一种用于检测猪疫病病原微生物的基因芯片及其检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及猪疫病病原微生物检测技术领域，具体涉及一种用于检测猪疫病病原 微生物的基因芯片及其检测方法。
【背景技术】
[0002] 随着规模化养猪业迅猛发展，猪病的发生对规模化养猪生产的危害日趋加重，特 别是传染性疾病，成为严重影响我国规模化养猪业健康、稳定发展的主要疫病。我国猪病的 种类越来越多，而且近几年新增疫病不少，疾病的复杂程度不断加剧，甚至老病新病混合感 染，导致发病率和死亡率明显上升，致使猪场在经济上遭受重大损失。在临床上，猪病以病 原体的多重感染或混合感染为主要流行形式，猪群发病往往不是以单一病原体所致，而是 以两种或多种病原体相互协同作用所造成的，常常导致猪群的高发病率和高死亡率，危害 极其严重，而且控制难度加大。继发感染现象在规模化猪场也十分普遍，特别是在猪群存在 一些原发性感染（如猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒2型、猪伪狂犬病病毒等）情况 下，一旦应激因素和饲养管理不良，就很容易发生继发感染。这种情况在猪呼吸道疾病中， 表现得最为明显。猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒2型感染猪群可继发猪链球菌病、 仔猪副伤寒、副猪嗜血杆菌感染、猪传染性胸膜肺炎等。猪群感染传染病之后，多病原混合 感染和继发感染现象的存在，增加了临床诊断的难度，因此在实验室进行病原检测，成为诊 断猪群疫病感染行之有效的方法。目前对猪源疾病的诊断，多采用病原分离及常规的血清 学方法，但病原分离不仅费时费力，而且敏感性和特异性都较差，血清学诊断方法也因实验 室条件和诊断方法的不同而产生不同的差异；虽然已有PCR诊断方法应用于病毒检测，但 需分别进行诊断。因此，研发一种快速、准确、灵敏、特异性好且能够同时检出多种病原微生 物的基因芯片，对养猪业疫情预警与防控，具有十分重要的指导意义和应用价值。
【发明内容】
[0003] 针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种用于检测猪疫病病原微生物的基因 芯片及其检测方法。该基因芯片能够同时对10种猪疾病病原微生物实现快速、特异、灵敏 的检测。
[0004] 为实现上述目的，本发明采用下述技术方案：
[0005] -种用于检测猪疫病病原微生物的基因芯片，包括固定在固相载体上的与待检致 病病原微生物相对应的寡核苷酸探针和阳性质控；
[0006] 所述寡核苷酸探针分别为猪传染性胸膜肺炎放线杆菌探针、猪瘟病毒探针、猪副 嗜血杆菌探针、猪流感病毒探针、猪肺炎支原体探针、猪圆环病毒II型探针、猪细小病毒探 针、猪蓝耳病毒探针、猪伪狂犬病病毒探针和猪链球菌探针，其分别相应于SEQ ID N0. 1、2、 3、4、5、6、7、8、9 和 10 的序列；
[0007] 所述阳性质控为美国INDVER公司提供的生物素标记的阳性质控基因片段；用于 监控基因芯片检测方法的有效性。
[0008] 所述固相载体为带有正电荷的玻璃片、硅片、聚丙烯膜、硝酸纤维素膜或尼龙膜。 综合考虑上述固相载体的使用效果、使用方便性、储存方便性及保质期等因素，本发明优选 玻璃片作为固相载体。
[0009] 上述基因芯片，其阳性质控呈"T"字型分布；与待检致病病原微生物相对应的寡 核苷酸探针呈微阵列分布。
[0010] 上述基因芯片的制备方法，步骤为：将寡核苷酸探针点样在固相载体上，点好样的 固相载体在长波紫外灯下进行交联；同时将阳性质控点样在固相载体上，即制得基因芯片。
[0011] 本发明还提供了用于特异性扩增猪传染性胸膜肺炎放线杆菌、猪瘟病毒、猪副嗜 血杆菌、猪流感病毒、猪肺炎支原体、猪圆环病毒II型、猪细小病毒、猪蓝耳病毒、猪伪狂犬 病病毒和猪链球菌病原微生物特定保守核苷酸序列的引物，其分别相应于SEQ ID N0. 11至 SEQ ID NO. 30所示的序列。
[0012] 上述用于特异性扩增的引物序列，具体如下：
[0013] 猪传染性胸膜肺炎放线杆菌：F:5 ' GCGGTAATGGCGATGACAC 3 ' (SEQ ID N0. 11)
[0014] R:5 ' TOGATATCTCTTGCGCGGTTA 3 ' (SEQ ID NO. 12)
[0015] 猪瘟病毒：F:5 ' GACTAGCAAACGGAGGGACTA 3 ' (SEQ ID NO. 13)
[0016] R:5 ' GCCAGGGTTAAGGTGTGTCT 3 ' (SEQ ID NO. 14)
[0017] 猪副嗜血杆菌：F:5 ' TGATGAGGAAGGGTGGTGTTT 3 ' (SEQ ID NO. 15)
[0018] R:5 ' TACGCCCAGTCATTCCGATTA 3 ' (SEQ ID NO. 16)
[0019] 猪流感病毒：F:5 ' TTATGCTGGAGCAAACAGC 3 ' (SEQ ID NO. I7)
[0020] R:5 ' ACATAGGCATCTGCATTTTGG 3 ' (SEQ ID NO. 18)
[0021] 猪肺炎支原体：F:5 ' GTGATGGGTGAACATGGTGAT 3 ' (SEQ ID NO. 19)
[0022] R:5 ' GTGAAATCCGTATTCTCCTCGTA 3 ' (SEQ ID NO. 20)
[0023] 猪圆环病毒 II 型：F:5 ' AGGTTTGGGGGTAAAGTAGC 3 ' (SEQ ID NO. 21)
[0024] R:5 ' CTCTGTGCCCTTTGAATACTA 3 ' (SEQ ID NO. 22)
[0025] 猪细小病毒：F:5 ' CAGAATCAGCAACCTCACCAC 3 ' (SEQ ID NO. 23)
[0026] R:5 ' GGGATCTGTTTGTTTGCCATGA 3 ' (SEQ ID NO. 24)
[0027] 猪蓝耳病毒：F:5 ' ATGAGTGAACCCGTACTTGTG 3 ' (SEQ ID NO. 25)
[0028] R:5 ' GTTCTGCGATGGTGCTAGG 3 ' (SEQ ID NO. 26)
[0029] 猪伪狂犬病病毒：F:5 ' GTTCAACGAGGGCCAGTACC 3 ' (SEQ ID NO. 27)
[0030] R:5 ' TGAAGCTGTCGTCGCTCCA 3 ' (SEQ ID NO. 28)
[0031] 猪链球菌：F:5 ' AGCAGTTCGCACGGACAT 3 ' (SEQ ID NO. 29)
[0032] R:5 ' GACCCATTTGGACCATCTAAGTAA 3 ; (SEQ ID NO. 30)
[0033] 本发明还提供了一种非诊断目的的检测猪疫病病原微生物的方法，包括如下步 骤：
[0034] (1)提取待检样品中的总RNA，作为模板，采用RT-PCR扩增，以SEQ ID N0. 11至 SEQ ID NO. 30所示的序列为扩增引物，并对扩增引物采用生物素标记；
[0035] (2)将RT-PCR过程中完成的生物素标记的产物进行双链解离，然后与基因芯片进 灯杂父；
[0036] (3)杂交后，通过试剂的添加，完成待测病原微生物核苷酸片段生物素、亲和素及 化学发光基团的结合，通过芯片读取仪（INDVER公司，美国），实现光激活状态下的化学反 应，根据芯片上的颜色变化判断检测结果。
[0037] 步骤⑴中，RT-PCR反应体系的组成为：
[0039] 步骤（1)中，RT-PCR扩增的程序为：
[0040] 1) 45 °C 30min ；
[0041] 2)95〇C 2min ；
[0042] 3)95〇C 15s ；
[0043] 4)56〇C 40s ；
[0044] 5)72〇C 15s ；
[0045] 6)回到第3)步，重复40次。
[0046] 步骤（1)中，采用维生素 Η对扩增引物进行生物素标记。
[0047] 本发明的有益效果：
[0048] 本发明的基因芯片实现了高效检测，一次性针对10种猪源病原微生物，大大提高 了检测效率；实现了 RNA病毒、DNA病毒和细菌在同一反应体系中的扩增，节约了时间，避 免了常规检测方法的反复操作；敏感度高，样品中核酸含量为pg级同样可以检出；特异性 强，本发明中设计的引物与探针均具有高度保守性和专属性，同时对芯片的布局设立三个 重复，有效避免了非特异性结果的出现。
【附图说明】
[0049] 图1 :为本发明的基因芯片模式图，B系列呈"T"字型，标红处为阳性参照点，1系 列点为3个平行的猪传染性胸膜肺炎放线杆菌探针点，2系列点为3个平行的猪瘟病毒探针 点，3系列点为3个平行的猪副嗜血杆菌探针点，4系列点为3个平行的猪流感探针点，5系 列点为3个平行的猪肺炎支原体探针点，6系列点为3个平行的猪圆环病毒II型探针点，7 系列点为3个平行的猪细小病毒探针点，8系列点为3个平行的猪蓝耳病毒探针点，9系列 点为3个平行的猪伪狂犬病毒探针点，10系列点为3个平行的猪链球菌探针点；
[0050] 图2 :猪瘟病毒（CSFV)检测结果；
[0051] 图3 :猪蓝耳病毒（PRRSV)检测结果；
[0052] 图4 :猪胸膜肺炎放线杆菌（APP)检测结果；
[0053] 图5 :猪副嗜血杆菌（HPS)检测结果；
[0054] 图6 :猪伪狂犬病病毒（PRV)检测结果；
[0055] 图7 :猪蓝耳病毒（PRRSV)和猪伪狂犬病病毒（PRV)检测结果。
【具体实施方式】
[0056] 结合实施例对本发明作进一步的说明，应该说明的是，下述说明仅是为了解释本 发明，并不对其内容进行限定。
[0057] 实施例1 :基因芯片的制备
[0058] 将设计的与待检致病病原微生物相对应的寡核苷酸探针点样在带有正电荷的玻 璃片（AMI公司，美国）上，点好样的玻璃片在长波紫外灯下进行交联lOmin左右，同时将 0. 2 μ L标记有生物素的阳性质控也点在每张玻璃片上。阳性质控的分布呈"T"字型，与待 检致病病原微生物相对应的寡核苷酸探针呈微阵列分布。该基因芯片的模式图如图1所 不。
[0059] 与待检致病病原微生物相对应的寡核苷酸探针的序列如下：
[0060] (1)猪传染性胸膜肺炎放线杆菌探针
[0061] SEQ ID NO. 1 ：5 ; gcaAAGGTAATGATATTCTAAgaggt
[0062] (2)猪瘟