专利名称：活化蛋白c的方法
技术领域：
本发明提供一种新的活化蛋白C的方法。该方法提供一种简便有效的手段，使蛋白C从酶原形式转变成活化蛋白C。活化蛋白C的先有技术方法包括用在溶液中的高浓度凝血酶，或在一起的凝血酶和凝血调变蛋白(thrombomodulin)，或其他价格昂贵的用于活化作用的酶来处理蛋白C的无活性酶原形式。本发明提供一种用固定的凝定酶使蛋白C活化的方法，从而避免使用凝血调变蛋白，并产生易于从固定的凝血酶络合物中纯化的活化蛋白C分子。
蛋白C在调节血液凝固中所起的作用蛋白C是一种依赖于维生素K的血浆蛋白，在控制止血作用方面具有重大的生理作用。蛋白C作为一个无活性分子被合成，此处称之为“初生蛋白C”。初生蛋白C经复杂的加工，产生很多不同的无活性分子，如同下面所作出的更加充分的叙述。此处将蛋白C的无活性分泌形式称作为“酶原蛋白C”。在血液中，通过涉及凝血调变蛋白一凝血酶络合物的反应，发生蛋白C的活化作用。经活化的蛋白C及其辅助因子蛋白S一起，是一种具有重要生理学意义的抗凝剂。活化的蛋白C能防止血管内血栓症，并控制原有血块的扩大。活化形式蛋白C的作用机理以及无活性凝血酶转变成活性蛋白酶的活化机理在近些年内已被阐明(文献综述见J.E.Gardiner and J.H.Griffin，Progress in Hematology，Vol.ⅩⅢ，PP.265-278，ed.Elmer B.Brown，Grune andStratton，Inc，1983)。
蛋白C的活化作用涉及凝血酶，即凝血链锁反应最终的丝氨酸蛋白酶，以及称之为凝血调变蛋白的、与内皮细胞膜相联的糖蛋白。凝血调变蛋白与凝血酶形成一个牢固紧密的化学计量络合物。当凝血调变蛋白与凝血酶络合时，完全改变了凝血酶的功能性质。在正常情况下，凝血酶将纤维蛋白原凝成块，使血小极活化，并将凝血因子Ⅴ和Ⅷ转变成它们的活化形式Ⅴa和Ⅷa。最后，凝血酶使蛋白C活化，但是很慢而且效能不高。反之，与凝血调变蛋白络合的凝血酶并不使纤维蛋白原凝成块，不使血小板活化，或不将凝血因子Ⅴ和Ⅷ转变成它们的活化相应物Ⅴa和Ⅷa，但变为非常有效的蛋白活化剂。通过凝血调变蛋白-凝血酶，蛋白C的活化作用速率常数比单独用凝血酶时高1000倍以上。
为了解活化蛋白C如何下调血液凝固，下面对凝固酶系统进行简略的叙述。最好把凝固系统作为包括各酶原依次连续性活化成为各种活性的丝氨酸蛋白酶的链锁反应来考察。该链锁反应最终产生凝血酶，它经过有限的蛋白分解，将血浆纤维蛋白原转变成不溶性的凝胶纤维蛋白。在凝固链锁反应中，两件关键的事情是一、通过凝血因子Ⅸa使凝血因子Ⅹ子转变成Ⅹa;二、通过凝血因子Ⅹa，使凝血酶原转变成凝血酶。这两种反应在细胞表面发生，最显著地在血小板表面，同时两种反应均需辅助因子。主要的辅助因子(因子Ⅴ和Ⅷ)在系统中作为相应的无活性前体流通，但当开头几个凝血酶分子形成时，凝血酶便返回来通过有限的蛋白分解使辅助因子活化。被活化的辅助因子Ⅴa和Ⅷa加速了高凝血酶原转变成凝血酶，也加速了因子Ⅹ转变成因子Ⅹa，速率大约提高5个数量级。活化蛋白C优先作用于蛋白的降解和水解，并不可逆地破坏凝血因子Ⅴa和Ⅷa(无活性凝血因子Ⅴ和Ⅷ的活化形式)。反之，凝血因子Ⅴ和Ⅷ对活化的蛋白C来说是非常差的底物。
活化蛋白C的一个重要辅助因子是蛋白S，它是另一种依赖维生素K的血浆蛋白。蛋白S使活化蛋白C介导的因子Ⅴa和Ⅷa的水解增加25倍。
蛋白C作为治疗剂蛋白C被公认为一个有价值的治疗剂(见欧洲专利公开No.0215548和美国专利No.4，775，624，此处作为参考文献)。经活化的蛋白C是一种常用的抗凝剂(如肝素及口服羟基香豆精抗凝剂)具有更大治疗指数的新抗血栓剂，在凝血酶再生之前，酶原蛋白C和活化蛋白C者均无效，因为将凝血因子Ⅴ和Ⅷ转变成Ⅴa和Ⅷa需要凝血酶;这两种辅助因子的活化形式对活化蛋白C来说是较好的底物。活化酶原蛋白C时也需要凝血酶，因为没有凝血调变蛋-凝血酶络合物，蛋白C酶原是不能被转变成其活性相应物的。
活化蛋白C是一种按照要求的抗凝剂，因为活化蛋白C是使辅助因子Ⅴa和Ⅷa失活而起作用的。因为因子Ⅴ及Ⅷ转变成它们的活化的相应物Ⅴa和Ⅷa时需要凝血酶，蛋白C仅仅在凝血酶再生之后才起到抗凝剂作用。与活化蛋白C相反，常用的抗凝剂只需给予病人，在整个循环中维持恒定的抗凝状态，因此，大大增加了并发出血症的危险，这种危险性超过了蛋白C或活化蛋白C所引起的。所以，活化蛋白C是一种按照要求的、在临床上广泛作为肝素和羟基香豆精的代用品使用的抗凝剂。
在某些疾病状态中(例如遗传性的蛋白C缺乏)，蛋白C酶原具有重大治疗重要性。在先天性纯合子(homozygous)蛋白C缺乏情况下，患者个人早在童年时代就因暴发性紫癜而死亡，这是一种弥散性血管内凝血异常常见的致死形式。在杂合子(heterozygous)蛋白C缺乏情况下，患者个人忍受厉害的周期性的血栓塞发作。临床上充分证实设计用来治疗血友病B或凝血因子Ⅸ缺乏的血浆蛋白浓缩物(含蛋白C作为杂质)，对预防和治疗杂合蛋白C缺乏情况下的血管内凝块有效。在血栓状态下(如弥散性血管内凝固)以及在易发生血栓的疾病状态下(如严重创作，大外科手术和癌症)，也已被注意到蛋白C的浓度出现反常的偏低。
虽然蛋白C酶原形式对治疗目的是十分有用的，将蛋白C的活化形式给予病人，某些疾病状态能得到更有效的治疗。在下列疾病状态下，例如，心肌梗塞或深度静脉血栓形式(特别发生在下肢外科手术之后)，病人有正常深度水平的蛋白C酶原，尚无足够的活化蛋白C来制止血栓生成或支持除去原有的血栓。之所以不能使活化蛋白C的生成达到足够的量是由于凝血调变蛋白不充分所造成。但是，不管什么原因，对这些疾病状态的有效治疗所需要的是活化蛋白C，并不是酶原。本发明提供了一种使蛋白C活化的新方法，访法采用的是固相的凝血酶，而不是凝血酶/凝血调变蛋白的络合物。
人蛋白C的合成和活化作用初生蛋白C能用下列图解描绘
pre-pro-初生人蛋白C的氨基酸残基1-42为人蛋白C的信号肽及前肽，对指导蛋白C的分泌和r-羧基化十分重要。
LC -初生蛋白C的氨基酸残基43-197，一旦经转译后修饰，就组成双链酶原(自单链酶原除去KR二肽而成，如下所讨论)和蛋白C的活化形式的轻链(LC)。
KR -初生人蛋白C的氨基酸残基198-199;这些残基确信要被除去(基于与牛蛋白C的同源性)，可能通过包括最初的裂解(在残基197-198之间或在199-200之间)随后通过羟肽酶或氨酞酶作用，形成双链蛋白C的两步程序。
AP -初生蛋白C的氨基酸残基200-211组成起活化作用的肽，它从蛋白C的酶原形试中除，去得到活化蛋白C。
AHC -初生蛋白C的氨基酸残基212-461，一旦经转译后修饰，组成活化蛋白C的活化重链(AHC)。
ⅡC -蛋白C酶原的二链形式的重链，一旦经转译后修饰，组成氨基酸残基200-461，即AP和AHC。
人蛋白C酶原是在肝中合成的丝氨酸蛋白酶前体，并存在于血液中，为表达完整的生物学活性，蛋白C需要进行转译后的修饰，此修饰过程需要维生素K。该成熟的、双链的、由二硫键连接的蛋白C酶原，由一个单链前体通过限制性蛋白水解作用而产生。这种限制性蛋白水解作用被确信包括pre-pro肽的裂解和除去，该肽由在细胞内加工过程中生成的氨基酸残基1-42所组成;从细胞中分泌初生多肽;以及除去氨基酸残基198和199以形成在酶原中观察到的双链。酶原活化成活性丝氨酸蛋白酶的过程涉及ARG-LEU肽键(残基211和212)的蛋白水解。后者裂解释放出构成双链酶原分子较大链(重链)氨基末端的十二肽(残基200-211)。蛋白C受到明显地糖基化作用，成熟的酶含约23%碳水合物。蛋白C也含有若干不平常的氨基酸，包括r-羧基谷氨酸和β羟基天冬氨酸(赤-L-β羟基天冬氨酸)。r-羧基谷氨酸(gla)由谷氨酸残基经r-谷氨酰基羧化反应而成，该反应借助于需要维生素K作为辅助因子的肝微粒体羧化酶。
人蛋白C的活化作用也能用图解表示并说明如下。本领域专业人员应该明白，图解中所示的步骤顺序不一定反映体内的途径。
本发明提供一种采用固相凝血酶使蛋白C酶原活化的新方法。
为了本发明的目的，在此处所公开的说明书和权利要求书中，下列术语定义如下。
本发明所描述的蛋白质或肽链中的氨基酸残基的缩写如下三字母缩写 氨基酸残基 一字母缩写PHE 苯丙氨酸 FLEU 亮氨酸 LILE 异亮氨酸 IMET 蛋氨酸 MVAL 缬氨酸 VSER 丝氨酸 SPRO 脯氨酸 PTHR 苏氨酸 TALA 丙氨酸 ATYR 酪氨酸 YHIS 组氨酸 HGLN 谷氨酰胺 QASN 天冬氨酰胺 NLYS 赖氨酸 KASP 天冬氨酸 DGLU 谷氨酸 ECYS 半胱氨酸 CTRP 色胺酸 WTRG 精氨酸 R
GLY 甘氨酸 GEnh或增强子-BK病毒增强子。
r-羧基化反应-在谷氨酸r碳原子上加上一个羧基的反应。
r-羧化蛋白-蛋白内某些谷氨酸残基已经过羧基化的蛋白。
初生蛋白-mRNA转录本刚转译过来的未经任何转译后修饰的多肽。然后诸如谷氨酸残基的r-羧基化以及天冬氨酸残基羟基化这样的转译后修饰可以在蛋白从mRNA转录本全部被转译之前发生。
蛋白C的活性-人蛋白C的任何性质蛋白水解，酰胺解，酯解以及生物学(抗凝固或纤维蛋白溶解)等活性。测定蛋白抗凝活性的方法在本领域是众所周知的，参见文献(Grinnell等，1987，Biotechnology51189)。
酶原-蛋白水解酶的无酶催化活性的前体。此处所用蛋白C酶原指的是蛋白C的分泌的、无活性形式，无论是单链还是双链。
本发明提供使蛋白C活化的新方法，该方法包括下列步骤a)使无活性蛋白C与固相的凝血酶相接触，以及b)从固相凝血酶和其他的污染物中纯化活化的蛋白C。
虽然几种产生无活性人蛋白C酶原和无活性的初生人蛋白C的方法已经被叙述(见欧洲专利公开215548和美国专利4，775，624，以此处将其方法指导通过参考文献编入)，但公开材料并没有提供采用固相凝血酶使蛋白C活化的方法。取而代之，到目前为止所产生的蛋白C酶原已被下列物质处理过，例如溶解状态的α-凝血酶、胰蛋白酶、Russell氏蝰蛇毒因子X的活化剂，或凝血酶和血栓缓和素的混合物，以便得到活化蛋白C。所有这些活化方法使得重组生产活化的人蛋白C效率低，有污染的危险以及成本较高。某些活化反应一定要严密的加以监控，以使蛋白分解在起活化作用的肽被裂解之后停止-，否则的话，所产生的活化蛋白C被裂解并变的无活性。此外，维持在溶解状态的α-凝血酶有自身消化的趋势，所以需要向反应混合物中连续添加α-凝血酶。本发明采用固相凝血酶使蛋白C活化的方法消除了凝血酶自身消化的问题，以及对凝血调变蛋白的需要。本发明的方法不仅能用于活化由DNA重组技术形成的人蛋白C酶原，而且能用于天然存在的，从血浆中分离的人蛋白C的活化。Kisiel，W.(1979，J.Clin.Invest.64761-769)公开了这样一种从血浆中分离蛋白C的方法，本文将该方法编入参考文献。此外，本发明的方法也可用于活化蛋白C的衍生物，如Bang等人的叙述(见欧洲专利公开No.EP-0-323 149)。包括新的糖基化作用型式的人蛋白C重组分子也可采用本发明的新的固相凝血酶方法进行活化。
通常，本发明的方法可通过将凝血酶固定于任何支持树脂上得以实施。所用凝血酶的类型取决于若干因素，特别是费用和安全性。尽管人、马、大鼠或小鼠的凝血酶在市场上都能买到，但牛凝血酶通常是优选的，因为它不大可能被人体内病毒污染。有几类凝血酶，例如α-凝血酶，β-凝血酶和δ-凝血酶也能买到，并在本发明中是有用的，但α凝血酶是优选的。
许多不同类型的固体支持物都可用来固定凝血酶(用于活化蛋白C)，但琼脂糖凝胶(Sepharose)和琼脂糖(agarose)是优选的。一种带有N-羟基琥柏酰亚胺(NHS)酯类作为交联试剂的琼脂糖亲和性支持物是最优选的。凝血酶含有赖氨酸残基，其ε-氨基在非氨基缓冲液如HEPES中被连接到柱子上，调节HEPES缓冲液的PH到大约7.6，以便维持凝血酶的稳定性，而且使赖氨酸变得足以去质子化。在酯内的碳原子通过去质子化的赖氨酸进行亲核性攻击，从而让凝血酶结构上的赖氨酸残基取代酯基。该反应是很温和的，凝血酶能保持稳定。
一旦凝血酶结合到支持物上，固相的凝血酶就能用适宜的缓冲液平衡，而且为了活化作用，可加入蛋白C。在批量反应中，固相的凝血酶能和蛋白C相接触，或者让蛋白C通过含有固相凝血酶的柱子。蛋白C可通过一长柱子处理或用一短柱子循环处理，并在反应过程中任何给定的点上检定其活化程度。固相凝血酶的方法比先前的可溶性凝血酶方法更有效，因为固相凝血酶不象溶解状态的凝血酶那么容易降解。固相凝血酶的柱子是可以重复利用的，通常多达15次。固相凝血酶的方法比先前的固相凝血酶/凝血调变蛋白方法更有效，因为在凝血酶/凝血调变蛋白方法中所用的凝血调变蛋白不是以共介键结合到固相支持物上，可能会污染活化蛋白C的最后洗脱液。当单独使用经固相的凝血酶时，这种交叉污染是不明显的(＜1ppm)。
活化蛋白C的活性能通过各种各样的方法加以监控，尽管最普通的是“Xa因子-步凝集测试法”或“活化部分促凝血酶原激酶的时间(APTT)的凝集测试法”。两种测试在文献中都有叙述(Grinnell等，1987.Biotechnology 51189-1192)，该方法全部被列为本发明参考文献。Bang还公开了一些活化方法(美国专利No.4，775，624，审定日期1988年10月4日)，该方法全部被列为本发明参考文献。
本发明方法的第一步是将大约50mg牛α-凝血酶溶解于约25ml50mMHEPES缓冲液(pH7.6)中。然后用大约500ml非常冷的高纯度水洗涤25ml瓶装的Affi-GelTM-10微球，在从微球内排出过量水份之后，将湿的微球加到凝血凝酶溶液中，并在4℃下于旋转混合器中缓和地混合1-2小时。将100ul1M甘氨酸(pH8.0)加到溶液中，于4℃下继续旋转1-16小时，以封闭Affi-GelTM10树脂上未反应的位点。
凝血酶微球(T-微球)被分装到二支消过毒的50ml聚苯乙烯管内，并在半速或更慢速度下离心30-60秒钟。将管子放在冰上，让T-微球沉降1-2分钟，然后移出上清液并弃去。每个管里留下大约1.25mlT-微球。
向每个试管中加入约35ml由20mM Tris-HCl(pH.4)和200mM NaCl组成的洗涤缓冲液，然后将其倒置，直到所有T-微球重新悬浮。如前面那样将管子离心，然后放在冰上使之完全沉淀，取出上清液并弃去。将该洗涤步骤重复10-15次，然后检验最后的上清液中酰胺分解活性，以检出未结合的或被冲洗掉的凝血酶。如果在405nm下光密度变化少于0.002/min，T-微球即可备用。如果光密度太高，应重复洗涤步骤，直至达到适当的水平。
一旦上清液显示出适当的纯度，就可制备25%的T-微球悬浮液，即每毫升经过离心的T-微球加入3ml由20mM Tris-HCl(pH7.4)，和200mM NaCl洗涤缓冲液，如果在洗涤缓冲液中于4℃保持消毒状态，T-微球能贮存较长一段的时间。
通过在1.5ml聚丙烯微量离心管中37℃下进行试验性活化2-3小时而测试T-微球悬浮液活化蛋白C的能力。通过Crinnell等人公开的S-2238酰胺分解步骤和抗凝活性步骤，均能测定蛋白C的功能活性，见文献(1987，Biotechnology 51189-1192)。旋转含有蛋白C、固相凝血酶的微量离心管，每次30-60分钟，直到蛋白C的功能活性达到稳定状态。
本发明通过以下范例作进一步阐明。
实例1牛α-凝血酶的固相化将一瓶大约5mg无热原质的高纯度牛凝血酶(得自Miles Laboratories，Inc.，1121 Myrtle，Box 2000，Elkhart，Indiana 46515或ICN Pharmaceuticals，Inc.，26201 Miles Road，Cleveland，Ohio，44128)溶解于25ml 50mM HEPES缓冲液(pH7.6)中。将25ml商标为Affi-GelTM10的瓶装微球(Bio-Rad Laboratories，P.O.Box 708，220Maple Avenue，Rockville Centre，New York 11571)置于150ml多孔玻璃漏斗中，用大约300-500ml冷的高纯度的水洗涤，在每次添加水后，将微球重新拌成浆状并且勿让其干燥。微球很脆，并且易被碎裂。
将凝血酶溶液转移到一支消毒的50ml聚苯乙烯离心管中，加入洗涤过的微球，加盖塞住，内容物于40℃在旋转混合器中旋转1-2小时，让其缓和地混匀。其次，加入100μl 1M甘氨酸溶液(pH8.0)，封闭Affi-GelTM-10树脂上未反应位点。重新将管子塞紧并于4℃旋转1-16小时。凝血酶微球(T-微球)被分成2份，各置于50ml聚苯乙烯离心管中。放在冰浴内进一步冷却。后置于阶式顶型临床离心机中(转速约1000-2000rpm)，在半速或低于半速下离心60秒钟。小心地将管子移入冰浴并让其在1-2分钟之后出现沉降。用消毒吸管将上清液从每个管子中移出。每管约有12.5ml T-微球留下来。
向每个管子内加入约35ml T-微球洗涤缓冲液[20mM Tris-HCl(pH7.4)，200mM NaCl]，塞紧，用手轻轻地倒转过来，直到T-微球重新悬浮。在用消毒吸管吸出上清液之前，将管子在半速下离心60秒钟，然后放入冰浴1-2分钟。该洗涤步骤重复约10-15次，以除去污染的内毒素，甘氨酸和凝血酶。
然后用S-2238酰胺分解测定法检验上清液。将25mg瓶装HelenaLaboratories出品的S-2238底物溶解在18ml 20mM Tris-HCl，150mMNaCl(pH7.4)中，该缓冲液经0.2mm Acrodisc过滤器消毒过滤。其次，配制“稀释缓冲液”，由20mM Tris-HCl，(pH7.4)，150mM NaCl3mM CaCl2和1mg/ml牛血清白蛋白(BSA)所组成。为检验沥滤凝血酶的T-微球，可按以下原始记录的操作步骤进行。在一次性使用的微量比色杯中，100μl T-微球上清液与600μl“稀释缓冲液”和300μl S-2238底物的溶液相混合。比色杯用封口薄膜封住，然后倒转混匀。在波长405nm下将光密度读数4分钟。如果每分钟光密度值差(△O.D./min)为0.002或更小，则表明T-微球是足够干净的。如果其差大于0.002，则按原始记录要求，一定要重复洗涤步骤，直到T-微球不含沥滤了的凝血酶。
一旦T-微球显得干净，就在离心管边上刻度，以计量T-微球的相对体积。然后加入三倍体积的T-微球洗涤缓冲液，以达到稀释至25%(1→4)的目的。如果在消毒条件下保存，T-微球在此溶液中，于4℃下可长时间贮存。
为测验T-微球对活化蛋白C的能力，将400μl重新悬浮的T-微球转移到1.5ml聚丙烯微量离心管中，在半速下离心60秒钟，然后小心地除去上清液。将500μl高质量的非活化的重组人蛋白C(1mg/ml)的样品和10μl 0.2mM EDTA(pH7.4，用来除去钙)一起加到T-微球中。将管子加盖，缓和地倒转数次，然后如前那样进行离心。从上清液移出100μl样品，并和900μl T-微球“稀释缓冲液”混合，在波长280nm下进行光密度读数，以确保样品在重组人蛋白C(rHPC)中为1mg/ml。
反应管重新加盖，在37℃下旋转2-4小时。在30分钟、1小时、2小时及4小时的时间点内，将管子离心并移出10μl样品，稀释该10μl样品，使得终浓度为10μg/ml rHPC。将该稀释的样品50μl加到650μl“活性测定用稀释缓冲液”和300μl S-2238底物中，然后缓和地倒转将其混匀。在波长405nm下进行光密度读数4分钟。如果光密度的变化大于0.1/分钟，表明rHPC是完全有活性的。
实例2γHPC的活化重组HPC的制备大体上按照以下方法指导进行，Bang等，美国专利4，775，624和Grlnnell等，1987，Biotechnology 51189-1194。100ml FFQ(Pharmacla Fast Flow Q)树脂按制造商所推荐的方法严格地制备而得。然后将FFQ树脂用含有20mM Tris，0.15M NaCl，2mM EDTA和2mM苯甲脒的缓冲液(pH7.4)平衡。将EDTA和苯甲脒加到细胞培养上清液中，终浓度分别为4mM和5mM。在线性流速为20cm·h时，将培养基通过FFQ柱(3×16cm)。将柱子首先用300ml(3个柱子体积)含20mM Tris，0.15M NaCl，2mM EDTA，2mM苯甲脒的溶液(pH7.4)洗涤，然后用300ml(3个柱子体积)含有20mM Tris，0.15M NaCl，10mM CaCl和2mM苯甲脒的溶液(pH7.4)洗涤。将此第二次洗脱液用经典的阴离子交换步骤浓缩。
将纯化的含γHPC的溶液通过消毒的0.2μm Acrodisc过滤器过滤到聚丙烯容器内。γHPC的浓度在1-10mg/ml范围内(在20mM Tris，pH7，4，0.15M NaCl中，不存在CaCl2的情下，即“活化前缓冲液”)。将实例1产生的T-微球用T-微球洗涤缓冲液洗涤，然后离心，弃去上清液。大约5-7ml T-微球已足够活化多达45ml纯净的γHPC。
将在“活化前缓冲液”中的γHPC加到T-微球中去，然后加入EDTA到终浓度为0.5mM。将管加盖，在37℃缓和地旋转。定时移出等分试样，按实例1的方法指导测定酰胺分解活性。经用此法处理过的蛋白C被发现在2小时内具有100%的活性。
本领域专业人员还会认识到许多与本发明所述的特定物质和方法等价的物质和方法(采用常规的实验方法)。这样的物质和方法也认为在本发明范围之内，并包括在下列权利要求书中。
权利要求
1.一种使蛋白C活化的方法，该方法包括下列步骤a)使非活化蛋白C与固相的凝血酶接触以及b)从固相的凝血酶和其他污染物中纯化活化蛋白C。
2.权利要求1的方法，其中凝血酶选自由牛凝血酶，与凝血酶，人凝血酶，小鼠凝血酶和大鼠凝血酶组成的一组凝血酶。
3.权利要求1的方法，其中凝血酶选自由α-凝血酶，β-凝血酶和γ-凝血酶组成的一组凝血酶。
4.权利要求1的方法，其中凝血酶被固定在琼脂糖上。
5.权利要求1的方法，其中凝血酶被固定在琼脂糖凝胶上。
6.权利要求1的方法，其中蛋白C选自由牛蛋白C，人蛋白C和人蛋白C衍生物组成的一组蛋白C。
7.权利要求6的方法，其中蛋白C是人蛋白C。
8.权利要求2的方法，其中凝血酶是牛α-凝血酶，
9.权利要求8的方法，其中牛α-凝血酶被固定在琼脂糖上。
10.权利要求9的方法，其中蛋白C是人蛋白C。
全文摘要
无论是衍生自血浆还是产生自DNA重组工程的蛋白C分子的活化，都能通过蛋白C分子与固相凝血酶相接触而达到目的。本发明方法比采用凝血酶/凝血调变蛋白络合物更为有效，并消除了凝血酶自身降解的问题。
文档编号C12N9/64GK1050043SQ9010746
公开日1991年3月20日 申请日期1990年9月5日 优先权日1989年9月5日
发明者殷秀慈 申请人:伊莱利利公司