概述
[0010]本文提供一种组合物，其包含嵌合光活化蛋白阳离子通道，当用光照射细胞时，所述嵌合光活化蛋白阳离子通道能够介导细胞中的去极化电流。
[0011]本文提供包含在细胞膜上表达的光活化蛋白的动物细胞，其中所述蛋白是(a)来源于来自强壮团藻(Volvox carteri)的VChRl和来自莱茵衣藻(Chlamydomonasreinhardti)的ChRl的嵌合蛋白，其中所述蛋白包含至少第一跨膜螺旋和第二跨膜螺旋置换为ChRl的第一跨膜螺旋和第二跨膜螺旋的VChRl的氨基酸序列；(b)对光可响应；并且(c)当用光照射细胞时，能够介导细胞中的去极化电流。在一些实施方案中，所述细胞是分离的或在细胞培养基中。
[0012]本文还提供包含在细胞膜上表达本文所描述的嵌合蛋白的细胞的细胞群。本文还提供包含在细胞膜上表达本文所描述的嵌合蛋白的细胞的非人动物和脑组织切片。
[0013]本文提供包含编码在细胞膜上表达的光活化蛋白的核苷酸序列的多核苷酸，其中所述蛋白是来源于来自强壮团藻的VChRl和来自莱茵衣藻的ChRl的嵌合蛋白，其中所述蛋白包含至少第一跨膜螺旋和第二跨膜螺旋置换为ChRl的第一跨膜螺旋和第二跨膜螺旋的VChRl的氨基酸序列；对光可响应；并且当用光照射细胞时，能够介导细胞中的去极化电流。还提供包含所述多核苷酸的载体(如表达载体)。在一些实施方案中，所述表达载体是病毒载体(例如，AAV载体、逆转录病毒载体、腺病毒载体、HSV载体、或慢病毒载体)。
[0014]本文还提供使用在细胞膜上表达本文所描述的嵌合蛋白的动物细胞的方法，所述方法包括用光活化所述嵌合蛋白。
[0015]本文还提供选择性地使存在于相同微回路中的兴奋性或抑制性神经元去极化的方法，所述方法包括:选择性地使包含第一光活化蛋白的兴奋性神经元去极化，其中所述第一光活化蛋白当被曝露于具有第一波长的光时被去极化；或选择性地使包含第二光活化蛋白的抑制性神经元去极化，其中所述第二光活化蛋白当被曝露于具有第二波长的光时被去极化。在一些实施方案中，所述第一光活化蛋白或所述第二光活化蛋白是来源于来自强壮团藻的VChRl和来自莱茵衣藻的ChRl的嵌合蛋白，其中所述蛋白包含至少第一跨膜螺旋和第二跨膜螺旋置换为ChRl的第一跨膜螺旋和第二跨膜螺旋的VChRl的氨基酸序列。在一些实施方案中，其中所述第一光活化蛋白包含与SEQ ID NO: K SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5或SEQ ID N0:7中所示的序列至少95%相同的氨基酸序列，并且其中所述第二光活化蛋白包含与 SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 13 或 SEQ ID NO: 14 中所示的序列至少95%相同的氨基酸序列。
[0016]一种选择性地使存在于相同微回路中的兴奋性或抑制性神经元去极化的方法，所述方法包括:在兴奋性神经元中表达第一光活化蛋白；并且在抑制性神经元中表达第二光活化蛋白，其中所述第一光活化蛋白当被曝露于具有第一波长的光时被独立地去极化，并且其中所述第二光活化蛋白当被曝露于具有第二波长的光时被独立地去极化。在一些实施方案中，所述第一光活化蛋白或所述第二光活化蛋白是来源于来自强壮团藻的VChRl和来自莱茵衣藻的ChRl的嵌合蛋白，其中所述蛋白包含至少第一跨膜螺旋和第二跨膜螺旋置换为ChRl的第一跨膜螺旋和第二跨膜螺旋的VChRl的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述第一光活化蛋白包含与SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 5或SEQ ID NO: 7中所示的序列至少95%相同的氨基酸序列，并且其中所述第二光活化蛋白包含与SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 12,SEQ ID NO: 13或SEQ ID NO: 14中所示的序列至少95%相同的氨基酸序列。
[0017]本文还提供用于鉴别选择性地抑制存在于相同微回路中的兴奋性或抑制性神经元的去极化的化合物的方法，所述方法包括:(a)用具有第一波长的光选择性地使包含第一光活化蛋白的兴奋性神经元去极化，或用具有第二波长的光选择性地使包含第二光活化蛋白的抑制性神经元去极化；(b)测量响应于选择性地使包含第一光活化蛋白的兴奋性神经元去极化的兴奋性突触后电位(EPSP)，或测量响应于选择性地使包含第二光活化蛋白的抑制性神经元去极化的抑制性突触后电流(IPSC) ；(c)使兴奋性神经元或抑制性神经元与化合物接触；(d)测量兴奋性突触后电位(EPSP)或测量抑制性突触后电流(IPSC)以确定使兴奋性神经元或抑制性神经元与化合物接触是否选择性地抑制任一神经元的去极化。在一些实施方案中，所述第一光活化蛋白或所述第二光活化蛋白是来源于来自强壮团藻的VChRl和来自莱茵衣藻的ChRl的嵌合蛋白，其中所述蛋白包含至少第一跨膜螺旋和第二跨膜螺旋置换为ChRl的第一跨膜螺旋和第二跨膜螺旋的VChRl的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述第一光活化蛋白包含与SEQ ID NO: K SEQ ID NO:3, SEQ ID N0:5或SEQ IDNO:7中所示的序列至少95%相同的氨基酸序列，并且其中所述第二光活化蛋白包含与SEQID NO:1USEQ ID NO: 12,SEQ ID NO: 13 或 SEQ ID NO: 14 中所示的序列至少 95% 相同的氨基酸序列。
[0018]应理解，可以将本文描述的不同实施方案的一种、一些或全部特性进行组合以形成本发明的其它实施方案。本发明的这些和其它方面对于本领域技术人员将变得显而易见。
[0019]附图简述
[0020]图1描绘了用于组合性光遗传学的改进型红移视紫红质通道蛋白的工程化。(a)用受CaMKIIa启动子控制的VChRl_eYFP或ClVl_eYFP转染的培养海马神经元的共焦图像。方框表示最后一幅图中放大的区域，其示出CIVl-tsYFP的树突状膜定位。比例尺:20ym(&)，4ym(S)。(b)来自表达指定视蛋白的培养海马神经元中的全细胞膜片钳记录的峰值光电流。(c) ChRl、ChR2以及VChRl的序列比对。指出两种ClVl变异体的剪接位点。推定跨膜螺旋1-7(ΤΜ1-7)用条栏指示；突变的氨基酸用灰色指示。(d)在表达ClVl剪接变异体I和2的HEK细胞中所记录的光电流振幅。(e)用与EYFP融合的指定视蛋白转染的培养海马神经元的单个共焦平面图像。DNA浓度在构建体间匹配。(f)ChR2、VChRl、ClVlwtXlV(E122T) ,ClVl (E162T)、以及 ClVl (E122T/E162T)的作用谱。在 HEK293 细胞中，用2ms光脉冲来收集光电流。(g)ClVl剪接变异体I的离子渗透，所述离子渗透是使用阳离子分离外部溶液通过全细胞膜片钳在HEK细胞中在_40mV下测得的光电流幅值所测量。将数据归一化为最大峰值Na电流。(h)ClVl嵌合体的示意图，其中点突变位置用白色指示。ChRl序列用黑色指示；VChRl序列用灰色指示。
[0021]图2描绘了测试用于组合光遗传学的改进型红移视紫红质通道蛋白。(a)表达指定视蛋白的培养神经元中的通道闭合时间常数的代表性迹线和汇总图线(summary plot);将迹线归一化为峰值电流。(b) C1V1-E122T钝化与ChR2去活的比较。(c)ClVl双重变异体E122T/E162T与其它ClVl变异体中的电流钝化的比较。(d)在表达指定视蛋白的培养神经元中所记录到的响应于2ms542nm光脉冲的平均峰值光电流。
[0022]图3描绘了在前额叶锥体神经元中进行短期切片记录获得的光电流。(a)峰值光电流显示始终与积分荧光强度相关。(b)ChR2(H134R)与ClVl (E122T/E162T)中的荧光-光电流关系。黑色线是对数据的线性拟合。(c)在用指定频率的560nm光脉冲列或电流注入所刺激的前额叶锥体神经元中进行的短期切片记录。汇总图形示出了群数据(n=6)。(d)在指定波长和光功率密度下，成功尖峰相对于电流注入(200pA，IOms脉冲；左上)或2ms光脉冲的分数。所有脉冲列由20 X 2ms脉冲组成，所述脉冲通过使用萨特(Sutter) DG-4光源的显微镜物镜递送、使用20nm带通滤光片和额外的中性密度滤光片过滤以使光功率减弱(在2种切片中n=6个细胞)。(e)在表达C1V1-E122T或C1V1-E122T/E162T的细胞中的电压钳对542nm和630nm光脉冲的响应(上部)。在表达C1V1-E122T的细胞中的电流钳记录显示响应于3.2mff ι?π 2下的50ms630nm光的5Hz列的尖峰(底部)。(f)ClVl (E122T)中的红光响应的动力学。在540nm和630nm下，从表达C1V1(E122T)的培养神经元中记录到的光电流的活化时间常数(τ 。应注意，光功率在630nm下是3.2mff mm-2并且在540nm下是
7.7mW mm2(n=5个细胞，ρ=0.0006成对t-检验)。(g)电压钳迹线显示在表达ClVl (E122T)的神经元中对630nm光脉冲的响应。脉冲长度指示于迹线上方。从150ms迹线计算出的τ活化是67ms。(h)来自表达ClVl (E122T)的神经元的电流钳记录，显示在630nm下由50ms脉冲(功率密度3.2mff mm 2)引发的尖峰。
[0023]图4描绘了兴奋性锥体神经元和表达小白蛋白的抑制性细胞的独立活化。(a)响应于560nm或405nm下的2ms光脉冲(5Hz ;在两个波长下7.6mff/mm2),由表达C1V1(E122T/E162T)或ChR2(H134R)的培养海马神经元得到的电流钳记录。(b)在皮质锥体神经元中表达CIVI并且在抑制性小白蛋白阳性中间神经元中表达ChR2 (H 134R)的双重注射动物中的记录配置。为了独立地表达视蛋白，给PV::Cre小鼠注射含有Lent1-CaMKIl a-ClVl (E122T/E162T)和 AAV5-EF Ia-DIO-Ch R2 (H134R)的双病毒混合物。
(c)由非表达性PYR神经元得到的电压钳记录，所述神经元接受来自表达ClVl的PYR-细胞和表达ChR2的PV-细胞的突触输入。在0mV、405nm光脉冲下钳制引发短潜伏期IPSC，而560nm脉冲仅引起小的、长潜伏期的抑制性突触响应。(d)由在c中所示的相同细胞得到的电压钳记录。在_65mV、560nm光脉冲下钳制引发EPSC,但405nm脉冲不能引起可检测到的突触电流。灰色线示出个别事件；黑色线示出光脉冲引发的平均值。(e)在注射CaMKIla::ClVl (E162T)-ts-eYFP 和 Efla-DIO::ChR2_eYFP 的被麻醉的 PV::Cre 小鼠中的mPFC光极记录(图表说明实验设置)。紫色(405nm)光脉冲相对于绿光脉冲(实例迹线)呈现出可变延迟(At)。(f)汇总图形示出了在紫光脉冲领先绿光脉冲所指示的延迟的情况下绿光引发的尖峰的概率。个别点是来自单个的记录。黑色线示出所有记录的平均值(每分区(bin) >3个记录位点)。(g)来自注射病毒的小鼠的光电极记录，示出一个推定锥体单元和一个推定PV单元分别响应于561nm刺激(右侧，上方波形)和405nm刺激(右侧，下方波形)而放电。
[0024]图5描绘了在不同完整系统制剂中的组合光遗传学激发。(a)在活体外用C1V1-E122T/E162T和ChR2_H134R进行的组合投射控制。实验性范例分别示出ClVl和ChR2在皮层丘脑(CT)和腹侧基底(VB)丘脑皮质的细胞(TC)中的表达。(b)由从CT和TC细胞两者中接收投射的nRT细胞得到的电压钳记录。同时刺激(At=O ms)导致来自两个投射的所引发的EPSC的线性叠加。(c)当输入是精确重合的时候，来自TC和CT纤维的个别低于阈值的输入仅在nRT神经元中产生尖峰。(d)CT与TC输入之间的延迟指示于左侧。水平短划线指示切去顶端的尖峰。由以可变潜伏期(At)活化的CT和TC纤维引发的归一化数目的动作电位(来自6个nRT细胞)指示只有在5ms内重合的情况下，CT和TC输入才产生有效的整合。汇总数据表示平均土SEM。
[0025]图6描绘了光谱时间分离和组合控制:正进行的突触活动下的E/Ι状态改变的回路调节和出射型态。(a)针对PV神经元的SSFO活化和锥体神经元中的ClVl活化的实验性范例。(b)在来自表达CaMKIla::C1V1 (E162T)和DIO-SSFO的PV::Cre小鼠的短期切片制剂中，在OmV下由锥体神经元得到的电压钳记录。SSFO和ClVl由蓝光脉冲活化⑵，并且通过持续的SSFO活性使IPSC频率增加(3 ；比较插图中针对活化前和活化后IPSC活性的上方和下方迹线)。持续的黄光脉冲使SSFO去活，并且活化ClVl和瞬时增加IPSC频率
(4)。群功率谱(右侧)示出光学兴奋性神经元活化(590nm脉冲)过程中的Y频率活性，所述Y频率活性在兴奋性和PV神经元(470nm脉冲)共同活化过程中增加。在迹线下方的图表示出实验过程中的ClVl和SSFO的预测活性。(c)所观察到的Y频率峰与先前经由SSFO对PV神经元的刺激无关。(d)基`线时和初始蓝光或橙色光脉冲后来自(b)和(c)的汇总IPSC频率。在迹线下方的图表示出实验过程中的ClVl和SSFO的预测活性。
[0026]详述
[0027]本发明特别提供包含在质膜上表达光活化嵌合蛋白的动物细胞的组合物；和使用所述组合物来选择性地使存在于前额叶皮质中的相同微回路中的兴奋性或抑制性神经元去极化的方法。本发明人开发了具有独特物理化学特性的嵌合蛋白，所述嵌合蛋白首次容许实验性操纵皮质E/Ι提高并且能够监测皮质切片中的Y振荡。这些独特的光敏性嵌合蛋白可以在非人动物的前额叶皮质中的兴奋性或抑制性神经回路中表达，然后可以响应于具有特定波长的光使所述兴奋性或抑制性神经回路去极化。此外，来自非人动物的含有表达本文公开的嵌合光敏性蛋白的皮质兴奋性或抑制性神经元的脑切片可以被用来搜寻可以选择性地抑制存在于相同神经回路内的兴奋性或抑制性神经元的去极化的化合物。
[0028]一般技术
[0029]除非另外指出，否则本发明的实践将采用本领域技术人员所熟知的分子生物学、微生物学、细胞生物学、生物化学、核酸化学以及免疫学的常规技术。所述技术已在文献中得到充分说明，如Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第二版(Sambrook等，1989)和 Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第三版(Sambrook 和 Russel, 2001)(本文统称为“Sambrook”)；Current Protocols in Molecular Biology(F.M.Ausubel 等编著，1987，包括 2001 年增刊)；PCR:The Polymerase Chain Reaction, (Mullis 等编著，1994) ;Harlow和 Lane(1988)Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring HarborPublications, New York ;Harlow 和 Lane(1999)Using Antibodies:A Laboratory ManualCold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (本文统称为 “Harlow和 Lane，，)，Beaucage 等编著，Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry Johnffiley&Sons, Inc., New York, 2000), Handbook of Experimental Immunology,第四版(D.M.Weir 和 C.C.Blackwell 编著，Blackwell Science Inc., 1987);以及 Gene TransferVectors for Mammalian Cells (J.M.Miller 和 M.P.Calos 编著，1987)。
[0030]定义
[0031]如本文所使用，除非另外指出，否则单数形式“一个/ 一种(a/an) ”和“所述(the) ”包括复数个指示物。
[0032]“动物”可以是脊椎动物，如任何常见的实验室模式生物或哺乳动物。哺乳动物包括但不限于:人、农场动物、运动动物、宠物、灵长类动物、小鼠、大鼠、以及其它啮齿类动物。
[0033]如本文所使用的“氨基酸取代”或“突变”意指指定氨基酸序列中的至少一个氨基酸组分改变或取代为另一个氨基酸，从而在细胞内产生活性或表达水平改变的由所述氨基酸序列编码的蛋白质。
[0034]“嵌合蛋白”是包含一个或多个来源于一种或多种不同蛋白的部分的蛋白。嵌合蛋白可以通过培养转染有编码所述嵌合蛋白的核酸的重组细胞来产生。
[0035]意欲在本说明书通篇中给出的每个最大数值限制包括每个较低的数值限制，如同所述较低的数值限制被清楚地写在本文中一般。在本说明书通篇中给出的每个最小数值限制将包括每个较高的数值限制，如同所述较高的数值限制被清楚地写在本文中一般。在本说明书通篇中给出的每个数值范围将包括每个落在所述较宽的数值范围之内的较窄的数值范围，如同所述较窄的数值范围都被清楚地写在本文中一般。
[0036]VlCl嵌合蛋白和表达所述VlCl嵌合蛋白的细胞
[0037]在一些方面中，本文所公开的动物细胞包含嵌合光敏性蛋白(称为“C1V1”)，所述嵌合光敏性蛋白是来源于来自强壮团藻的VChRl阳离子通道和来自莱茵衣藻的ChRl阳离子通道。所述蛋白可以由VChRl的氨基酸序列构成，但另外VChRl多肽的至少第一跨膜螺旋和第二跨膜螺旋可以置换为ChRl的相应第一跨膜螺旋和第二跨膜螺旋。ClVl嵌合视蛋白是从单独不能在神经元中很好地表达并且是有效、红移且稳定的视紫红质通道蛋白的其它视蛋白的片段组装而来。在一些实施方案中，所述动物细胞可以在细胞的质膜上表达第二光活化蛋白。所述第二光活化蛋白可以能够介导细胞质膜响应于光活化发生超极化。能够介导细胞质膜的超极化的光活化蛋白的实例可以例如在国际专利申请号PCT/US2011/028893中找到，所述专利 申请的公开内容以引用的方式全部并入本文。
[0038]本公开内容的实施方案还可以是针对ClVl的修饰或突变型式。这些蛋白可以单独或与多种其它视蛋白组合使用，以确保对神经元进行光学控制。具体来说，联合其它视蛋白使用修饰的ClVl被认为适用于对神经系统障碍进行光学控制。ClVl的具体用途涉及光遗传学系统或方法，所述光遗传学系统或方法使对神经回路的时间、空间和/或细胞类型特异性的控制与可测量的指标关联起来。
[0039]VlCl嵌合蛋白
[0040]本文提供在动物细胞质膜上表达的光活化嵌合蛋白。在一些方面中，所述光活化蛋白是来源于来自强壮团藻的VChRl和来自莱茵衣藻的ChRl的嵌合蛋白。在一些实施方案中，所述嵌合蛋白包含至少第一跨膜螺旋和第二跨膜螺旋置换为ChRl的相应第一跨膜螺旋和第二跨膜螺旋的VChRl的氨基酸序列。在其它实施方案中，所述嵌合蛋白包含第一跨膜螺旋和第二跨膜螺旋置换为ChRl的相应第一跨膜螺旋和第二跨膜螺旋的VChRl的氨基酸序列，并且进一步包含置换为ChRl的相应部分的位于第二跨膜螺旋与第三跨膜螺旋之间的细胞内环结构域的至少一部分。在一些实施方案中，在嵌合光活化蛋白的第二跨膜螺旋与第三跨膜螺旋之间的整个细胞内环结构域可以置换为ChRl的相应细胞内环结构域。在其它实施方案中，位于第二跨膜螺旋与第三跨膜螺旋之间的置换为ChRl的相应部分的细胞内环结构域的所述部分可以延伸至SEQ ID N0:1的A145。在其它实施方案中，所述嵌合蛋白包含第一跨膜螺旋和第二跨膜螺旋以及细胞内环结构域置换为ChRl的相应第一跨膜螺旋和第二跨膜螺旋以及细胞内环结构域的VChRl的氨基酸序列，并且进一步包含置换为ChRl的相应部分的第三跨膜螺旋的至少一部分。在另一个实施方案中，置换为ChRl的相应部分的第三跨膜螺旋的所述部分可以延伸至SEQ ID N0:1的W163。在一些实施方案中，所述光活化嵌合蛋白包含ChRl的氨基酸1-145和VChRl的氨基酸102-316。在一些实施方案中，所述光活化嵌合蛋白包含ChRl的氨基酸1-162和VChRl的氨基酸119-316。在一些实施方案中，所述光活化嵌合蛋白可以包含与SEQ ID NO:1中所示的序列在没有信号肽序列的情况下至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述光活化嵌合蛋白可以包含与SEQ ID N0:1中所示的序列至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或 100% 相同的氨基酸序列。
[0041]在其它实施方案 中，当用光照射细胞时，光活化嵌合蛋白能够介导细胞中的去极化电流。在一些实施方案中，所述光可以是绿光。在其它实施方案中，所述光的波长可以在约540nm至约560nm之间。在一些实施方案中，所述光的波长可以为约542nm。在一些实施方案中，当用紫光照射细胞时，嵌合蛋白可能不能介导细胞中的去极化电流。在一些实施方案中，当用波长为405nm的光照射细胞时，嵌合蛋白可能不能介导细胞中的去极化电流。
[0042]在一些实施方案中，蛋白可以进一步包含C末端荧光蛋白。在一些具体的实施方案中，所述C末端荧光蛋白可以是增强型黄色荧光蛋白(EYFP)、绿色荧光蛋白(GFP)、青色荧光蛋白(CFP)、或红色荧光蛋白(RFP)。在一些实施方案中，通过添加增强蛋白质向细胞质膜的转运的转运信号(ts)来修饰光活化嵌合蛋白。在一些实施方案中，所述转运信号是来源于人向内整流钾通道Kir2.1的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述转运信号包含氨基酸序列KSRITSEGEHPLDQIDINV。在一些实施方案中，所述蛋白中的信号肽序列可以置换为不同信号肽序列。
[0043]在一些实施方案中，动物细胞可以是神经元细胞、肌肉细胞、或干细胞。在一个实施方案中，动物细胞是神经元细胞。在一些实施方案中，神经元细胞可以是位于非人动物的前额叶皮质中的兴奋性神经元。在其它实施方案中，兴奋性神经元可以是锥体神经元。在其它的实施方案中，抑制性神经元可以是小白蛋白神经元。在一些实施方案中，神经元细胞可以是位于非人动物的前额叶皮质中的抑制性神经元。在一些实施方案中，神经元细胞可以是位于非人动物的前额叶皮质中的抑制性神经元。
[0044] 在一些实施方案中，动物细胞可以进一步包含在细胞的质膜上表达的第二光活化蛋白。在一些实施方案中，当用光照射细胞时，所述第二光活化蛋白可以能够介导细胞中的超极化电流。在一些实施方案中，所述第二光活化蛋白可以是NpHr、eNpHr2.0、eNpHr3.0、eNpHr3.1或GtR3。关于其它光活化阳离子通道、阴离子泵、以及质子泵的另外的信息可以在美国专利申请公布号2009/0093403 ;和国际专利申请号PCT/US2011/028893中找到，所述专利申请的公开内容由此以引用的方式全部并入本文。在一些实施方案中，相对于表达其它光活化阳离子通道蛋白的细胞，所述光活化嵌合蛋白在曝露于光的神经细胞中可以具有增强的光电流。在一些实施方案中，由光活化嵌合蛋白提供的光电流增强可以比表达其它光活化阳离子通道蛋白的细胞大I倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、或15倍中的任一者，包括所述倍数在内。
[0045]本文还提供在动物细胞质膜上表达的一种或多种光活化蛋白，其中所述一种或多种光活化蛋白包含与SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:5,SEQ ID N0:7、SEQ ID N0:9、SEQ ID N0:11、SEQ ID NO: 12,SEQ ID NO: 13 或 SEQ ID NO: 14 中所示的序列至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的核心氨基酸序列，并且进一步包含转运信号(例如，增强向质膜转运的转运信号)。所述转运信号可以融合至核心氨基酸序列的C末端或可以融合至核心氨基酸序列的N末端。在一些实施方案中，所述转运信号可以通过连接子连接至核心氨基酸序列。所述连接子可以包含5个、10个、20个、30个、40个、50个、75 个、100 个、125 个、150 个、175 个、200 个、225 个、250 个、275 个、300 个、400 个、或 500 个氨基酸中的任一长度。所述连接子可以进一步包含荧光蛋白，例如但不限于:增强型黄色荧光蛋白、红色荧光蛋白、绿色荧光蛋白、或青色荧光蛋白。在一些实施方案中，所述转运信号可以来源于人向内整流钾通道Kir2.1的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述转运信号可以包含氨基酸序列KSRITSEGEHPLDQIDINV。
[0046]VlCl嵌合突夺型夺异体
[0047]在一些方面中，本发明包括包含取代的或突变的氨基酸序列的多肽，其中所述突变型多肽保留了前体ClVl嵌合多肽的特征性光可活化性质，但在一些具体方面中也可以具有改变的特性。例如，本文所描述的突变型光活化嵌合蛋白可以展现出在动物细胞内或在动物细胞质膜上的表达水平均增加；当被曝露于不同波长的光(特别是红光)时，响应性改变；和/或性状的组合，其中嵌合ClVl多肽具有以下特性:低脱敏作用、快速去活、低紫光活化以便与其它光活化阳离子通道的交叉活化作用最低，和/或在动物细胞中具有强表达。
[0048]包含氨基酸取代或突变的光活化嵌合蛋白包括一个或多个氨基酸残基经历过氨基酸取代同时保留对光可响应的能力和控制质膜的极化状态的能力的那些蛋白。例如，可以通过将一个或多个氨基酸取代为对应于SEQ ID NO:1的氨基酸序列来制备包含氨基酸取代或突变的光活化蛋白。在一些实施方案中，本发明包括包含的氨基酸序列与SEQ ID NO:1中的氨基酸序列相比改变的蛋白质，其中所述改变的光活化嵌合蛋白保留了具有SEQ IDNO:1中所示的氨基酸序列的蛋白的特征性光活化性质和/或调控穿过质膜的离子流的能力，但在一些具体方面中可以具有改变的特性。[0049] 天然蛋白序列中的氨基酸取代可以是保守性或非保守性的，并且所述取代的氨基酸残基可以是或可以不是由遗传密码编码的氨基酸残基。基于侧链的化学特性，将标准的二十种氨基酸“字母表”分为化学家族。这些家族包括具有以下侧链的氨基酸:碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、不带电极性侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β -分支侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)以及具有芳香族基团的侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。“保守性氨基酸取代”是其中氨基酸残基置换为具有化学上类似的侧链的氨基酸残基(即，使具有碱性侧链的氨基酸置换为具有碱性侧链的另一种氨基酸)。“非保守性氨基酸取代”是其中氨基酸残基置换为具有化学上不同的侧链的氨基酸残基(即，使具有碱性侧链的氨基酸置换为具有芳香族侧链的氨基酸)。氨基酸取代可以是保守性或非保守性的。另外，氨基酸取代可以位于ClVl视黄醛结合袋、一个或多个ClVl细胞内环结构域和/或视黄醛结合袋或细胞内环结构域两者中。
[0050]相应地，本文提供在嵌合多肽的VChRl部分的整个视黄醛结合袋的关键位置上具有特定氨基酸取代的ClVl嵌合光活化蛋白。在一些实施方案中，所述ClVl蛋白可以在SEQID NO:1的氨基酸残基Ε122上具有突变。在一些实施方案中，所述ClVl蛋白可以在SEQID NO:1的氨基酸残基Ε162上具有突变。在其它实施方案中，所述ClVl蛋白可以在SEQID Ν0:1的氨基酸残基Ε162和Ε122两者上具有突变。在一些实施方案中，所公开的突变型ClVl嵌合蛋白各自可以具有可用于使响应于光的动物细胞的膜去极化的具体特性和特征。
[0051]C1V1-E122突变型多肽
[0052]本文提供在动物细胞质膜上表达的本文所公开的光活化ClVl嵌合蛋白，其中一个或多个氨基酸残基经历过氨基酸取代同时保留了 Civi活性(即，能够催化动物细胞响应于光活化的去极化)，并且其中突变可以是在对应于SEQ ID Ν0:1的E122(C1V1-E122)的谷氨酸残基上。在一些实施方案中，所述C1V1-E122突变型嵌合光活化蛋白包含在氨基酸E122上引入SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列中的取代，所述取代可以引起嵌合蛋白对光的敏感性增加、对特定波长的光的敏感性增加、和/或相对于在E122上不具有突变的ClVl嵌合光活化蛋白调控细胞质膜的极化状态的能力增加。在一些实施方案中，突变可以是保守性氨基酸取代。在一些实施方案中，突变可以是非保守性氨基酸取代。在一些实施方案中，在氨基酸残基E122上的突变可以是突变为苏氨酸(C1V1-E122T)。在其它实施方案中，所述光活化嵌合蛋白可以包含与SEQ ID N0:3中所示的序列在没有信号肽序列的情况下至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%相同的氨基酸序列。在其它实施方案中，所述光活化嵌合蛋白可以包含与SEQ ID N0:3中所示的序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%相同的氨基酸序列。在其它实施方案中，所述C1V1-E122突变型嵌合光活化蛋白可以融合至C末端转运信号。在一些实施方案中，所述转运信号可以通过连接子连接至C1V1-E122突变型嵌合光活化蛋白。所述连接子可以包含5 个、10 个、20 个、30 个、40 个、50 个、75 个、100 个、125 个、150 个、175 个、200 个、225 个、250个、275个、300个、400个、或500个氨基酸中的任一长度。所述连接子可以进一步包含荧光蛋白，例如但不限于:增强型黄色荧光蛋白、红色荧光蛋白、绿色荧光蛋白、或青色荧光蛋白。在一些实施方案中，所述转运信号可以来源于人向内整流钾通道Kir2.1的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述转运信号可以包含氨基酸序列KSRITSEGEHPLDQIDINV。
[0053]在其它实施方案中，当用光照射细胞时，C1V1-E122嵌合蛋白能够介导细胞中的去极化电流。在一些实施方案中，光可以是绿光。在其它实施方案中，光的波长可以在约540nm至约560nm之间。在一些实施方案中，光的波长可以为约546nm。在其它实施方案中，当用红光照射细胞时，C1V1-E122嵌合蛋白可以介导细胞中的去极化电流。在一些实施方案中，红光的波长可以为约630nm。在一些实施方案中，当用紫光照射细胞时，C1V1-E122嵌合蛋白可能不能介导细胞中的去极化电流。在一些实施方案中，当用波长为405nm的光照射细胞时，嵌合蛋白可能不能介导细胞中的去极化电流。在一些实施方案中，动物细胞可以是神经元细胞、肌肉细胞、或干细胞。在一个实施方案中，动物细胞可以是神经元细胞。在一些实施方案中，神经元细胞可以是位于非人动物的前额叶皮质中的兴奋性神经元。在其它实施方案中，兴奋性神经元可以是锥体神经元。在一些实施方案中，神经元细胞可以是位于非人动物的前额叶皮质中的抑制性神经元。在其它实施方案中，兴奋性神经元可以是锥体神经元。在其它实施方案中，抑制性神经元可以是小白蛋白神经元。在一些实施方案中，动物细胞可以进一步包含在细胞的质膜上表达的第二光活化蛋白。在一些实施方案中，当用光照射细胞时，第二光活化蛋白可以能够介导细胞中的超极化电流。在一些实施方案中，第二光活化蛋白可以是 NpHr、eNpHr2.0、eNpHr3.0、eNpHr3.1 或 GtR3。
[0054]C1V1-E162突变型多肽
[0055]本文提供在动物细胞质膜上表达的本文所公开的光活化ClVl嵌合蛋白，其中一个或多个氨基酸残基经历过氨基酸取代同时保留Civi活性(即，能够催化动物细胞响应于光活化的去极化)，其中突变可以是在对应于SEQ ID N0:1的E162(C1V1-E162)的谷氨酸残基上。在一些实施方案中，C1V1-E162突变型嵌合光活化蛋白包含在氨基酸E162上引入SEQID NO:1中所示的氨基酸序列中的取代，所述取代可以引起嵌合蛋白对光的敏感性增加、对特定波长的光的敏感性增加、和/或相对于在E162上不具有突变的ClVl嵌合光活化蛋白调控细胞质膜的极化状态的能力增加。在一些实施方案中，突变可以是保守性氨基酸取代。在一些实施方案中，突变可以是非保守性氨基酸取代。在一些实施方案中，在氨基酸残基E162上的突变可以是突变为苏氨酸(C1V1-E162T)。在其它实施方案中，光活化嵌合蛋白可以包含与SEQ ID NO:5中所示的序列在没有信号肽的情况下至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%相同的氨基酸序列。在其它实施方案中，光活化嵌合蛋白可以包含与 SEQ ID NO:5 中所示的序列至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 、或100%相同的氨基酸序列。在其它实施方案中，C1V1-E162突变型嵌合光活化蛋白可以融合至C末端转运信号上。在一些实施方案中，转运信号可以通过连接子连接至C1V1-E162突变型嵌合光活化蛋白。连接子可以包含5个、10个、20个、30个、40个、50个、75个、100个、125个、150个、175个、200个、225个、250个、275个、300个、400个、或500个氨基酸中的任一长度。连接子可以进一步包含荧光蛋白，例如但不限于:增强型黄色荧光蛋白、红色荧光蛋白、绿色荧光蛋白、或青色荧光蛋白。在一些实施方案中，转运信号可以来源于人向内整流钾通道Kir2.1的氨基酸序列。在一些实施方案中，转运信号可以包含氨基酸序列KSRITSEGEYIPLDQIDINV。
[0056]在其它实施方案中，当用光照射细胞时，C1V1-E162嵌合蛋白能够介导细胞中的去极化电流。在一些实施方案中，光可以是绿光。在其它实施方案中，光的波长可以在约540nm至约535nm之间。在一些实施方案中，光的波长可以为约542nm。在其它实施方案中，光的波长可以为约530nm。在一些实施方案中，当用紫光照射细胞时，C1V1-E162嵌合蛋白可能不能介导细胞中的去极化电流。在一些实施方案中，当用波长为405nm的光照射细胞时，嵌合蛋白可能不能介导细胞中的去极化电流。在一些实施方案中，C1V1-E162嵌合蛋白可以进一步包含C末端突光蛋白。在一些实施方案中，动物细胞可以是神经元细胞、肌肉细胞、或干细胞。在一个实施方案中，动物细胞可以是神经元细胞。在一些实施方案中，神经元细胞可以是位于非人动物的前额叶皮质中的兴奋性神经元。在其它实施方案中，兴奋性神经元可以是锥体神经元。在一些实施方案中，神经元细胞可以是位于非人动物的前额叶皮质中的抑制性神经元。在其它实施方案中，兴奋性神经元可以是锥体神经元。在其它实施方案中，抑制性神经元可以是小白蛋白神经元。在一些实施方案中，动物细胞可以进一步包含在细胞的质膜上表达的第二光活化蛋白。在一些实施方案中，当用光照射细胞时，第二光活化蛋白可以能够介导细胞中的超极化电流。在一些实施方案中，第二光活化蛋白可以是NpHr、eNpHr2.0、eNpHr3.0、eNpHr3.1或GtR3。在一些实施方案中，相对于缺乏E162上的突变的ClVl蛋白或相对于其它光活化阳离子通道蛋白，C1V1-E162光活化嵌合蛋白可以具有加速的光循环。在一些实施方案中，C1V1-E162光活化嵌合蛋白可以具有比缺乏E162上的突变的ClVl蛋白或相对于其它光活化阳离子通道蛋白快多于I倍、1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、或5倍的光循环，包括所述倍数在内。
[0057]C1V1-E122/E162双重突变型多肽
[0058]本文提供在动物细胞质膜上表达的本文所公开的光活化ClVl嵌合蛋白，其中一个或多个氨基酸残基经历过氨基酸取代同时保留Civi活性(即，能够催化动物细胞响应于光活化的去极化)，其中突变可以是在对应于SEQ ID N0:1的E122和E162(C1V1-E122/E162)的谷氨酸残基上。在一些实施方案中，C1V1-E122/E162突变型嵌合光活化蛋白可以包含在氨基酸E122和E162上引入SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列中的取代，所述取代可以引起嵌合蛋白对光的敏感性增加、对特定波长的光的敏感性增加、和/或相对于不具有E122和E162上的突变的ClVl嵌合光活化蛋白调控细胞质膜的极化状态的能力增加。在一些实施方案中，突变可以是保守性`氨基酸取代。在一些实施方案中，突变可以是非保守性氨基酸取代。在一些实施方案中，突变可以是保守性和非保守性的氨基酸取代两者。在一些实施方案中，在氨基酸残基E122和E162上的突变均可以是突变为苏氨酸(C1V1-E122T/E162T)。在其它实施方案中，光活化嵌合蛋白可以包含与SEQ ID N0:7中所示的序列在没有信号肽序列的情况下至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%相同的氨基酸序列。在其它实施方案中，光活化嵌合蛋白可以包含与SEQ ID N0:7中所示的序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%相同的氨基酸序列。在其它实施方案中，C1V1-E122/E162突变型嵌合光活化蛋白可以融合C末端转运信号上。在一些实施方案中，转运信号可以通过连接子连接至C1V1-E122/E162突变型嵌合光活化蛋白。连接子可以包含5个、10个、20个、30个、40个、50个、75个、100个、125个、150个、175个、200个、225个、250个、275个、300个、400个、或500个氨基酸中的任一长度。连接子可以进一步包含荧光蛋白，例如但不限于:增强型黄色荧光蛋白、红色荧光蛋白、绿色荧光蛋白、或青色荧光蛋白。在一些实施方案中，转运信号可以来源于人向内整流钾通道Kir2.1的氨基酸序列。在一些实施方案中，转运信号可以包含氨基酸序列KSRITSEGEHPLDQIDINV。[0059]在其它实施方案中，当用光照射细胞时，C1V1-E122/E162嵌合蛋白能够介导细胞中的去极化电流。在一些实施方案中，光可以是绿光。在其它实施方案中，光的波长可以在约540nm至约560nm之间。在一些实施方案中，光的波长可以为约546nm。在一些实施方案中，当用紫光照射细胞时，C1V1-E122/E162嵌合蛋白可能不能介导细胞中的去极化电流。在一些实施方案中，当用波长为405nm的光照射细胞时，嵌合蛋白可能不能介导细胞中的去极化电流。在一些实施方案中，相对于缺乏E122/E162上的突变的ClVl蛋白或相对于其它光活化阳离子通道蛋白，当被曝露于紫光时C1V1-E122/E162嵌合蛋白可以展现出较低程度的活化。在一些实施方案中，动物细胞可以是神经元细胞、肌肉细胞、或干细胞。在一个实施方案中，动物细胞可以是神经元细胞。在一些实施方案中，神经元细胞可以是位于非人动物的前额叶皮质中的兴奋性神经元。在其它实施方案中，兴奋性神经元可以是锥体神经元。在一些实施方案中，神经元细胞可以是位于非人动物的前额叶皮质中的抑制性神经元。在其它实施方案中，抑制性神经元可以是小白蛋白神经元。在一些实施方案中，动物细胞可以进一步包含在细胞的质膜上表达的第二光活化蛋白。在一些实施方案中，当用光照射细胞时，第二光活化蛋白可以能够介导细胞中的超极化电流。在一些实施方案中，第二光活化蛋白可以是NpHr、eNpHr2.0,eNpHr3.0,eNpHr3.1或GtR3。在一些实施方案中，相对于缺乏E122/E162上的突变的ClVl蛋白或相对于其它光活化阳离子通道蛋白，C1V1-E122/E162突变型光活化嵌合蛋白可以具有减少的钝化。在一些实施方案中，与缺乏E122/E162上的突变的ClVl蛋白相比或相对于其它光活化阳离子通道蛋白，C1V1-E122/E162突变型光活化嵌合蛋白可以钝化约 15%、16%、17%、18%、19%、20%、21%、22%、23%、24%、25%、26%、27%、28%、29%、或30%中的任一者，包括所述数据在内。在一些实施方案中，C1V1-E122/E162光活化嵌合蛋白可以具有比缺乏E122/E162上的突变的ClVl蛋白或相对于其它光活化阳离子通道蛋白快多于I倍、1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、5.5倍、6倍、6.5倍、7倍、7.5倍、8倍、8.5倍、9倍、9.5倍、或10倍的光循环，包括所述倍数在内。
[0060]增强型细胞内转运氨基酸基序
[0061]本公开内容提供通过添加一个或多个增强向哺乳动物细胞的质膜的转运的氨基酸序列基序而对细胞中表达的光活化嵌合蛋白进行修饰。具有来源于进化上较低等生物的组分的光活化嵌合蛋白可能不能由哺乳动物细胞表达或耐受，或当在哺乳动物细胞中高水平表达时可能展现出亚细胞定位障碍。因此，在一些实施方案中，在细胞中表达的嵌合光活化蛋白质融合至一个或多个氨基酸序列基序，所述氨基酸序列基序选自由以下组成的组:信号肽、内质网(ER)输出信号、膜转运信号、以及N末端高尔基(golgi)输出信号。增强光活化嵌合蛋白向哺乳动物细胞的质膜的转运的一个或多个氨基酸序列基序可以融合至光活化蛋白的N末端、C末端、或N末端和C末端两者。任选地，光活化蛋白和一个或多个氨基酸序列基序可以由连接子分开。在一些实施方案中，通过添加增强蛋白质向细胞质膜的转运的转运信号(ts)来修饰光活化嵌合蛋白。在一些实施方案中，转运信号来源于人向内整流钾通道Kir2.1的氨基酸序列。在一些实施方案中，转运信号包含氨基酸序列KSRITSEGEYIPLDQIDINV.可以增强光活化蛋白向细胞的质膜转运的另外的蛋白质基序描述于美国专利申请号12/041，628中，所述专利申请以引用的方式全部并入本文。在一些实施方案中，嵌合蛋白中的信号肽序列被缺失或取代为来自不同蛋白质的信号肽序列。
_2] 动物细胞、非人动物、以及脑切片[0063]本文提供包含本文所公开的光活化嵌合蛋白的细胞。在一些实施方案中，细胞是动物细胞。在一些实施方案中，动物细胞包含对应于SEQ ID N0:1的ClVl蛋白。在其它实施方案中，动物细胞包含对应于SEQ ID N0:3的突变型C1V1-E122T蛋白。在其它实施方案中，动物细胞包含对应于SEQ ID N0:5的突变型C1V1-E162T蛋白。在其它实施方案中，动物细胞包含对应于SEQ ID N07的突变型C1V1-E122T/E162T蛋白。在一些实施方案中，动物细胞可以是神经元细胞、肌肉细胞、或干细胞。在一个实施方案中，动物细胞可以是神经元细胞。在一些实施方案中，神经元细胞可以是位于非人动物的前额叶皮质中的兴奋性神经元。在其它实施方案中，兴奋性神经元可以是锥体神经元。在一些实施方案中，神经元细胞可以是位于非人动物的前额叶皮质中的抑制性神经元。在其它实施方案中，抑制性神经元可以是小白蛋白神经元。
[0064]本文还提供包含在动物的细胞的细胞膜上表达的本文所公开的光活化嵌合蛋白的非人动物。在一些实施方案中，动物细胞包含对应于SEQ ID N0:1的ClVl蛋白。在其它实施方案中，动物细胞包含对应于SEQ ID N0:3的突变型C1V1-E122T蛋白。在其它实施方案中，动物细胞包含对应于SEQ ID N0:5的突变型C1V1-E162T蛋白。在其它实施方案中，动物细胞包含对应于SEQ ID N07的突变型C1V1-E122T/E162T蛋白。在一些实施方案中，包含本文所描述的光活化嵌合蛋白的动物是以转基因方式表达所述光活化嵌合蛋白。在其它实施方案中，包含本文所描述的光活化嵌合蛋白的动物已通过病毒用携带光活化蛋白的载体(如，但不限于腺病毒载体)进行了转染。
[0065]本文提供来自非人动物的活脑切片，所述活脑切片包含在这些切片中的细胞的细胞膜上表达的本文所描述的光活化嵌合蛋白。在一些实施方案中，脑切片是来自以转基因方式表达本文所描述的光活化嵌合蛋白的非人动物。在其它实施方案中，脑切片是来自已通过病毒用携带所述光活化蛋白的载体(如，但不限于腺病毒载体)转染的非人动物。在一些实施方案中，脑切片是冠状脑切片。在一些实施方案中，脑切片具有约100 μ m、约150 μ m、约 200 μ m、约 250 μ m、约 300 μ m、约 350 μ m、约 400 μ m、约 450 μ m、或约 500 μ m 中的任一厚度，包括所述在内，包括在这些数值之间的任何厚度。
`[0066]分离的多核苷酸
[0067]本文提供分离的ClVl多核苷酸，所述分离的ClVl多核苷酸编码本文所描述的例如具有ClVl多肽的至少一种活性的任何嵌合多肽。本公开内容提供分离的、合成的、或重组的多核苷酸，所述多核苷酸包含与SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4、SEQ ID N0:6或SEQ IDNO: 8的核酸在至少约10个，例如至少约15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、75 个、100 个、150 个、200 个、250 个、300 个、350 个、400 个、450 个、500 个、550 个、600 个、650个、700个、750个、800个、850个、900个、950个、或1000个核苷酸的区域上具有至少约 70%,例如至少约 71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或 99% 或完全(100%)序列同一性的核酸序列。
[0068]本公开内容特别提供编码ClVl和/或其突变型变异体的核酸。例如，本公开内容提供分尚的核酸分子，其中所述核酸分子编码:(1)包含与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的氨基酸序列的多肽；(2)包含与 SEQ ID NO:3 的氨基酸序列具有至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的氨基酸序列的多肽；(3)包含与SEQ ID NO: 5的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的氨基酸序列的多肽；或(4)包含与SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的氨基酸序列的多肽。
[0069]启动子和载体
[0070]本公开内容还提供包含上述核酸的表达序列盒和/或载体。适合的是，编码本公开内容的嵌合蛋白的核酸可操作地连接至启动子。启动子是本领域众所周知的。在宿主细胞中起作用的任何启动子都可以用于表达本公开内容的ClVl和/或其任何变异体。有大量适用于驱动ClVl嵌合蛋白或其变异体在特定动物细胞中表达的启始控制区或启动子并且是本领域的技术人员所熟悉的。可以使用几乎任何能够驱动这些核酸的启动子。
[0071]具体来说，在希望在兴奋性神经细胞中重组表达ClVl嵌合蛋白的情况下，可以使用人钙调素依赖性蛋白激酶IIa (CaMKIIa)启动子。在其它实施方案中，可以将延长因子Ia(EF-1a)启动子与Cre诱导性重组AAV载体联合用于小白蛋白-Cre转基因小鼠来使表达ClVl嵌合蛋白靶向抑制性神经元。
[0072]本文还提供包含编码ClVl嵌合多肽或其任何变异体的本文所公开的多核苷酸的载体。可以根据本发明施用的载体还包括包含编码当从载体的多核苷酸中转录时将引起光活化嵌合蛋白在靶动物细胞的质膜上积聚的RNA(例如，RNA1、核酶、miRNA、siRNA)的多核苷酸的载体。可以使用的载体包括，但不限于:慢病毒载体、HSV载体、以及腺病毒载体。慢病毒包括但不限于:HIV-1、HIV-2、SIV、FIV以及EIAV。慢病毒可以是具有其它病毒的包膜蛋白的假型病毒，所述其它病毒包括但不限于:VSV、狂犬病病毒、Mo-MLV、杆状病毒以及埃博拉病毒(Ebola)。可以使用本领域中的标准方法来制备此类载体。
[0073]在一些实施方案中,载体是重组AAV载体。AAV载体尺寸相对较小的DNA病毒，所述DNA病毒可以稳定和位点特 异性的方式整合至它们感染的细胞的基因组中。所述AAV载体能够感染一系列细胞而不会诱导对细胞生长、形态学或分化的任何影响，并且它们似乎不参与人病理学。AAV基因组已进行了克隆、测序和表征。所述AAV基因组涵盖约4700个碱基并且在每个末端包含具有约145个碱基的反向末端重复(ITR)区，其用作病毒的复制起点。基因组的其余部分分为承载衣壳化功能的两个必需区域:基因组的左边部分，所述左边部分包含参与病毒基因的病毒复制和表达的rep基因；和基因组的右边部分，所述右边部分包含编码病毒的衣壳蛋白的cap基因。
[0074]AAV作为基因疗法的载体的应用已在近年来得到快速发展。野生型AAV可以用相对高的滴度感染分裂的或未分裂的细胞、或哺乳动物(包括人)的组织，并且还可以整合至人细胞中的特定位点(在染色体19的长臂上)(Kotin, R.M.等，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA87:2211-2215，1990) (Samulski, R.J 等，EMBO J.10:3941-3950，1991，所述参考文献的公开内容由此以引用的方式全部并入本文)。没有rep和cap基因的AAV载体失去位点特异性整合的特异性，但仍然可以介导外源基因的长期稳定表达。AAV载体以两种形式存在于细胞中，其中一种是染色体外的游离基因；另一种被整合至染色体中，其中前者作为主要的形式。此外，迄今为止尚未发现AAV与任何人疾病相关，也没有观察到整合引起生物学特征发生任何变化。在文献中报道了十六种血清型AAV，分别命名为AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV14、AAV15、以及 AAV16，其中 AAV5是最初从人中分离出来的(Bantel-Schaal 和 H.zur Hausen.1984.Virologyl34:52-63)，而AAV1-4和AAV6均是在腺病毒的研究中发现的(Ursula Bantel-Schaal, Hajo Delius以及 Harald zur Hausen.J.Virol.1999, 73:939-947)。
[0075]可以使用本领域中的标准方法来制备AAV载体。任何血清型的腺相关病毒都是适合的(参见，例如 Blacklow, “Parvoviruses and Human Disease"J.R.Pattison 编著(1988)的第 165-174 页；Rose, Comprehensive Virology3:1, 1974 ；P.Tattersall “TheEvolution of Parvovirus Taxonomy，，于Parvoviruses(JR Kerr, SF Cotmore.ME Bloom, RMLinden, CR Parrish 编著)第 5-14 页，Hudder Arnold, London, UK(2006);以及 DEBowles, JE Rabinowitz, RJ Samulski “The Genus Dependovirus，，(JR Kerr, SF Cotmore.ME Bloom, RM Linden, CR Parrish编著)第 15-23 页，Hudder Arnold, London, UK (2006),所述参考文献的公开内容由此以引用的方式全部并入本文)。用于纯化载体的方法可以见于例如美国专利号 6566118、6989264 和 6995006 以及名称为“Methods for Generating HighTiter Helper-free Preparation of Recombinant AAV Vectors” 的 W0/1999/011764,所述专利文献的公开内容以引用的方式全部并入本文。杂交载体的制备描述于例如PCT申请号PCT/US2005/027091中，所述申请的公开内容以引用的方式全部并入本文。使用来源于AAV的载体用于在活体外和活体内转移基因已有描述(参见例如，国际专利申请公布号91/18088 和 W093/09239 ;美国专利号 4，797，368,6, 596，535 和 5，139，941，全部所述专利文献均以引用的方式全部并入本文)。这些公布描述了 rep和/或cap基因被缺失并且置换为相关基因的各种AAV来源的构建体；以及使用这些构建体用于在活体外(转移至培养细胞中)或活体内(直接转移 至生物体中)转移相关基因。根据本发明的复制缺陷型重组AAV可以通过将含有侧接有两个AAV反向末端重复(ITR)区的相关核酸序列的质粒和带有AAV衣壳化基因(rep和cap基因)的质粒共转染至用人辅助病毒(例如腺病毒)感染的细胞系中来制备。然后，通过标准的技术来纯化所产生的AAV重组体。
[0076]在一些实施方案中，使供本发明方法使用的载体衣壳化成病毒粒子(例如AAV病毒粒子，包括但不限于 AAVl、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAVlO、AAVl 1、AAV12、AAV13、AAV14、AAV15、以及AAV16)。因此，本发明包括包含本文所描述的任何载体的重组病毒粒子(重组是因为它包含重组多核苷酸)。产生所述粒子的方法在本领域中是已知的，并且描述于美国专利号6，596，535中。
[0077]关于本文所描述的动物细胞，应理解可以对神经细胞、心脏细胞、或干细胞施用一种或多种载体。如果使用多于一种载体，应理解它们可以同时或在不同的时间里施用至动物细胞。
[0078]本发明的方法
[0079]本文提供用于通过在存在于相同微回路中的兴奋性或抑制性神经元中表达本文所描述的光活化嵌合蛋白而选择性地使那些神经元去极化的方法。在一些实施方案中，第一光活化蛋白(如本文所公开的那些)可以在兴奋性神经元中表达，而第二光活化蛋白可以在抑制性神经元中表达。在一些实施方案中，在兴奋性神经元中表达的第一光活化蛋白可以由不同于在抑制性神经元中表达的第二光活化蛋白的波长的光活化。在一些实施方案中，第一光活化蛋白和第二光活化蛋白可以在活的非人动物或在来自非人动物的活脑切片中表达。[0080]在其它实施方案中，提供用于鉴别选择性地抑制通过在存在于相同神经回路的兴奋性或抑制性神经元中表达本文所描述的光活化嵌合蛋白而引起的那些神经元的去极化的化合物的方法。在一些实施方案中，第一光活化蛋白可以在兴奋性神经元中表达，而第二光活化蛋白可以在抑制性神经元中表达。在一些实施方案中，在兴奋性神经元中表达的第一光活化蛋白可以由不同于在抑制性神经元中表达的第二光活化蛋白的波长的光活化。在一些实施方案中，第一光活化蛋白和第二光活化蛋白可以在活的非人动物或在来自非人动物的活脑切片中表达。
[0081]用于选择性地改变存在于相同微回路中的神经元中的E/Ι平衡的方法
[0082]在一些方面中，提供用于选择性地使存在于相同微回路中的兴奋性或抑制性神经元去极化的方法，所述方法包括:选择性地使包含第一光活化蛋白的兴奋性神经元去极化，其中所述第一光活化蛋白当被曝露于具有第一波长的光时被去极化；或选择性地使包含第二光活化蛋白的抑制性神经元去极化，其中所述第二光活化蛋白当被曝露于具有第二波长的光时被去极化。在一些实施方案中，第一光活化蛋白可以包含与SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%相同的蛋白。在其它实施方案中，第一光活化蛋白可以包含与SEQ ID N0:3中所示的氨基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%相同的蛋白。在一些实施方案中，第一光活化蛋白可以包含与SEQ ID NO:5中所示的氨基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%相同的蛋白。在一些实施方案中，第二光活化蛋白可以包含与SEQ IDNO: 11 中所示的氨基酸序列至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或 100% 相同的蛋白。在一些实施方案中，第二光活化蛋白可以包含与SEQ ID NO: 12中所示的氨基酸序列至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或 100% 相同的蛋白。在一些实施方案中，第二光活化蛋白可以包含与SEQ ID勵:13中所示的氨基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%相同的蛋白。在一些实施方案中，第二光活化蛋白可以包含与SEQ ID NO: 14中所示的氨基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%相同的蛋白。关于其它光活化阳离子通道的公开内容的更多信息可见于美国专利申请公布号2007/0054319 ;美国专利申请号61/410，704 ;以及国际专利申请公布号W02010/056970中，所述专利文献各自的公开内容由此以引用的方式全部并入。
[0083]在其它方面中，提供用于选择性地使存在于相同微回路中的兴奋性或抑制性神经元去极化的方法，所述方法包括:在兴奋性神经元中表达第一光活化蛋白；并且在抑制性神经元中表达第二光活化蛋白，其中第一光活化蛋白当被曝露于具有第一波长的光时，被独立地去极化，并且其中第二光活化蛋白当被曝露于具有第二波长的光时，被独立地去极化。在一些实施方案中，第一光活化蛋白可以包含与SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或 100%相同的蛋白。在其它实施方案中，第一光活化蛋白可以包含与SEQ ID N0:3中所示的氨基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%相同的蛋白。在一些实施方案中，第一光活化蛋白可以包含与 SEQ ID NO:5 中所示的氨基酸 序列至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%相同的蛋白。在一些实施方案中，第二光活化蛋白可以包含与SEQ ID N0:11中所示的氨基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%相同的蛋白。在一些实施方案中，第二光活化蛋白可以包含与SEQ ID NO: 12中所示的氨基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或 100% 相同的蛋白。在一些实施方案中，第二光活化蛋白可以包含与SEQ ID NO: 13中所示的氨基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%相同的蛋白。在一些实施方案中，第二光活化蛋白可以包含与 SEQ ID NO: 14 中所示的氨基酸序列至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%相同的蛋白。
[0084]在一些实施方案中，可以通过绿光来活化第一光活化蛋白。在一个实施方案中，可以通过波长为约560nm的光来活化第一光活化蛋白。在一个实施方案中，可以通过红光来活化第一光活化蛋白。在另一个实施方案中，可以通过波长为约630nm的光来活化第一光活化蛋白。在其它实施方案中，可以通过紫光来活化第二光活化蛋白。在一个实施方案中，可以通过波长为约405nm的光来活化第二光活化蛋白。在其它实施方案中，可以通过绿光来活化第二光活化蛋白。在一些实施方案中，通过光脉冲来活化光活化蛋白，所述光脉冲可以具有约I毫秒(ms)、约2ms、约3ms、约4ms、约5ms、约6ms、约7ms、约8ms、约9ms、约 10ms、约 15ms、约 20ms、约 25ms、约 30ms、约 35ms、约 40ms、约 45ms、约 50ms、约 60ms、约70ms、约 80ms、约 90ms、约 100ms、约 200ms、约 300ms、约 400ms、约 500ms、约 600ms、约 700ms、约800ms、约900ms、约I秒、约1.25秒、约1.5秒、或约2秒中的任一持续时间，包括所述数值在内，包括在这些数值之间的任何时间。在一些实施方案中，通过光脉冲来活化光活化蛋白，所述光脉冲的光功率密度可以为约0.05mff mm2、约0.1mff mm2、约0.25mff mm2、约0.5mffmm 2、约 0.75mff mm 2、约 ImW mm 2、约 2mW mm 2、约 3mW mm 2、约 4mW mm 2、约 5mW mm 2、约 6mWrnnT2、约 7mW rnnT2、约 8mW mnT2、约 9mW mnT2、约 10mW mnT2、约 IlmW mnT2、约 12mW mnT2、约 13mWmnT2、约 14mW mnT2、约 mW mnT2、约 16mW mnT2、约 17mW mnT2、约 18mW mnT2、约 19mW mnT2、约 20mWmm2、约 21mW mm2、约 22mW mm2、约 23mW mm2、约 24mW mm2、或约 25mW mm2 中的任一者，包括所述数值在内，包括这些数值之间的任何值。在一些实施方案中，神经元细胞可以是位于非人动物的前额叶皮质中的兴奋性神经元。在其它实施方案中，兴奋性神经元可以是锥体神经元。在一些实施方案中，神经元细胞可以是位于非人动物的前额叶皮质中的抑制性神经元。在其它实施方案中，抑制性神经元可以是小白蛋白神经元。在一些实施方案中，抑制性和兴奋性神经元可以是在活的非人动物中。在其它实施方案中，抑制性和兴奋性神经元可以是在来自非人动物的脑切片中。
[0085]用于鉴别选择性地改变存在于相同微回路中的神经元中的E/Ι平衡的化合物的述
[0086]在一些方面中，提供用于鉴别选择性地抑制存在于相同微回路中的兴奋性或抑制性神经元的去极化的化合物的方法，所述方法包括:(a)用具有第一波长的光选择性地使包含第一光活化蛋白的兴奋性神经元去极化，或用具有第二波长的光选择性地使包含第二光活化蛋白的抑制性神经元去极化；(b)测量响应于选择性地使包含第一光活化蛋白的兴奋性神经元去极化的兴奋性突触后电位(EPSP)或测量响应于选择性地使包含第二光活化蛋白的抑制性神经元去极化的抑制性突触后电流(IPSC) ；(c)使兴奋性神经元或抑制性神经元与化合物接触；(d)测量兴奋性突触后电位(EPSP)或测量抑制性突触后电流(IPSC)以确定使兴奋性神经元或抑制性神经元与化合物接触是否选择性地抑制任一神经元的去极化。在一些实施方案中，第一光活化蛋白可以包含与SEQ ID N0:1中所示的氨基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%相同的蛋白。在其它实施方案中，第一光活化蛋白可以包含与SEQ ID NO:3中所示的氨基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%相同的蛋白。在一些实施方案中，第一光活化蛋白可以包含与 SEQ ID NO:5 中所示的氨基酸序列至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%相同的蛋白。在一些方面中，第二光活化蛋白可以包含与SEQ ID ΝΟ:11中所示的氨基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%相同的蛋白。在一些实施方案中，第二光活化蛋白可以包含与SEQ ID NO: 12中所示的氨基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或 100% 相同的蛋白。在一些实施方案中，第二光活化蛋白可以包含与SEQ ID NO: 13中所示的氨基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%相同的蛋白。在一些实施方案中，第二光活化蛋白可以包含与 SEQ ID NO: 14 中所示的氨基酸序列至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%相同的蛋白。在一些实施方案中，化合物可以是组合化学文库中的成员。在其它实施方案中，所述方法进一步包括测定化合物以确定它是否不利地影响心脏组织的功能或哺乳动物的心脏动作电位。
[0087]在一些实施方案中，可以通过绿光来活化第一光活化蛋白。在一个实施方案中，可以通过波长为约560nm的光来活化第一光活化蛋白。在一个实施方案中，可以通过红光来活化第一光活化蛋白。在另一个实施方案中，可以通过波长为约630nm的光来活化第一光活化蛋白。在其它实施方案中，可以通过紫光来活化第二光活化蛋白。在一个实施方案中，可以通过波长为约405nm的光来活化第二光活化蛋白。在一些实施方案中，可以通过光脉冲来活化光活化蛋白，所述光脉冲可以具有约I毫秒(ms)、约2ms、约3ms、约4ms、约5ms、约6ms、约 7ms、约 8ms、约 9ms、约 10ms、约 15ms、约 20ms、约 25ms、约 30ms、约 35ms、约 40ms、约45ms、约 50ms、约 60ms、约 70ms、约 80ms、约 90ms、约 100ms、约 200ms、约 300ms、约 400ms、约500ms、约600ms、约700ms、约800ms、约900ms、约I秒、约1.25秒、约1.5秒、或约2秒中的任一持续时间，包括所述数值在内，包括在这些数值之间的任何时间。在一些实施方案中，可以通过光脉冲来活化光活化蛋白，所述光脉冲的光功率密度可以为约0.05mff mm2、约0.1mffmnT2、约 0.25mff mnT2、约 0.5mff mnT2、约 0.75mff mnT2、约 ImW mnT2、约 2mW mnT2、约 3mW mnT2、约 4mW mnT2、约 5mW mnT2、约 6mW mnT2、约 7mW mnT2、约 8mW mnT2、约 9mW mnT2、约 IOmW mnT2、约llmff mm2、约 12mW mm2、约 1`3mW mm2、约 14mW 1111]12、约碰 mm2、约 16mW mm2、约 17mW mm2、约 18mW mnT2、约 19mW mnT2、约 20mW mnT2、约 21mW mnT2、约 22mW mnT2、约 23mW mnT2、约 24mWmnT2、或约25mW mnT2中的任一者,包括所述数值在内，包括这些数值之间的任何值。在一些实施方案中，神经元细胞可以是位于非人动物的前额叶皮质中的兴奋性神经元。在其它实施方案中，兴奋性神经元可以是锥体神经元。在一些实施方案中，神经元细胞可以是位于非人动物的前额叶皮质中的抑制性神经元。在其它实施方案中，抑制性神经元可以是小白蛋白神经元。在一些实施方案中，抑制性和兴奋性神经元可以是在活的非人动物中。在其它实施方案中，抑制性和兴奋性神经元可以是在来自非人动物的脑切片中。
[0088]示例性实施方案
[0089]本公开内容涉及光活化嵌合体视蛋白，所述光活化嵌合体视蛋白当在膜表达时改变膜电压。虽然本公开内容不必限制于这些背景，但可以通过使用这些背景和其它背景对实施例进行讨论来理解本公开内容的不同方面。
[0090]本公开内容的不同实施方案涉及经过修饰以供在细胞膜(包括哺乳动物细胞)中表达的光活化视蛋白。所述视蛋白来源于两种不同的视蛋白(团藻视紫红质通道蛋白(VChRl)和莱茵衣藻视紫红质通道蛋白(ChRl))的组合。所述视蛋白可以适用于以高于它所来源的任一个别视蛋白的速率水平表达。
[0091]在某些更具体的实施方案中，ChRl/VChRl嵌合体(ClVl)的遗传序列主要是VChRl。VChRl序列中与转运相关的部分置换为来自ChRl的同源序列。
[0092]不同实施方案涉及针对添加转运信号以促进在哺乳动物细胞中的表达的修饰。
[0093]本公开内容的某些方面针对ClVl的进一步修饰型式。例如，某些实施方案包括ClVl的突变E162T，实验表明所述突变E162T提供了加速的光循环(例如，几乎3倍)。
[0094]本公开内容的不同实施方案涉及使对神经回路的时间、空间和/或细胞类型特异性控制与可测量的指标相关的光遗传学系统或方法。光遗传学系统使用多种视蛋白(包括ClVl和/或ClVl变异体)来确保对神经回路的多个部分进行控制。例如，不同的指标或症状可能与神经病症相关。光遗传学系统靶向患者体内的神经回路用于对其进行选择性控制。光遗传学系统涉及对患者的与神经病症相关的指标或症状进行监测。以此方式，光遗传学系统可以提供关于神经回路、其功能和/或神经病症的详细信息。
[0095]与本文所讨论的实施方案一致，特定实施方案涉及使用多种视蛋白来研究和探测病症。其它实施方案涉及对表型和内在表型的鉴别和/或研究。其它实施方案涉及治疗靶标的鉴别。
[0096]本公开内容的方面针对在快速时间尺度上人工诱导病症/疾病病况。基于关于加速的光循环的特征，使用视蛋白(如C1V1)可能特别有用。此外，某些实施方案允许用于可逆的疾病病况，这可以特别适用于建立用于测试和/或用于测试治疗对展现出疾病病况时和没有展现出疾病病况时的相同动物的作用的基线/控制点。使用视蛋白(如C1V1)允许使用光源对细胞进行控制。ClVl对光有反应，从而引起细胞的膜电位变化。去除光并且随后停止活化ClVl允许细胞返回至它的基线状态。存在各种其它的可能性，本文更详细地讨论了一些所述可能性。
[0097]本公开内容的不同方面针对ClVl视蛋白的E122T突变。在本公开内容的某些实施方案中，相对于未突变的视蛋白，E122T突变使ClVl或其变异体的最大吸收移向红光光
-1'TfeP曰。
[0098]本公开内容的不同实施方案涉及经过修饰以供在哺乳动物细胞中表达并且相对于ChR2，绿光光谱中的最大吸收得到迁移的视蛋白。ClVl视蛋白来源于视蛋白的组合，并且以高于它所来源的任一视蛋白的速率表达。视蛋白ClVl来源于团藻视紫红质通道蛋白(VChRl)和莱茵衣藻视紫红质通道蛋白(ChRl)。所得到的视蛋白ClVl以及其变异体在530nm与546nm之间的波长下具有最大吸收。
[0099]本公开内容的某些方面针对ClVl的进一步修饰型式。例如，某些实施方案包括突变E122T，所述突变E122T使ClVl的最大吸收移向红光光谱。其它修饰可以包括另一突变E162T，实验表明除了由E122T突变提供红移之外，所述另一突变E162T提供了加速的光循环。
[0100]在一些实施方案中，提供来源于VChRl并且转运序列置换为来自ChRl的同源序列的跨膜蛋白。在一些实施方案中，分子进一步包括突变E122T。在其它实施方案中，分子进一步包括E162T和E122T上的突变。在某些实施方案中，分子响应于绿光而活化离子通道。在一个实施方案中，分子的最大光吸收为约546nm。在另一个实施方案中，分子的最大光吸收为约535nm。
[0101]在一些实施方案中，提供一种动物细胞,所述动物细胞包含:表达对红光可响应的离子通道的整合外源分子；来源于VChRl并且包括其置换为来自ChRl的同源序列的跨膜转运序列的外源分子。在一些实施方案中，外源分子进一步包括E122T。在其它实施方案中，响应于分别具有405nm和560nm波长的光，细胞的神经放电比率为约14%至94%。在其它实施方案中，分别响应于具有405nm和560nm波长的光，细胞的神经放电比率为约11%至72%。
[0102]本公开内容的其它示例实施方案涉及使用杂交ChRl/VChRl嵌合体，所述杂交ChRl/VChRl嵌合体完全不包含ChR2序列，来源于不能单独良好表达的两种视蛋白基因并且在本文中称为C1V1。本公开内容的实施方案还涉及通过添加来源于KiJ.1通道的膜转运信号而改进VChRl的膜靶向。与ChR2相比，由表达VChRl-EYFP的培养神经元得到的共焦图像揭示细胞内蛋白的比例较大；因此，使用来源于U I通道的膜转运信号(ts)来改进VChRl的膜靶向。与VChRl-EYFP相比，这种VChRl-ts_EYFP的膜靶向稍微有所增强；然而，从表达VChRl-ts-EYFP的培养海马神经元中记录到的平均光电流仅稍微大于VChRl-EYFP的平均光电流。因此，本公开内容的实施方案涉及通过将螺旋更换为来自其它ChR的相应螺旋而修饰的VChRl。例如，在螺旋I和螺旋2置换为来自ChRl的同源区段的两个嵌合体中发现了稳定的改进。发现无论剪接位点是在螺旋2与螺旋3之间的细胞内环中(在ChRl残基Alal45上)或是在螺旋3内(在ChRl残基Trp 163上)，所得到的嵌合体均稳定地表达并且显示出类似增强的光电流和光谱特性。这种结果是出人意料的，因为ChRl仅具有弱表达并且不容易整合至大多数哺乳动物宿主细胞的膜中。
[0103]本公开内容的特定方面涉及适合于神经科学的微生物视蛋白基因，从而允许在完整哺乳动物脑内的特定细胞类型中使光脉冲列转变为毫秒时间尺度的膜电位变化(例如，视紫红质通道蛋白(ChR2)、团藻视紫红质通道蛋白(VChRl)以及盐细菌视紫红质(NpHR))。ChR2是来源于单细胞绿藻莱茵`衣藻的视紫红质。本文所使用的术语“视紫红质”是包含至少两个构建嵌段(即视蛋白和共价结合的辅因子，通常是维生素A醛(视黄醛))的蛋白质。视紫红质ChR2来源于衣藻基因组中的视蛋白通道视蛋白_2(Chop2)，最初命名为衣藻视蛋白-4(Cop4)。一种去极化视紫红质通道蛋白(ChR2)的时间特性包括活化和去活的快速动力学，从而给予精确定时的动作电位列的产生。针对寻求长时间尺度活化的应用，发现可以使视紫红质通道蛋白的通常快速的解离动力学变慢。例如，视紫红质通道蛋白的某些实施例应用lmW/mm2的光持续希望去极化的几乎全部时间，这可能不太合乎需要。
[0104]本文的大多数讨论是针对ChR2。除非另外指明，否则本公开内容包括许多类似的变异体。实例包括但不限于:Chop2、ChR2-310、Chop2_310、以及团藻视紫红质通道蛋白(VChRl)。为了对VChRl进一步详细说明，可以参考〃Red-shifted optogeneticexcitation:a tool for fast neural control derived from Volvox carteri, 〃NatNeurosc1.2008年6月，11 (6):631-3.Epub2008年4月23日，所述参考文献的公开内容以引用的方式全部完全地并入本文。在其它实施例中，可以对其它视蛋白分子进行类似的修饰。例如，可以对ChR2或VChRl变异体进行修饰/突变。此外，修饰的变异体可以与光活化离子泵组合使用。
[0105]本公开内容的实施方案包括天然存在的序列的相对次要氨基酸变异体。在一个例子中，变异体与天然存在的序列的蛋白质序列的同源性大于约75%。在其它变异体中，同源性大于约80%。其它的变异体具有大于约85%、大于90%、或甚至高达约93%至约95%或约98%的同源性。在此上下文中的同源性意指序列相似性或同一性，其中同一性是优选的。可以使用序列分析中已知的标准技术来确定这种同源性。本公开内容的实施方案的组合物包括本文所提供的蛋白质和核酸序列，包括与所提供的序列的同源性高于约50%、与所提供的序列的同源性高于约55%、与所提供的序列的同源性高于约60%、与所提供的序列的同源性高于约65%、与所提供的序列的同源性高于约70%、与所提供的序列的同源性高于约75%、与所提供的序列的同源性高于约80%、与所提供的序列的同源性高于约85%、与所提供的序列的同源性高于约90%、或与所提供的序列的同源性高于约95%的变异体。
[0106]如本文所使用，“刺激靶细胞”通常被用来描述对细胞的特性进行修饰。例如，靶细胞的刺激物可以造成细胞膜特性的变化，这可以引起靶细胞的去极化或极化。在一个具体的例子中，靶细胞是神经元，并且刺激物通过促进或抑制神经元的脉冲(动作电位)的产生来影响脉冲的传递。
[0107]关于对光活化视蛋白的进一步详细描述，可以参考Deisseroth等，名称为^Optically-Based Stimulation of Target Cells and Modifications Thereto, 〃的PCT公布号W02010/056970，所述专利文献以引用的方式全部完全地并入本文。
实施例
[0108]实施例1:嵌合视紫红质通道蛋白变异体ClVl的开发
[0109]在本实施例中，寻求将容许在皮质切片中以及在活动物实验中活体内驱动皮质E/I升高和监测Y振荡的工具，其中具有三个关键特性:1)实现剂量-响应研究的效力高得多；2)低脱敏作用，以允许E/Ι平衡的阶梯状变化；以及3)红移激发，以允许类似地驱动相同制剂中的不同的群。
[0110]这些实验最初尝 试使用VChRl，所述VChRl显示红移和降低的脱敏作用14，但先前研究表明表达VChRl的细胞中的光电流较小(-100-150pA14)，并且不能在下游细胞(未示出)中引发稳定的突触活性。实际上，当首先尝试在细胞中表达VChRl时，仅观察到小的光电流(图1A)，这与先前的发现一致。与VChRl-EYFP相比，添加来源于Kir2.1通道的膜转运信号以便产生VChRl-1s-EYFP仅实现了不高的光电流增强的趋向(图1B)。然而，要注意在ChR2中，用来自ChRl的同源区域置换跨膜区段增强了膜靶向并且增强了光电流，假设在VChRl的螺旋与来自其它ChR的相应螺旋之间的类似系统性交换可以类似地引起HEK细胞中的膜表达增强。
[0111]材料和方法
[0112]通过重叠延伸PCR将野生型或人的密码子优化的视紫红质通道蛋白-1与人密码子改适的VChRl (GenBankTM保藏编号A⑶70142.1)融合来产生嵌合视紫红质通道蛋白变异体C1V1。通过重叠PCR产生ClVl剪接变异体。变异体一包含ChRl的前145个氨基酸和VChRl的氨基酸102至316。变异体二包含ChRl的前162个氨基酸和VChRl的氨基酸119 至 316。将所得到的嵌合 PCR 片段克隆至 pECFP-Nl(Clonetech, Mountain View, CA)和慢病毒表达载体中的CaMKIIa启动子下。膜转运信号来源于Kir2.1通道。通过对编码序列和剪接位点进行测序来确认突变。对于AAV介导的基因递送，将视蛋白-EYFP融合物连同CaMKIIa启动子一起亚克隆到pAAV2_MCS载体的修饰型式中。通过以相反的方向在不相容1x位点对(1xP和lox2722)之间克隆视蛋白-EYFP序列盒以便产生在延长因子Ia(EF-1a)启动子控制下的双f 1xed倒置开放阅读框(DlO)来实现Cre-依赖性视蛋白表达。所有构建体可从戴瑟罗斯实验室(Deisseroth Lab) (www.0ptogenetics.0rg)获得。
[0113]在补充有10%胎牛血清、2mM谷氨酰胺(Biochrome,柏林,德国)、以及l%(w/w)青霉素(penicillin)/链霉素(str印tomycin)的杜尔贝科氏最低必需培养基中培养HEK293细胞。将细胞以0.175X106个细胞/毫升的浓度接种到盖玻片上，并且补充I μ M全反式维生素A醛。用Fugene6(罗氏(Roche)公司，曼海姆，德国)来进行瞬时转染，并且在20至28小时后做记录。通过常规的全细胞膜片钳来记录瞬时转染的HEK293细胞中的光电流。外部溶液包含[mM]:140NaCl、2CaCl2、2MgCl2、2KCl、10HEPES(pH7.2)。内部溶液包含[mM]:110NaCl、10EGTA、2MgCl2、lCaCl2、5KCl、10HEPES(使用 CsOH 或 HCl 将 pH 调至 7.2)。用 P-97 型拉针仪(micropipette puller)(萨特仪器公司(Sutter Instrument C0.),诺瓦托，加拿大)将膜片吸管从具有1.5ΜΩ至2ΜΩ电阻的分血器微管(Hecht-Assistant,桑德海姆，德国)中拉出。用EPC7(HEKA，Elektronik GmbH，兰布雷希特，德国)放大器进行HEK细胞的全细胞膜片钳。以20kHz对类似数据进行取样，用Digidatal440 (分子仪器公司(Molecular Devices),福斯特市，CA)进行数字化并且使用pClampl0.1软件(分子仪器公司，福斯特市，CA)来显示。为了记录波长相关性，将来自Polychrome V单元(TILLPhotonics公司，普拉内格，德国)的光导管安装在奥林巴斯1X70显微镜的表皮发光端口上。为了将光反射进入物镜中，使用分光镜(70%R/30%T)从而在盖玻片上在470nm下产生大约I X IO22个光子HT2iT1的最终光子密度。为了记录作用光谱，使用仅50%的光强度。用Tillvision软件(TILL Photonics,普拉内格,德国)与pClamp软件同步来对polychromeV单元进行控制。
[0114]结果
[0115]有趣的是，发现了嵌合体的最稳定的改进，在所述嵌合体中螺旋I和螺旋2置换为来自ChRl的同源物(图1C至图1D)。在培养HEK293细胞中测试了用于膜靶向的两种嵌合ChRl-VChRl通道和光电流大小。第一种嵌合ChRl-VChRl通道被接合在ChRl的Alal45之后的第二细胞内环中，并且第二种嵌合ChRl-VChRl通道被接合在ChRl的Trpl63之后的螺旋三内(图1C)。然而，这两种变异体在HEK293细胞中接近同等良好地表达(图1D)，在培养的神经元中第二变异体更稳定地表达(图1E)，并且与VChRl-EYFP相比显示大为增强的峰值光电流(888±128pA，n=ll个细胞;ρ〈0.0005)(图1B)。相对于ChR2，作用光谱峰保持稳定的红移(表1 ;图1F)，并且嵌合体的离子选择性类似于先前针对ChR2和VChRl所报道的离子选择性(图1G)。将Kir2.1转运序列添加至这种杂交体中倾向于进一步增加光电流(1104±123pA，n=12 个细胞；与 VChRl-EYFP 相比 ρ〈0.0005，与 C1V1-EYFP 相比 ρ=0.23 ；图1B ;表1至表2)。所得到的杂交ChRl/VChRl嵌合体完全不包含ChR2序列，明显来源于不能单独地良好表达的两种视蛋白基因，并且在本文被称为ClVl (图1A、图1H)。
[0116]实施例2 =ClVl的光电流动力学的优化
[0117]这种红移的视蛋白的快速去活特性28将是最大时间以及与由位于向着可见光谱蓝光端的波长活化的其它视蛋白光谱分离所需要的。然而，发现由CIVl-ts-EYFP显示的光电流展现出比ChR2慢>10倍的衰变，并且甚至比原始VChRl慢的衰变(图2A ;针对CIVl-ts-EYFP (n=4)和 VChRl-EYFP (n=5)，T去活分别为 156 ± 12ms 和 132 ± 12ms ;表 1)，潜在地排除了使用ClVl用于要求迅速放电速率的应用。为了校正ClVl的光电流动力学，使用已知的结构模型22’28(图1H)搜寻发色团区域，用于具有光循环动力学更快、钝化减小以及蓝光吸收减少的突变。接下来，基于螺旋2中富含谷氨酸的基序的研究将谷氨酸-122突变为苏氨酸，显示这种突变减小了钝化3。
[0118]材料和方法
[0119]通过定点诱变(安捷伦科技(Agilent Technologies),帕洛阿尔托,CA)在质粒中产生ClVl载体的所有点突变。膜转运信号来源于U.1通道。通过对编码序列和剪接位点进行测序来确认突变。
[0120]结果
[0121]ChETA同源性突变E162T28明显使光循环加速了几乎3倍(T_58±4.7ms，n=7个细胞；图2A，表1)。出人意料地，鉴于ChR2或其它微生物视蛋白中的类似突变引起红移28’29，在ClVl中这种突变使作用光谱在不希望的方向上移动，蓝移至530nm(图1F ;表1)。与ChR2去活46%相比，C1V1-E122T仅钝化26% (图2B，表1);另外，光谱进一步红移至546nm(图1F，表1)并且显示ClVl作用光谱有问题的蓝肩峰明显消失。最后，在双重突变体E122T/E162T中，电流的钝化甚至低于在E122T突变体中的钝化，并且与E162T相比光循环仍然更快(Ti活34±4.9ms,n=7个细胞；图2A，图2C，表1)，同时保留红移并且不存在作用光谱的蓝肩峰。此外，当E122突变体大幅减少光电流振幅(图2D)时，双重突变体恢复原始CIVl-ts所特有的极高电流。因此，在双重突变体、转运增强的ClVl嵌合体中保留个别突变体的多种出人意料和有用的特性。
[0122]表1:ChR2、VChRl以及ClVl变异体的光谱/动力学特性。
[0123]使用峰值活化波长下的2ms光脉冲，在HEK细胞中记录峰值活化波长。使用最大活化波长下的2ms光脉冲，在培养海马神经元中记录去活动力学(τ 和峰值光电流。为了鉴别出用于与ChR2组合活化的最优变异体，在HEK细胞中记录405nm和560nm下的响应百分比。使用300ms光脉冲来记录光电流的脱敏作用，从而对峰值光电流(Iiic)向稳定状态的衰变进行定量。
【权利要求】
1.一种动物细胞，其包含在细胞膜上表达的光活化蛋白，其中所述蛋白: 是来源于来自强壮团藻的VChRl和来自莱茵衣藻的ChRl的嵌合蛋白，其中所述蛋白包含至少第一跨膜螺旋和第二跨膜螺旋置换为ChRl的第一跨膜螺旋和第二跨膜螺旋的VChRl的氨基酸序列； 对光可响应；并且 当用光照射所述细胞时，能够介导所述细胞中的去极化电流。
2.如权利要求1所述的动物细胞，其中所述蛋白进一步在位于所述嵌合光响应性蛋白的第二跨膜螺旋与第三跨膜螺旋之间的细胞内环结构域中包含置换，其中所述细胞内环结构域的至少一部分置换为来自所述ChRl的相应部分。
3.如权利要求2所述的动物细胞，其中所述细胞内环结构域的所述部分置换为来自所述ChRl的延伸至所述ChRl的氨基酸残基A145的相应部分。
4.如权利要求2所述的动物细胞，其中所述蛋白进一步在所述嵌合光响应性蛋白的第三跨膜螺旋中包含置换，其中所述第三跨膜螺旋的至少一部分置换为ChRl的相应序列。
5.如权利要求4所述的动物细胞，其中所述细胞内环结构域的所述部分置换为来自所述ChRl的延伸至所述ChRl的氨基酸残基W163的相应部分。
6.如权利要求1所述的动物细胞，其中所述嵌合蛋白包含与SEQID NO:1中所示的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列。
7.如权利要求6所述的动物细胞，其进一步包含SEQID N0:1的氨基酸残基E122和/或E162上的突变。`
8.如权利要求7所述的动物细胞，其中氨基酸E122上的所述突变是突变为苏氨酸。
9.如权利要求7所述的动物细胞，其中氨基酸E162上的所述突变是突变为苏氨酸。
10.如权利要求1所述的动物细胞，其中所述嵌合蛋白包含SEQID NO:3的氨基酸序列。
11.如权利要求1所述的动物细胞，其中所述嵌合蛋白包含SEQID NO:1的氨基酸序列。
12.如权利要求1所述的动物细胞，其中所述嵌合蛋白包含SEQID NO:7的氨基酸序列。
13.如权利要求1至12中任一项所述的动物细胞，其中所述蛋白进一步包含C末端膜转运信号。
14.如权利要求13所述的动物细胞，其中所述C末端膜转运信号包含氨基酸序列KSRITSEGEYIPLDQIDINV。
15.如权利要求13或14所述的动物细胞，其中所述膜转运信号是通过连接子连接至所述蛋白的C末端上。
16.如权利要求1至15中任一项所述的动物细胞,其中所述蛋白进一步包含选自由以下组成的组的C末端荧光蛋白:EYFP、GFP、CFP、以及RFP。
17.如权利要求1至16中任一项所述的动物细胞,其中所述动物细胞选自由以下组成的组:神经元细胞、肌肉细胞、以及干细胞。
18.如权利要求1至17中任一项所述的动物细胞，其进一步包含在所述细胞膜上表达的第二光活化蛋白。
19.如权利要求18所述的动物细胞，其中所述第二光活化蛋白是当用光照射所述细胞时能够介导所述细胞中的超极化电流的蛋白。
20.如权利要求19所述的动物细胞，其中所述第二光活化蛋白选自由以下组成的组:NpHr、eNpHr2.0、eNpHr3.0、eNpHr3.1 以及 GtR3。
21.—种细胞群，其包含如权利要求1至20中任一项所述的细胞。
22.—种非人动物，其包含如权利要求1至20中任一项所述的细胞。
23.—种脑组织切片，其包含如权利要求1至20中任一项所述的细胞。
24.一种分离的多核苷酸，其包含编码在细胞膜上表达的光活化蛋白的核苷酸序列，其中所述蛋白是来源于来自强壮团藻的VChRl和来自莱茵衣藻的ChRl的嵌合蛋白，其中所述蛋白包含至少第一跨膜螺旋和第二跨膜螺旋置换为ChRl的第一跨膜螺旋和第二跨膜螺旋的VChRl的氨基酸序列；对光可响应；并且当用光照射所述细胞时，能够介导所述细胞中的去极化电流。
25.如权利要求24所述的分离的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含与编码SEQIDNO:1的氨基酸序列的核苷酸序列至少95%相同的序列。
26.如权利要求24所述的分离的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含编码SEQID NO:3的氨基酸序列的核苷酸序列。
27.如权利要求24所述的分离的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含编码SEQID NO:5的氨基酸序列的核苷酸序列。
28.如权利要求24所述的分离的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含编码SEQID NO:7的氨基酸序列的核苷酸序列。
29.—种表达载体,其包含如权利要求25至28所述的任何多核苷酸。
30.如权利要求29所述的表达载体，其中所述表达载体是病毒载体。
31.如权利要求30所述的表达载体，其中所述病毒载体选自由以下组成的组:AAV载体、逆转录病毒载体、腺病毒载体、HSV载体、以及慢病毒载体。
32.—种使用如权利要求1至20中任一项所述的细胞的方法，所述方法包括用光来活化光活化蛋白。
33.如权利要求32所述的使用细胞的方法，所述方法包括用红光来活化所述光活化蛋白。
34.如权利要求32所述的使用细胞的方法，所述方法包括用绿光来活化所述光活化蛋白。
35.一种选择性地使存在于相同微回路中的兴奋性或抑制性神经元去极化的方法，所述方法包括:选择性地使包含第一光活化蛋白的兴奋性神经元去极化，其中所述第一光活化蛋白当被曝露于具有第一波长的光时被去极化；或选择性地使包含第二光活化蛋白的抑制性神经元去极化，其中所述第二光活化蛋白当被曝露于具有第二波长的光时被去极化；其中所述第一光活化蛋白或所述第二光活化蛋白是来源于来自强壮团藻的VChRl和来自莱茵衣藻的ChRl的嵌合蛋白，其中所述蛋白包含至少第一跨膜螺旋和第二跨膜螺旋置换为ChRl的第一跨膜螺旋和第二跨膜螺旋的VChRl的氨基酸序列。
36.一种选择性地使存在于相同微回路中的兴奋性或抑制性神经元去极化的方法，所述方法包括:在兴奋性神经元中表达第一光活化蛋白；并且在抑制性神经元中表达第二光活化蛋白，其中所述第一光活化蛋白当被曝露于具有第一波长的光时被独立地去极化，并且其中所述第二光活化蛋白当被曝露于具有第二波长的光时被独立地去极化；其中所述第一光活化蛋白或所述第二光活化蛋白是来源于来自强壮团藻的VChRl和来自莱茵衣藻的ChRl的嵌合蛋白，其中所述蛋白包含至少第一跨膜螺旋和第二跨膜螺旋置换为ChRl的第一跨膜螺旋和第二跨膜螺旋的VChRl的氨基酸序列。
37.如权利要求35或36所述的方法，其中所述第一光活化蛋白包含与SEQID NO: 1、SEQ ID NO:3, SEQ ID N0:5或SEQ ID N0:7中所示的序列至少95%相同的氨基酸序列，并且其中所述第二光活化蛋白包含与SEQ ID NO:1USEQ ID NO: 12,SEQ ID NO: 13或SEQ IDNO: 14中所示的序列至少95%相同的氨基酸序列。
38.如权利要求37所述的方法，其中所述第一光活化蛋白由绿光活化，并且所述第二光活化蛋白由紫光活化。
39.如权利要求35至38中任一项所述的方法，其中所述抑制性和兴奋性神经元是在活的非人动物中。
40.如权利要求35至39中任一项所述的方法，其中所述抑制性和兴奋性神经元是在来自非人动物的活脑切片中。
41.如权利要求35至40中任一项所述的方法，其中所述抑制性和兴奋性神经元是来自前额叶皮质。
42.如权利要求35至41中任一项所述的方法，其中所述兴奋性神经元包含锥体神经元，并且所述抑制性神经元包含小白蛋白神经元。
43.一种用于鉴别选择性地抑制存在于相同微回路中的兴奋性或抑制性神经元的去极化的化合物的方法，所述方法包括: (a)用具有第一波长的光选择性地使包含第一光活化蛋白的兴奋性神经元去极化，或用具有第二波长的光选择性地使包含第二光活化蛋白的抑制性神经元去极化；其中所述第一光活化蛋白或所述第二光活化蛋白是来源于来自强壮团藻的VChRl和来自莱茵衣藻的ChRl的嵌合蛋白，其中所述蛋白包含至少第一跨膜螺旋和第二跨膜螺旋置换为ChRl的第一跨膜螺旋和第二跨膜螺旋的VChRl的氨基酸序列； (b)测量响应于选择性地使包含第一光活化蛋白的所述兴奋性神经元去极化的兴奋性突触后电位(EPSP)，或测量响应于选择性地使包含第二光活化蛋白的抑制性神经元去极化的抑制性突触后电流(IPSC)； (c)使所述兴 奋性神经元或所述抑制性神经元与化合物接触；以及 (d)测量所述兴奋性突触后电位(EPSP)或测量所述抑制性突触后电流(IPSC)以确定使所述兴奋性神经元或所述抑制性神经元与所述化合物接触是否选择性地抑制任一神经元的去极化。
44.如权利要求43所述的方法，其中所述第一光活化蛋白包含与SEQID NO: 1、SEQ IDNO:3,SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:7中所示的序列至少95%相同的氨基酸序列，并且其中所述第二光活化蛋白包含与 SEQ ID NO:1USEQ ID NO: 12,SEQ ID NO: 13 或 SEQ ID NO: 14 中所示的序列至少95%相同的氨基酸序列。
45.如权利要求44所述的方法，其中所述第一光活化蛋白由绿光活化，并且所述第二光活化蛋白由紫光活化。
46.如权利要求43至45中任一项所述的方法，其中所述抑制性和兴奋性神经元是在活的非人动物中。
47.如权利要求43至46中任一项所述的方法，其中所述抑制性和兴奋性神经元是在来自非人动物的活脑切片中。
48.如权利要求43至47中任一项所述的方法，其中所述抑制性和兴奋性神经元是来自前额叶皮质。
49.如权利要求43至48中任一项所述的方法，其中所述兴奋性神经元包含锥体神经元，并且所述抑制性神经元包含小白蛋白神经元。
50.如权利要求43至49中任一项所述的方法，其中所述化合物是组合化学文库中的成员。
51.如权利要求43至50中任一项所述的方法，其进一步包括在心脏组织上测定所述化合物以确定所述化合物是`否不利地影响心脏动作电位。
【文档编号】C12N15/00GK103492564SQ201180061697
【公开日】2014年1月1日 申请日期:2011年11月4日 优先权日:2010年11月5日
【发明者】K·戴瑟罗斯, O·伊扎尔, L·芬诺, P·黑格曼, M·普里格 申请人:斯坦福大学托管董事会