专利名称：组装活化蛋白(aap)及其用于制备基本上由vp3组成的细小病毒颗粒的应用的制作方法
组装活化蛋白(AAP)及其用于制备基本上由VP3组成的细
小病毒颗粒的应用本发明涉及编码新的细小病毒蛋白“组装活化蛋白”(AAP)的核酸，编码的多肽，生产多肽的方法，AAP特异性抗体，核酸在多肽制备中的应用，核酸或多肽在制备细小病毒颗粒中的应用，以及通过提供除细小病毒结构蛋白VP3的编码序列之外的序列片段Z来生产基本上由VP3组成的细小病毒颗粒的方法，所述序列片段Z为细胞中编码AAP和表达VP3的核酸，并且片段Z处在Np-非依赖性启动子的控制下。此外，本发明涉及基本上由VP3组成和/或通过上述方法可获得的细小病毒颗粒，以及包括(i)异源启动子和(ii)VP3编码序列和/或片段Z的表达盒。本发明进一步涉及包括细小病毒颗粒或表达盒的药物，尤其是疫苗，以及它们的应用。基于突变的细小病毒结构蛋白的病毒样颗粒(VLP)已被证明是合适的疫苗候选物(W0 2008/145401，在此引入参考)。基于这种突变的细小病毒结构蛋白，生成用于呈递耐受原或小抗原或甚至是单独的表位的VLP。当B细胞耐受性被破坏从而对患者产生疗效时，这些VLP被证明是特别有益的。对于基于VLP的疫苗的临床开发，生成理想的基于单一活性化合物/蛋白且尽可能纯的产物一般是必须的。就VLP而言，这时的问题一般在于病毒通常由超过一种的蛋白组成，并且能够包装特定的病毒DNA或来自宿主细胞的非特定DNA。因此，期望获得包含尽可能少的不同蛋白且优选没有核酸的“纯”VLP。在文献中，为有效生产这样的颗粒，已经进行了几次尝试。Rabinowitz等(如Rabinowitz等，1999)已经通过接头蛋白插入诱变改变了 AAV2 的结构基因，以明确病毒体组装和传染性的关键组分。他们生成了突变体H2634，突变体 H2634包含r印和cap 0RF,以及在沈34位点的HaeIII限制性位点处的插入。重要的是， 由于r印ORF的存在，这种插入突变体表达各自的R印蛋白。它组装完整的病毒体，并且衣壳似乎仅由VP3组成。作者认为，在细胞裂解物或纯化的病毒体中检测不到VPl和VP2的表达是检测限的问题。Warrington等Q004)和WO 2004/027019还解决了在衣壳形成中单独的衣壳蛋白的特定作用的问题，即限定全长肽可以被插入至AAV衣壳ORF而不破坏关键结构域的位置。生成包含r印和cap ORF的构建体，其中VP1、VP2和/或VP3的起始密码子突变，这样在R印存在下仅表达单一或两个衣壳蛋白，Warrington等证明只要VP3蛋白存在就会形成包含基因组的颗粒。因此，表达VPl和/或VP2作为单一衣壳蛋白或一起作为衣壳蛋白的突变体不形成颗粒。于是他们从该结果中得出的结论是，VPl对于病毒感染是必须的，但是对于衣壳组装和颗粒形成来说不重要，而VP2对于病毒传染性来说似乎是不必要的。此外， 他们观察到由具有突变的VPl和VP2起始密码子的构建体的单独VP3的表达足以形成VLP。同样地，Grieger等Q007)利用AAV2辅助质粒pXR2 (包含r印和cap基因，Li等 (2008))通过VPl和VP2起始密码子的诱变生成仅有VP3的颗粒。在R印存在下，只要它们缺少VPl亚单位，仅有VP3的构建体以及仅有VP2/VP3的构建体的表达就会形成非感染性病毒颗粒。
根据他们的结果，即一旦在R印存在下，由表达VP3的突变体形成作为仅有的衣壳蛋白的包含基因组的AAV-样颗粒，这些颗粒似乎就可以容易地获得。以上描述的全部表达构建体表达的R印蛋白不应当被考虑用于组装优选由一种蛋白组成且没有DNA的VLP。R印不仅呈递附着于VLP的另外的蛋白，还具有将病毒基因组和非特异性DNA包装到预制的衣壳的作用(King等，2001)。应避免DNA的包装，因为VLP 很可能进入患者的细胞，从而转染这种有害DNA，可能导致各种不利的效果。为确保仅有VP3 被表达，Hoque 等(1999a，1999b)和 Handa 等(JP2001169777)在异源启动子控制下，在任何一种R印cds不存在下，生成仅包括VP3编码序列(cds)的表达构建体。令人惊奇的是，他们由这些表达构建体中不能产生病毒颗粒。通过分析在VP3起始密码子的不同5’位点开始表达的VP2的一系列缺失突变体，他们鉴定了对于VP3的核转移来说必须的区域，并且发现衣壳蛋白的核定位效率与VLP的形成效率密切相关。他们观察到只要位于VP2的cds中四和34位氨基酸之间的区域被呈递，或换句话说只要VP3的 5’延伸的区域被呈递，就会形成病毒颗粒。该区域的氨基酸基序为PARKRL，由此他们得出的结论是，它的功能是作为核定位信号(NLS)，其对于VP3易位进入核仁是重要的。可选择地，如果猿猴病毒40 (SV40)大T抗原的NLS被融合至VP3蛋白的N-末端 (NLSsv4(l-VP3)，也可以获得衣壳。这种融合蛋白可以形成VLP，表明位于蛋白N-末端侧的 VP2-特异性区域不是结构所需的。由于该发现，作者推论VP3具有足够的VLP形成信息，并且VP2仅对于衣壳蛋白的核转移是必须的，其又是VLP形成的先决条件。由于他们使用的突变体构建的方法，全部构建体直接由位于编码序列5’末端的 ATG起始密码子开始。因为“位置效应”(KoZak，20(^) —般将引起转录体的第一(最上游) ATG起始密码子启动翻译，要被表达的主要蛋白和形成的颗粒将是N-末端延伸的VP3。仅小部分翻译将从VP3另外的下游ATG起始密码子开始。与Hoque等(如上文)和Handa等(如上文)相一致，使用他们描述的构建体， 我们利用AAV2滴定ELISA (根据制造商Imogen (Heidelberg，Germany)的说明书定量，图 15B)，既不在哺乳动物细胞也不昆虫细胞中，在组成型启动子控制下，不能由仅包括VP3的 cds的表达构建体以定量的量(意味着存在< 101(1，尤其是< IO8衣壳/ml)检测到仅由VP3 组成的VLP。在组成型启动子控制下，我们不能由仅包括各自的cds、以ATG密码子开始的表达构建体检测到仅表达VPl或VP2的AAV-样颗粒。在Rep表达存在或不存在时，以及在腺病毒辅助基因的共递送存在或不存在时，单独的或以不同比率的进行不同组合的全部构建体的衣壳生产效率处于AAV2滴定ELISA的较低检测限(< IO8衣壳/ml，见上文)。我们证实，VLP可以由包括一些VP3起始密码子5'序列和VP3编码序列的表达构建体生成，但是与Hoque等的结果相反，我们不能利用NLSsv4(1-VP3融合构建体以可检测的量定量衣壳组装(》IO8衣壳/ml，参见实施例8)。因此，Hoque等的方法不适用于生产适合于商业化接种疫苗目的的大量纯VLP。综合来看，为了获得商业上可行的工艺或产品，现有技术在Rep存在时利用表达系统不可避免地导致R印和DNA的包装，或者在R印不存在时VP3VLP的产量太低。因此，本发明的目的是提供避免了以上的一个或多个缺点，用作基于VLP的疫苗的颗粒，以及生产所述颗粒的方法。特别地，期望基本上仅由一种类型的病毒蛋白组成的 VLP不包含DNA或仅包含非常少量的DNA，和/或它们可以以经济的方式，如以高产量生产。
该问题是通过提供基本上由VP3组成、基本上没有VPl、VP2和R印蛋白的细小病毒颗粒来解决的。它们可以这样来产生，即在rep-非依赖性启动子控制下在细胞中由细小病毒结构蛋白VP3(VP3cds)的VP3编码序列(cds)表达VP3。此外，在该方法中，编码新鉴定的多肽的DNA序列片段(片段Z)(部分地)被表达，该多肽被命名为“组装活化蛋白”(AAP)， 该DNA序列片段能够得到高产量，例如每个细胞将形成大约IO5左右，优选大约106，并且更优选大约IO7个病毒颗粒。就一般的细小病毒衣壳组装而言，这种新的蛋白的鉴定是全新的概念，特别是对于VP3衣壳，因为作为假定，在VP2蛋白，如假定的“PARKRL”基序或者用于VP3的异源核定位序列内没有序列基序是必需的(Hoque等，1999a, 1999b)。与本领域的描述相反，这些VLP不包含异源NLS或VP2蛋白。一旦在VP3中的一个或几个优选位点插入表位，就成功地组装成呈递表位的颗粒用于疫苗开发。采用这种方法，每毫升粗裂解物中形成1011，优选大约1012，并且更优选大约IO13个病毒颗粒，因此产量足够用于商业上可行的产品。令人惊奇地并且符合其编码多肽的功能，可以以顺式或者反式提供序列片段Z，以组装基本上由VP3组成的衣壳。进一步地，片段Z和VP3可以源自细小病毒科的相同或不同的属，各自相互反式互补用于VP3颗粒组装。以下定义解释了在涉及本发明的产品、方法和应用的上下文中如何解释特定的术语。“AA”用作氨基酸的缩写，“nt”用作核苷酸的缩写。根据本发明，“细小病毒”或“细小病毒的”涉及细小病毒科成员，其中所述野生型表达VP1、VP2和VP3作为衣壳蛋白。细小病毒科包含以下2个亚科分出的几个属细小病毒亚禾斗(Parvovirinae)(细小病毒属(Parvovrius)、红病毒属(Erythrovirus)、依赖病毒属(Dependovrius)、阿留申水貂病毒属(Amdovirus)和博卡病毒属(Bocavirus)和浓核病毒亚禾斗(Densovirinae)(浓核病毒属(Densovirus)、艾特拉病毒属(Iteravirrus) > 环星黑烟浓核病毒属(Pefudensovirus)和康特拉病毒属(Contravirus)(领域病毒学， 第四版，2001 年，第 2 卷，第 69 和 70 章，Lippincott Williams ffilkins, Philadelphia ； http // virus. Stanford, edu/parvo/parvovrius. html ；http: // www, ncbi. nlm. nih. gov/ ICTYdb/Ictv/fs parvo. htm#SubFamilyl)。野生型衣壳由三种结构蛋白 VP1、VP2 和 VP3 组装而成，它们以1 1 8的比率形成AAV衣壳的60个亚单位(Kronenberg等，2001)。因此，术语“VP3”代表病毒蛋白3。天然存在的细小病毒颗粒由包围单链DNA基因组的二十面体衣壳组成。优选的细小病毒是依赖病毒属，包括AAV。在本发明的上下文中，术语“血清型”代表以它们的特征抗原集来区分的一组密切相关病毒中的一类病毒。因此，血清型通过血清学分型(检测在病毒表面上可识别的抗原) 来表征。因此，AAV 还可以选自源于 AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、 AAV10、AAVll至AAV12和AAV13，特别是AAV2的血清型。细小病毒颗粒“基本上由VP3组成”或“基本上仅由VP3组成”意味着衣壳被组装成至少98 %，优选至少99 %，更优选至少99. 6 %，并且基本上至少99. 8 %的VP3。这意味着仅1/50，优1/100，更优1/250，并且基本上仅1/500或更少的蛋白组装衣壳为VP3的N-末端延伸的形式或完全不同的蛋白。在优选的实施方案中，衣壳被组装成至少98%，优选至少99%，更优选至少99. 6%，并且基本上至少99. 8%的VP3，意味着仅1/50，优1/100，更优1/250和基本上仅1/500或更少的蛋白组装衣壳为VP3的N-末端延伸的形式或不同的细小病毒蛋白。特别优选的是，细小病毒衣壳仅由一种蛋白组成，该蛋白为其野生型序列的VP3 或其突变形式。“编码序列”或“cds”是指直接确定其产物氨基酸(AA)序列的基因部分。因此， “VP3编码序列”或“VP3cds”限定了 cap基因的一部分，根据该部分基因密码子被翻译成 VP3的氨基酸(AA)序列，可以是野生型或如本发明进一步限定的突变的。VP3cds位于cap ORF的3’末端，并且由编码蛋氨酸的ATG核苷酸三联体开始。根据所选择的细小病毒个体，VP3cds被翻译成大约533个Aas。以AAV2为例，主要衣壳蛋白VP3的cds可以根据 Ruffing 等(1994)从 NCBI 登记号(http: // www, ncbi. nlm. nih. gov/) NC 001401(核苷酸 2809-4410)获得，AA序列来自相应的NCBI登记号YP_680428。根据本发明的方法，本发明的VP3cds编码能够形成颗粒的VP3蛋白。N-末端延伸的VP3蛋白包括VP2的一个或多个各自的Aas。因此，与其N-末端插入异源序列的VP3相比，VP2可以被看作是N-末端延伸的VP3，所述异源序列如下文进一步限定的标签(Tag)或表位。基因密码子限定了三核苷酸序列之间的排布，被称为“密码子”和Aas。核酸序列中的三联密码子通常确定一个AA。“阅读框”是DNA或RNA中连续的且不重叠的三核苷酸密码子组。在mRNA链中有三种可能的阅读框，而在双链DNA分子中有六种可能的阅读框，这事因为由双链进行转录是可能的。“开放阅读框”(ORF)是包含起始密码子、通常具有三核苷酸倍数长度的后续区域和由终止密码子终止的阅读框。ORF可以编码蛋白。一个或两个核苷酸的插入明显导致移动至不同的阅读框(移码突变)。通常，ATG用作起始密码子。然而，来自AAV的VP2的已知的非典型起始密码子有时也被使用。“突变”是生物体遗传物质的核苷酸序列的改变。这种突变可能导致编码的蛋白的改变，因而根据它们发生在哪儿以及它们是否改变编码蛋白的结构和/或功能，可能有不同的影响。在结构上，突变可以分为点突变，添加一个或多个额外的nt至DNA/添加一个或多个额外的AA至蛋白的插入，或者移走一个或多个nt/AA的缺失。nt/AA的“插入”通常是指将至少一个异源nt/AA插入至本发明的细小病毒蛋白的序列。在本文中“异源”是指与细小病毒蛋白的来源病毒相比是异源的。以细小病毒结构蛋白为例，插入的Aas可以简单地被插入在细小病毒结构蛋白的两个特定Aas之间。Aas的插入还可以与在插入位点处的细小病毒结构蛋白的特定Aas的缺失一起导致细小病毒结构蛋白的Aas全部替换(如10 个特定Aas被10个或更多个插入的Aas替换)或部分替换(如10个特定Aas被8个插入的Aas替换)。为启动蛋白合成，除了开放阅读框由接近其5’末端的起始密码子开始外，在起始密码子局部环境中必须满足一些另外的序列要求。其中一种是“Kozak序列”。由特定mRNA 合成的蛋白的量取决于Kozak序列的活力。对于“强”共有序列，相对于被称作第1号的翻译起始密码子而言。在位点+4(即共有序列中的G)和-3(即共有序列中的A或G)处的核苷酸必须都与共有序列相匹配(没有第0号位点)。“适当的”共有序列仅有1个这样的位点，而“弱”共有序列两者都没有。在-1和-2的cc并不保守，但是对于总体的强度是有贡献的。还有证据表明在-6位点的G在翻译启动中是重要的。术语“同一性百分比”是关于两个序列，特别是氨基酸序列的，其显示在两个序列比对中有多少个氨基酸或碱基是相同的。为了标准化，可以使用更长序列、更短序列或比对栏占两种序列的长度。通常，使用序列比对软件以确定序列的同一性百分比。用于一般序列比对工作的常见软件工具包括例如用于比对的ClustalW和T-coffee，以及用于数据检索的BLAST和FASTA3X。技术人员在评估同一性百分比时，将能够选择合适的方法或软件及适当的设置。“核酸分子”可以为RNA形式，如mRNA或cRNA，或者为DNA形式，包括例如如通过克隆获得或化学合成技术产生或它们的组合获得的cDNA和基因组DNA。DNA可以是三链、 双链或单链的。单链DNA可以是编码链，又被称为有义链，或者可以是非编码链，又被称为无义链。“R印-非依赖性启动子”是在R印蛋白不存在时可以被活化的启动子，在本发明的上下文中，R印代表由细小病毒编码的非结构蛋白，尤其是如Muzyczka and BernS(2001)所描述的R印40、R印52、R印68和R印78。这些启动子包括例如异源的组成型启动子和诱导型
启动子。“基因表达”是来自基因，如DNA序列的遗传信息被转变成功能性基因产物，如蛋白或核酸的过程。因此，基因表达总是包括转录，但不必须包括翻译成蛋白。rRNA和tRNA基因是分别被表达成rRNA和tRNA，并且不翻译成蛋白的非蛋白编码基因的实例。为了发生基因表达，优选地，启动子必须存在于基因附近以提供结合位点和募集酶以开始转录。基因表达的“关闭”是指基因表达被阻断。其可以通过基因修饰(DNA序列的变化，包括其表达所必需的起始密码子、至少部分cds或至少部分序列元件，如启动子的突变或缺失)，或者通过用试剂，如短DNA或RNA寡核苷酸处理进行，该寡核苷酸具有与mRNA转录体或基因互补的序列。优选地，后者用于瞬时关闭。"Poly(A) ”位于转录体的3’末端，指示在转移到细胞质之前的RNA处理过程中添加一系列腺嘌呤。这些所谓的poly(A)尾增强了 RNA的稳定性。“序列片段Z”或“片段Z”是DNA片段，其包括(i) VP3起始密码子上游的至少44个核苷酸和(ii)从起始密码子开始的超过242个的VP3cds核苷酸，其源自(a)细小病毒，或(b)与源自AAV2(序列1，图2)的片段Z的核苷酸序列至少60%，优选80%，更优选90 %，特别是99 %并且有利的是100 %相同的核苷酸序列，或(c)在65°C下，于乜SSC、0. SDS中，与AAV2的片段Z DNA分子的互补链杂交的核酸序列，或(d)可以用于反式互补实验从而引发VP3 VLP组装的核酸序列。这意味着片段Z的序列同时代表VP2和VP3cds的一部分，因为AAV衣壳基因由相同ORF的重叠序列、利用可选的mRNA剪切和可选的翻译起始密码子编码。因此，VP2基因包含具有特定的5’区域的全部VP3基因序列(
图1中的图示)。要求保护的多肽或核酸的“功能活性变体”是指本发明上下文中所称的多肽或核酸，其为通过如本文详细描述的一种或多种突变获得的变体，其具有功能活性是因为该变体保持了其生物功能，如其启动VP3组装的能力。生物活性可以在反式互补实验中确定，其中由这样的核酸表达这样的多肽能够启动由VP3编码构建体组装VP3 VLP，而所述VP3编码构建体在适合条件下的表达不足以用于VP3衣壳组装。适合的不足的AAV2 VP3编码构建体为pCMV-VP3/^809或pCI_VP3。适合的实验在实例，如实施例3中描述。优选地，保持生物功能被定义为具有天然存在的AAP的至少50 %，优选至少60 %，更优选至少70 %，80 %或 90%，还更优选95%的活性。如实施例3所描述的，可以进行互补实验，并且通过ELISA (实施例1. 5)或通过免疫荧光(1.6)分析。两种实验都是基于通过单克隆抗体与组装状态中的病毒衣壳相结合来检测病毒颗粒。例如单克隆抗体A20 (Imogen，Heidelberg, Germany)与AAV2和一些其他 AAV血清型的病毒衣壳相结合，对于相关性较远的血清型可商购特异性抗体。如果没有可用的特异性抗体，可以通过电子显微镜检(例如参见Hoque等(1999b))，或蔗糖密度梯度分析 (实施例1. 3. 2.)检测病毒衣壳。"VP3的延伸形式”包括一般几个Aas在N-末端的延伸。这些N-末端延伸代表用于编码VP2但不编码VP3的序列的3’部分，因为AAV衣壳基因由相同ORF的重叠序列利用不同的起始密码子(图1)编码。因此，N-末端延伸的VP3与N-末端截短的VP2相同，意味着部分VP2可以存在于VP3的N-末端延伸内，但没有完全和完整的野生型VP2蛋白被表达，如Ruffing等(1994)给出的例子和可从NCBI (登录号:NC_001401)得到的。根据本发明，颗粒基本上由VP3组成(如所定义的)，因此VP3的延伸形式非常稀少，而天然存在的颗粒包括的 VPl VP2 VP3 的比率为 1 1 8 (Kronenberg 等，2001)。为确定表达于特定样品中的衣壳蛋白组成，可以使用蛋白免疫印迹(Western blot)分析。细胞裂解物或纯化的VLP可以利用蔗糖梯度来分离，由凝胶电泳分析分离产物并转移到硝化纤维素膜，其中可以利用特异性针对靶蛋白的结合剂探测它们。单克隆抗体 Bl与全部三种衣壳蛋白反应且可以被用于检测VP3，而单克隆抗体A69仅与VPl和VP2反应且可以被用于检测截短的VP2。在本发明上下文中，“有效的颗粒形成”是指在粗裂解液中形成大约1011，优选大约 IO12并且更优选大约IO13个颗粒/ml的高颗粒滴度(对应于每个转染的细胞大约105，优选大约IO6并且更优选大约IO7个颗粒)。术语“大约”是指根据本发明，一般误差范围为士20%，特别是士 10%，尤其是士 5%。病毒颗粒滴度可以利用可商购的滴度ELISA试剂盒，由转染的细胞(见上文)的裂解物以其未稀释形式或稀释形式来定量，所述滴度ELISA试剂盒是基于单克隆抗体A20 与组装状态的病毒衣壳的结合来测量病毒浓度的。如上文已经描述的，如果抗体A20不与例如不同病毒血清型的衣壳相结合，颗粒滴度可以由电子显微镜显像并由计数定量(Grimm 等，1999，Grimm 和 Kleinschmidt，1999，Mittereder 等，1996)。为分析蛋白表达和估计它的量，转染的细胞的相同部分的细胞裂解物可以经处理用于SDS-PAGE。通过凝胶电泳和转移到硝化纤维素膜，可以利用特异性针对靶蛋白的结合剂(如单克隆抗体B1、A69、抗-GFP)来探测蛋白。蛋白翻译的量可以由与蛋白特异性结合的结合剂的量来估算。这些复合物可以通过例如免疫组化染色、免疫荧光染色或放射性标记来显像和定量。术语“结合剂”是指与它各自的结合对象特异性相结合的分子。常规使用的结合剂是抗体，特别是单克隆抗体、如单链抗体或抗体片段的抗体衍生物。原则上，可以使用所有类别的抗体，优选IgG抗体。同样可以使用抗体的片段或多聚体。常规使用的片段是单链抗体、Fab-或(Fab)2-片段。其它合适的结合剂实例为蛋白支架，如anticalin或 1 ipocal in (Nygren和Skerra，2004)、受体或其部分(如可溶性T-细胞受体)、锚定蛋白、微体或核酸适体(aptamer)。术语“特异性结合”是指两种分子A和B，优选蛋白，相互结合从而生成复合物AB， 该复合物的亲和力(KD = k。ff/k。n)为至少Kd = lX10_5mol/l，优选至少1 X 10_7mol/l，更优选至少1 X 10_8mOl/l，尤其是至少1 X 10_9mOl/l。“表位”是由免疫系统，特别是抗体、B-细胞或T-细胞识别的大分子的一部分。“模拟表位”是由源自结构蛋白的线性序列的不同区域的几个Aas组成的非线性结构表位，这些区域由于衣壳的整体三级结构而位置紧密相邻，或者“模拟表位”是由源自非肽结构，如碳水化合物残基、核酸或脂质的几个Aas组成的非线性结构表位，上述非线性结构表位被抗体特异性结合。因此，通过模拟表位的结构，模拟表位引起的抗体响应与由表位激起的抗体响应相同。在本发明的上下文中，模拟表位可以由单独插入的肽序列组成(部分)，或者可以由插入的肽和细小病毒核颗粒AA残基组成。在此所使用的术语“B-细胞表位”是指还包括模拟表位。因此，表位可以是线性的和结构的。在涉及本发明的产品、方法和应用的上下文中，术语“抗原”是指与将诱导的免疫反应所针对的任何靶抗原。这种靶抗原通常是易引发体液免疫响应的抗原。它们通常是可以被翻译后修饰的蛋白，例如糖基化蛋白。术语“免疫球蛋白”(缩写Ig)是指在血清中天然存在的任何糖蛋白，其在对免疫抗原入侵的响应中被诱导，并且通过根除病原体来保护宿主。总之，已知有五种属于这类蛋白的人抗体:IgM、IgG、IgA、IgD 和 IgE0第一方面，本发明涉及一种核酸，所述核酸编码包括选自以下氨基酸序列的多肽 SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:6、SEQ ID NO :7、SEQ ID NO :8、SEQ ID NO :9、SEQ ID NO :10、SEQ ID NO :11、SEQ ID NO :12、SEQ ID NO :13, SEQ ID NO :14、SEQ ID NO :15、SEQ ID NO :16、SEQ ID NO :17、SEQ ID NO :18、 SEQ ID NO :19, SEQ ID NO :20, SEQ ID NO :21 禾口 SEQ ID NO :22，或者编码包括这些氨基酸序列中任何一种的功能活性变体的多肽，其中所述功能活性变体(i)具有与SEQ ID NO :1至22的氨基酸序列中任何一种至少60%相同的氨基酸序列，和/或(ii)由cDNA编码，所述cDNA与选自以下的核酸序列SEQ ID NO :23、SEQ ID NO: 24、SEQ ID NO :25、SEQ ID NO :26、SEQ ID NO :27、SEQ ID NO :28、SEQ ID NO :29、SEQ ID NO :30, SEQ ID NO :31、SEQ ID NO :32、SEQ ID NO :33、SEQ ID NO :34、SEQ ID NO :35、SEQ ID NO :36, SEQ ID NO :37、SEQ ID NO :38、SEQ ID NO :39、SEQ ID NO :40、SEQ ID NO :41、 SEQ ID NO :42,SEQ ID NO :43 禾口 SEQ ID N0:44，或者与 SEQ ID NO :23 至 44 的核酸序列中任何一种互补的核酸序列在6x SSCJx Denhardt' s溶液、0. 5% SDS中，于40°C下杂交2 至12小时；和/或(iii)由细小病毒基因组的一部分编码，所述细小病毒基因组的以部分包括的开放阅读框(ORF)未在编码VP1、VP2和VP3的框内，包括多于378个的VP30RF核苷酸，
其中所述核酸不能表达任何一种功能性R印蛋白，尤其是不能表达R印40、R印52、 R印68、Itep78、VPl、VP2 和 VP3。已证明AAV2cap基因的目前未鉴定的产物的共表达有效启动了 VP3组装成二十面体衣壳。这种被命名为组装活化蛋白或AAP的蛋白由cap基因的0RF2编码(其中第一 ORF 编码VP1、VP2和VP； )，并且分子量大约为23kDa。由蛋白免疫印迹估算的AAP分子量更大 (约30kDa)可能是由于翻译后修饰。它的细胞定位是在核仁中，并且它指引VP蛋白到发生衣壳组装的核仁。然而，单独的VP3核仁定位不足以形成衣壳，表明AAP还在全长AAV基因组内提供了额外的分子伴侣-类型、支架和/或成核作用。针对不同的细小病毒可以鉴别同源的多肽。图观中显示了这种源自不同细小病毒cap基因的0RF2的预测的AAP蛋白序列的比对。因此，根据本发明的核酸优选以编码包括 SEQ ID NO :1(AAV2),SEQ ID NO 2 (AAVl)的氨基酸序列，或者 SEQ ID NO :5(AAV5)的氨基酸序列的多肽为特征。本发明设想天然存在的AAP可以被修饰且保持功能活性。例如为增加表达、稳定性和/或活性，或者为利于更容易克隆构建体，可以生成这种功能活性变体。因此，本发明还涉及功能活性变体，所述功能活性变体具有的氨基酸序列与SEQ ID NO=USEQ ID NO :2、 SEQ ID NO 3, SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:6、SEQ ID N0:7、SEQ ID N0:8、SEQ ID NO :9,SEQ ID NO :10,SEQ ID NO =IUSEQ ID NO :12,SEQ ID NO :13,SEQ ID NO : 14、SEQ ID NO :15, SEQ ID NO :16、SEQ ID NO :17、SEQ ID NO :18、SEQ ID NO :19、SEQ ID NO :20、 SEQ ID NO :21和SEQ ID NO :22的氨基酸序列中任何一种至少65%，更优选至少70%，更优选至少75 %，更优选至少80 %，更优选至少85 %，更优选至少90 %，更优选至少95 %，最优选至少99%，并且特别是100%相同，和/或所述功能活性变体由cDNA编码，所述cDNA与 SEQ ID NO 23,SEQ ID NO 24,SEQ ID NO25,SEQ ID NO26,SEQ ID NO 27,SEQ ID N0: 28、SEQ ID NO :29、SEQ ID NO :30、SEQ ID NO :31、SEQ ID NO :32、SEQ ID NO :33、SEQ ID NO :34、SEQ ID NO :35、SEQ ID NO :36、SEQ ID NO :37、SEQ ID NO :38、SEQ ID NO :39、SEQ ID NO :40、SEQ ID NO :41、SEQ ID NO :42、SEQ ID NO 43 和 SEQ ID NO 44 的核酸序列中的任何一种互补的核酸序列在6x SSC,5x Denhardt，s溶液、0. 5% SDS中，于45°C，更优选 500C，更优选55°C，更优选60°C，尤其是65°C，并且有利地68°C下杂交。优选地，所述功能活性变体由cDNA编码，所述cDNA与SEQ ID NO 23的核酸序列或与SEQ ID NO 23的核酸
序列互补的核酸序列在6x SSC,5x 06池￡^肚，8溶液、0.5%303中，在上述特定的条件下杂 、-父。在本发明优选的实施方案中，所述核酸编码由选自以下氨基酸序列组成的多肽 SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:6、SEQ ID NO :7, SEQ ID NO :8、SEQ ID NO :9、SEQ ID NO :10, SEQ ID NO :11、SEQ ID NO :12, SEQ ID NO :13, SEQ ID NO :14、SEQ ID NO :15、SEQ ID NO :16、SEQ ID NO :17、SEQ ID NO :18、 SEQ ID NO :19, SEQ ID NO :20, SEQ ID NO :21 禾口 SEQ ID NO :22，或者编码由这些氨基酸序列中的任何一种的功能活性变体组成的多肽，其中所述功能活性变体的定义同上。更优选地，所述核酸编码由选自SEQ ID NO :1至SEQ ID NO 22的氨基酸序列组成的多肽。由于采用AAP的N-末端和C-末端截短实验已发现，就AAV2的AAP的3’ -末端而言，从ATG28tl9开始与VP30RF重叠378nt，不能支持VP3衣壳组装，而VP30RF的445个核苷酸在衣壳生产中与wt AAV大致同样有效。因此，本发明的核酸的特征在于其包括多于378 个的 VP30RF 核苷酸(如多于 378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、 391、392、393、394、395、396、397、398、399个核苷酸)，优选至少400个核苷酸(如至少400、 401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、 420、421、422、423、424个核苷酸)，更优选至少425个核苷酸(如至少425、426、427、428、 429、430、431、432、433、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444 或 445 个核苷酸)，和尤其是至少 445 个核苷酸(如 445、446、447、448、449、450、451、452、453、454、455、 456、457、458、459、460、461、462、463、464、465、466、467、468、469、470、471、472、473、474、 475、476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487 或 488、489、490、491、492、 493、494、495、496、497、498、499、500 或更多个核苷酸)。关于AAV2的AAP的5’ -末端，由具有VP3起始密码子上游的44个核苷酸延伸的核酸编码的N-末端截短的AAP在衣壳生产中与wt AAV大致同样有效，条件是翻译由框中插入的ATG开始至0RF2，并且若无ATG起始密码子被插入效率更低(数据未给出)。由在 2858位点代替ACG的ATG开始的核酸编码的N-末端截短的AAP未形成可检测的衣壳。对于AAV4和AAV9，已证实起始于各自的VP3起始密码子的VP3 cds表达构建体足以用于进行可检测的衣壳组装，因而还编码功能性AAP (变体)(数据未给出)。因此，本发明的核酸的特征在于其包括位于VP3起始密码子的5’端直接延续处的邻接VP2-编码核苷酸的至少44个核苷酸(如44、45、46、47、48、49或50个核苷酸)、优选至少 20 个核苷酸(如 20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、
39、40、41、42或43个核苷酸)、更优选至少5个核苷酸(如5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、 15、16、17、18或19个核苷酸)。核酸编码AAP或其变体可以正好从VP3的3’起始密码子起始，如从AAV4和 AAV9(上文)可以看出的。因而，在另一个优选的实施方案中，本发明的核酸的特征在于其起始密码子为VP3起始密码子下游的4个核苷酸，优选M个核苷酸，并且更优选44个核苷酸处的ATG。因而，在优选的实施方案中，本发明的核酸包括的核苷酸从VP3起始密码子上游至少44个核苷酸和下游445个核苷酸(计算包括ATG)开始，优选从VP3起始密码子上游至少 20 个核苷酸(如 20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、
40、41、42、43或 44 个核苷酸)和下游 425 个核苷酸(如 425、426、427、428、429、430、431、 432、433、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444 或 445 个核苷酸)，并且尤其是从VP3起始密码子上游至少5个核苷酸(如5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18或 19 个核苷酸)和下游 400 个核苷酸(如 400、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、 411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、423 或 424 个核苷酸)开始。因此， 本发明核酸的总长度为至少 489nt (如 489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、499、 500 或更多 nt)，优选至少 445nt (如 445、446、447、448、449、450、451、452、453、妨4、455、 456、457、458、459、460、461、462、463、464、465、466、467、468、469、470、471、472、473、474、 475、476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487 或 488nt)，和并且尤其是至少 405nt(如 405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、 422、423、424、425、426、427、428、429、430、431、432、433、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443 或 444nt)。本发明的核酸能够表达启动VP3衣壳组装的蛋白。它的特征在于它源自AAV2，并且它的翻译起始密码子(在野生型AAV2序列中发现)为C2729TG、A2735CG, A2717TT或T272JG, 或者它源自另一种细小病毒并且它的翻译起始密码子位于与AVV2的翻译起始密码子同源的位点。另外的细小病毒的同源起始密码子可以通过特定的比对(参见图27)并且寻找由可能的非典型起始密码子编码的氨基酸而容易地确定。这种可能的非典型起始密码子可以通过突变分析容易地鉴定，如实施例14中对AAV2C2729TG所做的分析。对于图27中未给出的细小病毒，这种序列可以容易地被添加到特定的比对中。在优选的实施方案中，AAP编码ORF突变的方式是为了生成能够改进开放阅读框翻译的ATG起始密码子，而“改进的”是指与各自的野生型序列相比，AAP或其突变体的表达更高。优选地，AAV2或其他细小病毒的同源位点的翻译起始密码子中的一个突变成ATG起始密码子。由典型起始密码子ATG开始翻译通常会获得最优化的AAP或其变体的表达，因此当AAP或其变体不是最优化的时，导致衣壳组装的产量增加。如果表达系统转变成各自病毒并不适应的细胞，这就变得特别有益。可以假定AAP或其变体在非宿主细胞内的表达将不是最优化的。例如，本发明可以预见为得到高的衣壳产量，在昆虫细胞或适合于杆状病毒感染的其它细胞，酵母或细菌中制备衣壳时，AAP或其变体的最优化表达可能是非常有益的或至关重要的。然而，处在顺式情况下，这种AAP起始密码子向ATG的突变可能减少衣壳的形成 (其中AAP由与编码VP3的ORFl重叠的核酸编码)，这种突变在反式情况下特别有益，其中 AAP的编码不依赖于编码VP3的ORFl (实施例14)。在本领域内和本发明的一部分中已熟知的是，核酸的特征在于核酸的多肽编码序列之后为poly(A)信号。在本发明的一方面，本发明的核酸包括驱动多肽-编码序列转录的启动子。在优选的实施方案中，使用异源启动子，即并不存在于AAP-编码核酸来源的病毒中的启动子， 或优选不存在于任何细小病毒野生型基因组中的启动子。在本文描述的方法中可以使用的启动子并不限于本文描述的实例。可以是任何已知的或随后发现的一种启动子。组成型启动子，例如连续转录的早期巨细胞病毒(CMV)启动子(US 4，168，062)，在本发明中可以作为诱导型启动子，如抗生素特异性或细胞特异性启动子来使用。对于在哺乳动物细胞系统中的表达，使用CMV启动子是特别优选的，例如利用转染方法在制备工艺中使用，而在昆虫细胞中多角体蛋白启动子(PolH)的使用是优选的。诱导型异源启动子是特别优选的，因为它们可以被用于建立稳定的VP3生产细胞。由于细小病毒中基因组组织的高度保守，本发明可以容易地转用到其他细小病毒成员。在细小病毒中，作为本发明的核酸来源的优选病毒是腺相关病毒(AAV)、鹅细小病毒、 鸭细小病毒和蛇细小病毒。优选的AAV选自牛AAV(b-AAV)、犬AAV(CAAV)、小鼠AAV1、山羊 AAV、大鼠 AAV、禽 AAV (AAAV)、AAV1、AAV2、AAV3b、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、 AAVlU AAV12 和 AAV13，特别是 AAV2。在另一方面，本发明的核酸包括于表达盒、构建体、载体或细胞系中。构建体，一般为质粒，通常是包括本发明的核酸和其他序列，如多克隆位点、复制起点、选择标记基因等的核酸。表达盒通常是一旦其位于细胞内就能通过细胞转录和翻译机制产生由本发明的核酸编码的蛋白的构建体。表达构建体被设计成包含用作增强子或启动子区域并且使得本发明的核酸有效转录的调控序列。它还通常包括poly (A)-位点，其随后被多聚腺苷酸化，这对于核输出、HiRNA翻译和稳定来说很重要。载体是用于将本发明的核酸引入细胞的构建体。 依据被转染的细胞，根据技术人员的标准技能来构建载体。这些载体可以是用于磷酸钙转染或脂质体转染的质粒，或病毒载体，如杆状病毒。细胞系是适合用于表达AAP或其变体或者复制AAP (变体)编码质粒的实验室细胞系。本发明的另一方面是由本发明的核酸编码的多肽。主要的天然存在的多肽被称为组装活化蛋白(ΑΑΡ)。因此，由本发明的核酸编码的这种多肽变体被称为AAP变体。例如， 包括AAP蛋白和一种或多种其它肽的变体被称为包括AAP的多肽。由0RF2(具有限定ORFl 的VP3起始密码子)表达蛋白ΑΑΡ,计算的分子量大约为23kDa，并且能够在核仁中提供VP3 的衣壳组装。于全AAV基因组内形成衣壳也是重要的。它将VP蛋白引向核仁并在那里发挥启动组装反应的额外作用。本发明的另一方面是通过在宿主细胞中表达本发明的核酸来生产本发明的多肽， 即AAP或AAP变体的方法。这种生产一般适合于启动细小病毒的衣壳形成，并且特别是包括VP3但没有VPl和VP2和Rep蛋白的衣壳形成。合适的宿主细胞可以由技术人员根据自己的需要和偏好选择。优选的宿主细胞选自哺乳动物细胞系、特别是人细胞系，用于杆状病毒感染的细胞系，细菌菌株和酵母菌株组成的目录。本发明的另一方面是一般特异性结合AAP的抗体或结合剂。特别地，抗体特异性结合SEQ ID NO :1至22的序列中的任何一种。这些抗体可以被用于进一步研究AAP的功能，或者当在异源表达系统中用作反式作用因子时，用以鉴定并且最优化AAP表达水平，用于商业生产的细小病毒DNA或病毒样颗粒。优选的抗体的特征在于其特异性结合AAV2的 AAP(SEQ ID NO :1)。本发明的抗体可以是多克隆或单克隆的。本发明进一步包含相应的抗体片段，如单链抗体、scFvs、Fab片段、纳米抗体(nanobodies)或类似物，或者抗体多聚体。本发明的另一方面是本发明的核酸在制备本发明的多肽，包括AAP和AAP变体中的应用。本发明的另一方面是本发明的核酸或多肽在制备细小病毒和细小病毒颗粒中的应用。AAP的鉴定使得制备这些病毒成为可能，这是以前未知的，因为为了增加产量或为了生成诱导型生产系统，利用稳定的转染的生产细胞系将表达构建体单独最优化。可以通过使用异源启动子而增强表达。特别地，可以在功能性Rep和VPl和VP2编码序列不存在时制备颗粒，这样能够制备不包括任何功能性蛋白VPl、VP2、R印40、R印52、R印68和R印78的细小病毒颗粒。在关于形成这种病毒和颗粒的有效、快速和廉价生产系统的上下文中，所有这些因素都是重要的。本发明的一方面是生产基本上由VP3组成的细小病毒颗粒的方法，所述方法包括以下步骤(i)提供能够由来自细小病毒VP3-编码序列(cds)表达VP3的细胞，其中所述 VP3受r印-非依赖性启动子控制，并且表达本发明的核酸编码的蛋白，(ii)在有利于VP3 和来自本发明的核酸的蛋白表达的条件下孵育细胞，从而产生细小病毒颗粒，以及(iii) 任选地由细胞纯化细小病毒颗粒，其中每个细胞形成至少IO5个病毒颗粒，并且没有功能性 VP1、VP2、R印40、R印52、R印68和R印78蛋白表达。利用片段Z代替本发明的核酸同样适用这种方法。
本发明的另一方面提供生产基本上由VP3组成的细小病毒颗粒的方法，所述方法包括以下步骤i.在r印-非依赖性启动子控制下，于细胞中由来自细小病毒的VP3编码序列 (cds)的表达VP3， 在r印-非依赖性启动子控制下，于细胞中表达DNA序列片段(片段Z)，该DNA 序列片段包括(1) VP3起始密码子上游的至少44个核苷酸，和(2)从起始密码子开始的多于242个的VP3cds核苷酸，其源自a)细小病毒，或者b)与源自AAV2的片段Z的核苷酸序列(序列1，图2)至少60%，优选80%，更优选90 %，特别是99 %，并且有利的是100 %相同的核苷酸序列，或者c)与AAV2的片段Z DNA分子(序列2)的互补链在4x SSC、0. 1 % SDS中，于65°C 下杂交的核酸序列，或者d)可以用于反式互补实验以引起VP3VLP组装的核酸序列，iii.在适合于VP3表达的条件下孵育细胞，以及iv.由细胞纯化细小病毒颗粒，其中每个细胞形成大约IO5个，优选大约IO6个，并且更优选大约IO7个病毒颗粒， 并且基本上没有VP1、VP2和R印蛋白(尤其是R印40、R印52、R印68和R印78)被表达。这些方法发明是基于由细小病毒科的病毒生成的颗粒，其中所述野生型表达VP1、 VP2和VP3作为衣壳蛋白。基本上由VP3组成的细小病毒颗粒可以通过在基本上不存在功能性VP1、VP2和R印，尤其是R印40、R印52、R印68和R印78蛋白表达时，表达细小病毒 VP3cds来生成。结果，纯化的细小病毒颗粒基本上仅由一种衣壳蛋白组成。由于颗粒中不存在R印，Rep-介导的DNA包装完全被避免。本发明提供了高滴度的基本上由VP3组成的细小病毒颗粒，除了别的之外，其适合用于疫苗开发。本领域内熟知的是，单独的VP3不能组装成衣壳。在本发明的上下文中，编码被命名为AAP的新的多肽的核酸、序列元件Z (片段Z)分别被鉴定，如果它们在细胞中表达，就介导VP3颗粒的组装，并且VP3并不需要另外的病毒蛋白用于衣壳组装。几条证据线索得出的结论是，VP3需要源自cap基因的RNA用于衣壳组装。可以以反式提供的VP3衣壳组装所需的这种因子在融合至gfp的cap基因片段(VP2N-gfp)中。 由这种cap基因片段(编码VP1、VP2和VP3的0RF)的第一 ORF表达蛋白不是必须的，因为在cap基因的相关区域中包含终止密码子的几个构建体也提供辅助作用。通过蛋白免疫印迹分析不能检测来自通读转录体的VP2N-gfp的表达。这种蛋白表达从非常规的翻译起始位点开始并且之后是终止密码子，这种蛋白表达的可能性很小且它们的量非常低。这种 VP2N-gfp的蛋白表达还不足以激发VP3的衣壳组装。这已通过利用替代密码子表达这种蛋白导致高VP2N-gfp蛋白水平，但未导致VP3衣壳组装而明确地证明。由于这种密码子的改变暗示核苷酸序列的改变，因此清楚地显示出正确的核苷酸序列对于组装辅助作用来说是必须的，而不是第一 ORF表达的蛋白。最终，通过质粒提供不能在第一 ORF中转录的正确核苷酸序列也不能形成衣壳组装，这对正确的核苷酸序列的转录是必需的提出了质疑。如图2所示，片段Z包括VP3起始密码子上游至少44个核苷酸和下游多于242个核苷酸。优选地，片段Z不包括全长VP3cds。片段Z的序列可以源自图2中所列出的许多不同细小病毒中的一种，图2中给出细小病毒AAV1、AAV2、AAV3b、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、 AAV8、AAVlO, AAVll和b_AAV的片段Z的各自区域的核苷酸序列的一些实例。该列表并不限于此处给出的细小病毒。另外的序列可以容易地通过其VP3起始密码子的位置来比对并被选择作为片段Z。核苷酸序列还可以通过它与源自AAV2的片段Z的核苷酸序列(SEQ ID NO 45,见下文)至少60%，优选80%，更优选90%，特别是99%，并且有利的是100%的序列同一性来选择作为片段Z。此外，在虹SSC、0. 1%SDS中，于65°C下与AAV2的片段Z DNA 分子(SEQ ID N0:46，见下文)的互补链杂交的核苷酸序列也可以用于反式互补实验中，以作为片段Z引发VP3VLP的组装。特别优选的是片段Z源自AAV2，并且包括SEQ ID NO :45。源自AAV2的DNA序列片段Z的核苷酸序列(SEQ ID NO :45，在图2中也给出)ltcggacagcc accagcagcc ccctctggtc tgggaactaa tacgatggct51acaggcagtg gcgcaccaat ggcagacaat aacgagggcg ccgacggagtIOlgggtaattcc tcgggaaatt ggcattgcga ttccacatgg atgggcgaca151gagtcatcac caccagcacc cgaacctggg ccctgcccac ctacaacaac201cacctctaca aacaaatttc cagccaatca ggagcctcga acgacaatca251ctactttggc tacagcaccc cttgggggta ttttgac可以被用于杂交实验以鉴定未知的DNA片段作为片段Z的SEQ ID NO :45的反式和互补序列(SEQ ID NO 46)lgtcaaaatac ccccaagggg tgctgtagcc aaagtagtga ttgtcgttcg51aggctcctga ttggctggaa atttgtttgt agaggtggtt gttgtaggtgIOlggcagggccc aggttcgggt gctggtggtg atgactctgt cgcccatcca151tgtggaatcg caatgccaat ttcccgagga attacccact ccgtcggcgc201cctcgttatt gtctgccatt ggtgcgccac tgcctgtagc catcgtatta25lgttcccagac cagagggggc tgctggtggc tgtccga为了启动VP3cds和片段Z序列或本发明的核酸的转录，选择一种或两种“R印-非依赖性启动子”。为了表达VP3和片段Z，在不存在细小病毒因子R印时使用r印-非依赖性启动子，避免存在细小病毒因子Rep是因为Rep具有将病毒基因组和非特异性DNA包装到细小病毒颗粒中的作用。出于本发明的目的，避免病毒或非特异性DNA的包装，因为细小病毒颗粒可以无意地被用作为基因治疗载体。通过将“R印-非依赖性启动子”用于VP3表达和片段Z或本发明核酸的转录，RNA聚合酶在不存在Rep蛋白表达时可以启动转录，使得在不存在R印蛋白尤其是R印40、R印52、R印68和R印78时能够制备衣壳。例如，R印-非依赖性启动子是异源组成型或诱导型启动子。因此，在本发明的一方面中，本发明的核酸包括驱动多肽-编码序列转录的启动子。在优选的实施方案中，使用不存在于任何一种细小病毒野生型基因组的异源启动子。可以用于在此描述方法的启动子并不限于在此描述的实例。可以是已知的或随后发现的任何一种启动子。组成型启动子，例如连续转录的早期巨细胞病毒(CMV)启动子(US 4, 168, 062)在本发明中可以用作诱导型启动子，如抗生素特异性或细胞特异性启动子。对于在哺乳动物细胞系统中的表达，使用CMV启动子是特别优选的，例如利用转染方法在制备工艺中使用，而在昆虫细胞中使用多角体蛋白启动子(PolH)是优选的。诱导型异源启动子是特别优选的，因为它们可以被用于建立稳定的VP3生产细胞。用于VP表达的适合条件是本领域内所熟知的，并且原则上可以被转变成仅表达 VP3。为产生细小病毒或特定的细小病毒颗粒，各自的DNA序列必须被转染至细胞中。在实施例中描述了一个方案。然而，不同的转染方法，不同的细胞或稳定转染的细胞可以替换使用。例如Grimm等Q002)以及Grieger和SamulskU2005)描述了不同的生产方法。本发明的方法得到高产量的细小病毒颗粒，其中每个转染的细胞形成大约105，优选大约106，并且更优选大约IO7个病毒颗粒。这些数字对应于每毫升粗裂解物大约1011，优选大约IO12并且更优选大约IO13个颗粒。VP3颗粒的商业应用需要提供高产量颗粒的有效生产方法。所述颗粒可以通过本文和现有技术公开的方法来纯化。特别优选的是，片段Z的序列或本发明的核酸和VP3cds以使得产生仅由VP3组成
的细小病毒颗粒的方式被安排和表达。在上下文中，“仅由......组成”是指没有其他蛋白
质分子作为颗粒的一部分可以通过常规方法，如蛋白免疫印迹被检测到。这种颗粒可以包括其他分子或盐，如水和其它缓冲液组分。此外，所述颗粒可以包括颗粒在组装期间被偶然封装在细胞内的分子。根据本发明的一种实施方案，片段Z或本发明的核酸的序列不与VP3cds重叠，使得细小病毒颗粒仅由VP3组成。这避免在颗粒中存在亚化学计量数量的N-末端延伸的VP3 蛋白(参见实施例4)。这种少量的N-末端延伸的VP3蛋白最有可能不影响颗粒的活性或产量。然而，在药物控制方面，得到单一蛋白产物是有利的。因此，特别优选的是，本发明的细小病毒颗粒仅是由VP3组装的。为此目的，通过本领域人员熟知的方法将VP1、VP2和R印，尤其是R印40、R印52、Rep68和R印78在细胞中的表达关闭，因为例如各自起始密码子的缺失或突变，蛋白的特定cds的缺失(全部或部分)，或者蛋白的特定cds的突变，阻碍功能性基因产物的表达(实例在例如Warrington等 (2004)中描述)。对大部分真核mRNA中翻译启动位点的选择似乎通过扫描机制进行，其预测与5’ 末端的接近程度在确定起始密码子中发挥主要作用。这种“位置效应”导致转录体的第一 (大多是上游的)ATG起始密码子启动翻译(Kozak，2002)。就细小病毒/AAV衣壳蛋白的表达而言，这意味着较少的剪切的转录体主要用于由第一 ATG合成VPl，然而VP3的翻译主要由它的ATG起始密码子启动，该ATG起始密码子是主要的剪切的转录体的大部分上游ATG。这种主要的剪切的RNA还编码VP3起始位点的上游的VP2的不常见ACG起始密码子。因此，除由主要的剪切的转录体有效合成的VP3之外，VP2在一定程度上被表达(Becerra等，1988 ；Becerra等，1985)。通常，位置效应在突变失活或移除正常起始位点和翻译转移至下游起始位点的情况下也是明显的。因此，沉默的内在ATG密码子可以被活化，并且翻译效率被提高，这是在一些疾病状态中熟知的问题(KOzak，2002)。考虑到这些知识，诱变VPl和VP2起始密码子以使它们的表达失活，可以活化截短蛋白由在野生型中沉默的下游位点开始的翻译(如Warrington等Q004)所描述，以及实施例2. 2中观察到的)。因而，除已知用于衣壳蛋白的主要起始密码子外，这种替代起始密码子优选是缺失或突变的，以确保VP3是唯一被表达的衣壳蛋白。仅表达VP3而关闭其他任何衣壳蛋白可以通过所描述的蛋白免疫印迹来控制。在进一步优选的实施方案中，用于VPl和VP2的编码序列(并不编码VP3序列) 完全从编码VP3的表达盒中缺失，而VPl和VP2的编码序列并不编码VP3序列。在这种情况中，以反式提供片段Z或本发明的核酸从而能够产生VP3衣壳。在本发明优选的实施方案中，片段Z或本发明的核酸的DNA序列之后为poly(A) 信号。所述Poly(A)信号能够恢复多聚腺苷酸化机制，一旦基因转录结束，就在RNA分子上添加延伸的腺嘌呤(poly(A)尾)。这种处理步骤增强在细胞内由片段Z转录的因子的稳定性。Poly(A)信号如来自SV40大T-抗原的poly (A)是本领域内所熟知的，并且常规应用于各种表达盒和构建体中。我们分析了在VP3起始密码子5'的不同位点开始表达的一系列缺失突变体，分析表明突变体PCMV-VP3/2765仍然能够引起衣壳组装(实施例幻。因而，如上文已经描述的，片段Z必须包括VP3起始密码子上游至少44个核苷酸。由于通过利用5’端延伸了一些核苷酸的片段Z提高了颗粒形成的效率，优选的是片段Z分别包括VP3起始密码子上游至少113个核苷酸，或特别至少198个核苷酸。在我们的实验中，我们选择的提供AAV2的片段Z的构建体从核苷酸沈96(对应于VP3起始密码子上游的113个核苷酸)开始。在图 2中列出了与加下划线的VP3起始密码子相关的不同血清型的序列。根据在各自的NCBI登录号给出的核苷酸序列，可以容易地在5’或3’方向延伸序列(比较图2的图例)。如果片段Z的5，延伸序列包括0RF1、0RF2或0RF3中的VPl和/或VP2的翻译起始密码子或者任何其它ATG起始密码子，它们必须通过突变或缺失被失活，以表达VP3作为唯一的衣壳蛋白。进一步地，片段Z必须包括多于242个的VP3起始密码子下游核苷酸。优选的是， 片段Z包括从起始密码子开始的VP3cds的多于大约275个核苷酸、多于大约300个核苷酸、 多于大约325个核苷酸、多于大约350个核苷酸、多于大约375个核苷酸、多于大约400个核苷酸、多于大约425个核苷酸，并且最优选多于大约445个核苷酸。特别优选的片段Z在大约核苷酸32M处(对应于VP3起始密码子下游大约445个核苷酸)终止。由片段Z编码的活性分子最有可能是扩散性分子，即命名为AAP的蛋白。基于简并基因密码子，我们最优化了片段Z的序列以得到能在Z内编码的推定扩散性蛋白潜在的更高表达，Z处在还编码衣壳蛋白VP1、VP2和VP3的第一阅读框(ORFl)中，从而保持在ORFl 中编码的蛋白的AA序列未改变，但是通过修饰DNA序列干扰由其它ORF编码的蛋白序列。 然而，这种密码子-最优化的片段不能介导颗粒形成，因为不再有病毒颗粒还可以被检测到(实施例5，图6)。另一方面，在片段Z内将终止密码子插入至0RF1，使得ORFl的蛋白合成被关闭，但是仅导致ORFl的DNA序列有较小的改变，并且不干扰0RF2的蛋白合成，仍然能够有效形成颗粒(实施例6，图8)。特别优选的是，片段Z的突变包括在第一或第三阅读框中至少一个用于蛋白翻译的一个终止密码子。结果，没有具有18AA或以上长度的蛋白可以由这些片段Z的阅读框翻译，尤其是没有生成VP2蛋白或其部分。因而，其主要优点在于没有VP2或其部分包括于颗粒中。作为本发明的优选实施方案，在片段Z或本发明的核酸内的VP3的主要翻译起始密码子ATG(AA 203，根据AAV2的VPl编号(Girod等，1999))突变。进一步优选的是，VP3 的较少的替代起始密码子(AA 211和AA 235 (Warrington等，2004))中的一个或两个也突变。在更优选的实施方案中，可以被用于VP3翻译起点的全部ATG密码子突变(许多可能的那些列于Warrington等，2004)，以完全避免由提供片段Z的表达构建体翻译VP3。由于片段Z的产物和本发明核酸的编码功能以反式作用元件为特征，意味着片段 Z和本发明的核酸编码扩散性分子，片段Z或本发明核酸的序列可以在相同或不同的核酸分子上作为cap基因或其部分，如VP3cds提供给细胞。在优选的实施方案中，提供的片段Z或本发明的核酸相对于VP3cds为“顺式”。如果提供片段Z/本发明的核酸相对于用于编码VP3的表达盒为“顺式”，意味着片段Z/本发明的核酸和VP3的表达由相同的一个启动子驱动。片段Z/本发明的核酸的序列可以位于 VP3cds的上游或下游。用于编码片段Z和VP3的序列可以直接连接可变数量的核苷酸或被其分开(图3. 1)。在本发明的更多特定实施方案中，片段Z/本发明的核酸直接位于VP3cds的上游。 由于片段Z/本发明的核酸包括多于242个的VP3起始密码子下游核苷酸，并且这种序列不必然重复存在，直接跟随的VP3cds必然仅提供VP30RF的剩余DNA序列(图3. 1. a中给出图解)。在这种情况下，亚化学计量数量的N-末端延伸的VP3被表达并且存在于衣壳中(实施例4)。为了不增加这部分N-末端延伸的VP3，不在片段Z/本发明的核酸5’末端或上游分别添加新的或缺失现有的起始密码子是本发明的一项重要实施方案。此外，仅有与片段Z/本发明的核酸不重叠的VP3-特异性cds可以被容易地突变。 与片段Z/本发明的核酸重叠的VP3cds的突变还能改变由片段Z/本发明的核酸编码的扩散性分子的序列。结果，在一些情况下，扩散性分子将不再有活性。这种情况下的突变包括沉默突变以及例如表位的插入。为了增加VP3cds突变的可能性，使重叠最小化，即分开片段Z/本发明的核酸和VP3cds是有益的。这可以以顺式方式进行，其中一个启动子驱动不包含对于片段Z来说重要的VP3起始密码子上游44个核苷酸的VP3cds的表达，和位于这种VP3cds之前或之后的单独的片段Z的表达。特别优选的是，提供的片段Z/本发明的核酸相对于VP3cds为“反式”。如果提供的片段Z/本发明的核酸相对于用于编码VP3的表达盒为“反式”，意味着片段Z/本发明的核酸和VP3的表达由各自的启动子驱动(与“顺式”相反，见上文)。片段Z的序列/本发明的核酸可以位于相同构建体上的VP3cds的上游或下游，或者与VP3cds不同的表达构建体上(实例列于图3. 2中)。在这种情况下，片段Z仅包括VP3cds的5 ‘末端，因此它主要的优点在于没有 N-末端延伸的VP3(见下文)可以被表达并且整合到衣壳中。因此，如果提供的用于编码 VP3和片段Z的序列为反式，推测可以获得更多纯的颗粒组合物，优选仅由结构蛋白VP3组成。反式构型的一个优点在于VP3cds可以容易地被修饰，例如最优化其用于表达细胞系的密码子使用，以进一步增加产量而不改变片段Z/本发明的核酸的序列。还可以进行其它修饰，如突变、插入、标签等而不影响片段Z/本发明的核酸。可以假设在之前尝试确定片段Z和VP3cds的重叠序列中的VP3内的插入位点时，可能有用的插入位点未被确定为也干扰片段Z的表达或干扰AAP的功能的插入位点。因此，这些序列的功能或者以无重叠的顺式设置，或者优选以反式设置来分开，使得VP3编码序列能够进行非依赖性诱变。这种诱变具有多种商业应用。在生产新的基因治疗载体的过程中，形成嵌合型细小病毒Cap序列的限制可以被克服。几个研究组尝试直接开发AAV，其涉及在一种血清型上随机诱变而成的病毒库的形成(Koerber等，2008)，利用已知的AAV血清型衣壳序列，通过使用STEP和 shuffling方法来形成多种随机组合的衣壳(Ward和Walsh，2009，Li等，2008)。以相似的方法，AAP的非依赖性表达可以被用于确定耐受配体(被用于以其他细胞为靶点)、B-细胞表位(被用于生成表位特异性疫苗)或缺失/替换(被用于病毒的去靶向或减少病毒的抗原性)的另外的插入位点。片段Z/本发明的核酸和VP3cds的反式构型的另一个优点在于，一种构建体可以被稳定地转染至生产细胞系，而其它构建体可以被瞬时转染/转导。例如，包括片段Z/本发明核酸的表达盒可以稳定地被转染至适合于VP3有效表达的细胞系，形成单一生产细胞系。然后，这种生产细胞系被特异性VP3cds瞬时转染/转导(如用病毒感染)，致使这种 VP3表达和各自的颗粒形成。因此，一种生产细胞系可以被用于生产不同的颗粒。给出确定用于制备药物的生产细胞系所需的时间和费用，这形成相当大的调节优势。出于这个原因， 特别优选的是，在各自的表达构建体上提供片段Z/本发明的核酸和VP3cds。通过以反式向细胞提供用于编码特定血清型的VP3的表达盒，这种设置可以另外被用于例如生成不同血清型的AAV/细小病毒颗粒，所述细胞已经被一种血清型的片段Z/ 本发明的核酸稳定地转染。一般地，特异性针对选自以下的AAV血清型的VP3cds可以被用于转染已经用仅一种血清型如AAV2的片段V本发明的核酸稳定转染的细胞:AAV1、AAV2、 AAV3b、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12 和 AAV13。从而，可以容易地生成由所选择的血清型如AAVl颗粒的VP3组成的AAV颗粒。对于AAVl和AAV2，我们证明片段Z/本发明核酸的表达介导VP3的衣壳组装，所述VP3不仅由从相同血清型克隆的构建体表达，而且由从其它血清型，即分别为AAV2和AAVl克隆的构建体表达(实施例21)。 然而，一般不能期望各个血清型彼此互补，但是在如在此所描述的反式互补实验中，本领域技术人员可以容易地鉴定来自一种细小病毒/血清型的AAP与来自不同种细小病毒/血清型的VP3的各自的配对，以得到VP3VLP的组装。例如，如果已获得可以被用于生产来自不同细小病毒或AAV血清型的VP3VLP的表达特异性AAP的稳定细胞系，可以使用交叉互补。 可以选择用于时间和成本效益高的高滴度VLP生产的各种组合。同样地，其它的方法是可能的，并且一种特定的VP3cds可以以反式被表达盒转染，所述表达盒提供选自用于编码片段Z的许多不同序列的片段Z/本发明的核酸，如选自不同的AAV血清型/细小病毒的。在本发明的另一个优选实施方案中，细小病毒颗粒不包含R印蛋白，尤其是任何功能性R印40、R印52、R印68和R印78蛋白。在此通过说明书给出了这种实施方案的详细内容。在本发明的另一个优选的实施方案中，仅/最多1/50的表达的结构蛋白，优选最多1/100，更优选最多1/250，并且基本上仅/最多1/500的结构蛋白是VP3的N-末端延伸形式。特别优选的是不包含任何具有VP3的N-末端延伸形式的结构蛋白的细小病毒颗粒， 或者反之亦然，没有结构蛋白是VP3的N-末端延伸形式。如果片段Z和VP3cds的序列重叠，并且在相同启动子(顺式形式)的控制下表达，VP3cds的ATG起始密码子主要被用作
26蛋白翻译的起始，而仅很小比例的蛋白翻译开始于上游。除了 VP3cds外，所得到的小部分蛋白包含对应于编码VP2而不是VP3的序列的3’部分的几个Aas的N-末端延伸。综合来看，这些VP3的5’延伸形式的表达在蛋白免疫印迹(实施例4)中是可见的，但是仅占结构蛋白的1/50，优选占细小病毒颗粒结构蛋白的1/100，更优选1/250，并且基本上仅1/500。在本发明的另一个优选的实施方案中，仅/最多1/50的表达的结构蛋白，优选最多1/100，更优选最多1/250，并且基本上仅/最多1/500的结构蛋白是本发明的多肽，即 AAP或其变体。然而没有在宿主细胞上显示出对AAP的特定影响，可能对细小病毒载体或颗粒的医药应用有影响，原则上有尽可能少的杂质是有益的。病毒R印蛋白与基因组和病毒DNA相结合，并且被认为在DNA包装中发挥作用。为了将AAV作为疫苗使用，并且避免对抗包装的DNA的非特异性反应或不期望的基因转移，细小病毒颗粒尽可能不含DNA是特别优选的。因此，细小病毒颗粒于不存在Rep蛋白表达时在细胞中产生。由此，在本发明的另一个优选实施方案中，仅1/100的颗粒，优选1/1，000，并且更优选仅1/10，000的颗粒包含DNA。特别优选的是，没有细小病毒颗粒包含DNA。优选最多1/100，更优选仅/最多1/1，000，甚至更优选仅/最多1/10，000的颗粒包含任何DNA。 结果，在实现接种疫苗目的之前，破坏包装的DNA的失活步骤(如Y -辐射或UV-辐射)不是必须的。根据本发明，细小病毒优选选自腺相关病毒(AAV)、牛AAV (b-AAV)、犬AAV (CAAV) 和禽 AAV (AAAV)。特别优选的 AAV 选自AAV-1、AAV-2、AAV_3b、AAV-4、AAV-5、AAV-6、AAV-7、AAV-8、 AAV-9、AAV-10、AAV-11、AAV-12 和 AAV13，特别是 AAV-2。AAVl 至 AAV12 指明了限定的腺相关病毒(AAV)血清型。如在此更详细地描述的，特别优选的是，VP3cds进一步包括至少一种突变。所述突变是与各自的野生型细小病毒序列相比较，优选选自一种或多种缺失、一种或多种插入， 一种或多种替代以及这些突变的组合。在本发明的实施方案中，VP3cds包括一种或多种沉默突变。通过引入不引起VP3 蛋白的AA序列改变的DNA突变，最优化VP3cds的密码子使用是可能的，如增强它的表达。 由于基因密码子的简并性，一种AA可以由多于一种的密码子确定，例如AA谷氨酸由密码子 GAA和GAG确定。因此，对于结构蛋白VP3的各种AA，可以分别选择以更高效率被翻译和突变cds的那些密码子。如已论述的，这些突变不改变蛋白的AA序列，这是为什么它们被称为沉默的，但是这些突变当然改变了包括由片段Z/本发明的核酸编码的扩散性分子的核苷酸序列。由于这个原因，本发明特别优选的实施方案是，仅部分VP3cds由插入或使用密码子最优化来修饰，例如以得到在选择条件下VP3的更高表达，该选择条件是指与片段Z的序列不重叠，或如以上文任何部分所描述的，以反式形式处在VP3cds内。在优选的实施方案中，VP3cds的一种或多种突变导致位于VP3VLP表面的一种或多种突变。结构蛋白的表面定位区域可以通过分析晶体结构来确定，这对于AAV2是已知的 (Xie等，2002)。如果所选择血清型的晶体结构还不可用，所选择的VP3序列可以与具有已知晶体结构的至少一种不同血清型的VP3序列进行比对，以鉴别感兴趣的同源区域。比对可以使用可商购的软件，例如Multialign(Corpet，1988)和其所描述的标准参数进行。在进一步优选的实施方案中，VP3cds的一种或多种突变导致位于VP3的N-末端的一种或多种突变。优选地，N-末端被定义为各自VP3的N-末端10个氨基酸，优选N-末端5个氨基酸，特别是N-末端2个氨基酸。特别优选的是位于N-或C-末端的插入或者对应于N-或C-末端的直接插入的插入，优选直接在AA 203(1-203)的C-末端的插入。根据本发明，优选的插入是插入至选自以下位点的一个或多个位点1力61、 1-266、 1-381、 1-447、 1-448、 1-453、 1-459、 1-471、 1-534、 1-570、 1-573、 1-584、 1-587、 1-588、1-591、1-657、1-664、1-713 和 1-716，优选 1-261、1-453、1-534、1-570、1-573 和 1-587，特别是 1-587。所使用的命名1-###涉及插入位点，其中###指定相对于AAV-2的VPl蛋白的AA 编号，然而这意味着插入可以直接位于特定AA的N-或C-末端，优选直接位于特定AA的 5Aas N-或C-末端的序列中一种AA的C-末端，优选特定AA的N-或C-末端的3种AA， 更优选2种AA，特别是1种AA。对于除了 AAV-2之外的细小病毒，如果可用的话，相应的插入位点可以通过进行AA比对或通过比较衣壳结构来鉴别。这种比对在细小病毒AAV-1、 AAV-2、AAV-3b、AAV-4、AAV-5、AAV-6、AAV-7、AAV-8、AAV-10、AAV-11、b-AAV、GPV、B19、MVM、 FPV 禾口 CPV(W0 2008/145400 的图 3)中进行。其后引入插入并且指定位置的AA位点被加上下划线。同样地，能够将插入引入至紧邻下划线AA的5个直接邻近的Aas，因为这些同样位于AAV2衣壳中的环(loop)内。例如，插入位点1-587对应于以下突出标示的Aas中的一种之前和/或之后的插入AAVl 的 FQSSS TDPAT,AAV2 的 IjQRGMmzRQAAT，AAV-3b 的 LQSSM TAPTT，AAV-6 的 LQSS运 TDPAT，AAV-7 的 LQAAM TAAQT，AAV-8 的 LQQQM TAPQIAAVlO 的 IjQQAM TGPIV,AAVll 的 NQNAI TAPIT 禾口AAV-5 的 NQSSI TAPAT。进一步地，插入位点1-453对应于以下各10个Aas的N-或C-末端的直接插入， 优选突出标示的AA的C-末端的直接插入AAV-I 的 QNQSe SAQNK,AAV-2 的 NTPSG453TTTQS，AAV-3b 的 GTTS辽 TTNQS，AAV-6 的 QNQS^ SAQNK,AAV-7 的 SNPGG TAGNR,AAV-8 的 QTTGG TANTQ,AAV-10 的 QSTGG TQGTQ,AAV-Il 的 SGETL NQGNA,以及AAV-5 的 FVSTM NTGGV。涉及AAV2序列，AAV和本发明包括的其它细小病毒的插入位点列于表1。
表1 用于细小病毒的插入位点
权利要求
1.一种核酸，所述核酸编码包括选自以下序列的氨基酸序列的多肽SEQ ID NO=USEQ ID NO :2、SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :5、SEQ ID NO :6、SEQ ID NO :7、SEQ ID NO 8, SEQ ID N0:9、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO :14, SEQ ID NO :15、SEQ ID NO :16、SEQ ID NO :17、SEQ ID NO :18、SEQ ID NO :19、SEQ ID NO :20,SEQ ID NO :21和SEQ ID NO :22，或者编码包括这些氨基酸序列中的任何一种的功能活性变体的多肽，其中所述功能活性变体(i)具有与SEQID NO :1至22的氨基酸序列中任何一种至少60%相同的氨基酸序列， 和/或(ii)由cDNA编码，所述cDNA和选自以下序列的核酸序列SEQID NO :23、SEQ ID NO: 24、SEQ ID NO :25、SEQ ID NO :26、SEQ ID NO :27、SEQ ID NO :28、SEQ ID NO :29、SEQ ID NO :30, SEQ ID NO :31、SEQ ID NO :32、SEQ ID NO :33、SEQ ID NO :34、SEQ ID NO :35、SEQ ID NO :36, SEQ ID NO :37、SEQ ID NO :38、SEQ ID NO :39、SEQ ID NO :40、SEQ ID NO :41、 SEQ ID NO :42,SEQ ID NO :43 禾口 SEQ ID NO :44，或者和与 SEQ ID NO :23 至 44 的核酸序列中任何一种互补的核酸序列，在6x SSC,5x Denhardt，s溶液、0. 5% SDS中，于40°C下杂交 2至12小时；和/或(iii)由细小病毒基因组的一部分编码，所述细小病毒基因组的一部分包括未在编码 VPU VP2和VP3的框内的开放阅读框(ORF)，且包括多于378个的VP30RF核苷酸，其中所述核酸不能表达任何一种功能蛋白，尤其是不能表达R印40、R印52、R印68、 R印78、VP1、VP2 和 VP3。
2.根据权利要求1所述的核酸，其特征在于，所述核酸编码包括SEQID NO=USEQ ID NO 2的氨基酸序列，或者SEQ ID NO 5的氨基酸序列的多肽。
3.根据权利要求1或2中任一项所述的核酸，其中所述功能活性变体具有的氨基酸序列与 SEQ ID NO :1、SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :5、SEQ ID NO 6、SEQ ID NO :7、SEQ ID NO :8、SEQ ID NO :9、SEQ ID NO :10、SEQ ID NO :11、SEQ ID NO 12、SEQ ID NO :13、SEQ ID NO :14、SEQ ID NO :15、SEQ ID NO :16、SEQ ID NO :17、SEQ ID NO 18, SEQ ID NO 19, SEQ ID NO 20, SEQ ID NO :21 禾口 SEQ ID NO :22 的氨基酸序列中任何一种至少65 %，更优选至少70 %，更优选至少75 %，更优选至少80 %，更优选至少85 %， 更优选至少90%，更优选至少95%，最优选至少99%和特别是100%相同。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的核酸，其中所述功能活性变体由cDNA编码，所述 cDNA 和与 SEQ ID NO 23、SEQ ID NO 24、SEQ ID NO 25、SEQ ID NO 26、SEQ ID NO :27、 SEQ ID NO 28, SEQ ID NO 29, SEQ ID NO 30, SEQ ID N0:31、SEQ ID NO 32, SEQ ID N0: 33、SEQ ID NO :34、SEQ ID NO :35、SEQ ID NO :36、SEQ ID NO :37、SEQ ID NO :38、SEQ ID NO 39,SEQ ID NO 40、SEQ ID NO :41、SEQ ID NO :42、SEQ ID NO :43 禾口 SEQ ID NO :44 的核酸序列中任何一种互补的核酸序列在6x SSC、5x Denhardt，s溶液、0. 5% SDS中，于45°C， 更优选50 V，更优选55°C，更优选60°C，尤其是65°C并且有利的68°C下杂交。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的核酸，其中所述功能活性变体由cDNA编码，所述cDNA和SEQ ID NO :23的核酸序列，或者和与SEQ ID NO :23的核酸序列互补的核酸序列，在 6x SSC、5x Denhardt' s 溶液、0.5% SDS 中杂交。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的核酸，其特征在于，所述核酸包括多于378个的VP30RF的核苷酸，优选至少400个VP30RF的核苷酸，更优选至少425个VP30RF的核苷酸， 特别是至少445个VP30RF的核苷酸。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的核酸，其特征在于，所述核酸包括直接位于VP3 起始密码子5’端上游的邻近VP2-编码核苷酸的至少44个核苷酸，优选至少20个核苷酸， 更优选至少5个核苷酸，或者其特征在于，所述核酸的起始密码子为位于VP3起始密码子下游4个核苷酸，优选M个核苷酸并且更优选44个核苷酸处的ATG。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的核酸，其特征在于，所述核酸能够表达启动VP3 衣壳组装的蛋白。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的核酸，其特征在于，所述核酸源自AAV2，并且所述核酸的翻译起始密码子为C2729TG、A2735CG、A2717TT或T272tlTG,或者所述核酸源自另一种细小病毒，并且所述核酸的翻译起始密码子位于AAV2的翻译起始密码子的同源位点。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的核酸，所述核酸包括产生ATG起始密码子的突变从而能够改进开放阅读框的翻译，优选地，其中所述AAV2的翻译起始密码子或其他细小病毒的同源位点中的一个被突变成ATG起始密码子。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的核酸，其特征在于，所述核酸的多肽编码序列之后为Poly(A)信号。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的核酸，其特征在于，所述核酸包括驱动多肽-编码序列转录的启动子，优选异源启动子，特别是诱导型异源启动子。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的核酸，其特征在于，所述核酸源自腺相关病毒 (AAV)、鹅细小病毒、鸭细小病毒和蛇细小病毒。
14.根据权利要求13所述的核酸，其特征在于，所述AAV选自牛AAV(b-AAV)、犬 AAV(CAAV)、小鼠 AAV1、山羊 AAV、大鼠 AAV、禽 AAV(AAAV), AAVU AAV2、AAV3b、AAV4、AAV5、 AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12 和 AAV13，特别是 AAV2。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的核酸，所述核酸包括于表达盒、构建体、载体或细胞系中。
16.一种由权利要求1至14中任一项所述的核酸编码的多肽。
17.根据权利要求16所述的多肽，其中所述多肽为组装活化蛋白(ΑΑΡ)。
18.—种生产根据权利要求16或17所述的多肽的方法，所述方法包括在宿主细胞中表达根据权利要求1至14中任一项所述的核酸。
19.根据权利要求18所述的方法，其特征在于，所述宿主细胞选自哺乳动物细胞系、特别是人细胞系，用于杆状病毒感染的细胞系，细菌菌株和酵母菌株。
20.一种特异性结合根据权利要求17所述的多肽的抗体。
21.根据权利要求20所述的抗体，其特征在于，所述抗体特异性结合AAV2的AAP(SEQ ID NO. 1)。
22.根据权利要求1至14中任一项所述的核酸在制备如权利要求16或17中任一项所述的多肽中的应用。
23.根据权利要求1至14中任一项所述的核酸或者根据权利要求16或17中任一项所述的多肽在制备细小病毒颗粒中的应用。
24.如权利要求23所述的核酸或多肽在制备不包括功能蛋白VP1、VP2和R印，特别是R印40、R印52、Rep68和R印78中任何一种的细小病毒颗粒中的应用。
25.—种生产基本上由VP3组成的细小病毒颗粒的方法，所述方法包括以下步骤i.提供能够由细小病毒的VP3-编码序列(cds)表达VP3的细胞，其中所述VP3在 rep-非依赖性启动子控制下，并且表达根据权利要求1至14中任一项所述的核酸编码的蛋白， 在有利于VP3表达和由根据权利要求1至14中任一项所述的核酸的表达蛋白的条件下孵育细胞，从而生产细小病毒颗粒，以及 iii.任选地从细胞中纯化细小病毒颗粒， 其中每个细胞形成至少IO5个病毒颗粒，并且没有功能性VP1、VP2和R印，尤其是R印40、R印52、R印68和R印78蛋白表达。
26.根据权利要求25所述的方法，其中所述每个细胞形成至少IO6个，并且优选至少 IO7个病毒颗粒。
27.根据权利要求25或沈中任一项所述的方法，其中所述功能蛋白VP1、VP2和R印， 尤其是R印40、R印52、R印68和R印78在细胞中的蛋白表达被关闭。
28.根据权利要求25至27中任一项所述的方法，其中提供的根据权利要求1至14中任一项所述的核酸相对于VP3cds为顺式。
29.根据权利要求25至观中任一项所述的方法，其中提供的根据权利要求1至14中任一项所述的核酸相对于VP3cds为反式。
30.根据权利要求25至四中任一项所述的方法，其中所述细小病毒颗粒不包含功能性 R印蛋白，尤其是R印40、Itep52、Rep68和R印78中的任何一种。
31.根据权利要求25至30中任一项所述的方法，其中最多1/50的表达的结构蛋白，优选最多1/100，更优选最多1/250，最优选最多1/500的表达的结构蛋白是根据权利要求16 所述的多肽，并且特别是没有结构蛋白是根据权利要求16所述的多肽。
32.根据权利要求25至31中任一项所述的方法，其中最多1/100的颗粒，优选最多 1/1，000的颗粒，更优选最多1/10，000的颗粒包含DNA，并且特别是没有颗粒包含DNA。
33.根据权利要求25至32中任一项所述的方法，其中所述VP3cds包括一种或多种突变。
34.根据权利要求33所述的方法，其中所述VP3cds的突变是选自以下突变的突变一种或多种缺失，一种或多种插入，一种或多种替换，以及它们的组合。
35.根据权利要求33或34中任一项所述的方法，其中所述VP3cds包括一种或多种沉默突变。
36.根据权利要求33至35中任一项所述的方法，其中所述VP3cds的一种或多种突变导致位于VP3VLP表面上的一种或多种突变。
37.根据权利要求33至36中任一项所述的方法，其中所述VP3cds的一种或多种突变导致位于VP3的N-末端的一种或多种突变。
38.根据权利要求33至37中任一项所述的方法，其中所述VP3cds的一种或多种突变导致一种或多种在选自以下位点的一个或多个位点的插入1_261、1-266, 1-381、1-447、 1-448、 1-453、 1-459、 1-471、 1-534、 1-570、 1-573、 1-584、 1-587、 1-588、 1-591、 1-657、 1-664、1-713 和 1-716，优选 1-261、1-453、1-534、1-570、1-573 和 1-587，特别是 1-587。
39.根据权利要求38所述的方法，其中所述两种插入是插入选自以下位点的两个位点:1-261, 1-453、1-534、1-570、1-573 和 1-587，优选 1-261 与 1-587 的组合，1-261 与 1-453的组合，或者1-453与1-587的组合。
40.根据权利要求38所述的方法，其中所述突变在VP3的三个位点进行，优选在位点 453插入和在位点587插入的组合与其他突变的组合。
41.根据权利要求33至40中任一项所述的方法，其中所述VP3包括至少一种与病毒异源的表位。
42.根据权利要求41所述的方法，其中所述VP3蛋白的表位为B-细胞表位。
43.根据权利要求41或42中任一项所述的方法，其中所述B-细胞表位被插入至1-453 和/或1-587，特别是插入至AAV1、AAV2或AAV4的1-453和/或1-587。
44.根据权利要求25至43中任一项所述的方法，其中所述VP3被包括于融合蛋白中。
45.根据权利要求25至44中任一项所述的方法，其中所述VP3包括至少一种用于与配体结合的标签。
46.根据权利要求33至45中任一项所述的方法，其中所述VP3包括至少一种另外的突变。
47.根据权利要求25至46所述的方法可获得的细小病毒颗粒。
48.一种基本上由VP3组成的细小病毒颗粒，i.其中所述VP3任选地包括一种或多种突变，和 其中所述VP3不包含异源的核定位信号，并且iii.其中所述颗粒不包含功能性R印蛋白，尤其是R印40、R印52、R印68和R印78中的任何一种。
49.根据权利要求47或48中任一项所述的细小病毒颗粒，其中所述衣壳仅由VP3组成。
50.根据权利要求47至49中任一项所述的细小病毒颗粒，其中所述VP3的突变是如权利要求33至46中任一项所述的突变。
51.一种VP3表达盒A，所述VP3表达盒A包括异源启动子和如权利要求25至46所述的VP3cds，其中所述VP3的转录由异源启动子驱动，并且其中所述表达盒能够基本上仅表达 VP3。
52.一种组合型表达盒，所述表达盒包括异源启动子、如权利要求25至46所述的 VP3cds和如权利要求1至14所述的核酸，其中所述VP3的表达和如权利要求16至17中任一项所述的多肽的表达由所述一种异源启动子驱动。
53.一种试剂盒，所述试剂盒包括至少一种根据权利要求51所述的VP3表达盒和至少一种包括于根据权利要求15所述的表达盒中的核酸。
54.一种试剂盒，所述试剂盒包括至少一种根据权利要求52所述的组合型表达盒和手ππ册。
55.一种用作药物的根据权利要求47至50中任一项所述的细小病毒颗粒。
56.根据权利要求55所述的细小病毒颗粒，其中所述药物还包括一种或多种赋形剂。
57.根据权利要求55或56中任一项所述的细小病毒颗粒，其中所述药物为疫苗。
58.根据权利要求57所述的细小病毒颗粒，其中所述疫苗还包括一种或多种佐剂。
59.根据权利要求55至58中任一项所述的细小病毒颗粒，其用于预防或治疗自体免疫性疾病、传染性疾病、肿瘤、过敏性疾病、代谢性疾病、(慢性)炎性疾病、神经性疾病、成瘾或者被用于眼科。
60.根据权利要求59所述的细小病毒颗粒，其中所述自体免疫性疾病和/或慢性炎性疾病选自类风湿性关节炎、银屑病和克罗恩病。
61.根据权利要求59所述的细小病毒颗粒，其中所述肿瘤适合用单克隆抗体治疗。
62.根据权利要求59所述的细小病毒颗粒，其中所述过敏性疾病选自哮喘、过敏和过敏性鼻炎。
63.根据权利要求59所述的细小病毒颗粒，其中所述神经性疾病为阿尔茨海默病。
64.根据权利要求59所述的细小病毒颗粒，其中所述代谢性疾病为动脉硬化症。
65.根据权利要求59所述的细小病毒颗粒，其中所述眼科疾病为与年龄相关的黄斑变性。
66.根据权利要求55至65中任一项所述的细小病毒颗粒，其用于阻断B-细胞耐受的方法中。
67.根据权利要求55至66中任一项所述的细小病毒颗粒，其中所述细小病毒突变的结构蛋白在基因治疗中不作为载体使用。
68.如权利要求55至56和59至66中任一项所述的细小病毒颗粒在基因治疗中的应用。
69.一种生产基本上由VP3组成的细小病毒颗粒的方法，所述方法包括以下步骤i.在r印-非依赖性启动子的控制下，于细胞中由细小病毒的VP3编码序列(cds)表达VP3, 在r印-非依赖性启动子控制下，于细胞中表达DNA序列片段(片段Z)，所述DNA序列片段包括(1)VP3起始密码子上游至少44个核苷酸，和(2)从起始密码子开始的多于242个的VP3cds核苷酸，其源自a)细小病毒，或者b)与源自AAV2(图2)的片段Z的核苷酸序列至少60%，优选80%，更优选90%，特别是99 %，并且有利的是100 %相同的核苷酸序列，或者c)与AAV2的片段ZDNA分子的互补链在虹SSC、0. 1% SDS中于65°C下杂交的核酸序列，或者d)可以用于反式互补实验以引起VP3VLP组装的核酸序列，iii.于适合VP3表达的条件下孵育细胞，以及iv.从细胞中纯化细小病毒颗粒，其中每个细胞形成大约IO5个，优选大约IO6个，并且更优选大约IO7个病毒颗粒， 并且基本上没有VP1、VP2和R印，尤其是R印40、R印52、R印68和R印78蛋白表达。
70.根据权利要求69所述的方法，其中所述片段Z的序列与VP3cds不重叠，致使细小病毒颗粒仅由VP3组成。
71.根据权利要求69或70中任一项所述的方法，其中所述VP1、VP2和R印，尤其是 R印40、R印52、R印68和Rep78的蛋白表达被关闭。
72.根据权利要求69至71中任一项所述的方法，其中所述片段Z的DNA序列之后为 poly(A)信号。
73.根据权利要求69至72中任一项所述的方法，其中所述片段Z包括VP3起始密码子上游至少44个核苷酸，优选113个核苷酸，并且更优选198个核苷酸。
74.根据权利要求69至73中任一项所述的方法，其中所述片段Z包括从起始密码子开始的VP3cds的多于242个核苷酸，优选多于大约275个核苷酸，多于大约300个核苷酸，多于大约325个核苷酸，多于大约350个核苷酸，多于大约375个核苷酸，多于大约400个核苷酸，多于大约425个核苷酸，并且最优选多于大约445个核苷酸。
75.根据权利要求69至74中任一项所述的方法，其中所述片段Z包括至少一种突变。
76.根据权利要求75所述的方法，其中所述片段Z的突变包括至少一种用于蛋白翻译的终止密码子。
77.根据权利要求69至76中任一项所述的方法，其中提供的所述片段Z相对于VP3cds 为顺式。
78.根据权利要求69至77中任一项所述的方法，其中提供的所述片段Z相对于VP3cds 为反式。
79.根据权利要求69至78中任一项所述的方法，其中所述细小病毒颗粒不包含Rep蛋白。
80.根据权利要求69至79中任一项所述的方法，其中仅1/50的表达的结构蛋白，优选1/100，更优选1/250，最优选1/500的结构蛋白是VP3的N-末端延伸形式，并且特别是没有结构蛋白是VP3的N-末端延伸形式。
81.根据权利要求69至80中任一项所述的方法，其中仅1/100的颗粒，优选1/1000的颗粒，更优选仅1/10000的颗粒包含病毒DNA，并且特别是没有颗粒包含任何一种病毒DNA。
82.根据权利要求69至81中任一项所述的方法，其中所述细小病毒选自腺相关病毒 (AAV)、牛 AAV (b-AAV)、犬 AAV (CAAV)和禽 AAV (AAAV)。
83.根据权利要求82所述的方法，其中所述AAV选自AAV-1、AAV-2、AAV_3b、AAV-4、 AAV-5、AAV-6、AAV-7、AAV-8、AAV-9、AAV-10、AAV-Il 和 AAV-12，特别是 AAV-2。
84.根据权利要求69至83中任一项所述的方法，其中所述VP3cds还包括一种或多种突变。
85.根据权利要求84所述的方法，其中所述VP3cds的突变是选自以下突变的突变一种或多种缺失、一种或多种插入、一种或多种替换，以及这些突变的组合。
86.根据权利要求84或85中任一项所述的方法，其中所述VP3cds包括一种或多种沉默突变。
87.根据权利要求84至86中任一项所述的方法，其中所述VP3cds的一种或多种突变导致位于VP3VLP表面上的一种或多种突变。
88.根据权利要求84至87中任一项所述的方法，其中所述VP3cds的一种或多种突变导致位于VP3N-末端的一种或多种突变。
89.根据权利要求84至88中任一项所述的方法，其中所述VP3cds的一种或多种突变导致一种或多种在选自以下位点的一个或多个位点的插入1_261、1-266, 1-381、1-447、 1-448、 1-453、 1-459、 1-471、 1-534、 1-570、 1-573、 1-584、 1-587、 1-588、 1-591、 1-657、1-664、1-713 和 1-716，优选 1-261、1-453、1-534、1-570、1-573 和 1-587，特别是 1-587。
90.根据权利要求89所述的方法，其中所述两种插入在选自以下位点的两个位点进行:1-261, 1-453、1-534、1-570、1-573 和 1-587，优选 1-261 与 1-587 的组合，1-261 与 1-453的组合，或1-453与1-587的组合。
91.根据权利要求84至89中任一项所述的方法，其中所述VP3包括至少一种与病毒异源的表位。
92.根据权利要求91所述的方法，其中所述VP3蛋白的表位为B-细胞表位。
93.根据权利要求91或92中任一项所述的方法，其中所述B-细胞表位被插入至1-453 和 / 或 1-587，特别是至 AAV-U AAV-2 或 AAV-4 的 1-453 和 / 或 1-587。
94.根据权利要求85至93中任一项所述的方法，其中所述VP3被融合至第二蛋白或多肽。
95.根据权利要求85至94中任一项所述的方法，其中所述VP3包括至少一种用于与配体结合的标签。
96.根据权利要求85至95中任一项所述的方法，其中所述VP3包括至少一种另外的突变。
97.根据权利要求69至96所述的方法可获得的细小病毒颗粒。
98.基本上由VP3组成的细小病毒颗粒， i.其中所述VP3包括一种或多种突变，和ii其中所述VP3不包含异源的核定位信号(NLS)，和 iii.其中所述颗粒不包含R印蛋白。
99.根据权利要求97或98所述的细小病毒颗粒，其中所述衣壳仅由VP3组成。
100.根据权利要求97至99中任一项所述的细小病毒颗粒，其中所述VP3的突变是如权利要求85至96中任一项所述的突变。
101.表达盒A，所述表达盒A包括异源启动子和根据权利要求69和84至96所述的 VP3cds，其中所述VP3的转录由异源启动子驱动，并且其中所述表达盒基本上仅表达VP3， 特别优选的是所述表达盒仅表达VP3的表达盒。
102.表达盒B，所述表达盒B包括异源启动子和根据权利要求69和73至76所述的片段Z，其中所述片段Z的转录由异源启动子驱动。
103.表达盒C，所述表达盒C包括异源启动子、根据权利要求69和84至96所述的 VP3cds、以及根据权利要求69和73至76所述的片段Z，其中所述VP3和片段Z的表达由所述一种异源启动子驱动。
104.一种试剂盒，所述试剂盒包括至少一种根据权利要求101所述的表达盒A和至少一种根据权利要求102所述的表达盒B。
105.一种试剂盒，所述试剂盒包括至少一种根据权利要求103所述的表达盒C。
106.一种药物，所述药物包括根据权利要求97至100中任一项所述的细小病毒颗粒。
107.根据权利要求106所述的药物，其还包括一种或多种赋形剂。
108.根据权利要求106或107中任一项所述的药物，其中所述药物为疫苗。
109.根据权利要求108所述的疫苗，其还包括一种或多种佐剂。
110.根据权利要求106至109中任一项所述的药物，其用于预防或治疗自体免疫性疾病、肿瘤、过敏性疾病、代谢性疾病、炎性疾病、神经性疾病，或者被用于眼科。
111.根据权利要求106至110中任一项所述的药物，其用于阻断免疫耐受。
112.根据权利要求106至111中任一项所述的药物，其中所述疾病不是传染性疾病。
113.根据权利要求106至112中任一项所述的药物，其中所述细小病毒突变的结构蛋白在基因治疗中不作为载体使用。
114.如权利要求97至100所述的包括至少一种与细小病毒异源的B-细胞表位的细小病毒颗粒在制备疫苗中的应用，其优选用于预防或治疗自体免疫性疾病和/或慢性炎性疾病，优选类风湿性关节炎和/或克罗恩病，肿瘤、过敏性疾病、哮喘、阿尔茨海默病、动脉硬化症、代谢性疾病、炎性疾病、神经性疾病或被用于眼科，尤其是其中所述药物如权利要求 106至113所述。
全文摘要
本发明涉及编码新的细小病毒蛋白“组装活化蛋白”(AAP)的核酸，编码的多肽，生产多肽的方法，AAP特异性抗体，核酸在多肽制备中的应用，核酸或多肽在制备细小病毒颗粒中的应用，以及在细胞中通过提供除细小病毒结构蛋白VP3的编码序列之外的序列片段Z/AAP编码核酸，并且在rep-非依赖性启动子控制下表达VP3和片段Z来生产基本上由VP3组成的细小病毒颗粒的方法。此外，本发明涉及基本上由VP3组成的和/或通过上述方法获得的细小病毒颗粒，以及包括(i)异源启动子和(ii)VP3编码序列和/或片段Z的表达盒。本发明进一步涉及包括细小病毒颗粒或表达盒的药物，尤其是疫苗，以及它们的应用。
文档编号A61K39/23GK102341406SQ201080010540
公开日2012年2月1日 申请日期2010年3月4日 优先权日2009年3月4日
发明者佛罗莱恩·桑塔格, 克斯廷·勒克斯, 尤尔根·克莱舒密特, 马库斯·奥雷 申请人:德国癌症研究中心, 麦迪金股份公司