基于磁珠绑定的二代测序文库快速构建方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种构建测序用DNA文库的方法。
【背景技术】
[0002] 二代测序也称深度测序、大规模平行测序，其核心思想是边合成边测序。常规的测 序前都需要对待测DNA片段进行一定的处理，构建测序文库，使DNA符合测序平台的要求。
[0003] 文库构建包含以下几个步骤：（1)待测DNA的片段化，使其适宜进行文库构建及测 序；（2)末端修复，将片段化的DNA分子修补形成正常平末端的DNA分子；（3)平末端加 A 尾，使修复完成的DNA分子具有粘性A末端；(4)加接头，利用带有3'端含有一个突出T碱 基的接头分子与带有A末端的DNA分子连接，组成接头链接产物；（5)根据需求进行PCR扩 增0-20个循环的PCR，完成文库分子的制备。上述5步反应的步骤之间以及文库PCR之后 均需要通过柱式离心法、切胶回收法、磁珠纯化法纯化上步的反应产物，用于下步反应。整 个反应过程中，也可以在任何步骤按照需求通过切胶回收或磁珠片段选择的方法对DNA片 段分子大小进行选择，最终获得所需大小DNA片段的文库分子，并且在接头连接或PCR步骤 中引入特征性序列标签，用于测序中不同文库间的区分。
[0004] 中国专利申请公开号CN104099666A(专利文献1)公开了一种二代测序文库构建 方法，该方法中合理安排了纯化步骤及纯化方式，获得了高质量的测序文库，且具有快速建 库的优点。
[0005] 但是，由于纯化反应本身的效率问题，样本在多步的纯化过程中将逐步损失，并导 致最终文库质量不高，此现象对于微量样本（l〇〇ng以下）影响尤为严重。
【发明内容】
[0006] 鉴于上述现有技术中存在的不足，本发明的目的在于提供一种即使以微量样本作 为起始，也能够构建高质量二代测序用DNA文库的文库构建方法。
[0007] 本发明的发明人为解决上述技术问题进行了深入研究，结果发现：通过采用在上 述专利文献1公开的二代测序文库构建方法的基础上进行巧妙的改进所获得的文库构建 方法，即使以微量样本（l〇〇ng以下）作为起始，也能够构建高质量二代测序用DNA文库，从 而完成了本发明。
[0008] 即，本发明包括：
[0009] 1. -种基于磁珠绑定的二代测序文库快速构建方法，其包括：
[0010] 步骤A :将希望进行测序的DNA片段进行末端修复并进行磁珠纯化，得到平末端 DNA片段，且不洗脱与磁珠结合的平末端DNA片段；
[0011] 步骤B:将所述平末端DNA片段进行3'端加 A，得到3'端加 A的DNA片段，且不进 行纯化；
[0012] 步骤C :将所述3'端加 A的DNA片段加接头并进行结合液纯化，得到加接头DNA片 段，且不洗脱与磁珠结合的加接头DNA片段；和
[0013] 步骤D :将所述加接头DNA片段进行PCR扩增，得到扩增产物，对所述扩增产物进 行结合液纯化，并洗脱与磁珠结合的所述扩增产物。
[0014] 2.根据项1所述的构建方法，其中，所述结合液包含15~30重量％的PEG6000~ 20000、以及1~4M的氯化钠。
[0015] 3.根据项2所述的构建方法，其中，所述结合液还包含1~lOOmM的Tris-HCl。
[0016] 4.根据项2或3所述的构建方法，其中，所述结合液还包含0. 1~10mM的EDTA。
[0017] 5.根据项2或3或4所述的构建方法，其中，所述结合液的pH为6. 0~9. 0。
[0018] 6.根据项1所述的构建方法，其中，步骤A中的希望进行测序的DNA片段的量为 0· 1 ~100ng〇
[0019] 7.根据项1所述的构建方法，其中，步骤A中的希望进行测序的DNA片段的量为 1 ~10ng〇
[0020] 8. -种测序方法，其中，以采用项1~7中任一项所述的构建方法构建的二代测序 文库作为对象进行测序。
[0021] 9.根据项8所述的测序方法，其中，所述测序利用Illumina平台进行。发明效果
[0022] 根据本发明，即使以微量样本作为起始，也能够构建高质量二代测序用DNA文库。 此外，本发明的二代测序文库构建方法中，中间过程不进行洗脱，可以进一步加快构建二代 测序文库的速度。
[0023] 发明的【具体实施方式】
[0024] 首先，在一个方面中，本发明提供一种磁珠绑定的快速二代测序文库构建方法 (本发明的构建方法），其包括：
[0025] 步骤A :将希望进行测序的DNA片段进行末端修复并进行磁珠纯化，得到平末端 DNA片段，且不洗脱与磁珠结合的平末端DNA片段；
[0026] 步骤B :将所述平末端DNA片段进行3'端加 A，得到3'端加 A的DNA片段，且不进 行纯化；
[0027] 步骤C :将所述3'端加 A的DNA片段加接头并进行结合液纯化，得到加接头DNA片 段，且不洗脱与磁珠结合的加接头DNA片段；和
[0028] 步骤D :将所述加接头DNA片段进行PCR扩增，得到扩增产物，对所述扩增产物进 行结合液纯化，并洗脱与磁珠结合的所述扩增产物。
[0029] 本发明中，所述结合液是指PEG(聚乙二醇）的水溶液，其包含15~30重量％ 的PEG6000~20000、以及1~4M的氯化钠。优选地，所述结合液还包含1~lOOmM的 Tris-HCl。优选地，所述结合液还包含0. 1~10mM的EDTA。优选地，所述结合液的pH为 6. 0 ~9. 0〇
[0030] 本发明中，对于磁珠纯化的方式没有特殊限制，例如可以按下述方式进行：
[0031] 1)向DNA中按比例加入磁珠试剂，静置使DNA与磁珠结合；
[0032] 2)吸附至磁力架，使磁珠吸附汇聚于磁力架一侧；
[0033] 3)保持磁珠一直处于吸附状态，移去上清废液，并使用乙醇清洗磁珠；
[0034] 4)移去上清废液，将磁珠于室温下晾干。
[0035] 需要说明的是，传统上认为，磁珠纯化（例如专利文献1中的磁珠纯化）必须在上 述4)之后进行洗脱，使DNA与磁珠脱离。例如，使用纯水或低盐的Tris-HCl溶液重悬磁珠， 洗脱磁珠上结合的DNA。
[0036] 但是，本发明人经过研究发现，在文库构建的中间步骤中，即使不进行上述的洗脱 操作，也可以无障碍地进行后续步骤，且不进行上述的洗脱操作可以提高纯化收率，有利于 获得高质量的测序文库，特别是对于微量样本而言。
[0037] 对于用于磁珠纯化的磁珠没有特殊限制，可以使用本领域技术人员通常使用的那 些，例如可以使用AMPure XP系列（Beckman公司）。
[0038] 在本说明书中，微量样本是指0· 1~100ng、优选1~10ng的起始DNA片段量（希 望进行测序的DNA片段的量）。
[0039] 对于步骤A中的"希望进行测序的DNA片段"没有特殊限制，从测序仪可接受的角 度来看，优选是10~l〇〇〇bp左右、更优选是20~800bp左右、更优选是30~750bp左右、 更优选是40~700bp左右、更优选是50~650bp左右、更优选是100~600bp左右、更优 选是150~550bp左右的DNA片段。
[0040] 此外，在一个方面中，本发明提供一种测序方法（本发明的测序方法），其中，以采 用本发明的构建方法构建的二代测序文库作为对象进行测序。
[0041] 除了以采用本发明的构建方法构建的二代测序文库作为对象之外，本发明的测序 方法可以采用本技术领域的常规方法来进行。优选地，本发明的测序方法可以利用例如 Illumina 平台（例如 HiSeq2500 或 NextSeq500)进行。 实施例
[0042] 以下通过实施例对本发明进行更具体的说明。应当理解，此处所描述的实施例是 用于解释本发明，而非用于限定本发明。
[0043] 实施例1采用本发明的方法构建测序用DNA文库
[0044] 样本准备：准备2