扩增过程中取样两次，第一次取样是在培 养阶段的零时刻进行，第二次取样是在培养阶段的第8-24h时进行；并将取样所得样品中 的致病菌迅速灭活或冻存；
[0014] (3)特异性实时定量PCR鉴定步骤：对步骤（2)中实时定量取样所得样品进行直 接特异性实时定量PCR或DNA提取后，对提取出的DNA进行特异性实时定量PCR鉴定分析； 和
[0015] (4)根据特异性实时定量PCR鉴定分析所得Ct值进行数据处理并分析结果的步 骤。
[0016] 本发明的上述步骤缺一不可。其中，步骤（1)的非特异性培养基可高效培养并保 证扩增所有污染菌，可用于多种菌的同时检测；步骤（2)的定量取样可以同时鉴定和区别 活菌和死菌污染，这是本发明的重点之一；步骤（3)的PCR方法是最灵敏和特异的检测方 法，采用PCR鉴定，可以不用特异培养，省时，而且同时测定多种致病菌；步骤（4)的所得Ct 值可以有效判断出食品中致病菌的污染程度、活菌比例、致病菌活性状况及污染历史，经过 对Ct值的精确选取，使得整个检测方法具有简单、直观，准确性和特异性高等优点，灵敏度 可以达到单个菌。同时利用探针法的荧光定量PCR可以对多种致病菌同时检测，满足食品 致病菌的国家检测标准要求。
[0017] 本发明中，由于采用的是广谱培养，如果培养时间过长，杂菌大量扩增会影响待测 菌的生长，因此，需要将培养时间控制在一定范围内。本发明采用在扩增过程中只取样两 次，并且第二次取样选取在培养阶段的第8-24h时进行，尤其是在18h时进行第二次取样， 该时段取样所得到的目标致病菌不仅可以实现扩增最大值，避免了菌与菌之间的生长相互 干扰，同时还实现了对食品中致病菌的污染程度、活菌比例、致病菌活性状况及污染历史的 精确检测；另外，只采取两次取样，大大简化了检测步骤，降低了成本。
[0018] 本发明中，所述非特异性培养通过改良的非特异性培养基实现，该非特异性培养 基是对致病菌营养成分齐全，无抑制成分，因此可在短期内有效修复并扩增所有污染致病 菌，使所有活性污染微生物在此培养基存在的培养条件下迅速恢复活力并可以按一定速度 扩增。该非特异性培养基可以是但不限于目前致病菌培养中通用的培养基；例如可以为巯 基乙酸盐培养基、LB液体培养基或月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST)肉汤中的任意一种；但优 选的非特异性培养基组成为：蛋白胨、牛肉浸粉和氯化钠；其中优选地，所述蛋白胨浓度为 5-20g/L，所述牛肉浸粉浓度为2-5g/L，所述氯化钠浓度为5-20g/L。与其它非特异性培养 基尤其是与缓冲蛋白胨水（BPW)相比，由蛋白胨、牛肉浸粉和氯化钠组成的非特异性培养 基可以有效实现多种致病菌的同时扩增，并且可以有效避免菌与菌之间的生长相互干扰， 使各致病菌的扩增达到最大效率。
[0019] 本发明所述非特异性培养基中，其中，所述蛋白胨的浓度为5-20g/L，例如可以是 5g/L、6g/L、7g/L、8g/L、9g/L、10g/L、llg/L、lg/L、12g/L、13g/L、14g/L、15g/L、16g/L、17g/ L、18g/L、19g/L、20g/L，优选为5-18g/L，进一步优选为5g/L ;所述牛肉浸粉浓度为2-5g/L， 例如可以是 2g/L、2. 2g/L、2. 5g/L、2. 8g/L、3g/L、3. 2g/L、3. 5g/L、3. 8g/L、4g/L、4. 5g/L、5g/ L，优选为3-5g/L，进一步优选为5g/L ;所述氯化钠浓度为5-20g/L，例如可以是5g/L、6g/ L、7g/L、8g/L、9g/L、10g/L、llg/L、lg/L、12g/L、13g/L、14g/L、15g/L、16g/L、17g/L、18g/L、 19g/L、20g/L，优选为 5-18g/L，进一步优选为 5g/L。
[0020] 本发明进一步优选的非特异性培养基组成为：每升培养基中含有5_18g蛋白胨、 3_5g牛肉浸粉和5-18g氯化钠；最优选的非特异性培养基组成为：每升培养基中含有5g蛋 白胨、5g牛肉浸粉和5g氯化钠。
[0021] 本发明中，对步骤（1)所述目标致病菌不作特别限定，例如可以为沙门氏菌、金黄 色葡萄球菌、大肠杆菌0157、单增李斯特菌、铜绿假单胞菌或粪便链球菌中的任意一种或至 少两种的组合，也可以是本领域常见的其它食品中的致病菌。
[0022] 本发明中，步骤（2)所述第二次取样在培养阶段的第8_24h时进行，例如可以是在 第 8h、9h、10h、llh、12h、13h、14h、15h、16h、17h、18h、19h、20h、21h、22h、23h、24h 时进行取 样，优选为第15_20h时进行，进一步优选为第18h时进行第二次定量取样。
[0023] 本发明优选18小时取样也考虑到既有充分时间使致病菌扩增但又不能因为时间 过长导致菌与菌之间的生长相互干扰。
[0024] 本发明所述的取样方式中，由于取样时间点包括培养阶段的零时刻及致病菌增长 阶段内的至少一个非零时刻，取样代表了样品最初致病菌污染情况和其中活菌的生长情 况。其中零时刻取样的样品中包括活性致病菌、死亡致病菌和DNA片段，这些成分在下一步 的PCR测试中均可无区别的测得，因此一般PCR无法对上述成分进行判别。而本发明所述 方法中由于还在微生物致病菌增长阶段内的一个非零时刻进行了取样，这些取样中不仅含 有前述零时刻取样中含有的各原始成分，还包括培养过程中新生长（扩增）的致病菌。因 此从后续的实时定量PCR中对零时刻及非零时刻所得取样中目标致病菌的定量分析可以 测定出活性致病菌的生长情况，同时对比初始致病菌含量可以得到死亡致病菌和活性致病 菌在原始致病菌中所占的比例，这些数据均对后续的毒素测定具有非常重要的指导意义。
[0025] 在进行结果分析时，若整个培养过程中没有量的增加则可以说明没有活性致病菌 存在；若虽没有量的增加，但培养过程中始终存在有高含量的DNA成分，则说明样品中曾经 有大量的目标微生物存在且已经死亡，此时应考虑进行毒素测定并鉴定目标微生物与毒素 之间的吻合度；若培养过程中自始至终检测到的量均为零，则说明样品中既无活性致病菌 也没有死亡致病菌，这种情况可以考虑不做毒素测定。因此本发明所述方法中的定时定量 采样步骤中取样时间点的分布中，几个时间点的致病菌的增长量将反映出活性致病菌的生 长情况，同时对比初始致病菌含量可得到死亡致病菌和活性致病菌的比例，这些数据均对 后续的毒素测定具有指导意义。
[0026] 本发明中，步骤（3)所述Ct值的测定采用荧光染料法或探针法进行，本发明对该 测定方法不作特别限制。
[0027] 本发明中，所述Ct值有两个，分别为培养阶段的零时刻所对应的Ct1值和培养阶 段的第8_24h所对应的Ct 2值。
[0028] 本发明中，所述Ct值用来分析样品中某种活性目标致病菌的初始浓度及扩增过 程的状态；和/或，所述Ct值用来分析样品中某种目标致病菌初始浓度中死亡致病菌和活 性致病菌的比例，还可同时测定同一样品中共存的多种致病菌，实现了高通量化。
[0029] 在进行检测时，当所述以2值>35时为阴性，表示未检出所述致病菌；当所述Ct 2值 〈32时为阳性，表示检出所述致病菌；当所述以2值〈32并且所述Ct 2值和Ct i值之差Λ Ct 大于4个Ct值（ACtM)时，表示检出所述致病菌为活性菌；当所述