一种检测水体鸡粪污染的巢式pcr试剂盒及其检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及水体污染检测领域，更具体地说，涉及一种检测粪便污染水体中鸡粪 污染的巢式PCR试剂盒及其检测方法。
【背景技术】
[0002] 近年来，我国水体污染日趋严重，威胁着人们的生存环境和健康用水，并对社会造 成了严重的经济损失。太湖流域畜禽养殖业发达，养殖业废水是造成太湖流域水体污染的 主要来源之一。粪便污染物进入水体后不仅会增加水体氮磷含量，造成富营养化，并且会带 入奠便中可能存在的致病菌，引发疾病的水体传播（Baldursson，S. and Karanis, P. (2011) Waterborne transmission of protozoan parasites:Review of worldwide outbreaks -An update 2004 - 2010. Water Research 45 (20) ,6603 - 6614·)。进行水体污染的控制和 治理已经刻不容缓。
[0003] 粪便污染的潜在污染源种类繁多，呈现点、面源结合的特征，缺乏对粪便污染来源 的准确掌握和定位，使得治理工作只停留在"见污治污"阶段，在一定程度上增加了污染治 理的成本。如何寻找和区分水体中粪便污染主要来源，从而快速、准确地确定污染源，成为 了解决问题的关键。传统方法通过检测水中粪便污染指示菌（如大肠杆菌、肠球菌等）来 判断水体粪便污染情况，耗时长且无法区分污染源。通过检测水体宿主特异性微生物或化 学标志物，可以达到粪便污染溯源的目的，但现存的一些微生物及化学标志物特异性不高， 往往导致假阳性结果的产生。2000年，Pierre等最先证实粪便中的线粒体DNA(mtDNA)具 有其种属特异性，并且动物粪便中含有较高丰度的mtDNA，通过PCR手段能够检测到明显 的mtDNA信号，因此提出了"水体奠便污染的mtDNA溯源方法"（Caldwell, J.，Payment, P. and Villemur, R. (2011)Mitochondrial DNA as Source Tracking Markers of Fecal Contamination.)〇
[0004] 以PCR为基础的分子生物学技术的快速发展为水体粪便污染的检测提供了强有 力的工具。通过特异性引物PCR扩增水体中的目标线粒体DNA片段，即可检测样品是否受 到潜在的粪便污染，用时短且准确度高。另外通过设计特异性的巢式PCR引物进行二次扩 增，极大的提高了方法的灵敏度，能够检测到水体中的微量粪便污染。
[0005] 目前国内对水体粪便污染溯源公开文献较少，国外针对鸡粪污染溯源主要集 中在宿主特异性微生物溯源法上，但微生物溯源法常常会出现特异性不高的现象（K 0 bayashi, A. , Sano, D. , Hatori, J. , Ishii, S. and Okabe, S. (2013) Chicken - and duck -associated Bacteroides - Prevotella genetic markers for detecting fecal contamination in environmental water. Applied Microbiology and Biotechnology 97(16),7427 - 7437.)，相比之下，线粒体DNA溯源法具有更好的特异性。目前尚未公开 基于鸡mtDNA设计的特异性巢式PCR引物及检测方法，此方法进行鸡粪污染溯源，具有 较高的特异性，且相比之前报道的巢式PCR方法具有更高的灵敏度（Kortbaoui，R.，Loc as, A. , Imbeau, Μ. , Payment, Ρ. and Villemur, R. (2009)Universal mitochondrial PCR combined with species -specific dot -blot assay as a source -tracking method of human,bovine, chicken, ovine, and porcine in fecal - contaminated surface water. Water Res 43 (7)，2002 - 2010.)。
【发明内容】
[0006] I、要解决的技术问题
[0007] 针对传统检测粪便污染的方法无法溯源的技术问题，本发明提供了一种检测水体 鸡粪污染的巢式PCR检测方法及试剂盒，可以实现快速、准确地检测水体微量鸡粪污染。
[0008] 2、技术方案
[0009] 本发明的目的通过以下技术方法实现：
[0010] 一种检测水体鸡粪污染的巢式PCR试剂盒，包括两对巢式PCR引物、dNTP、PCR buffer、Taq酶、Mg 2+和ddH 20,两对巢式PCR引物为：
[0011] SCF:5 ' - CACATGTTATCTGCACCAGC - 3 '
[0012] SCR:5 ' - GTTAAGGGTACGAGTTTGTCG - 3 '
[0013] NCF:5，- CCAAATCCATCTTAGCCTCAAC - 3，
[0014] NCR:5 ' - GGCGGGTTTCACATCCTT - 3 '。
[0015] 具体地，所述 PCR buffer 为 10XPCR buffer，dNTP 浓度为各 2. 5mmol/L，Taq 酶浓 度为5U/ul，Mg2+溶液浓度为25mmol/L。
[0016] 采用上述巢式PCR试剂盒检测水体鸡粪污染的方法，其步骤为：
[0017] (1)取待测水样提取DNA ;
[0018] (2)以水样DNA为模板，进行第一轮PCR扩增，PCR引物为SCF和SCR ;
[0019] (3)第一轮PCR扩增结束后，取PCR产物为模板，进行第二轮PCR扩增，PCR引物为 NCF 和 NCR ;
[0020] (4)凝胶电泳，观察第二轮PCR产物中是否存在长度为403bp的条带，若存在，则表 明水体受到了鸡粪污染。
[0021] 进一步，利用巢式PCR试剂盒检测水体鸡粪污染的方法，其具体步骤为：
[0022] (1)采集待测水样，提取水样DNA ;
[0023] (2)以水样DNA为模板，进行第一轮PCR扩增，反应体系为2.5ul的10XPCR buffer;2.5ul dNTP;0.1ul Taq 酶；2ul Mg2+;0.5ul 浓度为 lOumol/L 上、下游引物 SCF、 SCR;2ul模板DNA ;灭菌CldH2O补足至25ul ;反应条件为95°C，预变性5min ;95°C 30s， 58°〇3〇8,72°〇458,40个循环；72°〇711^11，4°〇保存。
[0024] (3)第一轮PCR扩增结束后，取0· 5ul PCR产物为模板，进行第二轮PCR扩增，反 应体系为 2. 5ul 的 10XPCR buffer ;2· 5ul dNTP ;0· Iul Taq 酶；2ul Mg2+;0. 5ul 浓度为 lOumol/L上、下游引物NCF、NCR ;0. 5ul模板DNA ;灭菌ddH20补足至25ul ;反应条件为95°C， 预变性311^11;95°〇158,58°〇158,72°〇3〇8,40个循环 ；72°〇71^11，4°〇保存。
[0025] (4)对第二轮PCR产物进行1 %琼脂糖凝胶电泳，电泳条件为：电压120V，电流 440mA，时间25min，观察第二轮PCR产物中是否存在长度为403的条带，若存在，则表明水体 受到了鸡粪污染。利用本发明进行水体鸡粪污染检测的检测限为〇. 〇〇21ng/ul鸡粪DNA。 具体的，步骤（4)中凝胶电泳为1%琼脂糖凝胶电泳，电泳条件为：电压120V，电流440mA， 时间25min。
[0026] 上述利用巢式PCR试剂盒检测水体鸭粪污染的方法中，步骤（2)完成后对第一轮 PCR产物进行凝胶电泳，若存在长度为783bp的条带，则表明水体受到了较严重的鸡粪污 染，检测阈值为0. 〇34ng/ul鸡粪DNA，无需进行步骤（3)和步骤（4)。
[0027] 3、有益效果
[0028] 相比现有技术，本发明的优点在于：
[0029] (1)本发明选取的鸡粪污染标志物为鸡线粒体DNA，使得检测方法具有良好的特 异性，减低了对检测样品的误判；
[0030] (2)本发明采用巢式PCR方法检测水体鸡粪污染，通过两次PCR扩增使得检测方法 具有较高的灵敏度，能够检测到水体中的微量鸡粪污染，在粪便污染防控预警方面具有很 高的应用价值。
【附图说明】
[0031] 图1 :巢式PCR方法的特异性检测电泳结果图：图I(A)为第一轮PCR扩增特异性 检测电泳结果图；图I(B)为第二轮PCR扩增特异性检测电泳结果图。
[0032] 图2 :巢式PCR方法的第一轮PCR检测限确定电泳结果图。
[0033] 图3 :巢式PCR方法的第二轮PCR检测限确定电泳结果图。
【具体实施方式】
[0034] 下面结合说明书附图和具体的实施例，对本发明作详细描述。
[0035] 实施例1 :
[0036] 一种检测水体鸡粪污染的巢式PCR试剂盒，包括两对巢式PCR引物、dNTP、PCR buffer、Taq酶、Mg 2+和ddH 20,两对巢式PCR引物为：