TATTCTCCTCGTA ； (SEQ ID NO. 20)
[0153] NO. 6-1-1 :5 ' AGGTTTGGGGGTAAAGTAGC ; (SEQ ID NO. 21)
[0154] NO. 6-1-2 ：5 ; CTCTGTGCCCTTTGAATACTA ； (SEQ ID NO. 22)
[0155] NO. 7-1-1 :5 ' CAGAATCAGCAACCTCACCAC；(SEQ ID NO. 23)
[0156] NO. 7-1-2 ：5 ; GGGATCTGTTTGTTTGCCATGA ；(SEQ ID NO. 24)
[0157] NO. 8-1-1 ：5 ; ATGAGTGAACCCGTACTTGTG ； (SEQ ID NO. 25)
[0158] NO. 8-1-2 :5 ' GTTCTGCGATGGTGCTAGG ; (SEQ ID NO. 26)
[0159] NO. 9-1-1 :5 ' GTTCAACGAGGGCCAGTACC ； (SEQ ID NO. 27)
[0160] NO. 9-1-2 ：5 ; TGAAGCTGTCGTCGCTCCA ； (SEQ ID NO. 28)
[0161] NO. 10-1-1 :5 ' AGCAGTTCGCACGGACAT ; (SEQ ID NO. 29)
[0162] NO. 10-1-2 :5 ' GACCCATTTGGACCATCTAAGTAA ； (SEQ ID NO. 30)
[0163] 实施例3 :基因芯片的特异性验证
[0164] 样本：特定的病毒和细菌培养液（特定的病毒和细菌分别为：猪瘟病毒、猪蓝耳病 毒、猪胸膜肺炎放线杆菌、猪副嗜血杆菌和猪伪狂犬病病毒）。
[0165] 1样品处理
[0166] 离心100mL细菌培养液，生理盐水重悬后，加入冻干保护剂（5%的脱脂奶粉），冻 干保存；取10mL的病毒培养液，加入冻干保护剂（5%的脱脂奶粉），冻干保存。
[0167] 2 总 RNA 提取
[0168] 各取细菌和病毒冻干样品，PBS重悬至50_100yL，使用总RNA提取试剂盒 (TIANGEN，德国），按照说明书进行操作。
[0169] 3RT-PCR 扩增
[0170] 以实施例2优化得到的引物作为特异性扩增引物，并对特异性扩增引物进行生物 素标记（以维生素 Η进行标记），标记的方法按照生物素标记PCR引物试剂盒（上海胜隆， 中国）说明书进行。
[0171] 构建一步法RT-PCR反应体系，体系中含有作为扩增模板的总RNA、RNA酶抑制剂、 MgCl2、dNTPs、生物素标记的特异性引物、反转录酶以及聚合酶等。设定反转录时间为30分 钟，使总RNA反转录成cDNA，在DNA聚合酶的作用下，完成多重PCR。
[0172] RT-PCR反应体系各组分构成比例如下：
[0173]
[0174] 核酸扩增程序为：
[0175] (l)45°C30min
[0176] (2)95〇C 2min
[0177] (3)95〇C 15s
[0178] (4) 56°C 40s
[0179] (5)72〇C 15s
[0180] (6)回到第⑶步，重复40次
[0181] 4PCR产物的双链解离
[0182] 向20 μ L PCR产物中添加10单位酶活性的Lambda DNA酶，37°C作用lOmin进行 DNA双链解离。
[0183] 5 杂交
[0184] 在解离产物中加入等量的杂交缓冲液，混匀后，滴加到玻璃片上，室温下杂交lh。
[0185] 6 洗涤
[0186] 将杂交后的玻璃片分别用洗涤液A、B、C和D (INDVER公司，美国）淋洗，晾干。
[0187] 7 标记
[0188] 杂交斑点的标记与显色按照INDVER公司生物素-亲和素标记与检测试剂盒说明 书进行。
[0189] 8结果判读
[0190] 结果如图2-6所示，玻璃片上阳性参照和猪瘟病毒（CSFV)、猪蓝耳病毒（PRRSV)、 猪胸膜肺炎放线杆菌（APP)、猪副嗜血杆菌（HPS)和猪伪狂犬病病毒（PRV)的血红色斑点为 阳性杂交结果，表明芯片上的探针已检出样品中所含有的特异性序列，继而判断检测出相 应的病原体。
[0191] 实施例4基因芯片对临床样本的检测
[0192] 样本：病死仔猪的脾脏
[0193] 1样品处理
[0194] 将样品研磨后，混匀处理。
[0195] 2总核酸提取
[0196] 取PBS重悬的样品50-100 μ L，使用总RNA提取试剂盒（TIANGEN，德国），按照说明 书进行操作。
[0197] 3 -步法 RT-PCR 扩增
[0198] 一步法RT-PCR反应体系同实施例3。
[0199] 核酸扩增程序为：
[0200] (l)45〇C 30min
[0201] (2)95〇C 2min
[0202] (3)95〇C 15s
[0203] (4)56〇C 40s
[0204] (5)72〇C 15s
[0205] (6)回到第⑶步，重复40次
[0206] 4PCR产物的双链解离
[0207] 向20 μ L PCR产物中添加10单位酶活性的Lambda DNA酶，37°C作用lOmin进行 DNA双链解离。
[0208] 5 杂交
[0209] 在解离产物中加入等量的杂交缓冲液，混匀后，滴加到玻璃片上，室温下杂交lh。
[0210] 6 洗涤
[0211] 将杂交后的玻璃片分别用洗涤液A、B、C和D (INDVER公司，美国）淋洗，晾干。
[0212] 7 标记
[0213] 杂交斑点的标记与显色按照INDVER公司生物素-亲和素标记与检测试剂盒 (INDVER公司，美国）说明书进行。
[0214] 8结果判读
[0215] 结果如图7所示，玻璃片上阳性参照和猪蓝耳病毒（PRRSV)和猪伪狂犬病病毒 (PRV)的血红色斑点为阳性杂交结果，表明芯片上的探针已检出样品中所含有的特异性序 列，继而判断检测出相应的病原体。
[0216] 采用本发明的基因芯片检测猪10种常见原发性病毒疾病和继发性细菌性疾病， 试验结果显示该检测方法特异性强，无假阳性和假阴性的结果。
【主权项】
1. 一种用于检测猪疫病病原微生物的基因芯片，其特征在于，包括固定在固相载体上 的与待检致病病原微生物相对应的寡核苷酸探针和阳性质控； 所述寡核苷酸探针分别为猪传染性胸膜肺炎放线杆菌探针、猪瘟病毒探针、猪副嗜血 杆菌探针、猪流感病毒探针、猪肺炎支原体探针、猪圆环病毒II型探针、猪细小病毒探针、猪 蓝耳病毒探针、猪伪狂犬病病毒探针和猪链球菌探针，其分别相应于SEQIDNO. 1、2、3、4、 5、6、7、8、9和10的序列。2. 如权利要求1所述的基因芯片，其特征在于，所述固相载体为带有正电荷的玻璃片、 硅片、聚丙烯膜、硝酸纤维素膜或尼龙膜。3. 如权利要求2所述的基因芯片，其特征在于，所述固相载体为带有正电荷的玻璃片。4. 如权利要求1所述的基因芯片，其特征在于，其阳性质控呈"T"字型分布；与待检致 病病原微生物相对应的寡核苷酸探针呈微阵列分布。5. 权利要求1至4任一项所述的基因芯片的制备方法，其特征在于，步骤为：将寡核苷 酸探针点样在固相载体上，点好样的固相载体在长波紫外灯下进行交联；同时将阳性质控 点样在固相载体上，即制得基因芯片。6. 用于特异性扩增猪传染性胸膜肺炎放线杆菌、猪瘟病毒、猪副嗜血杆菌、猪流感病 毒、猪肺炎支原体、猪圆环病毒II型、猪细小病毒、猪蓝耳病毒、猪伪狂犬病病毒和猪链球菌 病原微生物特定保守核苷酸序列的引物，其特征在于，其分别相应于SEQIDNO. 11至SEQ IDNO. 30所示的序列。7. -种非诊断目的的检测猪疫病病原微生物的方法，其特征在于，包括如下步骤： (1) 提取待检样品中的总RNA，作为模板，以SEQIDNO. 11至SEQIDNO. 30所示的序 列为扩增引物进行扩增，并对扩增引物采用生物素标记； (2) 将扩增过程中完成的生物素标记的产物进行双链解离，然后与权利要求1所述的 基因芯片进行杂交； (3) 杂交后，通过试剂的添加，完成待测病原微生物核苷酸片段生物素、亲和素及化学 发光基团的结合，在光激活状态下进行化学反应，通过芯片上的颜色变化判断检测结果。8. 如权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤（1)中，扩增的反应体系的组成为：浓 度为1U/μL的RNA酶抑制剂1μL、浓度为3U/μL的反转录酶0. 5μL、浓度为5U/μL的 TaqDNA聚合酶 0.3yL、浓度为ΙΟμ mol/LSEQIDN0.(11-30)F:混合液 0.6yL、浓度 为ΙΟμ mol/LSEQIDNa(ll-30)R:混合液 0.6yL、浓度为 20mmol/LMgCl25yL、浓度为 2. 5mmol/LdNTPs2μL、模板 2μL、双蒸水 13μL。9. 如权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤a)中，扩增的程序为： (1) 45〇C30min (2) 95〇C2min (3) 95〇C15s (4) 56°C40s (5) 72〇C15s (6) 回到第⑶步，重复40次。10. 如权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤（1)中，采用维生素Η对扩增引物进行 生物素标记。
【专利摘要】本发明公开了一种用于检测猪疫病病原微生物的基因芯片，包括固定在固相载体上的与待检致病病原微生物相对应的寡核苷酸探针和阳性质控。本发明还公开了采用该基因芯片对猪传染性胸膜肺炎放线杆菌、猪瘟病毒、猪副嗜血杆菌、猪流感病毒、猪肺炎支原体、猪圆环病毒Ⅱ型、猪细小病毒、猪蓝耳病毒、猪伪狂犬病病毒和猪链球菌进行检测的方法。本发明的基因芯片实现了高效检测，一次性针对10种猪源病原微生物，大大提高了检测效率。此外，本发明的基因芯片敏感性高、特异性强。
【IPC分类】C12Q1/68, C12Q1/04, C12Q1/70, C40B40/06, C12Q1/14
【公开号】CN105420817
【申请号】CN201510938436
【发明人】单宝龙, 陈雷, 谷巍, 程福亮, 王红, 聂兆晶, 王丽荣, 陈甜甜, 王春凤
【申请人】山东宝来利来生物工程股份有限公司
【公开日】2016年3月23日
【申请日】2015年12月15日