专利名称：一种用假单胞菌产生生物表面活性剂的方法
技术领域：
本发明涉及一种用假单胞菌产生生物表面活性剂的方法，该生物表面活性剂可以在环境污染治理中广泛使用。
背景技术：
表面活性剂是指具有固定的亲水亲油基团，在溶液的表面能定向排列，使溶液表面张力显著下降的物质。根据来源不同，表面活性剂通常可分为天然表面活性剂、化学合成表面活性剂和生物表面活性剂三大类。其中，化学合成类在表面活性剂的生产和使用中占有较大的比重，该类废水排放至环境中，不仅会影响曝气、沉淀等污水处理过程的效率，还会毒害一些微生物，抑制微生物在污染物表面的吸附，延缓污染物降解，带来的环境压力不容忽视。生物表面活性剂是微生物在代谢过程中分泌的集亲水基和憎水基于一体的两性 化合物。根据组成基团的不同，生物表面活性剂可分为六类(1)糖脂；(2)中性脂/脂肪酸；(3 )含氨基酸类脂；(4 )磷脂；(5 )聚合物；(6 )全细胞表面本身。和传统的化学合成表面活性剂相比，生物表面活性剂除了具有增溶、润湿、发泡、稳定乳化液、降低表面张力等一般特性外，还具有无毒、可生物降解、环境温和、稳定性好等优点，在医药、食品、化工、石油等领域发挥了重要的作用，特别是近年来在环境污染生物治理方面逐渐显示出了其巨大的应用潜力。近年来，研究者相继从油类污染的湖泊、土壤或海洋中分离得到了许多能产生生物表面活性剂的菌株。一些研究也表明，不同种类的微生物能产生具有特定结构的生物表面活性剂。例如，假单胞菌(Pseudomonas sp.)主要产生糖脂类生物表面活性剂(如鼠李糖脂)，革兰氏阳性芽孢杆菌(Bacillus sp.)主要产生脂肽类生物表面活性剂(如环脂肽)等。通常，微生物容易摄取那些易溶于水的物质，而对于一些疏水性的物质(水中溶解度较小)，一些菌株为了增加自身与这些物质的接近程度，能够在其利用疏水性物质的过程中产生类似表面活性剂的物质，增大这些疏水性物质的表观溶解度，从而提高微生物对这些物质的利用程度。《中国环境科学》2011，31(4)，“1株a-菔烯降解菌的分离鉴定及降解特性研究” 一文中公开了一种假单胞菌(Pseudomonas fluorescens) PT,该菌种目前保藏在位于中国武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2008年10月29日，保藏编号为M208182。假单胞菌(Pseudomonas fluorescens) PT是一种常见的短杆菌，能够在降解a -菔烯的过程中产生具有表面活性的物质，降低溶液的表面张力。经检索专利和其他相关文献，未见该菌株利用a-菔烯作为碳源合成生物表面活性剂的报道。该降解菌的发现，对于利用微生物合成法产生生物表面活性剂，实现污染物的资源化具有重要的理论和现实意义
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服现有技术中的不足而提供一种用假单胞菌产生生物表面活性剂的方法，该方法简单易行，稳定性好，所产生的生物表面活性剂无毒、可生物降解、环境温和。本发明解决上述技术问题采用的技术方案是该用假单胞菌产生生物表面活性剂的方法，其特征在于将假单胞菌经培养获得的菌悬液投入到含a-菔烯的污水试样中，菌浓度最终达 36. 5mg L-I ±3. 0，在 K+浓度为 0. 01 0. lg/L，Mn2+浓度为 0. 01 0. lg/L，NH4+浓度为0. 2 0. 8g/L的条件下培养，假单胞菌PT在利用a -菔烯的过程中产生生物表面活性剂，使污水试样的表面张力下降。本发明所述的污水试样中a -菔烯的浓度为300 2000mg/L，生物表面活性剂最大比产生速率为0. 1333mg/(mg cells h)。本发明所述的培养时间为36小时。 本发明所述的污水试样中当K+、Mn2+和NH4+的浓度分别为69. 8mg/L、65. lmg/L和482. 5mg/L时，污水试样表面张力从初始状态的72. OmN/m下降到40. 7mN/m。本发明所述的生物表面活性剂为紫苏酸，属于脂肪酸类物质。将积累有生物表面活性剂的培养液经过8000r/min，离心20min去除菌体，上清液用6mol/L的盐酸调pH值为2. O，等体积的乙酸乙脂萃取2次，合并有机相，40°C减压蒸馏完全(< 5ml)，氮气吹干，得到黄褐色油状产物。经表面薄层层析、红外光谱、液相-质谱和核磁共振等分析，确定该生物表面活性剂为脂肪酸类物质，分子式为CltlH14O2,结合相关代谢途径分析，确定该生物表面活性剂为紫苏酸。该生物表面活性剂对微生物的毒害性、生态毒性均小于化学表面活性剂。将分离纯化得到的上述生物表面活性剂添加至生物滴滤塔的循环液中，当停留时间分别为29、58、72s，疏水性物质a-菔烯进气浓度分别为50 100、100 150、200 350mg/m3时，与不添加表面活性剂的生物滤塔相比，a -菔烯的气液传质率提高了约60%。配制该生物表面活性剂的水溶液，使其浓度达到500mg/L，菲、萘、芘在水中的溶解度分别为I. 201,33. 18和0. 121mg/L，与未添加生物表面活性剂的水溶液相比，溶解度分别提高了2. 65%、6. 07%、10. 0%。本发明与现有技术相比具有以下优点本发明所述的假单胞菌PT取自废水处理单元，能以a-菔烯为唯一碳源生长，并能在代谢a-菔烯的过程中合成生物表面活性剂，降低培养液的表面张力；同时，从培养液中分离得到的生物表面活性剂能强化疏水性有机物的气液传质过程，增加菲、萘、芘等多环芳香烃在水溶液中的溶解度，可广泛用于环境污染治理。与其他化学法合成的表面活性剂相比，利用假单胞菌PT生产表面活性剂，其原料简单、过程简便、费用低，且不产生任何污染，合成的生物表面活性剂低毒高效、对环境无害。
图I为假单胞菌在降解不同浓度的a -菔烯过程中，培养液表面张力随时间变化曲线图。图2为假单胞菌在降解不同浓度的a -菔烯过程中，培养液生物量随时间变化曲线图。图3为本发明所述的生物表面活性剂生态毒性试验图。
图4为本发明所述的生物表面活性剂对疏水性VOCs传质强化效果曲线图。图5为本发明所述的生物表面活性剂对菲增溶效果曲线图。图6为本发明所述的生物表面活性剂对芘增溶效果曲线图。图7为本发明所述的生物表面活性剂对萘增溶效果曲线图。本发明所述的假单胞菌分类命名为突光假单胞菌PT (Pseudomonas fluorescensPT)，该菌种目前保藏在位于中国武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2008年10月29日，保藏编号为CCTCC N0:M208182。
具体实施例方式参见图I 图7,本发明所述的菌株属于假单胞菌属(Pseudomonas sp.),命名为PT，菌株16S rDNA的GenBank登陆号为FJ169494。该菌株的特征为菌落呈透明状，边缘整齐，光滑湿润。透射电镜下观察该菌体的形态为短杆菌，没有鞭毛，成对聚集，革兰氏染色阴性，氧化酶试验、过氧化氢酶试验、吲哚试验、甲基红试验等均为阳性，淀粉水解酶试验阴性；菌株PT能利用葡萄糖，但不能利用乳糖。本发明通过以下几个方面对假单胞菌PT在代谢a -菔烯的过程中合成生物表面活性剂进行了研究。一、响应面优化菌株Pseudomonas fluorescens PT利用a-菔烯产生生物表面活性剂的环境因子。I.响应面试验设计及菌株产生物表面活性剂产率预测模型的获得考察了培养液中K+、Mn2+和NH4+浓度等3个因素对菌株利用a _菔烯的程度及生物表面活性剂产生量的影响，利用SAS system软件对试验获得的溶液表面张力进行模型拟合，从而获得能够预测菌株Pseudomonas fluorescens PT在不同培养条件下利用a-菔烯产生生物表面活性剂,使培养液表面张力下降值。具体实施步骤如下分别以NH4+ 0. 5g/L (X1, Code=O)、K+0. 055gL (X2, Code=O)和 Mn2+O. 055g/L (X3,Code=O)为中心值，利用SAS system软件进行三因素三水平试验设计(表I)。按表I配制无机盐培养基，分装于250mL盐水瓶中，装液量为50mL/个，110°C灭菌40min。待培养液冷却后，每个盐水瓶中加入处于对数生长期的PT菌悬液，使初始生物量达到36. 54mg/L。以a -菔烯为唯一碳源，初始浓度为300mg/L，密封后置于摇床振荡培养。另取装有相同培养液的盐水瓶，灭菌后加入a -菔烯但不加入PT菌悬液，置于相同的条件下培养，作为空白对照。培养30h后，分析培养液的表面张力，同时测定生物量。根据测得的降解速率，利用SASsystem软件对其进行二次多元回归，拟合得到的预测模型为1/Y=0. 031415-0. 001309X^0.000367X2+0. 001223Xs+0. 002815X1*X1-0. 002431X4 2~0- 000045X1X3+0. 000426X2X2_0. 004124X2X3+0. 002405X3X3式中，Y为培养液表面张力的下降值(72. 7-培养液的表面张力)(mN/m)，X1, X2, X3分别为NH4+、K+和Mn2+浓度的Code值。多元回归方程的相关系数R2=O. 9744，说明该预测模型所预测的培养液表面张力的下降值与实际表面张力的下降值具有很好的相关性(表1)，可用于预测不同培养条件下菌株利用a-菔烯产生表面活性剂使溶液表面张力下降值。表I不同培养条件下培养液表面张力实测值与预测值实验因素水平*实测值预测值
编1;}XiX2Aj[mN/m][mN/m]
1-1-1030.330.1
2-11026.025.8
31-1028.028.2
4II031.831.9
50-1-133.035.0
60-1125.125.5
701-127.126.6
801130.831.5
9-10-126.627.2
10I0-128.929.3
11-I0I25.825.5
12I0I28.127.4
1300031.631.8
1400032.131.8
15000)18)18* =X1 为 NH:，Code 值 0 时为 0. 5gL, -I 时为 0. 2，+1 时为 0. 8g/L ；X2 为 K+，，Code 值 0 时为 0. 055g/L, -I 时为 0. 01，+1 时为 0. lg/L ；X3 为 Mn2+，Code 值 0 时为 0. 055g/L, -I 时为 0. 01，+1 时为 0. lg/L。2.菌株Pseudomonas fluorescens PT利用a -菔烯产生物表面活性剂的最佳环
境因子利用SAS system软件对获得的预测模型进行分析，令其一阶偏导数为零，获得菌株Pseudomonas fluorescens PT利用a -菔烯产生物表面活性剂的最佳环境因子，当NH4+、K+和Mn2+浓度分别为482. 5mg/L、69. 8mgL和65. lmg/L时，此时模型所预测的溶液表面张力下降至40. 7mN/m(72. 7_32)。菌株在上述培养条件下能使溶液表面张力下降至40. 63mN/m(72. 7-32. 07)，与预测值较为接近。具体实施步骤如下取200mL (pH7. 2)无机盐培养液，加入NH4+、K+和Mn2+，使其浓度分别达到480mg/L、70mg/L和65mg/L，分装至4个250mL的盐水瓶中，110°C灭菌40min。待培养液冷却后，取其中三瓶加入处于生长对数期的PT菌悬液，使初始细胞量达到35mg/L，以a -菔烯为唯一碳源，初始浓度为300mg/L。另取一瓶只加入a-菔烯而不加入菌悬液作为空白对照。上述4瓶盐水瓶置于30°C摇床中振荡培养，30h后，分析检测培养液的表面张力，同时测定培养液中的生物量。
在此培养基组成下，Pseudomonasfluorescens PT利用a-菔烯产生生物表面活性剂，能使培养液的表面张力下降至40. 5、40. 8和40. 6mN/m,培养液平均表面张力为40. 63mN/m，接近于模型预测值，表明此培养基组成为菌株PT利用a _菔烯产生生物表面活性剂的最佳组成。二、Pseudomonas fluorescens PT代谢不同浓度a -菔烯产生生物表面活性剂。在最佳培养基组成(NH4+480mgL、K+70mgL和Mn2+65mgL)下，考察了菌株PT对初始浓度300 2000mg/L a -菔烯的代谢及生物表面活性剂合成情况。结果表明，菌株PT均能利用300 2000mg/L a -菔烯产生表面活性剂，且当初始a -菔烯浓度为500mg/L时，菌株PT合成生物表面活性剂的能力最强，生长19h后就能使溶液的表面张力下降至31. 6mN/m，而此时在初始a -菔烯浓度为2000mg/L的培养液中，表面张力为45. 9mN/m。具体实施步骤如下配制pH为7. 2的无机盐培养液，加入NH4+、K+和Mn2+，使其浓度分别达到480mg/ L、70mgL和65mg/L，分装于250mL的盐水瓶中，每瓶50mL，110°C灭菌40min。待培养液冷却后，取其中6瓶加入处于对数生长期的LX-I菌悬液，使初始生物量达到36. 54mg/L,同时加A a -菔烯作为唯一碳源，使其浓度达到300、500、800、1000、1500和2000mg/L ;其余6瓶只加入相同量的a-菔烯而不加入PT菌悬液作为空白对照。盐水瓶密封后30°C振荡培养，定时测定培养液表面张力及生物量，绘制菌株PT代谢不同初始浓度a -菔烯，溶液表面张力变化曲线，同时计算相应的比产生速率。结果如图I和图2所示。菌株PT均能代谢初始浓度300 2000mgL的a -菔烯，并且在这范围内随着浓度的增加，菌株生长出现了较为明显的滞后期，溶液表面张力也因此呈现出不同的变化趋势。当初始a -菔烯浓度较低时(300 800mg/L)，菌株PT生长较快，且代谢生成生物表面活性剂的速率也较快，特别是当初始浓度为500mg/L时，培养19h后溶液的表面张力就下降到最低值(31. 6mN/m)，表明菌株PT在此浓度下代谢a -菔烯合成生物表面活性剂的能力较强。当a-菔烯初始浓度超过800mg/L，菌株生长明显出现了滞后期，表明菌株对于高浓度的a-菔烯，其生长需要一定的适应期。从图I和图2还可以看出，当初始浓度较高时，菌株PT合成生物表面活性剂的能力有限，可能是由于高浓度的a -菔烯对菌株产生了一定的毒害作用。当a-菔烯浓度为2000mg/L时，培养19h后溶液的表面张力仅下降至45. 9mN/m,62h后下降至最低值36. 3mN/m,高于低浓度的a-菔烯。对积累有生物表面活性剂的培养液进行离心、溶剂萃取、减压蒸馏等操作，分离生物表面活性剂粗品。当a -菔烯初始浓度为500mg/L时，IL的培养液中分离纯化能得到生物表面活性剂粗品为585mg，此时细胞生物量浓度为99. 91mg/L，计算得到生物表面活性剂最大比产生速率为 0. 2638mg 表面活性剂 / (mg cells h)。三、Pseudomonas fluorescens PT代谢a -菔烯的培养液中生物表面活性剂的分
离纯化及鉴定。在最佳培养基(NH4+480mg/L、K+70mgL和 Mn2+65mg/L)、初始 a -菔烯浓度为 500mg/L的条件下培养菌株PT，当培养液中生物表面活性剂积累达到一定量后，采用离心、减压蒸馏等处理方法对生物表面活性剂进行分离纯化，并采用薄层色谱、红外光谱、液相-质谱和核磁共振等方法对其进行鉴定。结果表明，所分离得到的生物表面活性剂为脂肪酸类物质，分子式为CltlH14O2,同时结合相关代谢途径分析，确定该生物表面活性剂为a -菔烯的代谢产物一紫苏酸。具体实施步骤如下配制pH 7. 2的无机盐培养液5L，加入NH4+、K+和Mn2+，使其浓度分别达到480mg/L、70mg/L和65mg/L，110°C灭菌40min后装入有效容积为5L的发酵罐中，待冷却后加入处于对数生长期的PT菌悬液，使其初始生物量达到40mg/L，同时加入a -菔烯作为唯一碳源，初始浓度达到500mg/L，定时测定培养液的表面张力和生物量。待表面张力下降至最低值时，取培养液在8000r/min，离心20min去除菌体，上清液用6mol/L的盐酸调pH值为2. 0，等体积的乙酸乙脂萃取2次，合并有机相，40°C减压蒸馏浓缩至5mL，氮气吹干，得到黄褐色油状产物。取纯化的黄褐色油状产物溶于二氯甲烷中，进行薄层色谱实验。KBr压片法制备油状产物的固体片剂，采用傅立叶变换显微红外光谱仪对片剂进行官能团分析，波数精度和分辨率分别优于0. 01/cm和0. 09/cm。采用高效液相色谱/质谱仪对分离得到的产物进行测试，液相色谱柱为C18反相柱(150mmX 46mmX 5 y m)，流动相为乙腈-/K，采用梯度洗脱，梯度洗脱程序如下初始乙腈配比为10%，保持3min，之后25min内乙腈配比由10%线性增大到90%并保持该配比运行5min ;流速为ImL ^irT1,检测波长为长230nm ;质谱条件为喷雾电压4. OKV, SIM扫描电压65V，脱溶温度300°C，柱后流出物导入离子源速率8 u L/min,质谱扫描质量数范围40 1000m/Z。最后采用核磁共振进行进一步分析。将分离得到的生物表面活性剂用适量的氯仿溶液转移到5mm的NMR谱用测试管中，氮气吹干，加入0. 5mL氘代氯仿(⑶Cl3)溶解，进行1H-NMK 13C-NMR等分析。测试条件为操作温度298K，5mm TXI反相三共振探头，1H-NMR测定的谱宽-I 14ppm (9000Hz), 13C-NMR谱测定的谱宽-50 250ppm (9000Hz)，采样时间5. 80min，弛豫时间20s，采样次数16次。结果分析如下。将溶于二氯甲烷的生物表面活性剂进行薄层分析，在显色剂茚三酮、2，7- 二氯荧光黄-三氯化铝-三氯化铁的作用下，薄层板上出现红色斑点，说明提取到的生物表面活性剂属于脂类化合物。红外图谱上，在3098. 5cm^\2962. 3 2928. 2cm^\1689. 7 1644. lcm'1421. I 1200cm_\895. 6 802. Scm'654. 8 550. Icm1 处分别有吸收峰，对照标准图谱，这些吸收锋可能是O-H (N-H)、CH2、C=0、C-H、C=C和C-C环骨架。由于这些振动峰的特征与脂类化合物的较为吻合，推断分离得到的生物表面活性剂可能是脂肪酸类或脂肽类化合物。高效液相色谱/质谱分析表明，对应物质的m/z为167. 1084，分子式为CltlH14O2，进一步推测该生物表面活性剂为脂肪酸类化合物。核磁共振1H-NMR图谱中，6 =7. Oppm为环上C=C键上的氢，S =4. 7和4. 8ppm为C=C烯烃键上的氢，S =1. 9ppm为环上-CH2-的氢，8 =0. 9ppm为端甲基-CH3的氢。13C-NMR图谱中，8 =179. 5ppm为环上C=O键上的碳，8 =151. 3 109. 8ppm为环状结构中的碳基团峰，6 =30. 5ppm和20ppm则分别归属为CH2和CH3，这些化学位移代表的结构式与脂肪酸类化合物的基本吻合。通过薄层色谱、红外光谱、液相色谱/质谱和核磁共振分析，确定该生物表面活性剂为脂肪酸类物质，结构中具有2个不饱和度(C=C和C=0)，特征官能基团为0-H、碳环、CH2和CH3等。结合微生物降解a-菔烯的代谢途径，最终确定该物质为紫苏酸。查阅相关的文献，未见有关其作为表面活性剂的报道。紫苏酸的结构式如下权利要求
1.一种用假单胞菌产生生物表面活性剂的方法，其特征在于将假单胞菌经培养获得的菌悬液投入到含α-菔烯的污水试样中，菌浓度最终达36. 5 mg*L-l±3.0，在K+浓度为O.Ol O. lg/L，Mn2+浓度为O. 01 O. I g/L，NH4.浓度为O. 2 O. 8 g/L的条件下培养，假单胞菌PT在利用a -菔烯的过程中产生生物表面活性剂，使污水试样的表面张力下降。
2.根据权利要求I所述的用假单胞菌产生生物表面活性剂的方法，其特征在于所述的污水试样中a -菔烯的浓度为300 2000 mg/L，生物表面活性剂最大比产生速率为O.1333 mg/(mg cells · h)。
3.根据权利要求I所述的用假单胞菌产生生物表面活性剂的方法，其特征在于所述的培养时间为36小时。
4.根据权利要求3所述的用假单胞菌产生生物表面活性剂的方法，其特征在于当K+、Mn2+和NH4+的浓度分别为69. 8 mg · L'65. I mg · Γ1和482. 5 mg · Γ1时，污水试样表面张 力从初始状态的72. O mN · πΓ1下降到40. 7 mN · πΓ1。
5.根据权利要求I或2所述的用假单胞菌产生生物表面活性剂的方法，其特征在于所述的生物表面活性剂为紫苏酸，属于脂肪酸类物质。
全文摘要
本发明涉及一种用假单胞菌产生生物表面活性剂的方法，其特征在于将假单胞菌经培养获得的菌悬液投入到含α-蒎烯的污水试样中，菌浓度最终达36.5mg·L-1±3.0，在K+浓度为0.01～0.1g/L，Mn2+浓度为0.01～0.1g/L，NH4+浓度为0.2～0.8g/L的条件下培养，假单胞菌PT在利用α-蒎烯的过程中产生生物表面活性剂，使污水试样的表面张力下降。本发明方法简单易行，稳定性好，所产生的生物表面活性剂无毒、可生物降解、环境温和。
文档编号C12P7/40GK102732573SQ20121017232
公开日2012年10月17日 申请日期2012年5月25日 优先权日2012年5月25日
发明者成卓韦, 朱润晔, 蒋轶锋, 陈建孟, 顾信娜 申请人:浙江工业大学