专利名称：菊花生长素响应蛋白Aux/IAA 编码基因CmIAA1 及其植物表达载体和构建方法
技术领域：
本发明属于分子生物学领域，涉及菊花生长素响应蛋白Aux/IAA编码基因CmIAAl及其植物表达载体和构建方法。
背景技术：
菊花(Chrysanthemum morifolium Tzvel.)是菊科菊属植物,原产我国，因其花型丰富、花色多变、易于栽培等特点，而深受我国及世界各国人民的喜爱，是我国十大传统名花和世界四大切花之一。上述菊花的特点是植物高度进化的表现。同一个物种，为什么能有这么多不同类型的差异？这些现象的出现其实都与植物细胞的分裂分化有关，因此，探索导致菊花细胞如此分裂分化的相关机理则是解释这些现象的关键所在。 生长素是最重要的植物激素之一，对在多个水平调控的植物的生长发育，如在植株水平促进顶端优势与侧根发生；细胞水平控制细胞伸长、分裂和分化；分子水平调控生长素快速响应基因的表达(Hagen G et al.，2001)。生长素信号途径由多基因参与，其中，ARF 家族和 Aux/IAA 家族(Woodward Aff et al. , 2005 ；Quint M et al.，2006)是生长素信号途径中的两个重要转录因子。生长素响应因子(Auxin response factor,ARF)是调节生长素响应基因表达的转录因子，是早期响应生长素的基因之一。Aux/IAA蛋白最早分离于大豆(Tiwari SB et al. , 2003),通过自身蛋白二聚化或与ARF蛋白发生二聚结合,从而调控其它基因的表达和调控(Jain M. et al.，2009)。目前，已从玉米、高粱、蓖麻等多个物种中克隆了 Aux/IAA家族成员。[ I ] Hagen, G. and Gui lfoyle, T. J. (2001) . Auxin-responsive geneexpression:Genes, promoters, and regulatory factors. Plant Mol. Biol, in press.[2] Woodward AWj Bartel B. (2005) A receptor for auxin. (2005) PlantCell, 2005，17(9) :2425 - 2429.[3]Quint M，Gray WM(2006) Auxin signaling. Curr Opin Plant Biol 9:448 -453[4] Tiwari SB, Hagen G, Gui lfoyle T. (2003) . The rolesof auxinresponse factor domains in auxin-responsive transcription.PlantCell, 2003，15(2) :533-543.[5]Jain M，Khurana JP(2009)Transcript profiling reveals diverse roles ofauxin-responsive genes during reproductive development and abiotic stress inrice. FEBS J 276:3148 - 3162.
发明内容
本发明为生长素信号途径的完善，提供一个新的菊花‘钟山紫桂’生长素响应蛋白Aux/IAA 编码基因 CmlAAl。
本发明还提供该生长素响应蛋白Aux/IAA编码基因CmIAAl的植物表达载体及其构建方法。本发明的技术问题可通过如下技术方案解决菊花‘钟山紫桂’生长素响应蛋白Aux/IAA编码基因CmlAAl，该基因的序列为SEQID NO. I。菊花‘钟山紫桂’生长素响应蛋白Aux/IAA编码基因CmIAAl的克隆方法如下以提取的‘钟山紫桂’幼嫩叶片为材料，提取总RNA，反转录为cDNA，设计引物扩增CmIAAl 基因，
上游引物CmIAAl-Fj' -ATGACATCCTTTGACG-3' (SEQ ID NO. 2)下游引物CmIAAlU' -GCTTCTGTTCTTGCATTTCTC-3' (SEQ ID NO. 3)以反转录的cDNA为模板，进行聚合酶链式PCR反应，产物连接到pMD19-T Simple载体，转化T0P10感受态细胞，进行序列测定，序列如SEQ ID NO. I所示。菊花‘钟山紫桂’生长素响应蛋白Aux/IAA编码基因CmIAAl植物表达载体，由本发明所述的菊花‘钟山紫桂’ CmIAAl基因与植物表达载体构成。菊花‘钟山紫桂’生长素响应蛋白Aux/IAA编码基因CmIAAl的植物表达载体，优选由本发明所述的菊花‘钟山紫桂’生长素响应蛋白Aux/IAA编码基因CmIAAl与中间植物表达载体pCAMBIA 1301构成，进一步优选BamH I和Xba I双酶切CmIAAl后插入到表达载体pCAMBIA 1301质粒进行重组反应得到。菊花‘钟山紫桂’生长素响应蛋白Aux/IAA编码基因植物表达载体，其构建方法如下设计引物以菊花‘钟山紫桂’cDNA为模板，用高保真酶进行PCR反应，在CmIAAl基因的上游和下游分别引入BamH I和Xba I酶切位点，上游引物CmIAAl-M-Fj' -CGGGATCCATGACATCCTTTGACG-3' (SEQ ID NO. 4)下游引物CmIAAl-MU'-GCTCTAGAGCTTCTGTTCTTGCATTTCTC-3' (SEQ ID NO. 5)PCR产物连接到pMD19-T Simple载体，转化T0P10感受态细胞，提取阳性质粒，BamH I和Xba I分别对所述的阳性质粒和pCAMBIA 1301进行双酶切，将得到的BamH I和Xba I双酶切的CmIAAl片段与BamH I和Xba I双酶切的pCAMBIA 1301连接，转化，提取阳性质粒，酶切电泳检测并测序验证，植物表达载体pCAMBIA 1301-CmIAAI构建成功。含有所述的菊花‘钟山紫桂’生长素响应蛋白Aux/IAA编码基因CmIAAl的转化体。所述的转化体优选拟南芥。CmIAAl的植物表达载体用于农杆菌介导的植物遗传转化，获得CmIAAl超表达新种质，研究植物生长素信号途径作用机理，方法如下农杆菌菌株EHA105感受态制备及冻融法转化拟南芥花序浸染及种子筛选PCR鉴定及不同浓度生长素处理下表型变化本发明的有益效果I.本发明提供的菊花‘钟山紫桂’CmlAAl是一个新的生长素响应蛋白Aux/IAA编码基因，该基因为生长素信号途径的重要成员之一。将CmIAAl的植物表达载体用于植物遗传转化，CmIAAl基因在CaMV35S启动子的启动下超量表达，影响生长素信号途径，对植物生长发育产生负调控作用，抑制植物主根伸长，促使侧根增多，并抑制植物整体生长进度。2.本发明构建的菊花‘钟山紫桂’ CmIAAl基因植物表达载体为首次报道，可直接用于农杆菌介导的遗传转化，获得CmIAAl超表达新种质。
图I为CmIAAl琼脂糖凝胶电泳分析MDL2000DNA Marker
I CmIAAI ；2 :pMD19_T Simple-CmIAAl 质粒 BamH I 和 Xba I 双酶切；3 pCAMBIA 1301-CmIAAI 表达载体 BamH I 和 Xba I 双酶切检测2植物表达载体pCAMBIA 1301-CmIAAl构建方法示意3转基因拟南芥植株PCR鉴定及表型35S: :CmIAAl和野生型拟南芥在1/2MS培养基上生长7天后根长情况(A) ；RTPCR检测阳性转基因苗的结果(B);去头的拟南芥的根生长情况，在第7天时滴加IAA (C)和第10天时(D);盆栽的拟南芥生长I个月情况对比(E)。A和E标尺25mm，C和D标尺为10_。
具体实施例方式实施例I. CmIAAl的克隆植物材料为菊花‘钟山紫桂’，保存于南京农业大学“中国菊花种质资源保存中心”。取自然条件下正常生长的叶片，液氮速冻后直接提取RNA。取0.2g幼嫩叶片，参照Trizol RNA提取试剂盒(TaKaRa)说明书方法，提取叶片总RNA，按照M-MLV反转录试剂盒(TaKaRa)取I y g总RNA反转录成cDNA，用RNase消化cDNA产物，用Primer 5软件分析设计引物扩增CmIAAl ；上游引物CmIAAl-Fj' -ATGACATCCTTTGACG-3' (SEQ ID NO. 2)下游引物CmIAAlU' -GCTTCTGTTCTTGCATTTCTC-3' (SEQ ID NO. 3)以提取的叶片cDNA为模板，进行PCR反应。25 ii L反应体系10XRCRBuffer 2. 5 ii L，CmlAAl-F、CmIAAl-R 弓丨物 # 0. 5 u L (10 u mol L-1), dNTP mix2. 0 u L (2. 5mmoI .L1), Taq DNA Polymerase 0. I U L, cDNA 模板 0. 5 U L, ddH2018. 9 U L ;反应程序94°C预变性 lOmin，然后 94°C变性 30sec，55°C退火 30sec，72°C延伸 Imin 30sec,反应30个循环，72°C终延伸IOmin ;PCR产物用凝胶回收试剂盒(AXYGEN)回收纯化，用T4DNA连接酶(TaKaRa)连接到pMD19_T Simple载体(TaKaRa)，转化T0P10感受态细胞，进行序列测定；，序列如SEQ ID NO. I所示。实施例2.植物表达载体pCAMBIA 1301-CmIAAl的构建设计引物进行PCR反应，在目的基因CmIAAl的上游和下游分别弓I入酶切位点BamHI和Xba 1沖0 产物连接到？1 191 Simple载体，转化T0P10感受态细胞，提取阳性质粒，BamHI和Xba I双酶切的CmIAAl片段与BamH I和Xba I双酶切的pCAMBIA 1301连接，转化，提取阳性质粒，酶切电泳检测并测序验证(图I)。上游引物CmIAAl-M-Fj' -CGGGATCCATGACATCCTTTGACG-3' (SEQ ID NO. 4)
下游引物CmIAAl-MU'-GCTCTAGAGCTTCTGTTCTTGCATTTCTC-3' (SEQ ID NO. 5)以菊花‘钟山紫桂’叶片cDNA作为模板，用高保真酶(PrimeSTAR HS DNAPolymerase, TaKaRa)进行 PCR 反应，25 y L 反应体系10XHS RCR Buffer 2. 5 u L,CmIAAl-M-F、CmIAAl-M-R 引物各 0.5 ii L(10 ii mol L-1), dNTP mix 2. Ou L(2. 5mmol L-1),PrimeSTAR HS DNAPolymerase 0. 2 u L, cDNA 模板 0. 5 y L，ddH2018. 8u L ;反应程序95°C预变性lOmin，然后94°C变性30sec，55°C退火30sec，72°C延伸90sec，反应30个循环，72°C终延伸IOmin ;PCR产物用凝胶回收试剂盒(AXYGEN，USA)回收，连接到pMD19_T Simple载体，转化TOPlO感受态细胞，提取阳性质粒pMD19-T Simple-CmIAAl ；取载体pCAMBIA 1301(Invitrogen, USA)和 pMD19_T Simple-CmIAAl 用 BamHI 和 Xba I 双酶切，双酶切体系(50 ii L) :10XFast Digest Buffe r 5 u L, pMD19_TSimple-CmIAAl 10 u L, BamH I 2 u L, XbaI 2 u L, ddH20 31 u L ;37。。反应 30min ;双酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，用凝胶回收试剂盒(AXYGEN)回收质粒pCAMBIA 1301大片段和PMD19-T Simple-CmIAAl小片段。用T4DNA连接酶(TaKaRa)连接两个回收的产物，连接反应体系(IOy L) :10XT4ligaseBuffer IuL, pCAMBIA 1301 大片段 2 y L，pMD19_TSimple-CmIAAl小片段6yL，T4DNA连接酶I y L ; 16°C连接反应lh，取IOy L连接产物转化T0P10感受态细胞。37°C培养12-16h，挑取阳性单克隆扩大培养，提取质粒pCAMBIA1301-CmIAAl，进行酶切和测序验证。植物表达载体pCAMBIA 1301-CmIAAI的构建成功(图2)。实施例3.植物表达载体pCAMBIA 1301-CmIAAl遗传转化拟南芥及其基因功能初
步鉴定农杆菌菌株EHA105感受态制备及冻融法转化从YEB (50ug/mL利福平)平板上挑取EHA105单菌落，接种于50mL含50ug/mL利福平的YEB液体培养基中，200rpm，28°C培养至OD值0. 5，而后冰浴菌液30min，离心收集菌体，悬浮于2mL预冷的IOOmM CaCl2 (20%甘油)溶液中，200uL/管分装，待用。取IOuL pCAMBIA 1301-CmIAAI载体质粒，加入200uL感受态细胞，冰浴30min，液氮冷冻5min，37°C 5min,加入800uL YEB液体培养基，28 V 200rpm预培养4h，菌液涂板于YEB (50ug/mL利福平+50ug/mL卡那霉素)固体培养基上，28°C暗培养3天，挑取单克隆检测，选取阳性克隆摇菌，用于拟南芥花序转化。拟南芥花序浸染及种子筛选将阳性单克隆接到50mL的YEB (50ug/mL利福平+50ug/mL卡那霉素)液体培养基中，培养24小时，5000rpm离心10分钟，然后用转化液(1/2MS，添加50克/升的蔗糖，调pH为5. 8，然后加200uL/L的Silwet L-77混合)剧烈悬浮沉淀至完全悬起。将拟南芥花序直接浸泡于上述悬浮液中I分钟，然后用黑色塑料膜完全包裹植株以保湿，放回培养室暗培养16小时,打开塑料膜,再放入人工气候箱培养,等种子成熟时米收。种子消毒与播种将种子放入I. 5mL的离心管中，加入ImL 75%酒精，添加0. 1%的TritonX-IOO摇晃20分钟，然后在超净台中用95%的酒精洗两次，而后直接把种子连同酒精倒在灭菌过的滤纸上，以吹干种子(放置10分钟)，轻轻敲击滤纸将干种子均匀撒播到筛选培养基上(l/2MS+20mg/L潮霉素+25mg/L氨苄青霉素)筛选培养15天，然后将抗性苗移栽到土中，用透明的薄膜覆盖幼苗I周以保湿。
PCR鉴定及基因功能初步鉴定待抗性苗长至7 8片叶，提取拟南芥叶片DNA，进行PCR (引物CmIAAl-F和CmIAAl-R)鉴定。经PCR鉴定的T1代转基因苗继续生长，采收T2代种子。将筛选出的转基因T2代种子和野生型种子同时播种到1/2MS培养基上，放置到光照培养箱中(23 +TC，16/8h, 80 - 100 u JiT2s' 80%的相对湿度)，7天后测定下胚轴根长并拍照，每组试验重复三次。转基因T2代种子和野生型种子同时播种到1/2MS培养基上，放置到光照培养箱中(23 +TC，16/8h, 80 - 100 u JiT2S' 80%的相对湿度)，7天后对植株进行去头处理，在切口处滴加lng/L的IAA溶液，以只滴加清水，不添加IAA的去头野生型与转基因植株作为对照组，垂直放置平板，去头植株在1/2MS培养基上继续培养3天后观察表型。另将野生型和转基因植株种子播于1/2MS培养基上，方法条件同上，待其长出真叶后移栽至蛭石营养土 =1:1的土中，在上述人工气候箱中培养一月后观察。生长至7d时，转基因拟南芥主根比野生型短(图3A);拟南芥去头处理后，转基因 植株和野生型均受到外源IAA的调控，但是转基因拟南芥发生更多的侧根(图3D);盆栽转基因拟南芥生长进度慢于野生型(图3E)。综上所述，本发明构建了含有生长素响应蛋白Aux/IAA编码基因的植物表达载体pCAMBIA1301-CmIAAl，其中CmIAAl为首次报道。所构建的载体可导入植物中，研究植物的 生长素信号途径。
权利要求
1.菊花‘钟山紫桂’生长素响应蛋白Aux/IAA编码基因CmlAAl，其特征在于该基因的序列为 SEQ ID NO. I。
2.菊花‘钟山紫桂’生长素响应蛋白Aux/IAA编码基因CmIAAl植物表达载体，其特征在于由权利要求I所述的菊花‘钟山紫桂’ CmIAAl基因与植物表达载体构成。
3.根据权利要求2所述的菊花‘钟山紫桂’生长素响应蛋白Aux/IAA编码基因CmIAAl植物表达载体，其特征在于所述的植物表达载体为BamH I和Xba I双酶切CmIAAl后插入到表达载体pCAMBIA 1301质粒进行重组反应得到。
4.权利要求3所述的菊花‘钟山紫桂’生长素响应蛋白Aux/IAA编码基因CmIAAl植物表达载体的构建方法，其特征在于包括如下步骤设计引物CmIAAl-M-F SEQ ID NO. 4和CmIAAl-M-R SEQ ID NO. 5，以菊花‘钟山紫桂’ cDNA为模板，用高保真酶进行PCR反应，在CmIAAl基因的上游和下游分别引入BamH I和Xba I酶切位点，PCR产物连接到pMD19_TSimple载体，转化TOPlO感受态细胞，提取阳性质粒，BamH I和Xba I分别对所述的阳性质粒和pCAMBIA 1301进行双酶切，将得到的BamH I和Xba I双酶切的CmIAAl片段与BamH I和Xba I双酶切的pCAMBIA 1301连接，转化，提取阳性质粒，酶切电泳检测并测序验证，植物表达载体pCAMBIAl301-CmIAAl构建成功。
5.含有权利要求I所述的菊花‘钟山紫桂’生长素响应蛋白Aux/IAA编码基因CmIAAl的转化体。
6.根据权利要求5所述的转化体，其特征在于所述的转化体为拟南芥。
全文摘要
本发明属于分子生物学领域，涉及菊花‘钟山紫桂’生长素响应蛋白Aux/IAA编码基因CmIAA1表达载体构建。本发明所构建的表达载体pCAMBIA 1301-CmIAA1是由CmIAA1基因插入到克隆载体pMD19-T simple vector，经BamH I和Xba I双酶切后连接到载体pCAMBIA 1301的BamH I和Xba I位点而得到的重组质粒。将该植物表达载体用于植物遗传转化，CmIAA1基因在CaMV35S启动子的启动下超量表达，大量合成Aux/IAA蛋白，影响生长素信号途径，对植物生长发育产生负调控作用，抑制植物主根伸长，促使侧根增多，并抑制植物整体生长进度。
文档编号C12N15/82GK102676545SQ20121017270
公开日2012年9月19日 申请日期2012年5月29日 优先权日2012年5月29日
发明者刘兆磊, 房伟民, 李佩玲, 杨冬寅, 滕年军, 管志勇, 蒋甲福, 陈发棣, 陈素梅, 顾春笋 申请人:南京农业大学