专利名称：检测OTOF基因c.1671_1673delG突变的试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因检测领域，具体涉及用于检测OTOF基因突变的试剂盒；本发明还涉及新的OTOF突变基因及其在诊断和/或治疗感音神经性聋及听神经病/听神经病谱系障碍的应用。
背景技术：
听神经病/听神经病谱系障碍(Auditory Neuropathy SpectrumDisorders, ANSD)是由第珊颉神经的听支受损而引起的一种特殊的感音神经性聋。表现为声音可以通过外耳、中耳正常的进入到内耳，但声音信号不能同步地从内耳传输到大脑的听功能异常性疾病。临床听力检查表现为诱发性耳声发射正常、听性脑干反应严重异常的一组听功能障碍症候群。听神经病谱系障碍多自幼年或青春期起病，在高危婴幼儿中发病·率约为0. 23%，在各种原因所致的ABR异常的聋病患儿中的发病率高达11%，无性别差异。目前研究表明，听神经病谱系障碍的发病主要和遗传、免疫、感染、中毒、代谢等相关因素相关。按照是否合并其他系统疾病可将遗传性听神经病谱系障碍分为两类一类是合并有其它颅神经和/或周围神经病损的综合征型疾病，如Charot Marie Tooth综合征CMT1型(脱髓鞘型)及CMT2型(轴突型)、费里德赖希共济失调综合征等；另一种是仅有听力下降表现的非综合征型听神经病谱系障碍。非综合征型听神经病谱系障碍由于表型单一，基因型与表型之间有较好的对应关系，逐渐成为近年来的研究热点。Stan■等根据发病部位的不同将其分为TYPE I型(病变部位在听神经)和TYPE II型(病变部位在内毛细胞及突触)。按照遗传模式的不同可将听神经病谱系障碍分为常染色体显性遗传(AUNAl)、常染色体隐性遗传(NSRAN)和X连锁隐性遗传(AUNXl)以及线粒体DNA突变等。2003年，Varga等运用连锁分析的方法，将四个家系定位在包含OTOF基因所在的2p23区域内，确定OTOF为第一个发现且较为常见的与非综合征型听神经病谱系障碍相关的基因。OTOF基因DNA序列全长101496bp，包含48个外显子，定位于2p23。OTOF基因的编码区，含终止密码子如SEQID NO. I所示。OTOF长亚型变异体的mRNA长度为7172bp，所编码的蛋白质otoferlin (如SEQ ID NO. 2所示)包含1997个氨基酸，可能参与突触囊泡的融合。Otoferlin具有6个钙离子结合区域(C2domain)，其中后4个含有完整的5个天冬氨酸残基，可以与钙离子结合，且存在I个羧基端跨膜区域(TM)，这些结构在脊椎动物都是高度保守的。2006年，Petit教授研究小组观察到小鼠otof基因编码的蛋白质otoferlin在耳蜗内毛细胞与传入神经元所形成的带型突触处呈高表达。敲除otof基因的纯合小鼠表现为极重度耳聋，其内毛细胞带型突触形态保持正常，钙离子流通也正常，但是突触囊泡的胞吐作用却完全废止，因此得出结论otof基因编码的蛋白质otoferlin作为一种I丐离子感应器,在内毛细胞带型突触处触发膜融合，从而在内毛细胞突触囊泡的胞吐过程中发挥着重要作用。因此由该基因突变导致的感音神经性聋及听神经病/听神经病谱系障碍患者病变部位多在耳蜗内毛细胞或突触，人工耳蜗手术治疗效果较好。而国内外对于感音神经性聋及听神经病/听神经病谱系障碍患者OTOF基因的筛查发现，携带有该基因突变的听神经病谱系障碍患者临床多以TypeII型表现为主，适合于人工耳蜗植入手术治疗并可取得良好的效果。而TYPE I型听神经病谱系障碍患者病变部位在听神经，位置深在，目前尚无有效的治疗方法。因此，利用对感音神经性聋及听神经病/听神经病谱系障碍患者的OTOF基因的检测进行辅助分型，对于临床治疗具有重要的指导意义。
发明内容
本发明的一个目的在于提供用于检测OTOF突变c. 1671_1673delG (X579)基因的试剂盒，其技术方案为一种用于检测与感音神经性聋及听神经病/听神经病谱系障碍相关的位于OTOF基因的c. 1671_1673delG(X579)突变的试剂盒，所述试剂盒包括从待测样品中提取DNA的试剂；·用于扩增样本DNA的PCR反应试剂；对PCR扩增产物进行测序的试剂；其中，所述扩增样本DNA的PCR反应试剂包括PCR引物，所述PCR弓丨物扩增的目标片段包含OTOF基因第1671-1673位碱基。具体地，上述PCR引物为选自0T0F-F-1 (SEQ ID NO. 3) :5’ -CTGAATGGCACACATGAAGTTCT-3’，0T0F-R-1 (SEQ ID NO. 4) :5’ -GCCTTATCCTGAGGTATGACTCC-3’ ；0T0F-F-2 (SEQ ID NO. 5) :5’ -CTCCACCCCAGCGCAGTGT-3’，0T0F-R-2 (SEQ ID NO. 6) :5’ -CCTGGGGGACAGCACAGTG-3’ ；0T0F-F-3 (SEQ ID NO. 7) :5’ -CCAGGAAGCAGGGAGCTAGA-3’，0T0F-R-3 (SEQ ID NO. 8) :5’ -CCCAGGTGACTCAGGGAGAA-3’ ；0T0F-F-4 (SEQ ID NO. 9) :5，-GGAAGAAATAGACCCAAGAGAG-3，，0T0F-R-4 (SEQ ID NO. 10) :5，-GACGAGGGCAGAGTCCTGT-3，；中的一对。本发明的另一个目的是提供上述试剂盒用于检测位于OTOF基因的c. 1671_1673delG(X579)突变的方法，包括以下步骤I)采集待测个体的血液、体液或组织样本，提取DNA ；2)以该DNA为模板，以下列PCR引物进行PCR反应，得到PCR反应产物；其中，所述PCR引物扩增的目标片段包含OTOF基因第1671-1673位碱基；3)将得到的PCR反应产物进行直接测序，并将测序结果与OTOF正常基因的序列进行比较，确定是否存在OTOF基因的c. 1671_1673delG突变位点。进一步地，上所述方法还包括下述步骤4)按照正常阅读框架进行翻译以确定c. 1671_1673delG突变使氨基酸序列自558位发生移码改变，并使氨基酸的编码提前终止于第579位的氨基酸(p. G558A fsx21)0本发明的又一个目的在于提供上述试剂盒在用于检测感音神经性聋及听神经病/听神经病谱系障碍中的用途，本发明将为在感音神经性聋及听神经病/听神经病谱系障碍患者中开展易感基因筛查提供方便确实的方法；同时可以指导临床治疗，并为将来利用这一突变作为靶点开展耳聋的基因治疗提供坚实的基础。
使用本发明的试剂盒的检测方法为通过检测来自于患者的待测样本中是否存在OTOF基因c. 1671_1673delG突变，而判断该患者感音神经性聋及听神经病/听神经病谱系障碍发生原因及类型。其中，OTOF基因的c. 1671_1673delG碱基558发生移码改变(P.G558Afsx21),导致编码提前终止于第579位(标记为X579)，形成Otoferlin的截短肽链，丧失其功能，不成熟的表达产物诱导启动体内调节机制，使变异的mRNA降解。OTOF基因突变相关的感音神经性聋及听神经病/听神经病谱系障碍以常染色体隐性遗传的方式传递。发明人应用候选基因筛查的方法对17例非综合征型听神经病谱系障碍患者和100例听力正常且无家族史的对照进行筛查，在一例听神经病谱系障碍患者发现OTOF基因的c. 1671_1673delG (X579)突变，OTOF基因突 变与听神经病谱系障碍表型共分离。目前国际上报道与感音神经性聋及听神经病/听神经病谱系障碍相关的突变有80余种，尚无c. 1671_1673delG突变的报道。图I给出OTOF编码区氨基酸与核酸碱基的对照图，并示出突变位点(方框标记处)，该突变使位于OTOF基因编码区的第1671-1673位中的一个G碱基丢失，使得氨基酸编码自第558位发生移码，在第579位的氨基酸密码子变为终止密码子，突变发生后基因表达产物由正常的1997个氨基酸变成了 578个氨基酸肽链。截断的氨基酸肽链启动体内调节机制，使变异的mRNA降解。检测该突变可用本领域的任何检测点突变的方法来进行，例如PCR (聚合酶链反应)-测序法、采用标记的OTOF基因DNA探针杂交法或用限制性片段长度多态性方法或序列特异性引物的方法等等。在本发明的一个实施方案中，采用PCR扩增-直接测序法来检测样本，具体包括下述步骤I)采集待测个体的样本，例如血液、体液或组织，提取基因组DNA ；2)以该DNA为模板，以针对OTOF基因或OTOF编码区第1671-1673位碱基附近设计的PCR引物进行PCR反应，得到PCR扩增产物；3)将得到的PCR产物进行直接测序分析，将所得到的序列与OTOF正常基因的序列进行比较，确定是否存在OTOF突变位点。4)根据以上结果判断待测个体是否为OTOF基因突变c. 1671_1673delG导致的感音神经性聋及听神经病/听神经病谱系障碍。进一步的，该方法可以选择性的包括如下步骤5)按正常阅读框进行翻译以确定氨基酸是否存在自第558位的移码至第579位的编码终止改变(P.G558A fsx21)。在发明人进行的实验中，通过聋病门诊及资源收集网络收集各种感音神经性耳聋患者，包括听神经病谱系障碍患者，建立资源库。在患者自愿的前提下，签署知情同意书后，留取5-10ml血样，并建立门诊病历资料库，详细记录患者病情、家系中的发病情况以及联系方式。然后，应用酚氯仿抽提的方法提取基因组DNA，定量后入库，-20° C保存，每份DNA样品均详细对应于登记的患者临床资料。然后，应用在线引物设计软件Primerf设计引物，包含OTOF整个编码区，应用PCR扩增。PCR产物直接测序测序引物与PCR扩增引物相同，正反向测序，应用ABI公司3700DNA测序仪。得到的序列与Genbank中的序列(登录号NC_000002. 11)比较确定OTOF突变位点。按正常阅读框进行翻译以确定OTOF的突变位点。
上述步骤2所得到的PCR反应产物还可以用杂交探针来检测，所用的杂交探针可以是与正常的OTOF核苷酸序列杂交，或与突变的核苷酸序列杂交，或与它们的互补序列杂交的探针。这些探针可以用放射性同位素、发色物质或荧光物质标记，尤其是可利用等位基因特异探针，也可用限制性酶切的方法筛查是否存在已被确定的突变。 因此，检测PCR扩增产物的试剂选自测序检测试剂、限制性内切酶酶切检测试剂、限制性长度多态性检测试剂、序列特异性引物检测试剂和探针杂交检测试剂。在上述方法中使用的PCR引物可以依据已知的核苷酸序列设计，通常为15 30个碱基，GC含量为45 50%左右，在适当的温度下与末端特异性结合，其可以利用专门的计算机程序设计。在本发明的一个具体实施例中，应用在线引物设计软件primer 3. 0设计了一对PCR引物，其序列为上游引物0T0F-F-1:5，-CTGAATGGCACACATGAAGTTCT-3’(nt77559_nt82557)下游引物0T0F-R-1:5，-GCCTTATCCTGAGGTATGACTCC-3’(nt78020_nt78042)·
OTOF正常基因的标准序列可以参考例如Genbank NC_000002. 11。用于检测OTOF基因c. 1671_1673delG突变的试剂盒中可以包含以下试剂用于扩增样本DNA中OTOF基因或OTOF基因编码区第1671-1673位碱基附近的PCR引物；以及以下一种或几种试剂的组合从待测样品中提取DNA的试剂；PCR反应试剂；对PCR扩增产物进行直接测序的试剂。例如，本发明的一个实施方案中提供一个检测OTOF基因c. 1671_1673delG突变的试剂盒，容器内装有用以检测OTOF基因c. 1671_1673delG突变的成分，与之同时提供的可以是经政府药物管理机构审核的、有关药品或生物制品的制造、使用及销售信息。例如，采用PCR扩增后，直接检测样品中OTOF基因c. 1671_1673delG突变位点的试剂盒，可含有扩增引物、dNTPs、用于PCR反应的DNA聚合酶及其缓冲液、或测序反应所需试剂等的一种或多种。本领域技术人员已知，以上组分仅是示意性的，例如，所述的引物可以采用上述的一对0T0F-F-1和0T0F-R-1引物，所述用于PCR反应的DNA聚合酶是能够用于PCR扩增的酶。所述试剂盒的使用方法主要包括如下步骤(I)提取待测血样的DNA，利用上述的一对0T0F-F-1和0T0F-R-1引物，进行PCR反应，得到PCR反应产物；(2)PCR反应产物纯化后直接测序，将所得的序列与Genbank中的标准序列比较确定突变位点的存在；所述步骤还可进一步包括(3)按正常阅读框进行翻译以确定是否存在自第558位氨基酸的移码至第579位氨基酸的终止改变(P.G558A fsx21)。该试剂盒可简便快捷地检测OTOF突变位点，从而应用于感音神经性聋及听神经病/听神经病谱系障碍相关基因的检测及其诊断或治疗方法中。本发明也提供了 OTOF突变基因在诊断或治疗人类感音神经性聋及听神经病/听神经病谱系障碍中的应用。通过检测来自患者的待测样本中是否存在OTOF基因c. 1671_1673delG突变而判断该患者的感音神经性聋及听神经病/听神经病谱系障碍发生原因及类型，进而为临床诊断和治疗提供依据；此外，在进一步的临床治疗方面，在检测为发生了 OTOF基因c. 1671_1673delG突变之后，可以将正常基因导入携带突变基因的细胞并在其中表达，它可与内源性突变基因发生重组，从而可以进行基因治疗。本发明提出了通过检测患者中是否存在OTOF基因新的突变而诊断感音神经性聋及听神经病/听神经病谱系障碍发生的原因和类型的检测方法，这将有利于为不同类型感音神经性聋及听神经病/听神经病谱系障碍患者确定个体化治疗方案，避免人工耳蜗植入无效而造成的不必要的经济损失。下面结合附图，通过对本发明较佳实施方式的说明，详细描述但不限制本发明。
图I为OTOF基因编码区核苷酸与氨基酸的对照(NM_194248. 2，NP_919224. I):突变位于OTOF基因第1671-1673位中一个G碱基，用方框圈起来的是突变的碱基和对应的氨基酸，突变后的碱基序列使氨基酸自558位发生移码(下划线部分的氨基酸)，并提前终止于·第579位氨基酸(“*”标记处)。 图2为本发明方法中PCR反应过程示意图，示出了反应温度和时间，其中*表示每个循环降低0.5°C。图3为本发明方法中，对PCR产物进行电泳定量的琼脂糖凝胶电泳图谱，图中示出了定量Marker的片段位置。图4为本发明方法中OTOF基因测序结果的局部图，4A为杂合突变序列(患者序列)，4B为野生型序列，方框表示突变位点位置。
具体实施例方式本发明所用试验材料，如无特别说明，均为市售购买产品。实施例I待测血样提取与OTOF基因编码区的PCR扩增一、待测对象血样DNA的制备I、研究对象对17例散发非综合征型听神经病谱系障碍患者和100名无家族史的听力正常对照按照下述方法进行OTOF基因的筛查。17例患者中，I例听神经病谱系障碍患者的OTOF基因检测发现患者为c. 1671_1673delG突变和另外一种突变的复合杂合子。对100名听力正常者的筛查中未发现c. 1671_1673delG突变者。对所有参加者详细调查其病史以及家族史，并对其进行体格检查，耳科检查包括耳镜检查、听力学评估。在签署知情同意书以后每人采集血样5 10ml。2、基因组DNA提取采用酚氯仿抽提法。第一天I)抗凝血用PBS作I倍稀释。2)在离心管中加入2倍体积的淋巴分离液(18° C 28° C)，上面铺一层I倍体积已稀释的血液，室温，IOOOXg,离心20分钟。3)吸弃上清液，小心吸出中间有核细胞层，转入5ml Ep管中，5000 Xg,离心10分钟，然后用PBS洗一次。5000Xg,离心10分钟。4)将细胞悬于 2ml TE 缓冲液(IOmM Tris. HCl, ImM EDTA，pH8. 0)中，加 10% 的 SDS(十二烷基硫酸)至终浓度 0.5% (100 iil)，蛋白激酶 k 100 200 ii g/ml (10mg/ml )，50° C水浴3 5小时。5)用酚氯仿提取。用等体积的饱和酚，加入混匀，5000Xg，离心10分钟。6)吸上清液至新离心管中，弃下层沉淀，加入等体积酚氯仿混合物，混匀，5000 Xg,离心10分钟。7)吸上清液至新离心管中，弃下层沉淀，加入等 体积氯仿异戊醇混合物，混匀，5000 Xg,离心10分钟。8)吸上清液至新离心管中，弃下层沉淀，加入1/10体积的乙酸钠，混匀。9)加入2. 5倍体积的无水乙醇。10)-20。C 沉淀 DNA 过夜。第二天11)高速离心，10000Xg，10 分钟，4。C。12)弃上清液，加入75%乙醇2ml，高速离心10000 X g，5分钟13)弃上清液，吹干。14)用 TE 缓冲液溶解(200 ii I TE/5ml 全血，400TE/10ml 全血)。15)分装。1%琼脂糖电泳和分光光度计定量。二、OTOF基因编码区的PCR扩增I、引物序列上游引物0T0F-F-1:5，-CTGAATGGCACACATGAAGTTCT-3’(nt77559_nt82557)下游引物0T0F-R-1:5，-GCCTTATCCTGAGGTATGACTCC-3，(nt78020_nt78042)注0T0F基因序列检索号NC_000002. 11。2、PCR反应体系的建立(表I)表I OTOF基因的PCR反应体系
名称__姐液浓度ill,!I丨(pD
緩冲液IOx2.5
dNTP2.5niM2
_]*j 丨物20pM0.4
Taq IU5 units/pl0.5
投板(步骤■屮提取的DNA) 50ng/^iI
总反成体系JdH2O补ii 18.6[il其中，PCR扩增使用鼎国公司Buffert、鼎国公司Taq酶、鼎国公司dNTP、Sigma公司 Betaine、电泳 TaKaRa MarkerDL2000o反应条件PCR反应在BIORAD SlOOO热循环仪上进行，反应过程(包括温度和时间)如图2所示。
实施例IOTOF基因编码区PCR扩增产物的纯化和定量一、PCR产物的纯化——96孔板法I、向装有PCR产物的96孔板中加入50 ill无菌水，混匀。2、将其转移到Millipore纯化板中，放到真空泵上抽滤约3分钟，看到纯化板中没有水即可。3、向纯化板中再次加入50 ii I的去离子水，继续抽滤，直到纯化板中没有水为止。4、将纯化板从真空泵上取下，向板中加入20 ii I的去离子水，静止15分钟，再震荡15分钟，然后吸到一新96孔板内。5、保存在_20°C冰箱中。·二、电泳定量I、样品准备取一 96孔点样板，每孔先加上样缓冲液6 Ul，在从装有PCR产物的腔板中，每孔用排枪移出PCR产物(2iU)，转移到点样板上、混勻、离心(腔板孔号要与96孔点样板一一对应)。2、流程1)配胶(0. 8%琼脂糖):称取2. 4g琼脂糖，悬浮于300ml 0. 5 X TBE中(500ml锥形瓶)。2)溶胶微波炉中高火加热至沸，持续沸腾数分钟，注意不要沸出，其间取出混匀。3)凉胶待胶完全溶解，从微波炉中取出，凉至60°C左右，加入I滴EB (约lOiil，10mg/ml),摇勻。4)铺胶平板两端用胶布封严，把250ml胶液全部倒入平板，插入梳尺。5)上胶将平板放入已盛有电泳液(0. 5XTBE，液面距胶面I至2mm)的电泳槽中，拔下梳尺。6)加样用排枪按规定格式加样，最后用单枪加入DNA标准品。7)走胶盖上电泳槽盖，检查正负级，开启电泳仪，调节电泳电压。8)定量当溴酚蓝走离加样孔I. 5至2cm处，关闭电泳仪，小心取胶，放入摄相仪照相，进行定量。定量marker为DL 2000，如图3所示，经过电泳后，有6条带可见，片段长度分别是 2000bp, IOOObp, 750bp, 500bp, 250bp, 100bp,DL2000 的总浓度是 300ng/5 u I。电泳时取5u I DL2000，因此每条带的含量为50ng。PCR产物电泳时取3yl (PCR产物)+5yl (上样缓冲液)进行电泳。根据PCR产物电泳后的灰度值与DL2000的灰度值的比较判断PCR产物
的含量。实施例3纯化的0T0F基因编码区PCR扩增产物的盲接测序一、PCR产物DNA模板的纯度与用量要求DNA 纯度0D26(i/0D28(i=1. 6 2. O。DNA 浓度PCR 产物 IOng/ U I。DNA 用量PCR 产物100-200 bp1-3 ng
200-500 bp3-10 ng
500-1000 bp5-20 ng
1000-2000 bp 10-40 ng > 2000 bp40-100 ng二、测序反应I、测序反应所需试剂应为新鲜配制，需要经高压灭菌的试剂必须灭菌后方可使用。测序反应所需的器材(如384孔板、tip头等)同样应为洁净无菌的。2、为了保证测序样本及反应试剂的新鲜，加样时应在冰上操作。3、目前的反应体系为5 yl，各种试剂加入量如表2所示。表2 OTOF基因PCR扩增产物的测序反应体系
权利要求
1.一种用于检测与感音神经性聋及听神经病/听神经病谱系障碍相关的位于OTOF基因的c. 1671_1673delG(X579)突变的试剂盒，所述试剂盒包括 从待测样品中提取DNA的试剂； 用于扩增样本DNA的PCR反应试剂； 对PCR扩增产物进行测序的试剂； 其中，所述扩增样本DNA的PCR反应试剂包括PCR引物，所述PCR弓丨物扩增的目标片段包含OTOF基因第1671-1673位碱基。
2.如权利要求I所述试剂盒，其中所述PCR引物为选自下述引物中的一对0T0F-F-1:5’ -CTGAATGGCACACATGAAGTTCT-3’，0T0F-R-1:5’ -GCCTTATCCTGAGGTATGACTCC-3’ ；0T0F-F-2:5， -CTCCACCCCAGCGCAGTGT-3，,0T0F-R-2:5’ -CCTGGGGGACAGCACAGTG-3’ ；0T0F-F-3:5， -CCAGGAAGCAGGGAGCTAGA-3，，0T0F-R-3:5’ -CCCAGGTGACTCAGGGAGAA-3’ ；0T0F-F-4:5， -GGAAGAAATAGACCCAAGAGAG-3，，0T0F-R-4:5， -GACGAGGGCAGAGTCCTGT-3，。
3.如权利要求I或2所述试剂盒，所述试剂盒用于检测位于OTOF基因的c.1671_1673delG(X579)突变的方法，包括以下步骤 1)采集待测个体的血液、体液或组织样本，提取DNA； 2)以该DNA为模板，以下列PCR引物进行PCR反应，得到PCR反应产物； 其中，所述PCR引物扩增的目标片段包含OTOF基因第1671-1673位碱基； 3)将得到的PCR反应产物进行直接测序，并将测序结果与OTOF正常基因的序列进行比较，确定是否存在OTOF基因的c. 1671_1673delG突变位点。
4.如权利要求3所述试剂盒，所述方法还进一步包括下述步骤 4)按照正常阅读框架进行翻译以确定c.1671_1673delG突变使氨基酸序列自558位发生移码改变，并使氨基酸的编码提前终止于第579位的氨基酸(p. G558A fsx21)0
5.如权利要求I所述的试剂盒在用于检测感音神经性聋及听神经病/听神经病谱系障碍中的用途。
全文摘要
本发明提供了一种用于检测与感音神经性聋及听神经病/听神经病谱系障碍相关的位于OTOF基因的c.1671_1673delG(X579)突变的试剂盒，所述试剂盒包括从待测样品中提取DNA的试剂、用于扩增样本DNA的PCR反应试剂、对PCR扩增产物进行测序的试剂；所述扩增样本DNA的PCR反应试剂包括PCR引物，所述PCR引物扩增的目标片段包含OTOF基因第1671-1673位碱基。使用本发明所述试剂盒检测患者中是否存在该突变基因而诊断感音神经性聋及听神经病/听神经病谱系障碍发生的原因和类型。该突变基因和检测方法将有利于临床上开展感音神经性聋及听神经病/听神经病谱系障碍患者的OTOF突变筛查工作，为感音神经性聋及听神经病/听神经病谱系障碍患者的诊断和治疗提供依据。
文档编号C12Q1/68GK102787163SQ20121017236
公开日2012年11月21日 申请日期2012年5月29日 优先权日2012年5月29日
发明者王秋菊 申请人:中国人民解放军总医院, 王秋菊