专利名称：菊花水孔蛋白编码基因CmAQP 及其植物表达载体和构建方法
技术领域：
本发明属于分子生物学领域，涉及菊花水孔蛋白编码基因CmAQP及其植物表达载体和构建方法。
背景技术：
菊花是世界四大切花之一，切花菊约占世界切花总量的30%，在花卉产业中占据重要的地位。随着菊花产业化的快速发展，其设施栽培面积不断增加，土壤盐溃化逐渐成为菊花周年供应的主要限制因素。然而目前的土壤改良措施存在着许多不足，同时巨大的水资源消耗也成为当前菊花产业发展的瓶颈。菊花抗逆育种一直是国内外园艺工作者致力的重要课题之一。 水孔蛋白作为一种功能性跨膜输水蛋白，对植物体形成水选择性运输通道并实现水分的跨膜运输起到重要的作用。当植物处于盐、干旱、低温等逆境胁迫状态时，体内的水分平衡被打破，水孔蛋白在水分运输和胞内渗透压的调控等方面表现出重要作用。研究表明，植物种子的萌发过程中，伴随细胞质渗透势的改变，需要迅速调节渗透势从而达到渗透平衡以提供最佳的发育环境，AQPs在调节渗透平衡中起着非常重要的作用，如转人参PgTIPl基因的拟南芥的发育速度远高于野生拟南芥发育速度(Lin et al.，2007)。盐胁迫可降低根的水分输导能力，Zhu等研究表明，200mmol/L NaCl盐胁迫处理24h后可抑制玉米水孔蛋白基因ZmPIPs和ZmTIPs的表达，且叶片含水量快速、持续下降(Zhu et al.，2005)。迄今，盐胁迫对AQP的表达调控研究主要集中在PIPs和TIPs等亚类，并推测PIPs与TIPs可能通过转录调节协同微调水分的跨膜运输，进而维持盐胁迫和高渗条件下的水分平衡(Shao et al.，2008)。在作物的遗传转化途径中，农杆菌介导法是应用最为广泛的方法之一，其中有效的植物表达载体至关重要。将抗逆基因基因构建植物表达载体，用于农杆菌介导的植物遗传转化，可获得具有耐逆特性的新种质。对于优良作物新品种的培育及在生产中的广泛应用具有重要意义。[I]Zhu C F，Schraut D, Hartung W. (2005). Differential responses ofmaizeMIP genes to salt stress and ABA. J Exp Bot. 56(421):2971-2981.[2] Lin W, Peng Y，Li G，et al. (2007). Isolation and functionalcharacterization of PgTIPl，ahormone—autotrophic cells—specific tonoplastaquaporin in ginseng. J ExP Bot.58:947-956.[3] Shao H B，Chu L Y，Shao M A et al. (2008). Advances in functionalregulation mechanisms of plant aquaporins:Their diversity, gene expression, Iocalization,structure and roles in plant soi1-water relations(Review). Mol MembrBiol. 25(3) :179-191.
发明内容
本发明为解决提高植物耐逆性的问题，提供一个新的菊花‘神马’抗逆基因CmAQP。本发明还提供该抗逆基因CmAQP的植物表达载体及其构建方法。所构建的植物表达载体可直接用于农杆菌介导的作物遗传转化，创制耐盐新种质，可用于植物品种改良。本发明的技术问题可通过如下技术方案解决菊花‘神马’抗逆基因CmAQP，该基因的序列为SEQ ID NO. I。菊花‘神马’抗逆基因CmAQP的植物表达载体，由本发明所述的菊花‘神马’抗逆 基因CmAQP与中间植物表达载体pCAMBIA 1301构成。菊花‘神马’抗逆基因植物表达载体，其构建方法如下I)菊花‘神马’抗逆基因CmAQP的克隆以‘神马’幼嫩叶片为材料，提取总RNA，反转录为cDNA，设计引物扩增CmAQP基因，上游弓丨物CmAQP-F: 5' -ATGACTAAAGATGTTGAAGTAGC-3' (SEQ ID NO. 2)下游引物CmAQP-Rj' -CAAGGCATAAATAAATATAGCCA-3' (SEQ ID NO. 3)以反转录的cDNA为模板，进行聚合酶链式PCR反应，产物连接到pMD19-T Simple载体，转化T0P10感受态细胞，进行序列测定；2)植物表达载体pCAMBIA 1301-CmAQP的构建设计引物以菊花‘神马’ cDNA为模板，用高保真酶进行PCR反应，在CmAQP基因的上游和下游分别引入BamH I和Xba I酶切位点，上游弓 I 物 CmAQP-TF: 5' -CGGGATCCATGACTMAGATGTTGAAGTAGC-3' (SEQ ID NO. 4)下游引物CmAQP-TR:5'-GCTCTAGACAAGGCATAAATAAATATAGCCA-3' (SEQ ID NO. 5)PCR产物连接到pMD19-T Simple载体，转化T0P10感受态细胞，提取阳性质粒，BamH I和Xba I双酶切的CmAQP片段与BamH I和Xba I双酶切的pCAMBIA 1301连接转化，提取阳性质粒，酶切电泳检测并测序验证，植物表达载体pCAMBIA 1301-CmAQP构建成功。本发明所述的菊花‘神马’抗逆基因CmAQP在创制耐盐新种质和/或植物品种改良中的应用。本发明所述的菊花‘神马’抗逆基因CmAQP植物表达载体在创制耐盐新种质和/或植物品种改良中的应用.CmAQP的植物表达载体用于农杆菌介导的植物遗传转化，提高拟南芥种子盐胁迫下的萌发率，方法如下农杆菌菌株EHA105感受态制备及冻融法转化拟南芥花序浸染及种子筛选PCR鉴定及耐盐性评价本发明的有益效果I.本发明提供的菊花‘神马’CmAQP是一个新的抗逆基因，该基因可提高拟南芥种子盐胁迫下的萌发率。2.本发明构建的菊花‘神马’CmAQP基因植物表达载体为首次报道，可直接用于农杆菌介导的遗传转化，创制耐盐新种质，提高拟南芥种子盐胁迫下的萌发率，可进行植物品种改良。
图I为CmAQP琼脂糖凝胶电泳分析M DNA MarkerI :CmAQP ；2 :pMD19_T Simple-CmAQP 质粒 BamH I 和 Xba I 双酶切；3 pCAMBIA 1301-CmAQP 表达载体 BamH I 和 Xba I 双酶切检测2植物表达载体pCAMBIA 1301-CmAQP构建方法示意3野生型与转基因拟南芥PCR鉴定图4野生型与转基因拟南芥种子盐胁迫下的萌发率评价
具体实施例方式实施例I. CmAQP的克隆选用菊花‘神马’作为材料，取0.05g幼嫩叶片，参照Trizol RNA提取试剂盒(TaKaRa)说明书方法，提取叶片总RNA，按照M-MLV反转录试剂盒(TaKaRa)取I y g总RNA反转录成cDNA,用RNase消化cDNA产物,参照菊花CmAQP序列信息,经Primer 5软件分析设计引物扩增CmAQP ；上游弓丨物CmAQP-F: 5' -ATGACTAAAGATGTTGAAGTAGC-3' (SEQ ID NO. 2)下游引物CmAQP-Rj' -CAAGGCATAAATAAATATAGCCA-3' (SEQ ID NO. 3)以提取的叶片cDNA为模板，进行PCR反应，50 ii L 反应体系10 X RCR Buffer 5. 0 u L, dNTP mix 4. 0 u L (2. 5mmol L-1)，CmAQP-F、CmAQP-R 弓丨物各 LOyL (20 u mo I L-1)，Taq DNAPolymerase 0. 2 u L, cDNA模板I y L，ddH2037. 8 ii L ;反应程序95 °C预变性4min，然后94 °C解链30sec，55 °C退火30sec，72°C延伸Imin 30sec，反应35个循环，72°C延伸IOmin ;PCR产物用凝胶回收试剂盒(AXYGEN)回收纯化，用T4DNA连接酶(TaKaRa)连接到pMD19_T Simple载体(TaKaRa)，转化T0P10感受态细胞，进行序列测定，CmAQP序列如SEQ ID NO. I所示。实施例2.植物表达载体pCAMBIA 1301_CmAQP的构建设计引物进行PCR反应，在目的基因CmAQP的上游和下游分别引入酶切位点BamHI和Xba 1沖0 产物连接到？1 191 Simple载体，转化T0P10感受态细胞，提取阳性质粒，BamHI和Xba I双酶切的CmAQP片段与BamH I和Xba I双酶切的pCAMBIA 1301连接转化，提取阳性质粒，酶切电泳检测并测序验证(图I)。上游弓丨物CmAQP-TF: 5' -CGGGATCCATGACTMAGATGTTGAAGTAGC-3' (SEQ ID NO. 4)下游引物CmAQP-TR:5'-GCTCTAGACAAGGCATAAATAAATATAGCCA-3' (SEQ ID NO. 5)①以菊花‘神马’叶片cDNA作为模板，用高保真酶(PrimeSTAR HS DNAPolymerase, TaKaRa)进行 PCR 反应，50 y L 反应体系10XHS RCR Buffer 5. 0 u L,CmAQP-TF、CmAQP-TR 引物各 I. Ou L(20umol L-1)，dNTP mix 4. Ou L(2. 5mmol L-1)，PrimeSTAR HS DNA PolymeraseO. 4u L, cDNA 模板 I y L, ddH20 37. 6 u L ;反应程序95°C预变性4min，然后94°C解链30sec，55°C退火30sec，72°C延伸Imin 30sec,反应30个循环，72°C延伸IOmin ;PCR产物用凝胶回收试剂盒(AXYGEN，USA)回收，连接到pMD19_T Simple载体，转化T0P10感受态细胞，提取阳性质粒pMD19-T Simple-CmAQP ；②取载体pCAMBIA 1301 (Invitrogen, USA)和 pMD 19-T Simple-CmAQP 用 BamH I和 XbaI 双酶切，双酶切体系(50 ii L) :10 X H Buffer 5u L,pMD19-T Simple-CmAQP 15 u L,BamH I 2 u L, Xba I 2 u L, ddH20 26 u L ;37°C反应3h ;双酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，用凝胶回收试剂盒(AXYGEN)回收质粒pCAMBIA 1301大片段和pMD19_T Simple-CmAQP小片段。用T4DNA连接酶(TaKaRa)连接两个回收的产物，连接反应体系(10 y L)IOXT4IigaseBuffer IuL, pCAMBIA 1301 大片段 2 y L，pMD19_T Simple-CmAQP 小片段6uL, T4DNA连接酶IuL ;16°C过夜连接反应，取5 ii L连接产物转化TOPlO感受态细胞。37°C过夜培养，挑取阳性单克隆扩大培养，提取质粒pCAMBIA 1301-CmAQP,进行酶切和测序验证。植物表达载体pCAMBIA 1301-CmAQP的构建成功(图2)。实施例3.植物表达载体pCAMBIA 1301-CmAQP遗传转化拟南芥及其耐盐性鉴定①农杆菌菌株EHA105感受态制备及冻融法转化从YEB (50ug/mL利福平)平板上挑取EHA105单菌落，接种于50mL含50ug/mL利福平的YEB液体培养基中，200rpm，28°C培养至OD值0. 5，而后冰浴菌液30min，离心收集菌 体，悬浮于2mL预冷的的IOOmM CaCl2 (20%甘油)溶液中，200uL/管分装，待用。取IOuL pCAMBIA 1301-CmAQP载体质粒，加入200uL农杆菌EHA105感受态细胞，冰浴30min，液氮冷冻5min，37°C 5min,加入800uLYEB液体培养基，28°C 200rpm预培养4h，菌液涂板于YEB (50ug/mL利福平+50ug/mL卡那霉素)固体培养基上，28°C暗培养2天，挑取单克隆检测，选取阳性克隆摇菌，用于拟南芥花序转化。②拟南芥花序浸染及种子筛选将阳性单克隆接到50mL的YEB (50ug/mL利福平+50ug/mL卡那霉素)液体培养基中，培养24小时，5000rpm离心20分钟，然后用转化液(1/2MS，添加50克/升的蔗糖，调pH为5. 8，然后加200uL/L的Silwet L-77混合)剧烈悬浮沉淀至完全悬起。将拟南芥地上部分直接浸泡于上述悬浮液中I分钟，然后用保鲜膜完全包裹植株以保湿，放回培养室培养12小时，打开保鲜膜，待种子成熟时米收。种子消毒与播种将种子放入2mL的离心管中，加入ImL 75%酒精，添加0. 1%的TritonX-IOO摇晃15分钟，然后在超净台中用95%的酒精洗两次，而后直接把种子连同酒精倒在灭菌过的滤纸上，以吹干种子(放置30分钟)，轻轻敲击滤纸将干种子均匀撒播到筛选培养基上(l/2MS+20mg/L草胺磷+25mg/L氨苄青霉素)筛选培养10天，然后将抗性苗移栽到土中，用透明的盖子覆盖幼苗I周以保湿。③PCR鉴定及耐盐性评价待抗性苗7 8片叶，提取拟南芥叶片DNA，进行PCR (引物CmAQP-F和CmAQP-R)鉴定(图3)。经PCR鉴定的T1代转基因苗继续生长，采收T2代种子。对野生型和T2代抗性转基因拟南芥种子进行盐胁迫处理(200mM NaCl),比较抗盐性，发现转基因拟南芥萌发率(47. 92%)高于野生型拟南芥(26. 53%)(图4)。综上所述，本发明构建了含有抗逆基因的植物表达载体pCAMBIA 1301-CAQP，其中CmAQP为首次报道。所构建的载体可导入植物中，提高拟南芥种子盐胁迫下的萌发率。
权利要求
1.菊花‘神马’抗逆基因CmAQP，其特征在于该基因的序列为SEQID NO. I。
2.菊花‘神马’抗逆基因CmAQP植物表达载体，其特征在于由权利要求I所述的菊花 ‘神马’抗逆基因CmAQP与植物表达载体构成。
3.根据权利要求2所述的菊花‘神马’抗逆基因CmAQP植物表达载体，其特征在于所述 的植物表达载体为BamH I和Xba I双酶切CmAQP后插入到表达载体pCAMBIA 1301质粒 进行重组反应得到。
4.权利要求3所述的菊花‘神马’抗逆基因CmAQP植物表达载体的构建方法，其特征在 于包括如下步骤设计引物以菊花‘神马’ cDNA为模板，用高保真酶进行PCR反应，在CmAQP基因的上游 和下游分别引入BamH I和Xba I酶切位点，上游引物 CmAQP-TF: SEQ ID NO. 2下游引物 CmAQP-TR: SEQ ID NO. 3PCR产物连接到pMD19-T Simple载体，转化T0P10感受态细胞，提取阳性质粒，BamH I 和Xba I双酶切的CmAQP片段与BamH I和Xba I双酶切的pCAMBIA 1301连接转化，提取 阳性质粒，酶切电泳检测并测序验证，植物表达载体pCAMBIA 1301-CmAQP构建成功。
5.权利要求I所述的菊花‘神马’抗逆基因CmAQP在创制耐盐新种质和/或植物品种 改良中的应用。
6.权利要求2所述的菊花‘神马’抗逆基因CmAQP植物表达载体在创制耐盐新种质和 /或植物品种改良中的应用。
全文摘要
本发明属于分子生物学领域，公开了菊花水孔蛋白编码基因CmAQP及其植物表达载体和构建方法。本发明所构建的表达载体pCAMBIA 1301-CmAQP是由CmAQP基因插入到克隆载体pMD19-T simple vector，经BamH I和Xba I双酶切后连接到载体pCAMBIA 1301的BamH I和Xba I位点而得到的重组质粒。将该植物表达载体用于植物遗传转化，CmAQP基因在CaMV35S启动子的启动下超量表达，大量合成CmAQP蛋白，从而提高拟南芥种子盐胁迫下的萌发率。
文档编号A01H5/00GK102660557SQ20121017152
公开日2012年9月12日 申请日期2012年5月29日 优先权日2012年5月29日
发明者刘兆磊, 刘浦生, 房伟民, 李佩玲, 滕年军, 王红宾, 管志勇, 蒋甲福, 陈发棣, 陈素梅 申请人:南京农业大学